Đa hình di truyền trên gen CRHR1 và FCER2 có ảnh hưởng đáng kể đến đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị hen phế quản. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào mô tà mối liên hệ giữa kiểu gen và khả năng đáp ứng thuốc corticoid ở bệnh nhân nhi hen phế quản Việt Nam. Đề tài nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình phân tích kiểu gèn của đa hình rs242941 trên gen CRHR1 và đa hình rs28364072 trên gen FCER2 ở bệnh nhân nhi hen phế quản.
Trang 1Chemistry Biochemistry and Implications The Royal
Society of Chemistry, 2-4
17 Sasaki, J., Lu, c., Machiya, E., Tanahashi, M.,
Hamada, K (2007) Processed black garlic (Allium
Sativum) extracts enhance anti-tumor potency against
mouse tumors Medical and Aromatic Piant Science and
Biotechnology, 1 (2), 278-281
18 Sato, E., Kohno, M., Ha mano, H., Niwano, Y
(2006) increased Anti-oxidative Potency of Garlic by
Spontaneous Short-term Fermentation Plant Foods for
Human Nutrition, 61,157-160
19 Wang, D., Feng, Y Liu, J„ Yan, J., Wang, M„
Sasaki, J., Lu, c (2010) Black Garlic (Allium sativum)
Extracts Enhance the Immune System Medicinal and
Aromatic Plant Science and Biotechnology, 37-40
20 Wang, X., Jiao, F., Wang, Q w , Wang, J., Yang, K„ Hu, R R., Liu, H c., Wang, H Y., Wang, V s (2012) Aged black garlic extract induces inhibition of gastric cancer cell growth in vitro and in vivo Molecular Medicine Report, 5,66-72
21 Xu, G., Ye, X., Chen, J „ Liu, D (2007) Effect of heat treatment on the phenolic compounds and antioxidant capacity of citrus peel extracts Journal of agricultural Food Chemistry, 55, 330-335
22 Yeh, Y Y., Liu, L (2001) Cholesterol-Lowering Effect of Garlic Extracts and Organosulfur The Journal of Nutrition, 131, 989-993
23 Yiimaz, Y-, & Toledo, R (2005) Antioxidant activity of water-soluble Maillard reaction products Food Chemistry, 93, 273-27 8
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN CRHR1 VÀ FCER2
Ở BỆNH NHÂN NHI HEN PHÉ QUẢN
Phạm Thị Hồng Nhung1, Vũ Thị Thơm 1, Đậu Thế Huy1, Nguyễn Thị Thu Hằng2,
Đ ỉnh Đoàn Long , Dương T hị Ly Hương
1 Khoa Y Dược, Đ ại học Quốc gia Hà Nọi
2 Đ a i h o c D ư ơ c H à N ô i
TÓM TẤT
Đặt vấn đề: Đa hình di truyền trên gen CRHR1 và FCER2 có ảnh hưởng đáng kể đến đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị hen phế quản Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào mô tà m ối liên hệ giữa kiểu gen và khả năng đáp ứng thuốc corticóid ở bệnh nhân nhi hen phế quản Việt Nam Mục tiêu: Xây dựng quy trình phân tích kiểu gèn của đa hình rs242941 trên gen CRHR1 và đa hình rs28364072 trên gen FCER2 ở bệnh nhân nhi hen phế quản Phương pháp: tách DNA từ máu ngoại vi, khuếch đại gen bằng PCR, xác định kiểu gen của bệnh nhân bằng phương pháp giài trình tự và PCR-RFLP Kết quả: 40 bệnh nhân nhi hen phế quàn đã được xấc định được kiều gen CRHR1 và FCER2 Tần số alen đột biến của đa hình rs242941 và rs28364072 lần lượt là 0,10 và 0,33 Kết luận: chúng tôi đã xây dựng được quy trình xấc định đa hình trên gen FCER2 sử dụng phương pháp giải trình tự
và xốc đinh đa hình trên gen CRHR1 với hai phương pháp song song là phương phấp PCR-RFLP va giải trình tự.
