Xây dựng quy trình nhân giống hoa đồng tiền gerbera jamesonii bolus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro

Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro đã và đang ngày càng phát triển trong thực tiễn để nhân giống nhiều loại cây trồng.. Bằng phương pháp nhân giống nuôi cấy mô in vitro cho

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƯ - -

NGUYỄN NHÂN NGỌC LĨNH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

HOA ĐỒNG TIỀN GERBERA JAMESONII BOLUS

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC

VINH - 12.2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƯ - -

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

HOA ĐỒNG TIỀN GERBERA JAMESONII BOLUS

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

VINH - 12.2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào Tất cả có được đều là nhờ

sự nỗ lực của bản thân dưới sự dẫn dắt của thầy giáo và cô giáo hướng dẫn Tôi xin cam đoan những điều trên là hoàn toàn trung thực, nếu có gì sai sự thật tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tác giả luận văn

Nguyễn Nhân Ngọc Lĩnh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo - Th.S Phan Thị Thu Hiền - cán bộ hướng dẫn khoa học, thầy giáo Phùng Văn Hào - cán bộ phòng thí nghiệm, đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp vô cùng quý báu của các thầy cô Khoa Nông – Lâm - Ngư, tạo sự điều kiện và ủng hộ của các cán bộ trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô - tế bào thực vật Khoa Sinh học, Trường Đại học Vinh

Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, cung cấp tư liệu, hóa chất, nguồn giống của Viện Công Nghệ Sinh học (thuộc Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Đây là lần đầu tiên tham gia nghiên cứu khoa học bản thân sẽ không tránh khỏi sự thiếu sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của thầy giáo, cô giáo và bạn bè để đề tài của tôi được hoàn thiện hơn

Vinh, tháng 12 năm 2010

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Nhân Ngọc Lĩnh

1.1.6 Những thuận lợi, khó khăn và phương hướng sản xuất hoa

1.1.7 Một số nghiên cứu về nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy

1.2 Công nghệ NCM – TB thực vật in vitro 17

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.5 Một số lưu ý trong quá trình nhân giống hoa Đồng Tiền

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 1.1 Tình hình xuất khẩu hoa của một số nước trên thế giới

Bảng 1.2 Diện tích và sản lượng hoa - cây cảnh Việt Nam năm 2004

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian xử lý hóa chất khử trùng HgCl2 đến tỷ

lệ thành công của mẫu

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ KI đến khả năng bật chồi và hệ số nhân

nhanh hoa Đồng Tiền (sau 4 tuần nuôi cấy)

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ KI đến khả năng sinh trưởng, phát triển

của hoa Đồng Tiền in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến thời gian ra rễ và khả năng ra rễ

của chồi hoa Đồng Tiền in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng sinh trưởng của rễ chồi

hoa Đồng Tiền in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sức sống của hoa Đồng Tiền in

vitro ở giai đoạn vườn ươm (sau 3 tuần theo dõi)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ KI đến khả năng bật chồi và hệ số nhân

nhanh hoa Đồng Tiền

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ KI đến khả năng sinh trưởng, phát triển

của hoa Đồng Tiền in vitro

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến thời gian ra rễ và khả năng ra

rễ của chồi hoa Đồng Tiền in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)

Hình 3.4 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sức sống của hoa Đồng Tiền in

vitro ở giai đoạn vườn ươm

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, sử dụng hoa trong sinh hoạt và công tác hàng ngày đã trở thành một thói quen tốt, tạo nên một nét văn hóa mới trong thưởng ngoạn, giải trí cũng như trong tiêu dùng

Hoa được coi là một món ăn tinh thần không thể thiếu của con người Hoa luôn mang cho đời màu sắc rực rỡ, hương thơm ngọt ngào Trong muôn vàn các loài hoa thì Đồng Tiền không những là một loài hoa đẹp, đa dạng về chủng loại

mà còn phong phú về màu sắc Hiện nay, hoa Đồng Tiền rất được ưa chuộng trên thị trường thế giới cũng như ở Việt Nam Loài hoa này được trồng phổ biến ở rất nhiều nước như Hà Lan, Mỹ, Đức, Nhật Bản, Trung Quốc [4] Sản xuất hoa Đồng Tiền đã đem lại nguồn doanh thu lớn cho các nước này, đồng thời nâng cao kim ngạch xuất khẩu của thế giới

Với vẻ đẹp thanh cao, màu sắc sống động, hoa Đồng Tiền đang được đông đảo người tiêu dùng Việt Nam ưa thích Loài hoa này không chỉ có mặt trong các vườn hoa công viên, trong phòng họp, bàn làm việc của các công sở cho đến phòng khách của nhiều gia đình mà còn có trong các lễ hội, sinh nhật

Việt Nam là nước có điều kiện khí hậu thuận lợi để trồng hoa Đồng Tiền Việc sản xuất hoa Đồng Tiền không chỉ nâng cao thu nhập cho người dân mà còn góp phần quan trọng trong việc thúc đẩy chuyển dịch cơ cấu cây trồng, đẩy nhanh tiến trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa Nông nghiệp và Nông thôn

Tuy nhiên ngành sản xuất hoa nói chung và ngành sản xuất hoa Đồng Tiền nói riêng ở nước ta hiện nay còn gặp phải rất nhiều khó khăn, nhất là chất lượng hoa còn thấp chưa đáp ứng được nhu cầu xuất khẩu Một trong những nguyên nhân chủ yếu đó là nguồn cây giống chưa đáp ứng được nhu cầu về cả chất và lượng

Để có thể đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ hoa ngày càng tăng, nhiều giống hoa, loại hoa mới, có giá trị thẩm mỹ, giá trị kinh tế và giá trị văn hóa được đưa

vào sản xuất trên quy mô lớn và được dùng nhiều phương thức tạo giống khác nhau, trong đó Nuôi cấy mô - tế bào thực vật in vitro được đánh giá là một phương pháp tiên tiến, ưu việt

Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro đã và đang ngày càng phát triển trong thực tiễn để nhân giống nhiều loại cây trồng Bằng phương pháp nhân giống nuôi cấy mô in vitro cho phép chúng ta sản xuất cây giống với số lượng lớn, cây khỏe mạnh, sạch bệnh, có độ đồng đều cao và chất lượng tốt Hoa đồng tiền được nhập nội vào nước ta từ những năm 1940 và đến nay đã phát triển ra nhiều tỉnh thành trong cả nước Tuy nhiên diện tích trồng hoa đồng tiền trong cả nước còn thấp, chất lượng hoa của một số vùng còn yếu, hoa được trồng ở một số địa phương có điều kiện như: Đà Lạt, Hà Nội, Thành Phố Hồ Chí Minh, Hải phòng Nguyên nhân của hạn chế về diện tích và chất lượng hoa đồng tiền là [23]:

