Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại.. Trong việc nỗ lực điều tra, nghiên cứu và tìm
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-Lại Hợp Hiếu
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA LÁ CÂY GIÁ (Excoecaria agallocha L.) VÀ CÂY ĐƠN LÁ ĐỎ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số: 9.44.01.14
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Hà Nội – 2021
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Ngô Đại Quang
Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Văn Thanh
Phản biện 1: ……… Phản biện 2: ……… Phản biện 3: ………
Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp Học viện họp tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2021
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Thư viện Quốc gia
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của luận án
Trải suốt lịch sử nhân loại, nguồn sinh vật biển và nguồn thực vật đã trở thành nguồn nguyên liệu tiềm năng cho nghiên cứu phát hiện các biệt dược phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng Hơn 70% thuốc chống ung thư trên thị trường hiện nay có nguồn gốc thiên nhiên hoặc được tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc của hợp chất thiên nhiên Song song bệnh ung thư hiện đang là vấn đề đau đầu của các nhà khoa học, các căn bệnh liên quan đến kháng sinh trước đây được điều trị bằng cách dùng các thuốc kháng sinh như penicillin, cephalosporin Tuy nhiên, hiện nay đã xuất hiện tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh không những ở Việt Nam và cả trên thế giới, ngoài các nguyên nhân thường gặp như ở các quốc gia khác, còn có nguyên nhân từ thói quen tự chữa trị và “bắt chước” đơn thuốc của người dân Chính những nguyên nhân này làm xuất hiện hiện tượng gọi là kháng kháng sinh Kháng kháng sinh là tình trạng các vi sinh vật như vi khuẩn, vi rút, nấm và ký sinh trùng thay đổi cách thức hoạt động, làm cho các thuốc trị bệnh do chúng gây
ra trở nên vô hiệu
Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại Giá trị của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà vì còn
có thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới Trong việc nỗ lực điều tra, nghiên cứu và tìm kiếm nguồn dược liệu phục vụ cho các chương trình chăm sóc sức khỏe cộng đồng, việc thực hiện các nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc
từ thiên nhiên có hoạt tính gây độc tế bào, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, các nguồn kháng sinh thế hệ mới… để ứng dụng trong phòng ngừa, chữa trị các bệnh ung thư, kháng sinh, kháng lao… là một trong những nhiệm vụ đặc biệt quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm Bên cạnh các nguồn tài nguyên thực vật có mạch trên đất liền, nguồn tài nguyên sinh vật biển, nguồn tài nguyên thực vật rừng ngập mặn và thực vật tham gia ngập mặn đã và đang trở thành đối tượng thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong lĩnh vực y sinh-dược học Nhiệm vụ điều tra, tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học trong các loài thực vật thuộc rừng ngập mặn đã và đang được triển khai, đang được nhiều cơ sở nghiên cứu quan tâm
và theo đuổi nghiên cứu
Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh
học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)” được thực hiện nhằm mục tiêu phát
hiện được các hoạt chất có tiềm năng từ cây Giá và Đơn lá đỏ góp phần làm
Trang 4rõ hơn những công dụng chữa bệnh trong y học cổ truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học của các cây này ở Việt Nam
2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây Giá (Excoecaria
agallocha) và Đơn lá đỏ (E cochinchinensis)
Đánh giá tác dụng gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cặn chiết tổng và các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho
những nghiên cứu tiếp theo
3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
Phân lập các hợp chất từ cây Giá và cây Đơn lá đỏ bằng các phương pháp sắc ký kết hợp Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo
CHƯƠNG I TỔNG QUAN
Những nghiên cứu trên thế giới và trong nước về thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học của cây Giá (E agallocha) và cây Đơn lá đỏ (E
Trang 5Mẫu thực vật được TS Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học, tiêu bản lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
và Viện Hóa sinh biển
II.2 Phương pháp nghiên cứu
II.2.1 Phương pháp ngâm chiết
Mẫu thực vật được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm sau đó được xay nhỏ, chiết siêu âm/hoặc ngâm ở nhiệt độ phòng với methanol Dịch chiết gom lại và cô cạn dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol Cặn chiết này được hoà với nước rồi chiết lỏng lỏng với chloroform thu được cặn chiết CHCl3 và phần dịch nước
II.2.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất
Việc ngâm chiết, phân lập, tinh chế các phần dịch chiết của cây Giá và Đơn lá đỏ được thực hiện bằng các phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) silica gel với các cỡ hạt khác nhau, sắc ký
cột pha đảo RP-18 và sephadex LH-20
II.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại: điểm nóng chảy (Mp),
độ quay cực ([α]D), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phun mù điện tử MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân: phổ một chiều (1
(ESI-H NMR, 13C NMR và DEPT) và phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC và NOESY/ROESY)
II.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư vú ở người (MCF-7), ung thư phổi người (LU-1) và ung thư biểu mô người (KB) sử dụng phương pháp MTT và SBR
Hoạt tính tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW264.7 kích thích bởi LPS
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ Tám chủng vi sinh vật kiểm định thử
nghiệm là: hai chủng vi khuẩn Gram (–) (Escherichia coli ATCC 25922
và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853), hai chủng Gram (+) (Bacillus subtillis ATCC 11774 và Staphylococcus aureus ATCC 11632), hai chủng nấm sợi (Aspergillus niger 439 và Fusarium oxysporum M42)
và hai chủng nấm men (Candida albicans ATCC 7754 và Saccharomyces cerevisiae SH 20)
Trang 6Chương III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
CHCl 3 /H 2 O 1:1 Cặn CHCl 3
E-3A
(78 mg)
1 Sephadex LH-20 CC, Methanol-H2O (1:1)
2 RP-18 CC, Methanol-H2O (1:2)
EA-6
(12 mg)
Sephadex LH-20 CC, Methanol-H2O (1:1)
(1:2)
Hình III.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc cây Giá
Trang 7(MeOH-H2O, 1:2) Silica gel CC,
n-Hexane-acetone (5:2)
Silica gel CC, CHCl3-MeOH (30:1, 20:1, v/v)
YMC RP-C18 CC Acetone-H2O (1:3,5, v/v) YMC RP-C18 CC
MeOH-H2O (3:3, v/v)
Diaion HP-20 MeOH-H2O (gradient 0:100, 25:75, 50:50, v/v)
Hình III.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ dịch chiết nước cây Giá
II.3.2 Phân lập các hợp chất từ cây Đơn lá đỏ
Hình III.4 Sơ đồ phân bố các phân đoạn từ cặn MeOH cây Đơn lá đỏ
Trang 8Silica gel CC, CHCl 3 -MeOH (50:1, 25:1, v/v)
Silica gel CC, CHCl 3 -MeOH (30:1, 20:1, v/v)
YMC RP-C18 CC Acetone-H 2 O (1:3,5, v/v)
Diaion HP-20 MeOH-H 2 O (gradient 0:100, 25:75, 50:50, v/v)
Hình III.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phần nước của cây Đơn lá đỏ
III.1.3 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất
Phần này trình bày thông số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ cây Giá và cây Đơn lá đỏ
III.2 Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập đƣợc
III.2.1 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Giá