T ừ khóa: CRHR1, FCER2, hen phế quản.
SUMMARY
CONSTRUCTION PROCESS TO GENOTYPE THE CRHR1 AND FCER2 GENE VARIATIONS OF PEDIATRIC ASTHMA PATIENTS
Pham Thi Hong Nhung1, Vu Thi Thom\ Dau The Huy1, Nguyen Thi Thu Hang2,
Dinh Doan Long\ Duong Thi Ly Huong1
1 School o f Medicine and Pharmacy - Vietnam National University, Hanoi
2 Hanoi University o f Phamacy Background: The genetic variations o f CRHR1 and FCER2 gene have significant influences in response to corticosteroid drugs in the treatment o f asthma However, no study about the relationship between this genotypes and the response to corticosteroid in pediatric asthma Vietnamese Objectives: construction genotyping tests of CRHR1 (rs242941) and FCER2 (rs28364072) polymorphisms on asthma pediatric patients Materials and method: DNA extraction from blood samples, polymerase chain reaction (PCR) amplification o f target genes, Sanger sequencing and PCR-RFLP Results: we have identified the FCER2 and CRHR1 genotype o f 40 patients The fr&quencies o f mutated alleles o f rs242941 and r$28364072 were 0.10 and 0.33, respectively Conclusion:
We have established successfully process to identified FCER2 polymorphisms using sequencing and CRHR1 polymorphisms using P C R - RFLP and sequencing.
Keyw ords: CRHR1, FCER2, asthma.
ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU
Hen phế quản ià bệnh hô hấp mãn tính, đa nhân tố
rất phổ biến ở nước ta cũng như trên thế giới với tĩ íệ
gia tăng liên tục ử trẻ em trong thời gian qua [3], [4]
Corticoid là nhóm thuốc được sử dụng phổ biến trong
điều trị hen phế quản, tuy nhiên đến 40% bệnh nhân
không có đáp ứng khi được điều trị với corticosteroid
CRHR1 !à gen mã cho thụ thể kết cặp G-protein liên kết với các neuropeptide thuộc họ hormon giải phóng corticotropin CRHR1 liên quan đến việc sản xuất corticosteroid nội sinh và do đó có thể được dự báo sẽ ảnh hưởng đến đáp ứng corticosteroid ngoại sinh Đa hình rs242941 (G> T) trên gen CRHR1 đã được chứng minh íàm ỉăng đáp ứng với điều trị
Trang 2FCER2 là gen mã hóa cho thụ thề gắn với IgE ái Xác ứịnh kiểu gen CRHR1 và FCER2 lực thấp (FcsRII/CD23) có mặt ờ nhiều dòng tế bào Sản phẩm PCR được gửi tinh sạch và giải trình tự như tế bào B, bạch cầu ổơn nhân, đại thực bào [5] Đa - 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia) Tần sổ alen của hình rs28364072 (A>G) trên gen FCER2 đã được các SNP sẽ được tính toán và so sánh với tần sổ lý chửng minh có liên quan với việc tăng nguy cơ các đợt thuyết theo định luật Hardy-Weinberg sử dụng chi-kịch phát với những bệnh nhân dử dụng corticosteroid square test
dạng hít [2] Cảc alen G có liên quan với nồng độ IgE Kiều gen của rs242941 được phát triển thêm quy tăng cao ở bệnh nhân hen suyễn trình xác định bằng PCR - RFLP với enzyme giới hạn Trong nghiền cứu này, chúng tôi tiến hành xây SsiỊ (ER1791, Thermo Scientific),