+) Thiếu giống tốt và thường xuyên phải nhập nội chủ yếu từ Hà Lan và Trung Quốc với giá thành cao (5.000/cây con) và không rõ nguồn gốc, thiếu chủ động Do vậy chi phí sản xuất của người trồng hoa bị nâng cao, từ đó giá thành sản xuất cũng lên cao

+) Hoa đồng tiền thường nhiễm bệnh nhất là nấm phytophthora trong điều kiện trồng trọt ở vùng nhiệt đới nước ta Với nguồn nước ô nhiễm, vệ sinh đồng ruộng kém, cành hoa cắt sát đất dễ bị mẫn cảm với bệnh nên các giống đồng tiền thoái hóa rất nhanh

+) Một yêu cầu đặt ra là phải sản xuất giống hoa có chất lượng và sạch bệnh, đạt tiêu chuẩn để cung ứng cho thị trường sản xuất hoa trong nước thay cho việc nhập khẩu các giống ở các nước Hà Lan, Trung Quốc từ lâu nay

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình

nhân giống hoa Đồng Tiền Gerbera Jamesonii Bolus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro”

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích

Góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống hoa Đồng Tiền bằng phương pháp nuôi cấy mô, phục vụ cho công tác duy trì và sản xuất giống hoa Đồng Tiền chất lượng cao để cung ứng cho sản xuất

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý hóa chất khử trùng đến khả năng thành công của mẫu cấy (đỉnh sinh trưởng)

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hệ số nhân nhanh

và sự sinh trưởng phát triển của chồi (giai đoạn nhân nhanh)

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng khả năng ra rễ và tạo cây con hoàn chỉnh (giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh)

- Xác định giá thể phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của hoa đồng tiền nuôi cấy mô trong giai đoạn vườn ươm

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là căn cứ quan trọng cho việc xây dựng quy trình nhân giống hoa đồng tiền bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro cho cây

hoa Đồng Tiền Gerbera Jamesonii Bolus

- Kết quả nghiên cứu của đề tài bổ sung nguồn tài liệu phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, giảng dạy và sản xuất cây hoa đồng tiền

1.3.2 Ý nghĩa thưc tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp cho sản xuất nguồn cây giống sạch bệnh, đồng đều và với số lượng lớn, có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt Áp dụng kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật trong giai đoạn sản xuất hoa Đồng Tiền thương phẩm, từ đó kích thích ngành sản xuất hoa ngày càng phát triển

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số nét về cây hoa đồng tiền

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại của cây hoa đồng tiền

1.1.1.1 Nguồn gốc

Hoa đồng tiền có tên khoa học là Gerbera Jamesonii (còn gọi là hoa mặt

trời hay hoa Phu Lăng), được tìm thấy đầu tiên ở các tỉnh Transvaal, Natal và Swaziland của Nam Phi Năm 1697 được Relomen phát hiện ở phía nam Châu Phi (Delasia) và ông đã đưa về vườn thực nghiệm nước Anh Irwin Lynch là người đầu tiên tiến hành lai tạo các giống Đồng Tiền với nhau Sau đó người Pháp và người Hà Lan cũng tiến hành lai tạo và dần hai nước này đẫ trở thành trung tâm tạo giống Đồng Tiền của thế giới Đến nay hoa Đồng Tiền được trồng nhiều nước trên thế giới điển hình là: Hà Lan, Mỹ, Đức, Nhật Bản, Trung Quốc [4]

Hoa Đồng Tiền rất phong phú và đa dạng với nhiều màu sắc khác nhau như: đỏ, cam vàng, trăng, phấn hồng, tím trên một bông hoa có thể có một màu đơn hoặc nhiều màu xen kẽ với nhau

Hoa Đồng Tiền có cuống hoa to, là hoa lý tưởng dùng để làm bó hoa, lẵng hoa, cắm nghệ thuật rất được ưa chuộng Ngoài ra hoa Đồng Tiền còn được trồng vào chậu để chơi cả chậu hoa trong suốt thời gian dài, đặt trong phòng làm việc, phòng tiếp khách rất phù hợp

Hoa Đồng Tiền là một trong mười loại hoa được ưa thích nhất trên thế giới (sau hoa hồng, cúc, lan, cẩm chướng, lay ơn) Các nước có sản lượng hoa Đồng Tiền lớn là: Hà Lan, Colombia, Pháp, Trung Quốc

Ở Việt Nam, hoa Đồng Tiền được người Pháp đưa vào những năm 1940 thế kỷ XX và được phát triển đến ngày nay nhưng chủ yếu vẫn là các giống Đồng tiền đơn, hoa nhỏ Cây sinh trưởng phát triển tốt, thích nghi với điều kiện nước ta nhưng hoa nhỏ, cánh đơn, màu sắc hoa đơn điệu nên không được trồng rộng rãi

Vào những năm 1990 nước ta bắt đầu nhập khẩu giống Đồng Tiền kép từ Trung Quốc, Hà Lan, Đài Loan Các giống này có ưu điểm hơn hẳn Đồng Tiền đơn: Hoa to, cánh dày gồm nhiều tầng xếp lại, màu sắc phong phú, hình dáng hoa cân đối, năng suất cao và rất được ưa chuộng [4], [23] Chính vì vậy mà những giống hoa này đã được tiếp cận và phát triển mạnh mẽ ở nhiều địa phương, tỉnh thành trên cả nước Hoa Đồng tiền kép mới chỉ được du nhập vào Việt Nam với

số lượng lớn phục vụ cho sản xuất trong một vài năm gần đây (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2004; Đặng Văn Đông, 2007) [3], [4]

1.1.1.2 Phân loại thực vật

Trong hệ thống phân loại thực vật, cây hoa Đồng Tiền được được xếp vào

nhóm hai lá mầm (Dicotyleon), thuộc phân lớp Cúc (Asteridae), bộ Cúc (Asteraleas),

họ Cúc (Asteraceae) và có tên khoa học là Gerbera jamesonii [23]

1.1.2 Đặc điểm thực vật học và yêu cầu sinh thái của cây hoa Đồng Tiền

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật học

- Cây Đồng Tiền là cây thân thảo, nhị bội (2n = 50), không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, thân cây thấp, nhiều lá, trên thân có nhiều lông Lá nhị có bản rộng

xẻ thùy, mọc sát gốc

- Rễ Đồng Tiền thuộc rễ chùm, phất triển khỏe và ăn nổi lớp đất mặt

- Hoa Đồng Tiền có khoảng 40 loài, thuộc loại hoa lưu niên, ra hoa quanh năm, gồm hai loại: Đồng Tiền đơn và Đồng Tiền kép

+ Đồng Tiền kép: Hoa có nhiều tầng cánh xếp xít vào nhau tạo thành nhiều vòng Điển hình là loại kép đỏ, kép vàng, kép trắng

+ Đồng Tiền đơn: Hoa chỉ có một hoặc hai tầng cánh xếp xen kẽ, cành hoa mỏng và yếu hơn so với hoa Đồng Tiền kép Điển hình là các loại đơn trắng, đơn hồng, đơn đỏ [4], [23]