Bảng III.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết MeOH
IC 50
(µg/mL)
% ức chế
IC 50
(µg/mL)
% ức chế
Trang 9Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH cho thấy cặn chiết MeOH của cây Giá có khả năng ức chế lớn hơn 50% sự phát triển tế bào sống trên cả ba dòng tế bào ung thủ thử nghiệm là KB, LU-1 và MCF7 Chất đối chứng dương ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99
III.2.2 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cây Giá
Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH của cây Giá cho thấy chỉ có hoạt
tính kháng một VSVKĐ của vi khuẩn Gram dương B subtillis (MIC = 200
µg/mL) Các hợp chất phân lập được đã được thử hoạt tính kháng vi sinh vật
kiểm định trên tám chủng vi khuẩn bao gồm hai chủng vi khuẩn Gram (–): E
coli, P aeruginosa, hai chủng vi khuẩn Gram (+): B subtillis, S aureus, hai
chủng vi khuẩn nấm mốc: A niger, F oxysporum, hai chủng vi khuẩn nấm
men: S cerevisiae và C albicans Hợp chất blumenol A (EA-6) thể hiện hoạt
tính kháng VSVKĐ trên chủng F oxysporum (MIC = 50 µg/mL)
Bảng III.3 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các
hợp chất và cặn chiết từ cây Giá
Ký hiệu mẫu
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (g/mL)
# Nồng độ mẫu đầu tương đương với 0,1 mM; Streptomycin, nystatin và tetracyclin được sử dụng
như những kháng sinh chuẩn *Ec (Escherichia coli), Pa (Pseudomonas aeruginosa), Bc (Bacillus subtillis), Sa (Staphylococcus aureus), An (Aspergillus niger), Fo (Fusarium
oxysporum), Sc (Saccharomyces cerevisiae) và Ca (Candida albicans) (-) Không xác định
Trang 10III.2.3 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của cây Đơn lá đỏ
Bảng III.4 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế quá trình sản sinh nitric oxide
(NO) trên đại tế bào RAW264.7 của các hợp chất
Hợp chất Nồng độ (µM) Ức chế (%) Tế bào sống (%) EC-1
Trang 11CHƯƠNG IV THẢO LUẬN KẾT QUẢ
IV.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cây Giá
IV.1.1 Hợp chất excoecarin L (EA-1, Chất mới)
Hình IV.1 Cấu trúc của EA-1, tương tác COSY, HMBC chính và chất tham
397.2241 +MS, 1.5min #90
Hình IV.2 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EA-1
Hợp chất EA-1 phân lập từ phân đoạn chloroform, có dạng bột
màu trắng Phổ HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M + Na]+
tại m/z
343,1897 (tính toán theo lý thuyết C19H28NaO4
+,343,1880), phù hợp với công thức phân tử C19H28O4 Trên phổ 13
C NMR và phổ HSQC cho tín hiệu cộng hưởng của 19 carbon, gồm bốn carbon không liên kết với hydro, sáu nhóm methine, tám nhóm methylene và một nhóm methyl
Trong đó, các tín hiệu của hai carbon methine olefin [δC 135,5 (C-15) và
H-Hz, H-20a)/3,89 (1H, dd, J = 3,5, 9,5 H-Hz, H-20b), hai proton olefin thuộc một liên kết đôi hai lần thế tại δH 5,73 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-15)
và δH 5,66 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-16) (Bảng IV.1)
Trang 12Hình IV.3 Phổ 1H NMR của hợp chất EA-1
Hình IV.5 Phổ HSQC của hợp chất EA-1
Trang 13Hình IV.6 Phổ HMBC của hợp chất EA-1
Hình IV.7 Phổ COSY của hợp chất EA-1
Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HSQC, HMBC và COSY
cho thấy hợp chất EA-1 có cấu trúc phẳng tương tự như hợp chất agallochin
I (trước đó cũng được phân lập từ cây này), ngoại trừ sự có mặt thêm tín
hiệu của một nhóm hydroxy tại vị trí C-17 Các tương tác xa HMBC giữa δH
3,40/3,45 (H-17) với δC 28,0 12), 51,1 13), 56,6 14) và 135,2 16) cho thấy nhóm OH liên kết với C-17, trong khi đó các tương tác hai chiều trên phổ COSY giữa proton H-18/H-4/H-5/H6/H-7 một lần nữa khẳng định nhóm methyl liên kết với C-4 và nhóm hydroxy liên kết với C-6 Ngoài ra, sự dịch chuyển hóa học về phía trường yếu của carbon hemiketal
(C-tại δC 98,69 (C-3) kết hợp với các tương tác HMBC giữa δH 3,80/3,89
(H-20) với δC 32,7 (C-1), 98,6 (C-3), 57,9 (C-5) và 37,5 (C-10) cho phép khẳng định liên kết cầu eter giữa C-20 với C-3 và nhóm hydroxy còn lại trong phân tử liên kết tại C-3 (Hình IV.5-IV.6)
Trang 14Bảng IV.1 Số liệu phổ NMR (δ ppm) của EA-1 và hợp chất tham khảo
a Đo trong CDCl 3 , b 75MHz; c đo trong CD 3 OD, d 125MHz, e 500MHz # δ C số liệu phổ của
agallochin I tham khảo tài liệu sô [35]
Cấu hình tương đối của hợp chất EA-1 được xác định dựa vào giá
trị hằng số tương tác (JH-H) và các tương tác trên phổ NOESY Các vị trí
H-5, H-6, H-7a và H-9 được xác định là axial do giá trị JH-H lớn (J = 11,0 -
Trang 15Hình IV.8 Các tương tác NOESY của hợp chất EA-1
Hình IV.9 Phổ NOESY của hợp chất EA-1
12,5 Hz) Thêm nữa, các tương tác NOESY giữa proton 5/9, 1a, 7a; H-7a/H-14a, H-9; H-20b/H-15; H-15/H-16 và H-20a/H-11a, H-1b, H-2a xác nhận cấu hình khung beyer-15-ene diterpenoid Cuối cùng, các tương tác giữa H-6/H-20b, H-15, H-4 và giữa H3-18/H-2b cho phép khẳng định cấu
H-hình β của H-6 và H-4 (Hình IV.8-IV.9) Từ các phân tích phổ nêu trên, hợp
chất EA-1 được xác định là
3β,20-epoxy-3,6α,17-trihydroxy-19-nor-beyer-15-ene, đây là một chất mới và cũng là hợp chất dạng 19-nor-beyerene
diterpenoid đầu tiên phân lập được từ cây E agallocha và được đặt tên là
excoecarin L
Chi tiết xác định cấu trúc 8 hợp chất còn lại trong Luận án và được tóm tắt Hình IV.26 dưới đây:
Trang 16Hình IV.26 Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cây Giá
IV.2 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Đơn lá đỏ
IV.2.1 Hợp chất dien-3-one 20-O-β-D-glucopyranoside (EC-1, Chất mới)
6α,7α-epoxy-4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15-Hợp chất EC-1 phân lập được có dạng bột, màu trắng Phổ
HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M - H]- tại m/z 541,2297 (tính toán theo
lý thuyết C26H37O12
,541,2291), 577,2063 [M + Cl]- (tính toán theo lý thuyết C26H38ClO12-, 577,2057) và 587,2346 [M + HCOO]- (tính toán theo lý thuyết C27H39O14-, 587,2345), phù hợp với công thức phân tử C26H38O12
-(Hình IV.28)
Hình IV.27 Cấu trúc của EC-1 và hợp chất tham khảo
Trang 17Hình IV.28 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EC-1
Phổ 13C NMR và phổ HSQC cho tín hiệu cộng hưởng của 26 carbon, bao gồm sáu carbon không liên kết với hydro, 13 nhóm methine, bốn nhóm methylene và ba nhóm methyl Phân tích độ chuyển dịch hóa học của các tín
hiệu cho phép nhận dạng một nhóm carbonyl [δC 209,9 (C-3)], bốn carbon
olefin [δ C 163,0 (C-1), 134,7 (C-2), 145,9 (C-15) và 117,2 (C-16)], sáu
carbon thuộc một gốc đường glucose [δC 104,8 (carbon anome, H-1'), 75,2 (C-2'), 78,0 (C-3'), 71,6 (C-4'), 78,0 (C-5') và 62,8 (C-6')], ba carbon không
Trang 18mang hydro liên kết với oxy [δC 74,7 (C-4), 64,6 (C-6) và 77,3 (C-9)], ba
nhóm oxymethine [δC 68,1 (C-5) và 62,3 (C-7) và 71,4 (C-13)], cùng với một
nhóm oxymethylen [δC 74,2 (C-20)] Phổ 1H NMR cho tín hiệu của hai nhóm
methyl [δH 1,70 (3H, s, H-17) và 1,76 (3H, d, J = 2,0 Hz, H-19)], một nhóm methyl bậc hai [δH 0,96 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-18)], một proton olefin thuộc một liên kết đôi ba vị trí thế [δH 7,66 (1H, br s, H-1)], hai proton olefin khác thuộc một liên kết đôi dạng >C=CH2 [δH 4,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-16a)/5,04 (1H, br s, H-16b), một proton anome của gốc đường glucose có cấu hình β [δH 4,33 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1') và các tín hiệu của các nhóm oxymethine/oxymethylene trong vùng dịch chuyển hóa học từ δH 3,20 – 4,20
ppm (Hình IV.28-IV.29)
Hình IV.31 Các tương tác COSY, HMBC và NOESY chính của EC-1
Hình IV.31 Phổ HSQC của hợp chất EC-1
Hình IV.32 Phổ HMBC của hợp chất EC-1
