Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định đột biến điểm trên gen của muỗi culex quinquefasciatus kháng hóa chất diệt tại hà nội

Một số loài côn trùng cũng tạo ra những lớp kitin dày hơn hoặc làm biến đổi cấu trúc nhằmlàm giảm quá trình xâm nhập của hoá chất gặp ở loài ruồi ngựa [25, 31] Theo WHO, năm 2006 có hơn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban giám hiệu Viện Đại Học Mở

Hà Nội cùng quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình dạy

dỗ và tạo điều kiện học tập tốt nhất cho tôi trong suốt 4 năm vừa qua

Để hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâusắc đến TS.Phạm Thị Khoa - Trưởng Khoa Hóa Thực Nghiệm, Viện Sốt rét -

Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo vàhướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh Học Phân Tử - Viện Sốt rét - Kýsinh trùng - Côn trùng Trung Ương cùng các bạn sinh viên trong nhóm thựctập đã góp ý và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đãluôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôihọc tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Hà Nội , ngày 18 tháng 05 năm 2010 Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hà

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về bệnh giun chỉ bạch huyết (LF_Lymphatic filarias3 1.1.1.Bệnh giun chỉ bạch huyết 3

1.1.2.Sự truyền bệnh 3

1.1.3.Các triệu chứng nhiễm bệnh 4

1.1.4.Tình hình bệnh giun chỉ bạch huyết trên thế giới 5

1.1.5.Tình hình bệnh giun chỉ bạch huyết tại Việt Nam 5

1.1.6.Vector truyền bệnh giun chỉ bạch huyết 6

1.2.Các hóa chất diệt muỗi 8

1.3.Các cơ chế kháng hóa chất diệt ở muỗi 11

1.3.1.Kháng trao đổi chất 11

1.3.2.Kháng đột biến gen

12 1.4.Các phương pháp đã và đang được áp dụng trong nghiên cứu phát hiện tính kháng hóa chất ở muỗi 16

1.4.1.Phương pháp thử sinh học xác định độ nhạy cảm của

WHO/CDS/CPC/MAL/98.12 16

1.4.2.Phương pháp hóa sinh 16

1.4.3.Phương pháp phân tử xác định tính kháng hóa chất diệt côn trùng 21

1.5.Chiến lược kiểm soát tình trạng kháng hóa chất diệt côn trùng

24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu 26

2.2.Vị trí phân loại

26 2.3.Thời gian nghiên cứu 26

2.4.Địa điểm nghiên cứu 26

2.5.Phương pháp nghiên cứu 26

2.5.1.Phương pháp thu mẫu vật 26

2.5.2.Phương pháp định loại bằng hình thái dựa theo tác giả: Chester J.Stojanovish và Harold George Scott, 1966 27

2.5.3.Phương pháp thử sinh học xác định độ nhạy cảm của WHO/CDS/CPC/MAL/98.12 27

2.5.4.Phương pháp tách chiết DNA bằng Chelex 100 28

2.5.5.Kỹ thuật PCR 29

2.5.5.1.Các thành phần trong PCR 29

2.5.5.2.Tiến hành PCR 30

2.5.6.Kỹ thuật điện di 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Kết quả định loại đặc điểm hình thái 33

3.2.Kết quả phương pháp thử nghiệm sinh học xác định độ nhạy cảm theo WHO/CDS/CPC/MAL /98.12 35

3.3.Kết quả xác định đột biến kháng bằng kỹ thuật PCR 40

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận 43

4.2.Kiến nghị 43

Phụ Lục 49

Danh Mục Các Từ Viết Tắt

B timori: Brugia timori

OP: Organophosphate

AChE: Enzyme Acetylcholinesterase

ACh: Chất dẫn truyền thần kinh

(Acetylcholine)

ChAT: Enzyme Choline Acetyl-TrasferaseVg-Na+: Cổng điện thế kênh vận chuyển Na+ (Voltage-gated Sodium channel) MACE: Acetylcholinesterase biến đổi

(Modified Acetylcholinesterase) Kdr: Kháng ngã gục

(Knock-down resistance) GST: Enzyme Glutathione S-transferaseEST: Enzyme Esterase

ADN: Axit Deoxyribonucleic

ARN: Axit Ribonucleic

cDNA: ADN bổ sung (complementary

DNA)

TBE: Tris-Borate-EDTA

PCR: Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase

1) Trao đổi chất (tăng tiết enzyme liên quan đến khả năng giải độc của côn trùngnhư esterase, monooxygenase, glutathione-S-transferases)

2) Kháng tại vị trí đích (gồm có đột biến trên gen kdr và sự biến đổi enzyme acetylcholinesterase)

Thêm vào đó, nhiều hoá chất diệt côn trùng như là DDT và permethrincũng ảnh hưởng làm thay đổi tập tính côn trùng- ví dụ, bằng cách giảm tỷ lệmuỗi vào trong nhà, tăng tỷ lệ muỗi ngoài nhà đó là những sự thay đổi trong

những thời gian hoạt động (Mathenge và cộng sự, 2001) Một số loài côn

trùng cũng tạo ra những lớp kitin dày hơn hoặc làm biến đổi cấu trúc nhằmlàm giảm quá trình xâm nhập của hoá chất gặp ở loài ruồi ngựa [25, 31]

Theo WHO, năm 2006 có hơn 500 loài muỗi đã kháng với các loại hóa chấtdiệt côn trùng, trong đó có hơn 50% là các loại muỗi truyền sốt rét, sốt xuấthuyết Dengue, truyền bệnh giun chỉ Người ta đã chứng minh sự kháng chéo

DDT với nhóm Pyrethroid Anopheles gambiae ở châu phi đã kháng với permethrin, deltamethrin, lambda - cyhalothrin Anopheles sacharovi kháng với

DDT propoxur, bendiocarb, permethrin và lambda - cyhalothrin ở Thổ Nhỉ Kỳ

(WHO 2006) Loài muỗi truyền giun chỉ Culex quinquefasciatus được liệt vào

danh sách những loài muỗi đa kháng Một số bệnh tật từ xưa nay có thể quay trởlại do môi trường ô nhiễm và muỗi kháng hóa chất (WHO, 2006) [25]

Ở Việt Nam từ năm 1975 người ta đã phát hiện tính kháng với hóa chất diệt

côn trùng của loài muỗi truyền bệnh giun chỉ Culex quinquefasciatus, loài muỗi truyền bênh sốt Dengue/SXH Dengue Aedes aegypti, một số loài muỗi ruyền bệnh sốt rét ven biển Nam Bộ như Anopheles epiroticus, Anopheles sinensis,

Anopheles vagus, [7]

Phun hóa chất diệt là biện pháp quan trọng để giảm mật độ muỗi Đặc biệt làkhi dịch bệnh do muỗi truyền đang có nguy cơ gia tăng người ta phải tăng liềulượng, thay đổi chủng loại hoặc kết hợp các loại hóa chất diệt Việc sử dụng hóa

chất diệt không chọn lọc với quần thể muỗi làm thay đổi cấu trúc di truyền củaquần thể muỗi đó