đựng quy trình phân tích các đa hình trên CRHR1 và KẾT QUẢ
FCER2 ờ bệnh nhân nhi hen phế quản, cung cẩp công 1- Tách ch iế t DNA tổng số từ máu ngoại ví
cụ giúp phân tích mối liên quan giữa kiểu gen và đáp Tất cả 40 mẫu máu đều tách được DNA tổng sổ đù ứng thuốc corticosteroid chắt lượng cho các thí nghiệm tiếp theo DNA thu ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u được cho băng sáng rõ khi điện đi và có nồng độ từ 8
Mâu máu cua 40 bệnh nhân nhi hen phế quản có 2 Khuếch đại vùng gen quan tâm bằng PCR
độ tuổi íừ 6-16 đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Thành phần phản ứng tổỉ ưu nhân dòng đoạn gen ương Quá trinh thu thập mẫu máu được sự cháp CRHR1 chứa rs242941 gồm 2 mM dNTP, 3 mM thuận của gia đỉnh bệnh nhân và được Hội đồng đạo MgS04, 0.3 pM mỗi mồi, 0.05 uỉụỉ Pfu DNA
2 Phương pháp nghiên cứu trình đảm bảo độ nhạy với nồng độ DNA khuôn từ 5
-2.1 Tách ch iế t DNA tổ n g số từ m áu toàn phần 500 ụg/pi phản ứng Kết quả thí nghiệm tối ưu PCR
E.Z.N.A blood DNA Mini kit (Omega-Biotek) được đưực trình bày ở hinh 1
sử dụng theo quy írình khuyến cáo của hãng Thành phần phản ứng tối ưu nhân dòng đoạn Tối ưu hóa điều kỉện khuếch đại gen bằng PCR gen FCER2 chứa rs28364072 gồm 2 mM dNTP, 2
Sử dụng cặp mồi tự thiết kế, chúng tôi tiến hành tối M gS04, 0.3 mM mỗi mòi, 0.05 u/ụl Pfu DNA
ưu các yeu tố: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ polymerase Nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 560C Quy MgS04 Các thí nghiệm được tiến hành trên 3 mẫu cổ trình đảm bảo độ nhạy với nồng độ DNA khuôn từ 5 nong ổộ DNA khâc nhau: niẫu 17 (nồng độ DNA 177 - 100 pg/pl phản ứng PCR với nồng độ mẫu quá ng/yí), mẫu 29 (nồng độ DNA 90 ng/pi), mẫu 49 (nồng cao (như mẫu 17) sẽ ức chế phàn ứng khuếch đại
độ DNA 46 ng/ụí) Đánh giá độ nhạy cua phương pháp gen Kết quả thỉ nghiệm tối ưu PCR được trình bày với dải nồng độ DNA từ 5 - 5Ó0 ng/ụl Sản phẩm PCR Ờ h in h 2
được điện di trên gel agarose 1%,
i
Hình 1 Ảnh điện di thí nghiệm tối ưu PCR nhân vùng chứa rs242941 (CRHR1) trên gel agarose 1%
Ảnh A: PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi (Làn M: thang chuẩn DNA100 bp) Ảnh B: PCR tối ưu nồng độ
mồi Ảnh C: PCR tối ưu nồng độ MgS04 và DNA Ảnh D: PCR với điều kiện tốl ưu với 3 mẫu baỉ kì
Trang 3SiS bp —►
N hiệt độ gắn m ồi (°C)
52 54 5Ố 58 59
M (- ) 0.9 0.3 0 1 0 9 0 1 0 1 0 9 0 3 0 1
mm
M ầ u 17 M ầ u 29 M ẩ u 49 Nồng độ DNA (ng/|il) Nồng độ M g S 0 4 (mM )
_ M ầ u 17 M lu 29 M ầ u 49
Hình 2 Ảnh điện di thí nghiệm tối ưu PCR nhân vùng chứa rs28364072 (FCER2) trên gel agarose 1%, thang chuẩn DNA 100 bp (iàn M) Ảnh A: PCR tối tru nhiệt độ gắn Ành B: PCR tôi ưu nong độ mồi Ảnh C: PCR tối ưu nông độ MgS04 và nồng độ DNA Ành D: PCR VỚI điều kiện tối ưu với 3 mẫu bất kì
3 Xác định kiểu gen CRHR1 và FCER2 trên 40