- Quả Đồng Tiền thuộc loại quả bé có lông, không có nội nhũ, hạt nhỏ, trung bình có

280 - 300 hạt [4], [23]

1.1.2.2 Yêu cầu về sinh thái

Yêu cầu về ngoại cảnh của các loại hoa rất đa dạng và khác nhau nhưng chịu sự tác động chính của một số yếu tố sau đây: Nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, dinh dưỡng

Đối với cây hoa Đồng Tiền vốn là giống nhập nội nên cũng có những điều kiện sống riêng trong những giai đoạn phát triển của cây

năng suất hoặc phẩm chất giảm

- Ánh sáng: Hoa Đồng Tiền là cây ưa ánh sáng tán xạ, không thích hợp với cường độ chiếu sáng mạnh Vì vậy trồng hoa Đồng Tiền phải có lưới phản quang

- Ẩm độ thích hợp sẽ giúp cây sinh trưởng phát triển tốt, ít sâu bệnh và chất lượng hoa cao Độ ẩm thích hợp từ 60% - 70%, độ ẩm không khí từ 55% - 60% là thuận lợi cho cây phát triển Trong quá trình sinh trưởng và phát triển phải cung cấp đầy đủ lượng nước cho cây bằng các biện pháp khác nhau

- Dinh dưỡng: là yếu tố quyết dịnh trực tiếp đến năng suất và chất lượng hoa Vì vậy cần cung cấp dinh dưỡng một cách cân đối và đầy đủ Các loại phân chủ yếu trong thâm canh hoa là: Phân tổng hợp NPK, phân hữu cơ (phân chuồng, phân xanh, phân bắc), phân vi lượng (Cu, Fe, Zn, Ca, Mo), vitamin

Đối với cây hoa Đồng Tiền [4]:

+ Đồng Tiền cần nhiều đạm vào giai đoạn sinh dưỡng Lượng đạm nguyên chất sử dụng cho một ha Đồng Tiền là 120 - 140 kg/năm

+ Kali cần cho giai đoạn kết nụ và nở hoa Lượng Kali nguyên chất cần cho một ha Đồng Tiền là 120 - 140 kg/năm

+ Đồng Tiền cần đất tơi xốp, thoáng khí nên yêu cầu lượng phân hữu cơ cao

để tạo mùn Cần bón khoảng 1500 kg/sào/năm

1.1.3 Giá trị sử dụng và hiệu quả kinh tế của cây hoa Đồng Tiền

Hoa Đồng Tiền có màu sắc tươi sáng, phong phú từ: đỏ, cam, vàng, trắng Trên một bông hoa có thể có nhị một màu hoặc nhiều màu xen kẽ Bông hoa to

cứng, lý tưởng để làm hoa bó, lẵng hoa và cắm hoa nghệ thuật rất được ưa thích Ngoài ra hoa Đồng Tiền có thể trồng trong chậu để chơi thời gian dài

Hoa Đồng Tiền là loại có sản lượng kinh tế cao, trong điều kiện thích hợp cây sẽ ra hoa quanh năm, tỉ lệ cành cắt và tỉ lệ hoa thương phẩm có chất lượng tốt đều cao Thêm vào đó việc chăm sóc cây hoa nhị đơn giản, ít tốn công, đầu tư một lần có thể cho thu hoạch 3 - 4 năm, hình dáng hoa cân đối hài hòa, giá trị thẩm mỹ cao, tươi lâu và là một trong 10 loại hoa được ưa chuộng nhất trên thế giới Các nước có sản lượng hoa lớn là: Hà Lan, Colombia, Pháp, Trung Quốc

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây nhờ thực hiện chuyển đổi cơ cấu cây trồng theo hướng cho giá trị cao nhất trên đơn vị diện tích, thì ngành thương mại hoa đang trở thành một trong những lĩnh vực đem lại giá trị cao, được nhiều địa phương quan tâm chú trọng phát triển Trong

đó hoa Đồng Tiền nổi lên là một trong những loài cho giá trị cao nhất Trồng một sào hoa Đồng Tiền giống mới có thể cho thu nhập 50 triệu đồng/sào [15]

1.1.4 Các phương pháp nhân giống hoa đồng tiền

1.1.4.1 Phương pháp nhân giống bằng hạt

Các giống Đồng Tiền trồng trong chậu chủ yếu được nhân bằng hạt Đồng Tiền là loại cây khó tự thụ phấn Vì vậy muốn lấy hạt nhất thiết phải thụ phấn bổ khuyết Hạt Đồng Tiền có sức sống rất ngắn (2 - 3 tháng) nên thường gieo ngay sau khi thu hái Đất gieo hạt cần phối trộn đất mùn 2 phần + than bùn 1 phần + cát sông 1 phần Hạt không cần lấp kín hoàn toàn chỉ cần lấp một lớp đất mịn mỏng, sau đó đậy nilon giữ ẩm Hạt Đồng Tiền ưa sáng nên sau khi gieo hạt phải đưa ra ánh sáng Thời gian gieo thích hợp: gieo trong nhà vườn vào tháng 1 - tháng 2, gieo ngoài trời thì vào tháng 3, sau đó đến vụ thu thì trồng vào chậu, đặt trong nhà lưới [4]

* Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt:

a) Ưu điểm:

- Nhân giống bằng hạt nhanh, dễ làm, quen với tập quán kinh nghiệm của nông dân, chi phí đầu vào thấp nên phổ biến trong sản xuất hoa

b) Nhược điểm:

ẩm độ, lượng mưa ) chi phối

- Cho cây không đồng đều, sản lượng cũng như chất lượng hoa thấp

- Sau nhiều mùa gieo liên tục gây nên hiện tượng thái hóa giống

1.1.4.2 Phương pháp nhân giống bằng tách cây

Từ 1 cây giống sau một năm trồng trở đi có thể tách được 3 - 5 cây khác để đem trồng Việc tách cây thường được thực hiện từ tháng 2 - tháng 4, lúc này phù hợp cho cây sinh trưởng và phát triển Khi tách cây đào cả bụi, rũ sạch đất, dùng tay và dao sắc nhẹ nhàng tách từng thân ra sao cho cây không bị đứt rễ và mỗi thân cây mới ít nhất phải mang 1 - 2 rễ trở lên Chú ý sau khi dùng dao cắt có thể nhúng chổ vết cắt vào dung dịch IBA nồng độ 100 ppm để tăng khả năng tái sinh của cây Sau khi đã xử lý dung dịch ra rễ, trồng cây như với cây nuôi cấy mô nhưng phải che bớt nắng hai tuần đầu để tăng tỷ lệ sống của cây [4], [23]

* Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng tách cây:

1.1.4.3 Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô in vitro

Hoa Đồng Tiền nhân giống bằng tách chồi có hệ số nhân giống thấp, mặt khác nếu nhân liên tục nhiều năm, virut tích lũy lại và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, làm cho cây sinh trưởng yếu, hoa nhỏ Để khắc phục nhược điểm trên người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Cho đến nay, kỹ thuật

nuôi cấy mô tế bào đã trở nên quen thuộc và đang ngày được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất hoa Đồng tiền

* Tóm tắt quy trình nuôi cấy mô:

+ Lấy mẫu: Các phần lấy để nuôi cấy mô có thể lấy từ đỉnh lá, nụ cuống hoa nhưng lấy phần non của đỉnh sinh trưởng là tốt hơn cả Vì chúng dễ lấy, dễ khử trùng, thời gian mọc thành cây ngắn

+ Khử trùng mẫu, mẫu được lấy ra ngâm vào nước sạch 15 phút rồi đưa lên tiêu

khử trùng trong 10 phút

+ Nuôi cấy trong phòng: điều tiết môi trường nuôi cấy nhiệt độ thích hợp

- 12h, (các bước nuôi cấy mô giống như với loài thân thảo khác)

+ Đưa cây ra vườn ươm: sau khi các cây con đủ tiêu chuẩn về hình thái, cây đạt 4 – 6 lá, chiều dài rễ từ 3,5 - 5 cm, có thể đưa ra vườn trồng

Khi mới lấy từ bình nuôi cấy ra không nhất thiết phải tách thành cây một, đợi cho sau khi cây sống chắc chắn rồi thì mới tách riêng ra Thời gian đầu chú ý

C) Đối với giống quý hiếm, để đảm bảo tỷ lệ sống cao thường sau khi lấy từ bình ra, người ta đặt trên giấy thấm nước, đợi cho rễ con ra nhiều lông hút mới rồi chuyển vào nơi tiêu độc để trồng trong vườn ươm Thông thường tỷ lệ sống của cây nuôi cấy mô hiện nay có thể đạt từ 80 - 100%

* Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính in vitro [16]

a) Ưu điểm:

- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được một số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan của cây

- Bảo tồn nguồn gen của một số loại cây quý hiếm

- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống được tạo ra với số lượng lớn và sạch bệnh

- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây, thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng theo ý muốn

- Cây khỏe, sạch bệnh, hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây lớn

- Có thể tiến hành quanh năm mà không bị chi phối của điều kiện ngoại cảnh tác động

- Cây giống nhân in vitro có thể được bảo quản trong thời gian dài trong ống nghiệm

1.1.5 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa trên thế giới và ở Việt Nam

Cùng với sự phát triển không ngừng về khoa học kỹ thuật và kinh tế xã hội, ngày càng có nhiều giống hoa mới được lai tạo và hoa trở thành nhu cầu không thể thiếu trong đời sống hằng ngày của con người Cũng vì thế, ngành sản xuất hoa ngày càng phát triển và đang mang lại những lợi ích cho nhiều quốc gia trên thế giới nói chung cũng như ở Việt Nam

1.1.5.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa trên thế giới

Ngày nay trên thế giới sản xuất hoa cây cảnh đang phát triển một cách mạnh mẽ và trở thành một ngành thương mại đem lại hiệu quả kinh tế cao Bên cạnh những nước có truyền thống sản xuất, xuất khẩu lâu đời như: Hà Lan, Pháp, Mỹ Một loạt các nước như: Thái Lan, Trung Quốc, Đài loan đang dần nổi lên

là những cường quốc sản xuất hoa

Trong sản xuất, cây hoa Đồng Tiền là loài hoa có giá trị kinh tế cao: hoa Đồng Tiền có thể trồng một lần và cho thu hoạch quanh năm, mỗi cây cho khoảng 50 - 60

bông/năm [4] Một ha Đồng Tiền có thể trồng tới 60.000 cây [4]; Ở trên thị trường thì bình quân một bông hoa Đồng Tiền bán với giá 1.500 - 2.000 đồng/bông, vào ngày lễ tết giá từ 3.000 - 5.000đồng/bông Vì vậy giá trị đầu bông hoa Đồng Tiền không cao như hoa Phăng, hoa Lily, hoa Lay ơn tuy nhiên hiệu quả kinh tế thu được trên một đơn vị diện tích là khá cao

Các loại sản phẩm hoa thương mại bao gồm: hoa cắt, hoa trồng chậu, hoa trồng thảm, cây lá màu Tuy nhiên, buôn bán trên thị trường thế giới gồm hai loại chính: hoa cắt và hoa trồng chậu

Những năm gần đây, nhu cầu hoa trên thế giới tăng từ 6 - 9%/năm Năm 1995, tổng giá trị hoa cắt tiêu thụ trên thị trường thế giới là 20 tỷ USD đến năm 1997 đạt 27

tỷ USD và dự đoán trong những năm tới nhu cầu tiêu thụ sẽ tăng lên tới 40 tỷ USD, gồm chủ yếu là hoa Đồng Tiền, Cẩm Chướng, hoa Hồng [23]

Các thị trường lớn bao gồm: Tây Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản, trong đó thị trường Nhật Bản tăng mạnh nhất, thị trường Tây Âu được coi là già cổi và bão hòa, thị trường các nước Châu Á tăng do thu nhập của người dân ngày càng tăng Châu Á là khu vực thuận lợi cho nghề trồng hoa phát triển, với khí hậu đa dạng, chi phí lao động thấp, đất đai màu mỡ dồi dào Mặt khác, Ở đây nghề trồng hoa đã có từ lâu đời, mặc dù trồng hoa thương mại chỉ mới phát triển từ những năm 80 của thế kỷ XX Diện tích trồng hoa ở Châu Á - Thái Bình Dương khoảng 134.000 ha, chiếm 60% diện tích trồng hoa trên thế giới Tuy nhiên thị trường trồng hoa ở các nước đang phát triển chỉ chiếm khoảng 20% thị trường hoa trên thế giới mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu trang thiết bị kỹ thuật Những nước xuất khẩu nhiều hoa nhất là: Thái Lan, Malaysia, Philippin, đây là 3 nước sản xuất hoa chính trong vùng [23]

Sản xuất hoa đang tăng ở các nước phát triển, sản phẩm xuất khẩu chủ yếu

là bonsai và hoa trồng chậu đang gia tăng

Bảng 1.1 Tình hình xuất khẩu hoa của một số nước trên thế giới [23]

Lily, hồng, lay ơn, đồng tiền, tuy líp Cúc, hồng, lay ơn, đồng tiền

Cẩm chướng, hồng, đồng tiền Cẩm chướng, hồng

Cẩm chướng, hồng Cẩm chướng, phong lan Cẩm chướng, hồng, đồng tiền

1.1.5.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa ở Việt Nam

So với các lĩnh vực nông nghiệp khác, hoa cây cảnh là một ngành kinh tế còn non trẻ nhưng những năm qua đã phát triển với tốc độ mạnh mẽ nhờ giá trị

mà nó đem lại, giá trị sản lượng hoa cây cảnh toàn thế giới năm 1995 đạt 45 tỷ USD nhưng đến năm 2006 đã tăng lên 66 tỷ USD [4] Việc nâng cao hiệu quả kinh tế trên đơn vị diện tích đất nhằm đảm bảo an ninh lương thực, góp phần thúc đẩy kinh tế phát triển là yêu cầu cấp thiết trong chiến lược phát triển nông nghiệp nước ta hiện nay