Có thể giám sát sự kháng hóa chất diệt ở các loài muỗi truyền bệnh bằngphương pháp thử sinh học, ứng dụng phương pháp điện di enzyme esterase - mộttrong những enzyme liên quan đến khả năng giải độc của muỗi với các hóa chấtdiệt và kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với các cặp mồi đặc hiệu giúptìm ra những đột biến trên gen của một số loài muỗi Từ đó đề ra các chiến lượcphòng chống các bệnh do muỗi truyền, lựa chọn các biện pháp thích hợp để tránhlãng phí, ô nhiễm môi trường và nguy hại đến hệ sinh thái đang là biện pháp cấpthiết hiện nay

Chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định đột biến điểm

trên gen của muỗi Culex quinquefasciatus kháng hóa chất diệt tại Hà Nội”

Với mục tiêu:

1 Xác định thực trạng mức độ nhạy, kháng của muỗi truyền bệnh giun chỉ

Culex quinquefasciatus tại Hà Nội bằng phương pháp thử sinh học theo WHO/

CDS/CPC/MAL/ 98.12

2 Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện đột biến trên gen mã hóa protein xuyên

màng của kênh vận chuyển ion Na+ liên quan đến tính kháng hóa chất nhóm Pyrethroid, DDT, Photpho hữu cơ đã và đang sử dụng tại Việt Nam với loài

muỗi Culex quinquefasciatus

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về bệnh giun chỉ bạch huyết

1.1.1 Bệnh giun chỉ bạch huyết (LF_Lymphatic filariasis)

Bệnh GCBH là 1 bệnh do ký sinh trùng gây ra xảy ra phổ biến ở các nướcnhiệt đới và cận nhiệt đới Bệnh do ký sinh trùng truyền giun chỉ là

Wuchereria bancrofti và Brugia malayi, Brugia timori có hình dạng giống sợi

chỉ sống chủ yếu trong cơ [4]

Bệnh giun chỉ Bancrofti, do loài giun chỉ W bancrofti gây nên Bệnh này

do muỗi Culex quinquefasciatus, và 1 số loài muỗi Anopheles, Aedes truyền

qua vết đốt Năm 1996 ước tính có đến 107 triệu người mắc, tại nhiều vùng ởTrung Quốc, Ấn Độ, các đảo ở Thái Bình Dương, châu Phi, Trung và Nam

Mỹ, Đông Nam Á bao gồm cả Việt Nam [4]

Bệnh giun chỉ Brugia do Brugia malayi và Brugia timori gây nên Năm

1996 ước tính có tới 13 triệu người mắc, chủ yếu ở các nước vùng Đông Nam

Á Muỗi truyền bệnh là các loài thuộc giống Mansonia B timori có mặt ở các đảo Flores, Timor, miền đông Java và do muỗi loài Anopheles barbirostris

truyền [4]

1.1.2 Sự truyền bệnh

Giun chỉ trưởng thành sống trong các mạch bạch huyết của cơ thể, sinh racác ấu trùng, chúng di chuyển trong mạch máu và vào cơ thể muỗi khi muỗiđốt người bệnh Ấu trùng khi phát triển trong cơ thể muỗi nhiều ngày tùy loài,chúng sang người lành khi muỗi nhiễm hút máu, chúng di chuyển đến cáchạch bạch huyết và phát triển thành giun chỉ trưởng thành Khả năng mắcbệnh do 1 lần bị muỗi đốt là rất thấp Giun chỉ trưởng thành có thể sống nhiềunăm sinh ra 1 lượng lớn ấu trùng trong máu [4]

Giun chỉ Bancrofti có 2 thể: Ở thể phổ biến nhất, ấu trùng giun chỉ dichuyển trong máu về đêm, trong khi ở thể thứ 2, ấu trùng có mặt liên tục trong

máu nhưng số lượng lại tăng lên vào ban ngày Muỗi Cx quinquefasciatus là vector chính truyền bệnh và một số loài Anopheles (đốt mồi về đêm) Thể thứ

2 được thấy ở Nam Thái Bình Dương và một số vùng nông thôn ở Đông Nam

Á nơi mà loài truyền bệnh chính là các loài muỗi đốt

Bệnh giun chỉ Brugia, do loài B malayi gây ra, cũng có hai thể, trong đó

phổ biến nhất được truyền về đêm, và thể kia, được truyền cả đêm lẫn ngày.Thể thứ nhất xảy ra tại các vùng trồng lúa ở châu Á Thể này do các loài

Anopheles đốt mồi ban đêm, và các loài Mansonia đẻ trứng tại các vùng đầm

lầy ở Indonesia và Malaysia có thể nhiễm sang người ở gần đó [4]

Hình 1 Chu kỳ sinh học của bệnh giun chỉ

( www.impe-qn.org.vn)

1.1.3 Các triệu chứng nhiễm bệnh (PGS.TS Cao Văn Viên - ThS Nguyễn Văn Dũng Khoa Truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai)

Thời kỳ nhiễm bệnh thường được chia làm 3 giai đoạn

Thời kỳ ủ bệnh: Bệnh nhân không có bất kỳ triệu chứng gì nhưng xét

nghiệm ngẫu nhiên thấy có ấu trùng giun chỉ trong máu ngoại vi.thời gian ủbệnh có thể kéo dài từ 4-7 năm ,thường bệnh nhân có các biểu hiên như ngứangoài da ,sốt nhẹ,bạch cầu ái toan trong máu tăng cao, mệt mỏi Thời kỳ này

có khả năng lây bệnh cao [23]

Thời kỳ khởi phát: Bệnh nhân xuất hiện các đợt viêm hạch bạch huyết

kèm theo sốt, diễn biến như các bệnh nhiễm trùng Các đợt viêm hạch bạchhuyết ngày càng tăng, có thể thấy hoặc sờ thấy hạch vùng nách, bẹn hoặc các

bạch mạch nổi cứng Đối với loài W bancrofti hay xuất hiện hiện tượng đái ra

dưỡng chấp, có khi có máu và dưỡng chấp Bệnh nhân gầy sút nhanh Nhữngđợt phát bệnh tự hết và xuất hiện dần hiện tượng phù chân voi Phù chân voi

thường xuất hiện ở chi dưới, bộ phận sinh dục W bancrofti hay gây hiện tượng phù ở bộ máy sinh dục còn đối với B malayi hay gây hiện tượng phù

voi ở chi Thời kỳ này kéo dài nhiều năm Trong thời kỳ này nếu xét nghiệmmáu ngoại vi có thể tìm thấy ấu trùng giun chỉ [23]

Thời kỳ tiềm tàng: Ở thời kỳ này, bệnh nhân không thấy xuất hiện các đợt

viêm bạch mạch cấp tính, nhưng các hạch bạch huyết có thể to lên thườngxuyên Quan trọng nhất thời kỳ này là xuất hiện phù voi Các đợt phù voi liêntiếp, da dày dần, ở chân có thể thấy phù từ dưới lên trên Thường bệnh nhânphù một chân hoặc 1 tay, ít trường hợp phù cả 2 chân Bộ máy sinh dục nam,

nữ cũng có hiện tượng phù to, không đỏ, không đau Trong thời kỳ này rất ítkhi tìm thấy ấu trùng giun chỉ trong máu ngoại vi.[23]