bệnh nhân nhí
Hình ảnh kết quả giải trình tự các kiểu gen được
trình bày ờ hình 3-4 và một sổ tần số alien đột biền
trên CRHR1 và FCER2 được trình bày ở bảng 1 Giải
trinh tự phân vùng gen FCER2, ngoài rs28364072
chúng tôi xác định thêm được 16 SNP khác là: rs
2277994, rs76013233, rs77121754, rs78283814,
rs75584211, rs74927160, rs2277995, rs4996972,
rs4996973, rs2228138, rs4996975, rs4996976,
rs4996977, rs4996978, rs4996979, rs4996980
I - Z _A - I - À _A
Tần sô alien đột biên 0,10 0,33
RFLP vớí xử lý Ssil 1u ừong 1 giờ ở 37°c (hình 3)
Alen G trên bản điện di sẽ cho 2 băng kích thừớc 156
và 225 bp; alen T chỉ cho một băng kích thước 381 bp
Kết quả phân tích PCR-RFLP với cho kết quả tương
đồng 100% với kết quả giải trình tự
CA)
r " r " " ■“
o ÕI q t o c q g g c c q c ó ỉ í
•• — bi’ : = ĩ l i ĩ
c o c o 3 Q I O G G G Q C
m ầ
2J0
C O C G G G rG G G G G C
ftm ề ỊẬ
Hỉnh 3 Kết quả phân tích kiểu gen rs242941 (CRHR1) của bệnh nhân mã sổ 01 và 04 Ảnh A: ảnh điện di sản phẩm PCR-RFLP trên gel agarose 1.5%, íàn M: 100 bp DNA Ladder, làn 1-4: san phẩm PCR, làn 1.1 -1.3 và 4.1 - 4.3: sàn phẩm cắt với mẫu PCR từ bệnh nhân số 01 (kiểu gen GT) và 04 (kiểu gen GG) trong thời gian ủ tương ứng 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ Ảnh B: Kết quà gỉài trình tự tương ứng
Hình 4 Kết quả giải trình tự đa hình rs28364072 cùa bệnh nhân có kiều gen AA (hình A), kiểu gen AG (hình
B), kiểu gen GG (hỉnh C)
Trang 4BÀN LUẬN
Chúng tối đã xây dựng được quy trình xác định
kiểu gen của CRHR1 và FCER2 dựa trên kĩ thuật
PCR-RFLP và giải trình tự Sanger Ưu điểm của
phương pháp giải trinh tự là chúng ta sẽ biết được
toàn bộ trình tự của phân đoạn DNA được nhân !ên
trong Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn giải trình tự để
xác định được đống thời 17 SNP trên FCER2 Với
phương pháp PCR-RFLP, đây là phương pháp đơn
giản, nhanh và có giá thành rẻ hơn so giải trình tự nên
có thể ỉriển khai ở những phòng xét nghiệm, nghiên
cứu cơ bàn
Với tập hợp mẫu n=40, kiểm định chi-square cho
thấy tần số của các alen trên phân bố theo định luật
Hardy-Weinberg, nhóm mẫu nghiên cứu có tính đại
diện cho quần thể bệnh nhân nhi hen phé quàn
So sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới,
chúng tôi thấy rằng tần số cùa các alen đột biến trong
nghiên cứu này khá tương đồng với tần số ở các quần
thể khu vực Đông Á (hình 5) Điều đó cho thấy sự gần
gũi về khoảng cách địa lý và chủng tộc phản ánh tương đổi rõ qua sự tương đồng về mặt di truyền, các quần thể thuộc cùng một khu vực địa lý có tần số ãlen xắp xỉ nhau Điều đáng chú ý là alen T của rs242941
và aìen G của rs28364072 ơ các quần thể người ử Châu Phi hoặc gốc Phi có tỷ lệ cao vượt trội Trong Chương trinh quản íý hen ở trẻ em, nghiên cứu của Kelan và cộng sự cho thấy sự tăng tần số đa hỉnh di truyền trên FCER2 có thế giúp iỷ giải sự tăng tỷ lệ nhập viện liên quan đến hen ở trẻ em Mỹ gốc Phi [1], Tính đa hinh trên FCER2 cao cho thấy các nghiên cứu