Hiện tại so với diện tích tự nhiên sẵn có (33 triệu ha) thì diện tích trồng hoa ở nước ta còn quá nhỏ (khoảng 3500 ha), tập trung chủ yếu ở các vùng truyền thống như: Tây Tựu, Ngọc Hà, Mê Linh (Hà Nội), Triệu Sơn (Thanh Hóa), Gò Vấp, Hóc Môn (TP Hồ Chí Minh), Đà Lạt (Lâm Đồng) [23]

Từ những năm 2009 trở lại đây trên cả nước đã có nhiều vùng trồng hoa mới làm cho diện tích đất trồng hoa tăng lên đáng kể với việc chú trọng sản xuất các loại hoa được ưa chuộng, mang lại giá trị kinh tế cao như: Ly ly, Đồng Tiền, hoa Hồng

Trước đây, kỹ thuật trồng hoa cây cảnh tại Việt Nam chủ yếu dựa vào kinh nghiệm truyền thống với các giống hoa cũ nên sản lượng thấp và chất lượng

còn kém Những năm gần đây cùng với việc nhập khẩu nhiều giống hoa cắt, hoa trồng chậu khác nhau từ Trung Quốc, Thái Lan đã góp phần làm phong phú tập đoàn hoa giống Thêm vào đó là sự phát triển như vũ bão của khoa học – kỹ thuật

đã thúc đẩy công tác chọn giống và nhân giống bằng các phương pháp tiến bộ

như: Nhân giống in vitro, công nghệ chuyển gen, chọn tạo dòng tế bào thực vật

nhằm tạo ra cây khỏe, sạch bệnh, hệ số nhân cao, làm tăng chất lượng và sản lượng hoa Tổng giá trị hoa cắt trên toàn quốc đạt khoảng 700 - 1000 tỷ VNĐ [23]

Năm 2010 tổng diện tích hoa là 16.000 ha với 5 tỷ cành hoa cắt, ước tính đạt doanh thu xuất khẩu 60 triệu USD [23]

Bảng 1.2 Diện tích và sản lượng hoa - cây cảnh Việt Nam năm 2004 [23]

Diện tích (ha)

Giá trị sản lƣợng (Tr.đ)

658

546

52

572 1.467

325 2.325

482.606 81.729 12.210 38.144 26.320 8.585 12.764 24.194 193.500 6.640 78.520 Nguồn Viện nghiên cứu rau - quả

1.1.6 Những thuận lợi, khó khăn và phương hướng sản xuất hoa ở Việt Nam [23]

1.1.6.1 Thuận lợi

- Việt Nam là nước có khí hậu đa dạng nên có nguồn trên cây hoa phong phú, đồng thời có thể canh tác nhiều loại hoa với nhiều vụ trong năm

- Là một nước nông nghiệp, diện tích đất tự nhiên lớn, nông dân cần cù giàu kinh nghiệm sản xuất, nghề trồng hoa có từ lâu đời

- Thị trường hoa ngày càng được mở rộng từ nội địa đến tiềm năng xuất khẩu hoa ra nước ngoài

- Nhà nước khuyến khích trồng hoa, mở rộng đầu tư và phát triển sản xuất hoa ở những nơi có điều kiện phù hợp

1.1.6.2 Khó khăn

Miền Nam quanh năm nóng ẩm, mùa nắng khô, mùa mưa ẩm độ cao không thích hợp cho nhiều loại hoa có nguồn gốc ôn đới chất lượng cao

- Có ít loài hoa chất lượng cao thích nghi với điều kiện của từng vùng

- Sản xuất hoa còn nhỏ, lẻ, tiến bộ kỹ thuật chưa đồng đều

- Thiếu trang thiết bị nhà lưới, nhà kính, nhà bảo quản

- Thiếu đội ngũ cán bộ kỹ thuật, các nghiên cứu về cây hoa

- Nhà nước chưa có bản quyền về giống cây trồng

- Hoa nhập nội còn nhiều, hoa trong nước chưa đủ để đáp ứng

1.1.6.3 Phương hướng sản xuất hoa trong tương lai

- Nhà nước cần đầu tư cho công tác nghiên cứu phát triển hoa ở Việt Nam, khai thác hợp lý, tận dụng tiềm năng, khắc phục hạn chế, khó khăn đem lại hiệu quả cao cho sản xuất

- Tập trung nghiên cứu cải tiến giống, đầu tư phát triển các loài hoa nhiệt đới quý hiếm đẹp được thị trường chấp nhận, phát triển các loài hoa ôn đới theo mùa vụ cho các vùng có khí hậu thích hợp

- Tăng cường đào tạo đội ngũ cán bộ kỹ thuật, nhà khoa học nghiên cứu

về cây hoa, nhanh chóng áp dụng các biện pháp sản xuất hoa của các nước tiên tiến vào ngành sản xuất hoa Việt Nam

- Xây dựng cơ sở hạ tầng: nhà kính, nhà lưới, nhà bảo quản phục vụ cho sản xuất

- Tìm kiếm mở rộng thị trường hoa

- Ra luật bản quyền về giống cây trồng

Tích cực hợp tác, mời chuyên gia hàng đầu của các nước tiên tiến sang thăm và truyền đạt kinh nghiệm, kỹ thuật trong sản xuất hoa chất lượng cao

1.1.7 Một số nghiên cứu về nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.7.1 Trên thế giới

sau đó nuôi cấy trong nhà kính Tác giả đã tìm ra được hàm lượng các chất điều

tiết sinh trưởng tối ưu cho nuôi cấy mô hoa Đồng Tiền in vitro [17]

U Soczek, M Hempel (1972), đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất

hữu cơ trong nuôi cấy mô hoa Đồng Tiền in vitro, tác giả đã đưa ra kết luận về

vai trò của các chất điều tiết sinh trưởng là: BA, KI, α-NAA [17]

A Lisiecka (1990), nghiên cứu sự ảnh hưởng về sự sinh trưởng đến các phương pháp nhân giống và sản lượng hoa Đồng Tiền Tác giả đã đưa ra kết luận: Giai đoạn tốt nhất cho giai đoạn nhân giống là giai đoạn sau trồng 2,5 tháng khi cây có từ 4 - 5 nhánh Để thu được sản lượng hoa cao nhất cần cung cấp đầy

đủ dinh dưỡng, nước và nhiệt độ thích hợp cho cây hoa [17]