1.1.4 Tình hình bệnh giun chỉ bạch huyết trên thế giới

Bệnh giun chỉ bạch huyết được biết ảnh hưởng lên người cách nay khoảng

4000 năm Các tài liệu mô tả về triệu chứng bệnh đầu tiên là thế kỷ 16, khi JanHuyghen van Linschoten viết về bệnh trong suốt quá trình tìm ra Goa Những

nổ lực từ Chương trình toàn cầu loại trừ bệnh giun chỉ (Global Programme to

Eliminate LF) được đánh giá là đã phòng ngừa được 6.6 triệu ca mắc mới từ

các trẻ em và làm dừng diễn tiến bệnh trên 9.5 triệu người khác nhiễm chúng.Tiến sĩ Mwele Malecela-chủ tịch chương trình cho biết chúng ta vẫn còn đốimặt và cần nổ lực nhiều hơn để tiến đến mục tiêu loại trừ giun chỉ vào năm2020.Hiện nay, hơn 1 tỉ người ở trên 80 quốc gia trên khắp thế giới đang sốngtrong vùng lưu hành của bệnh giun chỉ bạch huyết Hàng năm, có hơn 120triệu người mắc phải căn bệnh này và đã có 40 triệu người trong tình trạng tànphế với nhiều bộ phận cơ thể bị biến dạng [4]

1.1.5 Tình hình bệnh giun chỉ bạch huyết tai Việt Nam

Bệnh rất phổ biến ở các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới, trên thế giới cókhoảng 120 triệu người ở 73 quốc gia nhiễm bệnh và 1,1 tỷ người ( khoảng

20% dân số thế giới) sống trong vùng có bệnh lưu hành.Tại Việt Nam, theo sốliệu điều tra trước năm 2000, bệnh giun chỉ phân bố chủ yếu ở các vùng đồngbằng châu thổ sông Hồng như tỉnh Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, HàNam, Nam Định với tỷ lệ nhiễm chung là 2,01% Kết quả điều tra năm 2000-

2005 trên toàn quốc cho biết bệnh giun chỉ bạch huyết phân bố tại ít nhất 12huyện thuộc 7 tỉnh Hà Nam, Hưng Yên, Thái Bình, Hòa Bình, Quảng Bình,Khánh Hòa, Ninh Thuận với tỷ lệ nhiễm từ 0.3%-13% và bệnh có tính chấtkhu trú rõ rệt (Đặng Thị Cẩm Thạch và cs., 2007) [37]

Trong những năm qua, bệnh giảm do công tác điều trị toàn dân tại cáchuyện trọng điểm có bệnh giun chỉ bạch huyết Ngoài ra, tại một số tỉnh đồngbằng miền bắc, tỷ lệ nhiễm giun chỉ giảm nhiều có thể do điều kiện kinh tếđược nâng cao và điều kiện vệ sinh môi trường được cải thiện và có sự thayđổi về nhận thức và một số tập quán sinh hoạt Bệnh thường xảy ra ở ngườitrong độ tuổi lao động 20-50 tuổi

Một số loài muỗi có khả năng truyền bệnh giun chỉ bạch huyết như : Cx.

quinquefasciatus, Culex pipens, Anopheles sinensis v.v.[37]

1.1.6 Vector truyền bệnh giun chỉ bạch huyết

Giống muỗi Culex có 550 loài đã được mô tả, đa số tồn tại ở các nước

nhiệt đới và cận nhiệt đới.Muỗi Culex quinquefasciatus là vector truyền bệnh

giun chỉ bạch huyết và chỉ có muỗi cái hút máu người để đẻ trứng [4]

Hình thái: Muỗi Cx quinquefasciatus cái màu nâu có kích thước trung

bình đến lớn, vòi màu đen có những vảy màu xám ở dưới, ở giữa lưng cónhững vảy hẹp màu vàng đồng, cánh có vảy đen, đùi ở chân sau hầu hết màuxám, phần còn lại của chân có những vảy màu đen trừ phần nối giữa xươngchày và xương bàn chân có màu xám, phần bụng có những vảy màu đen xen

kẽ những dải nền hẹp màu xám ở bên, mảnh ức có những vảy màu xám [36]

Hình 2 Muỗi Culex quinquefasciatus

( www.arbovirus.health.nsw.gov.au )

Vòng đời: Như các loại muỗi khác sự phát triển của Cx quinquefasciatus

có các giai đoạn Trứng -> Bọ gậy -> Loăng quăng -> Muỗi trưởng thành.Muỗi cái đẻ trứng thành từng bè 100 trứng hoặc hơn trên mặt nước Bè trứng

nổi cho đến khi nở, khoảng 2-3 ngày sau Cx quinquefasciatus thường đẻ ở

nơi nước bẩn chứa nhiều chất hữu cơ [4]

Hình 3 Vòng đời của muỗi

(www nimpe.vn)

Tập tính: Cx quinquefasciatus là loài sống gần người Muỗi cái đốt người

và gia súc suốt đêm, cả trong nhà, ngoài nhà Ban ngày, muỗi không hoạtđộng thường tìm nghỉ ở các góc tối trong phòng, chỗ kín, vòm cống rãnh.Chúng cũng đậu ngoài nhà trên các hốc cây trong rừng [4]

Để phòng chống bệnh giun chỉ có 2 biện pháp chủ yếu

1.Điều trị bệnh nhân

2.Giảm mật độ vector truyền bệnh

Biện pháp phòng chống vector truyền bệnh chủ yếu bằng phun hóa chất diệt

1.2 Các hóa chất diệt muỗi [4, 27]

Theo Jan A.Rozendall (1998), các hoá chất diệt muỗi gồm 4 nhóm chính

NhómChlo hữu cơ (Oganochlorines): DDT, lindane

Nhóm Photpho hữu cơ (Oganophosphate): malathion,

fenitrothion,chlorpyrifos-methyl,pyrimifos-methyl…

NhómCarbamate: propoxur, bendiocarb…

Nhóm Pyrethroids tổng hợp: permethrin, cypermethrin, deltamethrin,

lambda-cyhalothrin, bifenthrin v.v

Bảng 1: Các hóa chất diệt muỗi đã được sử dụng

trong chương trình phòng chống sốt rét thế giới

(Nguồn: Public health journal 18/2006)

Việc sử dụng hóa chất để phòng chống véc tơ ở Việt Nam đã có nhiều

thành tựu đáng kể, nhất là đối với muỗi Anopheles [3, 5, 8, 10, 12]; Vũ Đức

Hương, Nguyễn Thị Bạch Ngọc và ctv, 2006 [22]; Nguyễn Văn Quyết, 2006

Các hóa chất thuộc nhóm Pyrethroids tổng hợp (permethrin,

lambda-cyhalothrin, alpha-cypermethrin v.v ) đã và đang được sử dụng rộng rãi từnăm 1993 đến nay, thay thế cho DDT đã dùng trước đây DDT ít được sử

dụng do nó tồn lưu trong mỡ của các loài động vật vì vậy gây tác hại cho conngười [1, 14, 33]