về di truyền học dược lý liên quan đến các SNP này ở người Việt Nam có thể sẽ mang lại nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn Việc mở rộng nghiên cứu với số lượng mẫu lởn hơn, đánh giá khả năng đáp ứng thuốc
ờ các nhóm kiểu gen sẽ cung cấp những dữ liệu có giá trị cho nghiên cứu về mối liên hệ giữa kiểu gen và khả năng đáp ứng thuốc của từng cá thể, có thề hỗ trợ xây dựng mô hình tiên iượng đáp ứng corticoid trong điều trị hen
Châu Phi
Châu Âu ỊìIìIÌkÉkìS ị I
Châu Phi Chân Mỹ Châu Âu Đông Á Việt Nam Nam Á pẩiii&ĩPìị I Ị Ị j : I i I Nam Á
0 ( U 0 2 0 3 OA 0 5 0 6 0 7 o is 0.9 1
A Tần số alen T của rs24294Ị-(CRHR!) B Tần số alen G của rs28364072 ựCER2)
Hình 5 Tần sô"các alen thuộc gen CRHR1 và FCER2 ờ người trong lìhiếu quân thê’ khác nhau trên thê giới:
Châu Phi, Châu Mỹ, Châu Âu, Đông A, Nam Á [8]
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình xác
định kiểu gen FCER2 và CRHR1 đảm bảo tính chính
xác, độ nhạy và độ lặp lại cao Với quy trình này,
chúng tôi đã thu được số liệu ban đầu ve phân bố tần
số cốc alen và kiểu gen thuộc gen CRHR1 và FCER2
trên nhóm bệnh nhân nhi hen phế quản người Việt
Nam
Chúng tôi kiến nghị sử dụng quy trình phân tích
trên cho các nghiên tiếp phân tfch mối liên quan giữa
kiểu gen và khả năng đáp ứng thuốc corticoid trong
điều trị hpn ở trẻ em Việt NarrChỗ trợ nâng cao hiệu
quả điều trị
LỜI CẤM ƠN
Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Đại học
Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã sổ QG.Ĩ4.59 để thực
hiện nghiên cứu này Chúng tôi chân thành cám ơn
nhóm nghiên cứu của bệnh viện Nhi Trung ương đã
cung cấp mẫu máu để thực hiện nghiên cứu
TÀI LIỆU THAM KHẨO
1 Kelan G et al (2007), “FCER2: A pharmacogenetic
2 Koster s E et al (2011), “FCER2 T2206C variant associated with chronic symptoms and exacerbations in steroid-treated asthmatic children", Allergy, 66, pp 1546- 1552
3 Masoli M et ai (2004), “The global burden of asthma: executive summary of the G!NA dissemination committee report”, Allergy, 59, pp 469 - 478
4 Matthew M et al (2004), "Globa! Burden of Asthma”, Medical Research institute of New Zealand, University of Southampton
5 Tantisira K et al (2007), “FCER2: A pharmacogenetic basis for severe exacerbations in children with asthma”, J Allergy Clinlmmunol, 120, pp 1285-1291
6 Tantisira K et al (2004), “Corticosteroid pharmacogenetics: association of sequence variants in CRHRIwith improved lung function in asthmatics treated with inhaled corticosteroids”, Human Molecular Genetics, 13(13), pp 1353-1359
7 Tantisira K.G et al (2011), “Genomewide association between GLCCI1 and response to glucocorticoid therapy in asthma”, N Engl J Med 365(13),