Van Der Gaag DJ; Kerssies A; Lanser C người Pháp (2001), đã nghiên cứu phương pháp sự lan rộng của bệnh mốc sương ở rễ cây hoa Đồng Tiền bằng

xử lý đất trước khi trồng và hàm lượng dinh dưỡng trong đất Họ trồng cây nhiễm bệnh trong đất đã được xử lý, kết quả hơn 80 % số cây trồng vào đất trên thì bệnh mốc sương không lan rộng nữa [17]

Maurer (1968), đã thực nhiện lai giống hoa Đồng Tiền Kết quả ông đã công bố hai giống hoa Đồng Tiền mới được tạo ra bằng phương pháp lai giống

Adnet (1909), đã tiến hành trồng, lai giống giữa giống Đồng Tiền màu đỏ

và giống Đồng Tiền màu hồng nhạt, kết quả ông đã thu được hai giống có màu mới là đỏ nhạt và hồng da cam [17]

Hiện nay, việc sử dụng mô, lá và đoạn thân để làm nguyên liệu nuôi cấy in

vitro vẫn là phương pháp phổ biến nhất bởi cho phép trong thời gian ngắn tạo ra

được một số lượng cây đồng nhất Phương pháp này hoàn toàn đáp ứng được cho sản xuất quy mô công nghiệp

Việc sử dụng cánh hoa, đế hoa, quả làm nguyên liệu nuôi cấy tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo callus cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu (Ohishi, Sakurai - 1988, Fujii Shimzu - 1990)

Ngoài ra, với việc ứng dụng kỹ thuật NCM - TB ngày càng phổ biến rộng rãi một số nhà khoa học đã nghiên cứu về việc nhân giống bằng cách xử lý các tác nhân đột biến [19]

1.1.7.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các ngành khoa học nói chung và công nghệ NCM - TB nói riêng đang tiến triển chậm hơn so với thế giới rất nhiều Việc ứng dụng những

thành tựu của phương pháp nhân giống in vitro còn là một lĩnh vực khá mới mẻ

Tuy nhiên, trong những năm gần đây chúng ta đã đạt được những thành tựu đáng kể trong thực hiện nhân nhanh các loại cây như: Cà phê, cỏ ngọt, chuối (Trung tâm CNSH), dứa (Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, Trung tâm sinh học và cây thực nghiệm), cây vani, cây nho không hạt, cây dâu tằm, cây măng cụt, lúa, khoai tây, và một số giống hoa khác Đối với các giống hoa, ngoài phong lan và cúc là hai loại cây được nhân giống rộng rãi nhất bằng kỹ thuật in vitro Hiện nay cũng có nhiều loại hoa được nghiên cứu nhân nhanh bằng công nghệ này như hoa Đồng Tiền, hoa Loa Kèn, hoa Lily, hoa Cẩm Chướng, hoa

Chuông [4], [8]

Cây Đồng tiền đã được trồng từ rất lâu, song chủ yếu là những giống hoa Đồng Tiền đơn cho nên việc nghiên cứu về giống hoa này còn hạn chế Từ những năm 1990 trở lại đây, với sự xuất hiện của nhiều loại hoa đồng tiền kép mới nhập nội đã làm thay đổi cơ cấu trồng Đồng Tiền ở nhiều vùng trồng hoa và nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong nước

Từ năm 1998, Nguyễn Quang Thạch, Mai Kim Tân, Đinh Trường Sơn (Viện sinh học nông nghiệp - Đại học Nông Nghiệp I) đã nghiên cứu phương pháp nuôi cấy mô in vitro giống hoa Đồng Tiền từ Tiệp Khắc, kết quả nghiên cứu đã hoàn thành quy trình nhân giống hoa Đồng Tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy

mô được Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn công nhận là tiến bộ kỹ thuật cho áp dụng rộng rãi ngoài sản xuất

Hiện nay Viện Sinh học Nông Nghiệp đang tiếp tục nghiên cứu nhân các dòng hoa Đồng Tiền mới bằng phương pháp khí canh, thủy canh Bên cạnh đó bước đầu nghiên cứu tạo giống hoa Đồng Tiền mới bằng phương pháp gây đột biến bằng hóa chất (Colchicine), chiếu xạ (tia Gamma) [19]

Công ty Hafarm ( Đà Lạt - Lâm Đồng) đã ứng dụng công nghệ trồng hoa Đồng Tiền trong nhà lưới thu được hiệu quả rất cao, sản lượng cao gấp 10 - 15 lần so với trồng hoa thông thường [21]

Viện Nghiên cứu Rau Quả từ năm 1999 - 2002 cũng đã nghiên cứu quy trình trồng trọt để sản xuất hoa Đồng Tiền, cho nở hoa đúng vụ [23]

1.2 Công nghệ NCM - TB thực vật in vitro

1.2.1 Cơ sở khoa học của công nghệ NCM - TB thực vật in vitro

a) Tính toàn năng của tế bào thực vật

Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã được phân hóa đều chứa toàn bộ lượng thông tin di truyền (AND) cần thiết cho tất cả các cơ thể thực vật đó nếu gặp điều kiện thuận lợi thì mỗi tế bào đều có thể pháp triển thành một cá thể hoàn chỉnh gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật [16], [24], [26]

Quá trình phát sinh hình thái trong NCM - TB thực chất là kết quả của sự phân hóa và phản phân hóa [25]

b) Khả năng phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Cơ thể thực vật được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tất cả các loại

tế bào đó đều bắt nguồn từ một loại tế bào đầu tiên gọi là hợp tử Ở giai đoạn đầu, hợp

tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang các chức năng riêng biệt, có khả năng phân chia Sự chuyển hóa của các tế bào phôi thành các tế bào mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau gọi là sự phân hóa tế bào

Khi các tế bào phôi sinh đã phân hóa thành các tế bào thành các tế bào có chức năng chuyên biệt thì các tế bào không hoàn toàn mất đi tính biến đổi của mình Trong những trường hợp cần thiết ở những điều kiện thích hợp chúng lại

trở về dạng tế bào phôi sinh và lại có khả năng phân chia mạnh mẽ Quá trình

này gọi là phản phân hóa tế bào [24]

Quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào được mô tả qua sơ đồ sau:

Phân hóa tế bào

Phản phân hóa tế bào

1.2.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện cần thiết, là yếu tố quyết định đến sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ chất dinh dưỡng và các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh

trưởng phát triển bình thường của cây [14]

Thành phần của môi trường nuôi cấy thay đổi tùy đối tượng nuôi cấy, bộ phận nuôi cấy, ngoài ra còn tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cây và mục đích nuôi cấy: tạo rễ, tạo mầm, tái sinh hay muốn giữ trạng thái mô sẹo

Tuy nhiên, tất cả các môi trường nuôi cấy bao giờ cũng có các thành phần sau:

- Nguồn carbon (thường là đường saccaroze)