Pyrethroids là dẫn xuất của este cacboxylat (còn gọi là este pyrethrum hoặc

este pyrethrin) có nguồn gốc tự nhiên từ cây hoa cúc họ Chrysanthemum

cinerariefolium và Chrysanthemum roseum, chứa nhiều hoạt chất pyrethrin có

độc tính cao đối với côn trùng nhưng có độc tính thấp với động vật máu nóng

Đặc tính chung của nhóm Pyrethroid là:

Có tác dụng chọn lọc cao, diệt được các loại côn trùng kháng clo hữu cơ,photpho hữu cơ và carbamat

Hoà tan nhanh trong lipit và lipoprotein nên có tác dụng tiếp xúc mạnh,hóa chất diệt gây hiện tượng choáng độc nhanh và có tác dụng xua một số loạicôn trùng

Độ độc cấp tính đối với con người và động vật máu nóng thấp hơn nhiều

so với hợp chất photpho hữu cơ, nhanh chóng phân huỷ trong cơ thể sống vàtrong môi trường, nhưng rất độc với cá và động vật thuỷ sinh khác [33]

Alpha-cypermethrin thuộc nhóm độc loại II, liều độc LD50 tuỳ thuộc vào

tỷ lệ đồng phân cis/trans, đối với chuột LD50=79-400mg/kg qua đườngmiệng, có tác dụng độc tiếp xúc, ức chế thần kinh trung ương và ngoại vi vớiliều rất nhỏ, có phổ diệt rộng với côn trùng miệng nhai và chích hút Ngoài tácdụng diệt muỗi, ruồi Alpha-cypermethrin còn tác dụng diệt trừ ve, bọ chét,chấy rận cho vật nuôi, trừ được nhiều sâu và nhện hại, đặc biệt là côn trùngthuộc bộ cánh vẩy [33]

Deltamethrin

Deltamethrin có tên thương phẩm là Decis, Decamethrin, Cislin, Othrin, có công thức phân tử là C22H19Br2NO3, khối lượng phân tử 505,2 đvC

K-Deltamethrin được sản xuất dưới dạng K-Othrin 2,5SC, 2,5WP, 2,5EC, có tácdụng diệt theo đường tiếp xúc và tiêu hoá, liều gây độc với chuột làLD50=139mg/kg (trong dung dịch dầu) và >5000mg/kg (trong dịch treo), đốivới thỏ LD50=2940mg/kg và diệt được nhiều côn trùng y học gây hại như ve,

bọ chét, chấy rận hại vật nuôi

Deltamethrin có tính độc cao đối với côn trùng và một số động vật máulạnh, nhưng có tính độc thấp với động vật máu nóng và có hệ số sử dụng antoàn cao [33]

Permethrin

Permethrin có tên thương phẩm là Permit, Ambush, Coopex, Agniban,Imperator, Outflank, có công thức phân tử là C21H20Cl2O3, khối lượng phân tử391,3 đvC

Permethrin có 4 cặp đồng phân quang học, gồm hai cặp đồng phân cis vàhai cặp đồng phân trans, tỷ lệ đồng phân cis: trans là 25:75 đến 50:50 [33]

Lambda-cyhalothrin

Lambda-cyhalothrin có tên thương phẩm là Karate, PP321, ICON, có côngthức phân tử C23H19ClF3NO3, khối lượng phân tử 449,9 đvC, phân tử này có 4đồng phân quang học trong đó có hai cặp đồng phân dạng cis:trans

Lambda-cyhalothrin được sản xuất dưới dạng huyền phù (CS), dạng bột dễtan trong nước (WP), dạng nhũ dầu (EC)

Lambda-cyhalothrin thuộc nhóm độc loại II, có tác dụng diệt tiếp xúc [33]

Etofenprox

Etofenprox có tên thương phẩm là Vectron, Trebon, có công thức phân tử

-C25H46O3 Chất này có tác dụng diệt côn trùng qua đường tiếp xúc, phổ diệtcôn trùng rộng, độ độc với động vật máu nóng rất thấp [33]

1.3 Các cơ chế kháng hóa chất diệt ở muỗi

Kháng hóa chất diệt ở muỗi xảy ra khi quần thể côn trùng vẫn còn sống sótsau một thời gian dài tiếp xúc với hóa chất diệt ở các liều lượng thông dụng

Năm 1986, Brown A xác định có khoảng 109 loài muỗi đã kháng với 1,2hoặc cả 4 nhóm hóa chất diệt côn trùng [27]

Tính kháng hóa chất diệt côn trùng là một đặc trưng được thừa hưởng liênquan đến những thay đổi ở một hay nhiều gene của côn trùng Do ý thức sửdụng hoá chất của người dân, liều lượng sử dụng hoá chất v.v vô hình chungchúng ta đã tạo ra một áp lực chọn lọc mạnh mẽ cho những quần thể muỗi vànhiều loài đã phát triển những cơ chế kháng chống lại hoá chất diệt muỗi.Ngày nay nhiều loài muỗi truyền bệnh kháng với DDT và rất nhiều loàikháng với các hóa chất hiện đang sử dụng trong phòng chống, nhất là các loài

muỗi truyền sốt rét Anopheles epiroticus, muỗi truyền sốt dengue/sốt xuất huyết dengue Ae aegypti, muỗi truyền bệnh giun chỉ bạch huyết Cx.

quinquefasciatus…[10, 14, 27]

Các cơ chế kháng khác nhau làm côn trùng không bị diệt bởi các loại hóachất, hầu hết những cơ chế kháng có thể được chia thành hai nhóm chính [24,31]

1 Cơ chế trao đổi chất: Tăng enzym liên quan tới khả năng giải độc của côn trùng

2 Cơ chế kháng đột biến gen: Những đột biến ở những gen quy định protein ở vị trí đích

Thêm vào đó, nhiều hoá chất diệt côn trùng như là DDT và permethrincũng ảnh hưởng làm thay đổi tập tính côn trùng- ví dụ, bằng cách giảm tỷ lệmuỗi vào trong nhà, tăng tỷ lệ muỗi ngoài nhà đó là những sự thay đổi trong

những thời gian hoạt động (Mathenge và cộng sự, 2001) Một số loài côn

trùng cũng tạo ra những lớp kitin dày hơn hoặc làm biến đổi cấu trúc nhằmlàm giảm quá trình xâm nhập của hoá chất gặp ở loài ruồi ngựa [25]

1.3.1 Kháng trao đổi chất

Kháng trao đổi chất là cơ chế kháng phổ biến nhất xảy ra ở côn trùng Cơ sởcủa cơ chế này là tăng phiên mã của hệ thống enzyme Tất cả các enzyme liênquan đến tính kháng giúp côn trùng giải độc một cách tự nhiên Ba loạienzyme liên quan đến chức năng này là: esterase, monooxygenases và

glutathione-S-transferases Các enzyme thường tăng lên ở quần thể côn trùngkháng hóa chất diệt côn trùng diệt, nhiệm vụ của các enzyme này là chuyểnhoá hoặc làm suy giảm hóa chất diệt côn trùng diệt trước khi chúng có hiệulực như một chất độc với côn trùng Một trong cơ chế kháng trao đổi chấtthường gặp nhất là tăng hoạt tính của enzyme esterase, enzyme này được biết

là liên kết ester hydrolyse hoặc cô lập hóa chất diệt Gần như tất cả các quần

thể Cx quinquefasciatus đã kháng với nhóm hóa chất diệt organophosphate

(OP) được tìm thấy có chứa nhiều bản sao của gen mã hoá cho esterase

Ngược lại, các quần thể Anopheles kháng với malathion, trao đổi chất với

OP, malathion ở một tốc độ nhanh hơn nhiều so với tốc độ thông thường.Tương tự, mức độ kháng trao đổi chất có thể khác nhau từ thấp đến rất cao và

có thể khác giữa hợp chất này với hợp chất khác Cơ chế kháng trao đổi chấtgặp ở nhiều quần thể vector với tất cả các nhóm hóa chất diệt chính bao gồmorganophosphates, carbamates, Pyrethroids và DDT [24, 25, 31]

1.3.2 Kháng đột biến gen

Cơ chế kháng thứ hai quan trọng ở côn trùng là kháng đột biến gen Cáchoá chất diệt thường tác động vào một vị trí đích gây chết cho côn trùng,thông thường là trong hệ thống thần kinh (nhóm hóa chất diệt OP, carbamate,

và Pyrethroid) Kết quả tiếp xúc thường xuyên với một hay hai nhóm hóa chấtdiệt có cùng vị trí tác động, côn trùng xuất hiện đột biến một số vị trí Kết quả

là côn trùng không bị ảnh hưởng hoặc ít bị ảnh hưởng của hoá chất diệt hơncác côn trùng nhạy cảm [24, 25]

Hóa chất diệt côn trùng khi xâm nhập vào muỗi thường liên kết với các vịtrí nhất đinh, muỗi kháng hóa chất diệt do protein vị trí đích bị biến đổi làmcho hóa chất diệt không liên kết và nhanh chống bị các enzym cô lập và phânhủy Quần thể côn trùng đã kháng với một loại hóa chất diệt côn trùng thìcũng có thể kháng với một vài hóa chất diệt tương tự cùng nhóm, hoặc khángchéo với các hóa chất nhóm khác nhưng có cùng vị trí tác động [25]

Hình 4 Cơ chế tác động gây chết muỗi của 4 nhóm hóa chất diệt côn trùng

(Public health journal 18/2006)

Nhóm Photpho hữu cơ và Carbamat liên kết với enzyme AChE, nhómPyrethroid và DDT liên kết với cổng điện thế của kênh vận chuyển ion Na+

(WHO, 2006) Trong đó AchE: enzym Acetylcholinesterase, Ach chất dẫntruyền thần kinh Acetylcholin, ChAT là enzym vận chuyển Acetylcholin, vg-

Na+ là kênh vận chuyển ion Na+, MACE là enzyme Acetylcholin đã bị biếnđổi, kdr là kháng ngã quỵ

Theo đó DDT và Pyrethroid đều có cùng đích tác động là kênh vận chuyểnion Na+, do đó đột biến trên gen kdr làm cho muỗi kháng đồng thời với cả hainhóm hóa chất này Hóa chất thuộc nhóm Photpho hữu cơ và Carbamat cóđích tác động là enzyme AchE, đột biến trên gen qui định protein ở AchE làmcho hóa chất diệt không liên kết được với đích tác động của chúng [25] AchEđóng một vai trò then chốt trong hệ thống thần kinh để kết thúc sự phát sinhxung thần kinh bằng cách AchE thủy phân chất dẫn thần kinh acetylcholinthành cholin và axit acetic Các hóa chất diệt côn trùng đã ức chế hoạt độngcủa AchE bằng cách photphoryl hóa hoặc carbamyl hóa gốc serin, là trung

tâm hoạt động của enzyme này Nghiên cứu ở nhiều loài muỗi như Culex

pipens, Cx quinquefasciatus, Culex tritaeniorhynchus [32]

Ae aegypti đã kháng hóa chất diệt ở đại đa số địa phương trên thế giới Ở

Việt Nam, loài này đã kháng DDT từ năm 1960, kháng chéo với nhiều hóachất diệt côn trùng thuộc nhóm Pyrethroid và temephos ở một số nước, một sốnơi còn nhạy cảm với malathion [21]

DDT được phát minh vào năm 1940 và được sử dụng như là một trongnhững hóa chất diệt côn trùng có hiệu quả đầu tiên trên thế giới.Kháng DDT ởcôn trùng được bắt đầu biết đến vào những năm 1960

C.Brengues và cộng sự (2003) cũng đã chứng minh tính kháng DDT rộng rãi

của Ae aegypti ở 13 địa điểm nghiên cứu thuộc nhiều nước khác nhau từ năm

1995 – 1998: Ở Brazil, French Guiana, French Polynesia, Indonesia, IvoryCoast, Martinique, Thái Lan và Việt Nam [26]

Ở Việt Nam, muỗi Ae aegypti ở Nam Bộ và Tây Nguyên đã kháng với

DDT và một số hóa chất diệt côn trùng thuộc nhóm Pyrethroid có thể dochúng đã được sử dụng nhiều năm trong chương trình phòng chống côn trùngtruyền bệnh [20]

Việc sử dụng malathion trong chương trình phòng chống muỗi Ae aegypti

ở Mỹ La tinh, người ta thấy hiện tượng kháng hóa chất diệt này ở loài muỗi

truyền giun chỉ Cx quinquefasciatus nhưng chưa thấy kháng ở loài muỗi truyền SD/SXHD Ae aegypti

Phân tích độ nhạy kháng chỉ ra rằng, tất cả các dòng Ae aegypti nghiên

cứu ở Cu ba, Venezuela, Costa Rica và Jamaica vẫn nhạy với malathion Tỷ lệkháng (RRs) có giá trị thấp

Bảng 2 Những cơ chế kháng chính ở muỗi (WHO, 2006)

(Public health journal 18/2006)

Hóa chất

Kháng trao đổi chất

S-TransferasePyrethroid

DDT

Carbamates

Organophosphates

(Các enzyme khử độc có vai trò trong sự kháng hóa chất diệt là: esterase,

monooxygenase, glutathione S-transferase (vòng tròn xanh lam) 2 cơ chế tác

động chính liên quan: kdr (kháng ngã gục), 1 đột biến ở cổng điện thế của

kênh vận chuyển Na (vòng tròn màu hồng), và MACE (biến đổi

acetylcholinesterase) (vòng tròn màu xanh lá cây) Tầm quan trọng của mỗi

cơ chế kháng được biểu hiện bằng độ lớn của vòng tròn)

Ở Việt Nam, năm 2000 – 2002, nghiên cứu tại 22 địa điểm thuộc 11 tỉnh

thành, Vũ Đức Hương và cộng sự đã kết luận: Muỗi Ae aegypti còn nhạy cảm

với malathion và kháng với DDT ở hầu hết các địa điểm nghiên cứu [20, 21]

Kháng hóa chất thuộc nhóm Pyrethroid của Ae aegypti còn được ghi nhận

đồng thời với tính kháng DDT ở nhiều địa điểm khác nhau trên thế giới [26]

Năm 1998 – 1999, nghiên cứu về độ nhạy kháng với hóa chất diệt của Ae.

aegypti đã được tiến hành ở 3 tỉnh thuộc Nam Bộ và 8 tỉnh thuộc cao nguyên

Trung Bộ Kết quả cho thấy Ae aegypti còn nhạy với malathion; kháng với

DDT và 3 hóa chất thuộc nhóm Pyrethroid (permethrin, deltamethrin, lambda

- cyhalothrin) [34]

1.4 Các phương pháp đã và đang được áp dụng trong nghiên cứu phát

hiện tính kháng hoá chất diệt ở muỗi

1.4.1 Phương pháp thử sinh học của WHO/CDS/CPC/MAL/98.12

Đây là các thử nghiệm được sử dụng rộng rãi nhất ở thực địa Người ta chorằng côn trùng tiếp xúc với giấy thấm tẩm hóa chất diệt côn trùng có côngthức pha chế hòa tan trong dầu Liều lượng được điều chỉnh tới mức cao hơn

gấp hai lần xo với liều giết chết 100% muỗi cái Anopheles trưởng thành không

hút máu 3 ngày tuổi và là các quần thể nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng

đã biết ở trong phòng thí nghiệm liều sử dụng là liều mà các cá thể muỗi nhạycảm không có khả năng sống sót, theo WHO chỉ khi nào 5% số muỗi sống saukhi tiếp xúc với liều sử dụng thì mới coi là phát sinh tình trạng kháng với hóachất diệt côn trùng Bởi vậy theo phương pháp trên thì mức độ kháng củamuỗi phải rất cao thì mới bị phát hiện

Hiện nay WHO đã công bố một danh sách các liều chẩn đoán cần thiết vớicác hóa chất diệt côn trùng khác nhau để phát hiện tình trạng kháng hóa chấtdiệt côn trùng của một số loài véc tơ truyền bệnh Hầu hết các báo cáo về tình

trạng kháng hóa chất diệt côn trùng của muỗi Anopheles thuộc châu phi và muỗi Aedes trên toàn thế giới đều dựa vào các kết quả thu được khi sử dụng

phương pháp nói trên của WHO

1.4.2 Phương pháp hóa sinh

Phương pháp hóa sinh kiểm tra sự biểu hiện quá mức của các enzyme khửđộc liên quan đến cơ chế kháng trao đổi chất, các enzym này gồm: esterase,P450, GST

Phương pháp điện di enzym

Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống đều do cácprotein đặc biệt xúc tác, các protein này gọi là các enzyme Enzyme có trongmọi tế bào sống, vì vậy, protein enzym được gọi là chất xúc tác sinh học Mỗimột hệ enzyme có thể do một hoặc một số locut gen xác định và được gọi là

isozyme Isozyme(isoenzyme)được xácđịnh là những dạng đa phân tử

củaenzyme, xuất hiện trong cùng loài của một sinh vật (Yong H.S và MarkJ.W, 1985

Thuật ngữ isozyme được dùng để chỉ biến dạng của một enzym bao gồmcác tiểu đơn vị và được mã hóa bởi hai hay nhiều gen cấu trúc tổng hợp hệenzyme đó [6]

Trong nghiên cứu hệ isozyme, người ta dùng phương pháp điện di enzyme

để phát hiện ra những biến đổi cấu trúc của các locut protein enzyme Nhữngbiến đổi này được ứng dụng trong nghiên cứu bản đồ gen, phân loại hoặctrong nghiên cứu tiến hóa.[6]

Việc nghiên cứu hệ enzyme (isozyme) bằng phương pháp điện di đã đượcứng dụng rộng rãi trên các đối tượng thực vật, động vật và đặc biệt là ở côntrùng [15, 16, 17]

Trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu về hệ isozyme của muỗi nói

chung và Ae aegypti, Anopheles minimus nói riêng.

Maria Magdalena Rodriguez Coto và cộng sự đã nghiên cứu tính kháng

malathion ở Ae aegypti và Cx quinquefasciatus sau khi sử dụng hóa chất này trong chương trình phòng chống muỗi Ae aegypti Dựa trên các giá trị LC50

và LC90, các tác giả đã chỉ ra tỷ lệ kháng malathion thấp (< 2 lần) ở tất cả các

dòng Ae.aegypti nghiên cứu, cho thấy Ae aegypti vẫn còn nhạy với hóa chất này Tỷ lệ kháng của tất cả các dòng Cx quinquefasciatus ở mức độ cao (> 11 lần) Giá trị kháng cao nhất ở dòng Cx quinquefasciatus của Cu ba [32]

Năm 2000, Gladys Beatriz de Sousa và cộng sự nghiên cứu việc biến đổi di

truyền ở các quần thể Ae aegypti ở miền Trung Argentina và xác định khoảng

cách di truyền giữa chúng Các tác giả đã phân tích các tần số alen ở 11 locuttrong các mẫu muỗi của địa phương [29]

Hệ enzyme từ 13 quần thể Ae aegypti trên thế giới cũng được C.Brengues

và cộng sự (2003) nghiên cứu Kết quả cho thấy, so với hai dòng nhạy DDT

và pyrethroid (Bora và AEAE) thì ở tất cả các dòng, trừ Larentuka và Bouake,

bọ gậy tuổi 4 đều kháng permethrin Mười dòng được phân tích hóa sinh,trong đó nhiều dòng có Carboxylesterase có hoạt tính cao so với dòng nhạyBora Hoạt độ của monooxygennase tăng cao ở dòng Slatyga và Paea (French

Polynesia) nhưng giảm ở hai dòng Mae Kaza và Mae Kud (Thái Lan) và dòngLarentuka [26]

Hoạt tính của glutathione S – transferase cao ở dòng Guyane Sự kháng cảDDT và Pyrethroid ở dòng Semarang, Belem (Brazil) và Long Hoa (ViệtNam) gợi ý về sự xuất hiện của đột biến kháng gã gục ở gen (kdr) [26]

Ở Việt Nam, Trịnh Đình Đạt và cs (2006) đã xác định mức độ và đặc điểm di

truyền tính kháng hoá chất của mỗi truyền giun chỉ Cx quinquefasciatus.

Kháng malathion của các quần thể muỗi kháng và nhạy với hóa chất diệt cóliên quan tới tăng hoạt tính enzyme esterase tuỳ thuộc vào mức độ phun hóachất trừ sâu Phân tích kết quả con lai giữa dòng kháng và nhạy cảm cho thấy

tính kháng malathion của Cx quinquefasciatus là do các gen nửa trội quy định

[16]

Trịnh Đình Đạt và cs cũng đã nghiên cứu tính đa hình di truyền hệ isozyme

esterase của 3 loài muỗi truyền bệnh sốt rét: Anopheles minimus, Anopheles

epiroticus và Anopheles dirus Nghiên cứu cho thấy hệ isozym esterase của cả

3 loài muỗi trên đều có tính đa hình cao Trong đó, hệ isozyme esterase của

loài muỗi Anopheles minimus và Anopheles dirus do 6 locut gen trong đó ít nhất có 4 locut gen có 2 alen quy định Hệ isozym esterase của Anopheles

epiroticus do 4 locut trong đó có 3 locut đa hình do 2 hoặc 3 loại alen quy

định [16, 18]

Vũ Đức Hương, Nguyễn Thị Bạch Ngọc và cộng sự (2000) khi nghiên cứu

độ nhạy kháng của muỗi Ae aegypti với một số hóa chất diệt côn trùng ở

Nam Bộ, Trung Bộ và Tây Nguyên đã sử dụng phương pháp điện di enzymeesterase (EST) ở bọ gậy tuổi 4 và thấy có sự khác nhau giữa các quần thểkháng hóa chất diệt và quần thể còn nhạy cảm với hóa chất diệt [20]

Năm 2007, Phạm Thị Khoa và cs nghiên cứu mối liên quan kỹ thuật thử

nhạy kháng với phân tích đa hình di truyền của muỗi Ae aegypti quận Thanh

Xuân - Hà Nội thấy enzyme Est-1 liên quan đến tính kháng hoá chất diệt côntrùng nhóm Pyrethroid và DDT [13]

Phương pháp hóa sinh.

Hiện đã có một số thử nghiệm hóa sinh đơn giản để phát hiện sự tăng hoạttính của 3 họ enzyme : Esterase, GST và P450- là các enzyme tham gia vào sựkháng hóa chất diệt côn trùng Nhiều thử nghiệm đã phát hiện thấy hoạt tínhcủa các enzym nói trên tăng lên ở những cá thể muỗi kháng hóa chất diệt côntrùng.Trước hết, sử dụng một qui trình tách ARN khá đơn giản Kế đó, sửdụng quy trình phiên mã ngược ARN của muỗi thành cDNA Cuối cùng làphản ứng PCR từ cDNA với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen cần khuếch đại.Cytochrom P-450 dựa trên các monooxygense hoặc các oxidase chức nănghỗn hợp (MFOs) là một nhóm các enzyme oxy hoá với việc gối lên các chấtnền đặc trưng Chúng chỉ ra sự kháng đối với một nhiều các hoá chất diệt(Oppenoorth, 1985) Tác động của của các oxidase này trên một chất nền cho

ra sản phẩm tăng khả năng hoà tan trong nước, có thể đào thải dễ dàng hơn.Vai trò của MFOs trong kháng luôn có thể nhận biết bằng việc dùng chất tăngcường tác dụng piperonyl butoxide trong thử nghiệm sinh học đối với hoá chấtdiệt côn trùng Kháng MFOs có thể bao gồm sự thay đổi cấu trúc hoặc sự tăngcường các sản phẩm của một hay nhiều thành phần trong hệ thống phức [24,25]

Hình 5 Cytochrome P450

(www.kms.ac.jp)

Các enzym đơn oxygen Cytochrome P450 (P450, CYP) đại diện cho mộttổng họ enzym có khả năng chuyển hoá một loạt các hợp chất nội ngoại sinhphức tạp khác nhau, bao gồm nhiều hoá chất diệt côn trùng Ở muỗi, phức hợp

gen CYP6 và CYP4 được phân lập Ví dụ, phức hợp gen CYP6 và CYP4 đã

được công bố với Anopheles gambiae (Ranson và cộng sự 2002b, Nikon và cộng sự 2003) và gen 17CYP4 được xác định trong Anopheles albimanus

(Scott và cộng sự 1994)

Đối với côn trùng, các enzyme CYP rất quan trọng, nó giúp điều khiển sựsinh trưởng và phát triển, dung nạp các độc tố thực vật và kháng lại hoá chấtdiệt (theo Hodgsson và Kulkani 1983, Scott và cộng sự 1998 và Feyereisen1999) Với sự đa dạng của CYP đã được biết, việc xác định được các dạng đặchiệu liên quan với kháng hoá chất diệt côn trùng thường là khó Ở côn trùng,

sự kháng Pyrethroid nhờ enzyme oxygen có liên quan đến biểu hiện quá mứccủa một hoặc nhiều gen cytochrome P450 trong các họ CYP4, CYP6, CYP12(theo Feyereisen 1999) Ví dụ ở Musca domestica kháng với các hoá chấtnhóm Pyrethroid, sản phẩm phiên mã của CYP6D1 là protein được tăng lên(Tomita và cộng sự 1995, Lui và Scott 1998, và Scott 2000) [28] Sự biểuhiện phiên mã quá mức của các gen CYP khác nhau liên quan đến kháng hoáchất diệt như Cyp6a8, Cyp12d1, Cyp6g1 trong các quần thể Drosophilamelanogaster chọn lọc dưới áp lực của DDT, cho thấy mức độ liên quan đếnviệc giải độc DDT và một loạt các hoá chất diệt bao gồm phostphate hữu cơ,neonicotinoid và benzoylphenylurea (Brant và cộng sự 2002, Le Goff và cộng

sự 2003) Bản đồ gen CYP6Z1 được vẽ dựa trên đặc điểm số lượng các gen

liên quan đến kháng permethrin của Anopheles gambiae Daborn và cộng sự

2001, 2002 đã vẽ bản đồ các gen kháng DDT của Drosophila melanogaster vàxác định gen CYP6G1 có biểu hiện phiên mã quá mức trong 28 quần thểkháng với DDT Gen Cyp12d1 có sự kháng chéo với DDT, neonicotinoid vàmalathion, trong khi gen Cyp6g8 lại kháng chéo với DDT và neonicotinoid(Legoff và cộng sự 2003) Gen CYP6AA3 có mức độ phiên mã tăng lên ở các

quần thể Anopheles minimus kháng thuộc thế hệ F13 và F19, có liên quan tới

tăng mức độ kháng hóa chất

1.4.3 Phương pháp phân tử xác định tính kháng hóa chất diệt côn trùng

Trước tình hình nhiều loài muỗi truyền bệnh đã phát triển kháng với một

số hóa chất diệt, và có nhiều cá thể có biểu hiện mức độ kháng khác nhau việcứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định cơ chế kháng của các véc tơtruyền bệnh cho người góp phần đề ra chiển lược phòng trừ muỗi hiệu quảnhất [5]

Kháng đột biến gen tại vị trí đích với hóa chất diệt côn trùng được xác địnhthông qua các kỹ thuật PCR, phương pháp này lợi thế hơn các phương phápkhác là phát hiện được cá thể dị hợp, đồng hợp kháng mà các phương phápkhác không phát hiện được - Phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệuViệc sử dụng rộng rãi những hoá chất Pyrethroid và DDT đã dẫn đến sự pháttriển của khả năng kháng quỵ (kdr) ở nhiều loài côn trùng (theo Liu và cộng

sự, 2000; Soderlund và Knipple, 2003) bao gồm Anopheles và Aedes Việc sử

dụng DDT và Pyrethroid trong việc kiểm soát những loài gây hại cho việctrồng lúa và bông đã đóng góp đáng kể cho sự phát triển tính kháng ở

Anopheles gambiae từ miền Tây Châu Phi (theo Elissa và cộng sự., 1993);

Martinez-Torres và cộng sự., 1998) Cơ chế phân tử của kdr được chỉ ra sựkhác biệt với cơ chế trao đổi chất [26, 30]

Cổng điện thế của kênh vận chuyển ion Na+ chính là vị trí đích của cả DDT

và nhóm Pyrethroid Đột biến ở gen này có liên quan đến kháng quỵ(Knockdown resistance) kdr với những hoá chất này ở một vài loài côn trùng

trong đó có cả Anopheles gambie Đột biến ở alen kdr có liên quan đến tính

kháng gặp nhiều ở côn trùng kết quả là sự thay thế Leucine bằngPhenilalanine ở vị trí S6 đầu kỵ nước của vùng II (Theo Williamson và cs,1996; Dong, 1997, Jamoz và cs, 1998, Martinez-Torress và cs, 1998, 1999b).Hai sự thay thế luân phiên ở vị trí này cũng liên quan tới việc kháng DDT vànhóm Pyrethroid, việc thay thế leucine bằng histidine cũng liên quan đến việckháng hoá chất nhóm Pyrethroid ở Hethiothis virescens (Parte và Taylor,1997) và sự thay thế leucine bằng serine liên quan đến sự kháng DDT và

kháng ở mức độ thấp với permethrin ở Cx pipiens tại Trung Quốc

(Martinez-Torress và cs, 1999) Sự thay thế leucine bằng phenilalanine ở vị trí 1014 ở

cổng điện thế của kênh vận chuyển Na có liên quan với sự kháng hoá chất

DDT và permethrin ở rất nhiều loài côn trùng, trong đó có Anopheles gambiae

ở Tây Phi Ở loài Anopheles gambiae ở Kenya thì gen quy định cổng điện thế

của kênh vận chuyển Na+ nằm trên vai trái của nhiễm sắc thể số 2 (2L), vị trí20C Đây là vị trí của locut mang tính chất đặc trưng chủ yếu xác định tínhkháng permethrin

Kháng ngã qụy (kdr) với Pyrethroid là do một sự biến đổi trong quan hệtương tác giữa hoá chất diệt côn trùng và vị trí liên kết của chúng trên kênhvận chuyển Na+, kdr hình thành những sự thay thế một hoặc nhiều nucleotittrong gen quy định kênh vận chuyển Na+ Brengues và cs 2003 đã nghiên cứu

tính kháng DDT và Pyrethroid ở Ae aegypti ở 13 địa phương khác nhau trên

thế giới và thấy quần thể kháng đột biến kdr với DDT và Pyrethroid tạiSemarang - trung tâm Java, Belem ở Brazil và quần thể Long Hòa ở ViệtNam Quần thể Belem có axit amin valine ở vị trí 923 của exon 19 trong khi 3

quần thể Ae aegypti khác và Anopheles gambiae có một axit amin leucine ở

vị trí tương tự Tất cả các quần thể Ae aegypti chứa một axit amin leucine tại

vị trí 952 và 1 axit amin lysine ở vị trí 961của exon 20 nhưng ở vị trí tương

tự của Anopheles gambiae lại là valine và histidine Quần thể Long Hoa chứa tryptophan ở vị trí 982 của exon 20 trong khi 3 quần thể Ae aegypti khác và

Aopheles gambiae có leucine ở vị trí tương tự Tuy nhiên, ở vị trí 1011 của

exon 20quần thể Belem là methionine, còn 3 quần thể Ae aegypti khác và

Anopheles gambiae là leucine Quần thể Thái Lan, vị trí 1016 của exon 21 là

glycine trong khi 3 quần thể Ae aegypti khác và Anopheles gambiae lại là

valine

Ở một vài loài côn trùng, hầu hết đột biến kdr làm một leucine thay thếthành phenylalanine (Leu→ Phe) trên đoạn kị nước S6 của vùng II trên genquy định kênh vận chuyển Na+(Williamson và cs, 1996; Martinez-Torres và

cs, 1998) Tuy nhiên, một sự thay thế thứ hai ở vị trí tương tự (Leu → Ser) đã

được tìm thấy ở Anopheles gambiae Đông Phi (theo Ranson và cs, 2000a,b).

Cả những đột biến đã được báo cáo ở loài Anopheles acharovi tại Thổ Nhĩ Kỳ

Những nghiên cứu tính kháng chéo ở vị trí đích đã được tìm thấy trong

loài Ae aegypti (Hemingway và cs, 1989; Brengues và cs, 2003) Việc phân

tích trình tự của cADN của chuỗi xoắn kị nước S6 ở vùng II của sáu quần thể

Aedes kháng Pyrethroid đã chỉ ra rằng sự thay thế phổ biến nhất Leu → Phe ở Anopheles gambiae thì chưa gặp trong loài Ae aegypti [26]

Loài muỗi Ae aegypti kháng hoá chất nhóm Pyrethroid ở Việt Nam là đồng

hợp tử do sự thay đổi 2 nucleotit, dẫn đến một đột biến Leu → Trp Những cá

thể loài Ae aegypti kháng Pyrethroid ở Brazil là đồng hợp tử hoặc dị hợp tử

cho cả hai axit amin không liền kề (isoleucine thành methionine và glycinethành valine), sự biến đổi này xảy ra là kết quả đột biến một nucleotit Nhữngthay đổi này cũng đã được tìm thấy ở những cá thể muỗi từ hai vùng khác

nhau ở miền trung nước Mỹ Những mẫu Ae aegypti từ Indonesia và Thái Lan

đã có một đột biến thay thế valine thành glycine là kết quả của sự thay đổi mộtnucleotit

Có khoảng 20 trình tự axit amin đơn nhất của gen quy định kênh vậnchuyển ion Na+ đa hình đã được xác định liên quan với tính kháng Pyrethroid.Tất cả những đột biến đã được xác định ở muỗi đã được tìm thấy ở vùng IIcủa kênh vận chuyển Na+[29]

Giải trình tự ADN vùng II của cổng điện thế kênh vận chuyển ion Na+ xácđịnh kháng đột biến ở muỗi Tuy nhiên, điều này không thể ứng dụng chonghiên cứu quần thể Phương pháp PCR chuẩn đoán đơn giản đã được pháttriển (Martinez-Torres và cs, 1998) phương pháp này có khả năng chuẩn đoánnhanh những thay thế phổ biến Leu thành Phe ở muỗi kháng, và những cặpmồi đặc hiệu nhằm xác định những đột biến khác đã được phát triển (Ranson

và cs, 2000; Enayati và cs, 2003) Gen quy định kênh vận chuyển Na+ đã được

sử dụng như là một công cụ phân tử để tìm kiếm cấu trúc quần thể Anopheles

gambiae tại Mali và Burkina Faso

1.5 Chiến lược kiểm soát tình trạng kháng hóa chất diệt côn trùng.