- Các loại muối khoáng

b Các loại muối khoáng

* Các khoáng đa lượng

- Các nguyên tố đa lượng bao gồm: N, P, K, S, Fe, Mg, Ca chúng có chức năng chính là tham gia vào thành phần cấu trúc tế bào Nồng độ của các

nguyên tố trong môi trường trên 30 ppm, tức 30 mg/l [1]

+ Nitơ: Cây sử dụng nitơ được dưới hai dạng NH4+ và NO3- với tỷ lệ tùy

loại cây và tùy giai đoạn phát triển

trong môi trường khoảng 3 - 6 mM

Lưu huỳnh tham gia cấu trúc một số loại axit amin và tham gia vào quá trình khử, tổng hợp chất hữu cơ tương ứng, ngoài ra lưu huỳnh còn điều tiết quá trình trao đổi chất và năng lượng, xây dựng các chất kháng sinh, vitamin,

+ Phot pho (P): Photpho được cây hấp thụ dưới dạng muối PO43- và hai

quá trình nuôi cấy

nồng độ biến thiên từ 2 - 25 mM, trung bình khoảng 10 mM

nồng độ 0,5 - 3 mM.Trong tế bào, Mg có vai trò xúc tác cho nhiều hệ enzim quan trọng, là cầu nối giữa enzim và cơ chất, làm tăng hạt tính enzim, Mg còn ảnh hưởng

etylen diaminteraaxetat (EDTA), ở dạng này Fe không bị kết tủa mà giải phóng dần ra môi trường tùy nhu cầu của mô thực vật [1]

* Các khoáng vi lượng

Các nguyên tố vi lượng được tìm thấy trong cây dưới dạng phức chất hữu

cơ - khoáng, các phức chất này có thể tham gia vào các phản ứng mà bản thân các chất thành phần không thể tham gia được Đặc biệt vai trò quan trọng nhất của các nguyên tố vi lượng là tham gia vào cấu trúc của các enzim và tham gia vào tất cả các quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất trong tế bào, do đó

có thể nói các nguyên tố vi lượng là cơ sở của sự sống

Các nguyên tố vi lượng bao gồm: Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co đó là những

nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm [1]

Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino axit tự do và AND tăng lên, nhưng lượng ARN và sinh tổng hợp protein giảm, các quá trình phân bào bị ức chế

- Bo (B): Thường được cây sử dụng dưới dạng H3BO3 Nếu thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện thừa auxin Mô nuôi cấy có biểu hiện thành mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là loại mô xốp, mọng nước, kém tái sinh

0,08 mM

c Vitamin

Vitamin là các hợp chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc của enzim và các cofacto của nhiều phản ứng sinh hóa Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các vitamin nhưng thường không đủ về lượng do đó cần phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, nhất là các vitamin nhóm B

Một số vitamin thường được dùng trong môi trường nuôi cấy [11], [23]

Các vitamin thường được pha trong hỗn hợp dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 500 - 1000 lần so với dung dịch làm việc Các dung dịch vitamin dễ bị nhiễm

C [26]

d Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, là thành có vai trò quyết định quá trình

phát triển hình thái của cây

Một số chất điều tiết sinh trưởng thường dùng [11], [23]

Tên chất sinh trưởng Nồng độ sử dụng (mg/ l)

2,4 D [dichlonophenoxy axetic]

α_NAA [naphtylaxetic axit]

β_NAA [ indol axetic axit]

IBA [ indol butyric axit]

Kinetin [ 6 finfurylaminopurine]

BA [ 6_BAP] [6 benzyl amino purine]

2- IP [N6γ-γDymetylally amino purine]

GA [Gibbberelic axit]

0,2- 5 0,1- 5 0,1- 5 0,1- 2 0,1- 2 0,1- 2 0,1- 2 0,1- 2

Các chất trên thuộc nhóm sau:

+ Auxin

Auxin là một loại hoocmon thực vật (Phytohormon), nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giản nở của tế bào, tăng cường quá trình tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ Có 4 loại auxin thường được sử dụng trong NCM - TB là:

- Indolylacetic (IAA)

- Naphthylacetic axit (α-NAA)

- 2,4-Dichlonophenoxy axetic (2,4-D)

- Indolbutyric axit (IBA)

Hàm lượng của các chất này từ 0,1- 2,0 ppm Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp Tùy theo loại, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [1]

+ Xytokinin

Các hợp chất xytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961) Các chất xytokinin có biểu hiện ức chế sự hình thành rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh phôi vô tính của mô cấy Các loại xytokinin thường được dùng trong nuôi cấy, bao gồm:

- Kinetin (6-furfurylamio purine)

- Zeatin (6-[4 hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine)

- BAP (6-benzylamino purine)

- 2-iP (Isopentenyl adenine)

Hàm lượng sử dụng của xytokinin dao động từ 0,1- 2,0 ppm Ở nồng độ cao hơn, xytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Trong nhóm này, KI và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả

Các chất này thường được pha trong dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 1000 lần so với dung dịch sử dụng Các chất này có thể tác động lên mô nuôi cấy ở

) [1]

[16]

+ Axit abscisic (ABA)

ABA thuộc chất ức chế sinh trưởng ABA có tác dụng tăng khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi [1]

e Các hỗn hợp chất tự nhiên

Một số hợp chất được sử dụng để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng như:

+ Nước dừa:

Từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi phôi Daruta và năm 1949 nuôi

mô của Daucus Cho đến nay nước dừa là hợp chất được sử dụng nhiều hơn cả Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo - inositol (m-inositol) và một số

axit amin khác Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá lớn chiếm 10 - 20 % thể tích môi trường [1], [23]

f Các thành phần khác

+ Chất độn - thạch (Agar)

Agar là một trong những chất được dùng để làm đông môi trường phổ biến nhất (tạo gel), được sử dụng làm chất đệm cho môi trường dinh dưỡng rắn

thái gel Khả năng ngậm nước của thạch là 6 - 12 g/1lít nước [1]

+ Nước pha môi trường

Nước pha môi trường nuôi cấy phải là nước hoàn toàn sạch ion Thông

thường người ta sử dụng nước cất hai lần [1]

+ Than hoạt tính

Được dùng để hấp thu các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp Làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có than hoạt tính, có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ Hàm lượng sử dụng của than hoạt tính là 0,2 - 0,3% [1]

+ Độ pH của môi trường

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường tế bào Vì vậy đối với mỗi loại môi trường nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của các cây nuôi cấy mà chỉnh độ pH của môi trường cho phù hợp về mức ổn định ban đầu

Đối với môi trường cấy mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 - 6,0; sau 4 tuần nuôi cấy đạt được 6,0 - 6,5 [1], [8], [23]

g Môi trường nuôi cấy cơ bản

Môi trường được sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật rất phong phú, nhưng sử dụng phổ biến hơn cả là môi trường MS (Murashige- Knoog, 1962) Thành phần môi trường MS bao gồm:

Vitamin

Glyxine Myo-inositol Nicotinic acid Pyridocine Thiamine

2

100 0,5 0,5 0,1

Các chất hữu cơ Saccarose

1.2.3 Quy trình chung của NCM - TB in vitro

Cho tưới nay quy trình nhân giống in vitro được áp dụng cho rất nhiều đối tượng thực vật (khoảng 350 loài) Về nguyên tắc, quy trình nhân giống vô tính in vitro gồm 4 giai đoạn [26]

- Giai đoạn vào mẫu

- Giai đoạn nhân nhanh

- Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh

- Giai đoạn huấn luyện thích nghi

a Giai đoạn 1: Giai đoạn vào mẫu

Đây là giai đoạn khó khăn nhất có ý nghĩa quyết định tới toàn bộ quy trình nhân giống Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra các nguyên liệu thực vật

vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro [27]

Giai đoạn này phải đảm bảo được các yêu cầu sau:

- Tỷ lệ chết thấp

- Tỷ lệ sống cao

- Mô cấy sinh trưởng và phát triển tốt

Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh

từng mô thực vật mà lựa chọn nồng độ, thười gian xử lý và hóa chất thích hợp Đối với mẫu dễ bị hóa nâu khi nuôi cấy, có thể bổ sung vào môi trường than hoạt tính hoặc ngâm mẫu trước khi cấy vào hỗn hợp axit ascobic và axit citric nồng độ

25 - 150 mg/l

b Giai đoạn 2: Giai đoạn nhân nhanh

Giai đoạn nhân nhanh được xem là giai đoạn then chốt của cả quá trình nhân giống in vitro vì mục đích của giai đoạn này nhằm tạo ra hệ số nhân chồi in vitro cao nhất Giai đoạn này có thể kéo dài từ 10 - 36 tháng, nhưng không nên kéo dài quá vì mẫu cây chuyền nhiều lần dẫn đến hiện tượng biến dị xoma

Để tăng hệ số nhân chồi, phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng các chất điều tiết sinh trưởng: Auxin, Cytokinin, gibberelin, Các hợp chất tự nhiên kết hợp với yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp [27]

c Giai đoạn 3: Giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Môi trường nuôi cấy thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin vì đây là nhóm hormon thực vật có vai trò sinh lý là tạo rễ bất định cho cây nuôi cấy, trong

đó IAA, IBA, α-NAA, 2,4 D được sử dụng nhiều nhất Giai đoạn này thường kéo dài 2 - 8 tuần [27]

d Giai đoạn 4: Giai đoạn huấn luyện thích nghi

Đây là giai đoạn cuối cùng của nhân giống in vitro, nó quyết định khả năng ứng dụng của quá trình này vào thực tiễn sản xuất Thời gian tối thiểu cho quá trình là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây cần được chăm sóc, bảo vệ cẩn thận trước những bất lợi như: mất nước, nhiễm nấm, khuẩn Giai đoạn này cần

có giá thể chăm sóc phù hợp Yêu cầu của giai đoạn này là:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẫn nhất định về hình thái

- Phải tìm được giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp, đạt yêu cầu tơi xốp, thoáng mát

- Phải giữ ẩm cho cây, khi đưa cây ra ngoài vườn ươm cần phải che chắn giữ

ẩm và tránh ánh sáng quá mạnh Giai đoạn này cần đảm bảo độ ẩm đất từ 76 - 80 %

và độ ẩm không khí đạt 82 - 85 % [27]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là giống hoa Đồng Tiền kép (Gerbera

Jamesonii Bolus), hoa đỏ, trắng, vàng có nguồn gốc từ Trung Quốc được nhập

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Các giai đoạn: Khử trùng, vào mẫu, nhân nhanh, ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh được thực hiện tại phòng thí nghiệm NCM - TB thực vật Khoa Sinh học, Trường Đại Học Vinh

- Các nghiên cứu trong giai đoạn huấn luyện thích nghi của cây in vitro với điều kiện môi trường bình thường được tiến hành tại vườn thực nghiệm Khoa Sinh học, Trường Đại Học Vinh

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được nghiên cứu từ tháng 2 - 2010 đến tháng 11 - 2010

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu với các nội dung sau:

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý hóa chất khử

Thí nghiệm gồm 4 công thức:

+ CT4: HgCl2 0,1% (20 phút)

- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ KI đến quá trình phát

sinh chồi hoa Đồng Tiền (giai đoạn nhân nhanh)

(Môi trường nền: MS + 8 g/l Agar + 20 g/l saccaroza + 10% nước dừa)

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng quá

trình phát sinh rễ hoa Đồng Tiền (giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh)

Thí nghiệm gồm 5 công thức:

+ CT1: môi trường nền + 0 ppm IAA (Đối chứng)

+ CT2: môi trường nền + 2,5 ppm IAA

+ CT3: môi trường nền + 5 ppm IAA

+ CT4: môi trường nền + 10 ppm IAA

+ CT5: môi trường nền + 15 ppm IAA

(Môi trường nền: MS + 8 g/l Agar + 20 g/l saccaroza + 10% nước dừa + 0,5 g/l than hoạt tính)

- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và khả năng

sinh trưởng của cây hoa Đồng Tiền in vitro ở giai đoạn vườn ươm (giai đoạn huấn luyện thích nghi)

Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức sau:

+ CT1: Cát

+ CT2: Đất thịt

+ CT3: Trấu hun

+ CT4: Cát + Đất thịt + Trấu hun (tỷ lệ 1: 1: 1)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Các thí nghiệm ngoài vườn ươm

+ Ra cây vườn ươm: Mỗi công thức theo dõi từ 10 - 20 cây

+ Trồng thử nghiệm: Mỗi ô theo dõi từ 10 - 20 cây

2.3.2 Điều kiện thí nghiệm

- Ở trong phòng: Điều kiện nuôi cấy là:

+ Độ ẩm: 60 - 70%

+ Ánh sáng: 2.000 – 2.500 lux

+ Thời gian chiếu sáng là: 12h/ngày

- Ở ngoài vườn ươm: Điều kiện huấn luyện:

+ Độ ẩm không khí 80 - 85%

+ Độ ẩm giá thể 65 - 80%

C

2.3.3 Vật liệu khởi đầu

Vật liệu khởi đầu cho quá trình nghiên cứu là đỉnh sinh trưởng của cây hoa Đồng Tiền được trồng trong vườn thực nghiệm Các cây được sử dụng để làm mẫu phải khỏe mạnh, phát triển tốt, không mang mầm bệnh

2.3.4 Giai đoạn vào mẫu

Mẫu hoa Đồng Tiền được lấy vào thời điểm râm mát, khô ráo (trước đó ít nhất 3 ngày không mưa, không tưới nước) để hạn chế sự nhiễm khuẩn Các đỉnh sinh trưởng được cắt đem vào phòng thí nghiệm và được làm sạch sơ bộ bằng chất tẩy rửa (xà phòng, nước rửa chén), rửa sạch bằng nước cất vô trùng sau đó

xử lý theo các bước sau: