Tách dòng , giải trình tự và thiết kế vector biểu hiện gen novs tham gia tổng hợp đường noviose trong cấu trúc của kháng sinh novobiocin

---&&&---KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TÁCH DÒNG, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN NOVS THAM GIA TỔNG HỢP ĐƯỜNG NOVIOSE TRONG CẤU TRÚC KHÁNG SINH NOVOBIOCIN Khoa : Công nghệ

-&&& -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

TÁCH DÒNG, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU

HIỆN GEN NOVS THAM GIA TỔNG HỢP ĐƯỜNG NOVIOSE

TRONG CẤU TRÚC KHÁNG SINH NOVOBIOCIN

Khoa : Công nghệ sinh họcGiáo viên hướng dẫn : TS.Tạ Thị Thu ThủySinh viên thực tập : Phạm Văn Phú

Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS

Tạ Thị Thu Thủy, đã giao để tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiệnthuận lợi giúp đõ em hoàn hành bản khóa luận này

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, cán bộkhoa công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện giúp

đỡ em trong quá trình em thực tập tại Phòng thì nghiệm sinh học phân tửkhoa công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội

Em xin gửi lời cảm ơn các anh, chị và các bạn trong phòng thínghiệm Sinh học phân tử đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho

em trong thời gian vừa qua để em có thể hoàn thành tốt bản khóa luậnnày

Do thời gian và khả năng bản thân có hạn, nên trong bài khóa luậnnày không tránh khỏi những thiều sót Rất mong nhận được sự chỉ bảocủa các thầy cô và sự góp ý kiến của các bạn để bài khóa luận này đượcđầy đủ và hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2010

Sinh viênPhạm Văn Phú

MỞ ĐẦUNgày nay, công nghệ sinh học được coi là một trong năm ngànhcông nghệ mũi nhọn của nhân loại gồm công nghệ sinh học, công nghệthông tin, công nghệ điện-điện tử, công nghệ vật liệu mới, công nghệnăng lượng.

Công nghệ sinh học là bộ môn tập hợp các ngành khoa học và côngnghệ gồm: sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học,công nghệ học, nhằm tạo ra các quy trình công nghệ khai thác ở quy môcông nghiệp các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào động, thực vật đểsản xuất các sản phẩm có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xãhội và bảo vệ môi trường

CNSH đã và đang được ứng dụng vào trong rất nhiều lĩnh vực nhưcông nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ chomọi như cầu của cuộc sống như dinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sức khỏe Bằng những kiến thức sinh học về thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn, và

sử dụng “công nghệ ADN tái tổ hợp” những nhà khoa học đang cố gắng

tạo ra những cây trồng, vật nuôi có năng suất và chất lượng cao, nhữngloại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh cho con người

Mục tiêu đề tài là: Tách dòng , giải trình tự và thiết kế vector biểu

hiện gen novS tham gia tổng hợp đường noviose trong cấu trúc của kháng sinh novobiocin.

NHỮNG TỪ NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Taq Polymerase Polymerase Thermus aquaticus

MỤC LỤC

CHƯƠNG I 7

TỔNG QUAN 7

1.1 Đại cương về kháng sinh 7

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 9

1.1.2 Cơ chế tác dụng 9

1.1.2.1 Ức chế sự thành lập vách tế bào 9

1.1.2.2 Ức chế quá trình trao đổi chất của màng tế bào 10

1.1.2.3 Ức chế sự tổng hợp protein 10

1.1.2.4 Ức chế tổng hợp acid nucleic 11

1.2 Kháng sinh Novobiocin 12

1.2.1 Giới thiệu 12

1.2.1.1 Khái niệm 12

1.2.1.2 Cấu trúc 17

1.2.2 Cơ chế hoạt động 18

1.2.3 Ứng dụng novobiocin 18

1.3 Đường khử trong cấu trúc Novobiocin 19

1.3.1.Giới thiệu chung về đường khử 19

1.3.2 Vai trò của đường noviose trong kháng sinh novobiocin 20

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh vật 21

1.3.4 Đặc điểm chức năng riêng biệt của novS liên quan đến quá trình sinh tổng hợp đường L-noviose 23

CHƯƠNG II 24

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Hóa chất 24

2.1.2 Thiết bị 24

2.1.3 Vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy 25

2.1.3.1 Chủng vi sinh vật 25

2.1.4 Vector biểu hiện và vector tách dòng 25

2.1.4.1 Vector tách dòng pGEM -3Z (hình 4) 26

2.1.4.2 Vector biểu hiện pET -32 a(+) (hình 5) 28

2.2 Phương Pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Tách chiết ADN plasmid 31

2.2.2 Chạy điện di ADN plasmid trong Agarose 31

2.2.3 Kỹ thuật cắt gen 32

2.2.4 Nhân gene bằng phản ứng PCR 32

2.2.5 Tạo vector tách dòng pGEM -3Z 33

2.2.6 Biến nạp ADN vào tế bào vi khuẩn E.coli XL1 Blue (hình 8)34 2.2.7 Giải trình tự gen 37

2.2.8 Tạo vector tái tổ hợp pET -32 a(+) 37

CHƯƠNG III 38

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả 38

3.1.1 Kết quả PCR kiểm tra cắt gen novS bằng NedI và EcoRI 38

3.1.2 Kết quả PCR chuyển gen novS vào vector pGEM -3Z 40

3.1.3 Kết quả xác định trình tự đoạn gen NovS 42

3.1.4 Kết quả chuyển gen novS vào vector biểu hiện pET -32 a(+).47 3.2 Thảo luận 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về kháng sinh

Sự phát triển về vi sinh vật học nói chung, và vi sinh vật côngnghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch sử là phát minh vĩ đại về chấtkháng sinh của Alexander Fleming (1982) đã mở ra kỷ nguyên mới trong

y học: Khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh và ứngdụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người

Thuật ngữ "chất kháng sinh" lần đầu tiên được Pasteur và Joubert

(1877) sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi

khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các

động vật này một số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Babes (1885)

đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tínhtổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đốikháng

Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩncủa Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành bào tử của loạitrực khuẩn này Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách được từ nấm mốcmột chế phẩm có thể sử dụng để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễmtrên da do cầu khuẩn

Mặc dù vậy, trong thực tế mãi tới năm 1929 thuật ngữ " Chất kháng

sinh" mới được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và chính thức

trong báo cáo chi tiết về penicillin

Thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượtbậc của ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt sựkiện như: Khám phá ra hàng loạt Chất kháng sinh, thí dụ như:griseofulvin (1939), gramicidin S (1942), streptomycin (1943), bacitracin(1945), cloramphenicol và polymicin (1947), clotetracyclin vàCephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin và nystatin(1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), amphotericin B vàvancomycin (1956), metronidazol, kanamycin và rifamycin (1957) Ápdụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến (đặc biệt làcác kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợpgen ) đã tạo ra những biến chủng công nghiệp có năng lực tổng hợp cácchất kháng sinh cao gấp hàng ngàn vạn lần các chủng ban đầu

Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuấtcông nghiệp để sản xuất penicillin G (1942) và việc hoàn thiện công nghệ

lên men này trên các sản phẩm khác.

Việc phát hiện, tinh chế và sử dụng axit 6 - aminopenicillanic APA, 1959) làm nguyên liệu để sản xuất các chất kháng sinh penicilinbán tổng hợp đã cho phép tạo ra hàng loạt dẫn xuất penicilin và một sốkháng sinh b - lactam bán tổng hợp khác

(6-1.1.1 Định nghĩa kháng sinh.

Kháng sinh là tất cả các hợp chất tự nhiên, tổng hợp và bán tổnghợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật gây bệnh

mà không có hoặc hầu như không có tác dụng lên người, động vật và thựcvật.(1)

1.1.2 Cơ chế tác dụng

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh (hay các đối tượng gây bệnhkhác - gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mang đặcđiểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó; trong đó, nhữngkiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạnchức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất,làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quátrình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất địnhtrong các chuyển hóa trao đổi chất(2)

Cơ chế tác động chủ yếu của kháng sinh:

1.1.2.2 Ức chế quá trình trao đổi chất của màng tế bào

Chức năng của màng tế bào: Màng tế bào là lớp màng bao bọc bênngoài tế bào có Nó tham gia vào quá trình thẩm thấu chọn lọc, vậnchuyển chủ động, kiểm soát các thành phần bên trong màng tế bào

Kháng sinh thuộc nhóm này :Amphotericin B, colistin, imidazole,

nystatin, polymycins

Tác dụng: Imidazole làm suy yếu sự toàn vẹn của màng tế bào vinấm bằng cách ức chế sự tổng hợp lipid của màng tế bào Polymycins tácđộng lên vi khuẩn Gr (-) Polyenes tác động lên vi nấm

1.1.2.3 Ức chế sự tổng hợp protein

Kháng sinh thuộc nhóm này bao gồm: Chloramphenicol,erythromycins, lincomycins, tetracyclines, aminoglycosides

Cơ chế tác dụng:

Aminoglycosides :Giai đoạn 1 thuốc gắn vào thụ thể trên tiểu đơn

vị 30S Giai đoạn 2 phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên trong quátrình thành lập chuỗi peptid Giai đoạn 3 thông tin mRNA bị đọc sai dẫnđến 1 acid amin không phù hợp Giai đoạn 4 làm vỡ các polysomes thànhmonosomes làm mất có chức năng tổng hợp protein

Tetracyclines:Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 30S / ribô thể, ngăn chặncác amino acid mới gắn vào chuỗi peptid mới được thành lập

Macrolides:Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 50S/ ribô thể, ngăn cản sựthành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi peptid

Lincomycins: Cơ chế giống nhóm Macrolides

1.1.2.4 Ức chế tổng hợp acid nucleic

Kháng sinh thuộc nhóm này: Actinomycin, Mitomycin,

nalidixicacid, novobiocin, pyrimethamin, rifampin, sulfonamides,

đó nó cạnh tranh với PABA tạo những chất tương tự acid folic nhưngkhông có chức năng làm cản trở sự phát triển của vi khuẩn

Trimethoprim: Kháng sinh này ức chế dihydrofolic acid reductasetham gia vào sự chuyển Dihydrofolic acid thành tetrahydrofolic acidtrong quá trình tổng hợp purines/ ADN

1.2 Kháng sinh Novobiocin

1.2.1 Giới thiệu

1.2.1.1 Khái niệm

Novobiocin là kháng sinh thuộc nhóm aminocaumarin được sinh ra

bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces Spherodes sp có tác dụng rất hiệu quả

trong điều trị các bệnh bị nhiễm bởi nhóm vi khuẩn Gram (+) như

Staphylococcus spp, Streptococcus spp, đồng thời có khả năng kháng lại

với các enzim thuộc nhóm beta – lactamase Hiện nay novobiocin đang

được sử dụng để bào chế kháng sinh dùng điều trị bệnh cho người vàtrong thú y dùng điều trị một số bệnh cho đại gia súc (3)

Về cấu tạo, novobiocin bao gồm 3 tiểu phần, gốc đường khử

noviose (vòng C), gốc coumarin (vòng B) và gốc axit prenylated

4-hydroxylbenzoic (ring A) (hình 1) Trong đó gốc đường noviose có tác

dụng tăng tính tan của thuốc và tăng sự tương tác của thuốc với tác nhângây bệnh, vòng B và vòng A có vai trò chính trong quá trình gây bất hoạtchức năng của enzyme tại trung tâm hoạt động của enzim ADN gyrase(4)

Hình 1 Cấu trúc hóa học của kháng sinh novobiocin

Trong các kháng sinh đại phân tử gốc đường khử có vai trò vôcùng quan trọng trong việc tăng tính tan của chúng trong dung môi vàtăng khả năng tương tác của thuốc với tác nhân gây bệnh và đôi khi gốcđường còn có vai trò chính gây bất hoạt chức năng tác nhân gây bệnh Trong đó gốc đường noviose (vòng C) (hình 2) có vai trò rất lớn trongviệc xác định phổ kháng khuẩn của gốc coumarin bởi các 3 nhóm methyl

tromg phân tử đường và chính phân tử noviose giúp cho gốc coumarin

của kháng sinh này tương tác tốt hơn với enzim gyrase (GyrB)

Hình 2 Dự đoán con đường sinh tổng hợp đường noviose (ring C)

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về novobiocin.

Năm 2000 nhóm gen tham gia vào con đường sinh hóa tổng hợpnovobiocin đã được tách dòng thành công bởi nhóm nghiên cứu M

Steffensky và các cộng sự Toàn bộ đoạn ADN với tổng số 26,5 kb và với

23 gen (ORFs) nằm trên hệ gen của xạ khuẩn Streptomyces Spheroides sp

NCIB 11891 đã được giải trình tự và công bố trên ngân hàng gen(genbank – NCBI) Bằng cách so sánh trình tự với các gen tương tự trênngân hàng gen tất cả chức năng của từng ORF trong nhóm gen đó đãđược dự đoán Tuy nhiên để chứng minh chức năng nayg cần phải có cácnghiên cứu tiếp theo bằng các nghiên cứu thực nghiệm.(5)

Theo như công bố của nhóm nghiên cứu C T Walsh năm 2008 vàcác cộng sự, gốc coumarin là gốc chính tương tác với enzim gyrase của vikhuẩn và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chính Gốc này được bắt đầu

tổng hợp từ tyrosin dưới sự xúc tác của các enzyme được tạo ra từ novH,

novJ, novK và cuối cùng được kết thúc bằng hoạt tính của enzim NovH.

Các gen này được tách dòng chứng minh hoạt tính bằng phương pháp gây

đột biến ngoài ra gen tách dòng được biểu hiện trên vật chủ E.coli các

enzim được được tinh sạch và chứng minh hoạt tính bằng phương phápkhối phổ

Theo Heide và các cộng sự công bố năm 2008 , xu hướng ngày naycủa nghiên cứu kháng sinh đó là ứng dụng công nghệ gen để tạo các thế

hệ kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn và có khả năngkhông bị kháng lại bởi vi sinh vật gây bênh Để tạo ra các thế hệ

coumarin mới, vật chủ ngoại là xạ khuẩn Streptomyces coelicolor và vật chủ chuyển gen là E coli M512 phage PhiC31 đã được sử dụng để

chuyển nhóm gen tạo novobiocin để kết hợp vào hệ gen của vật chủngoại Toàn bộ cosmid có chứa 23 gen tham gia tổng hợp novobiocin đã

chuyển vào hệ gen Streptomyce coelicolor từ đó đã tạo được chủng tái tổ

hợp mới, cùng với phương pháp gây đột biến điểm hoặc đột biến thay thếmột số gen trong nhóm gen vật chủ tái tổ hợp mới đã tạo ra hàng loạt cácchất dẫn xuất mới của aminocoumatin hay chính là các thế hệaminocoumarin mới

1.2.1.2 Cấu trúc

Novobiocin có công thức tổng quát là C31H36N2O11 Khối lượngphân tử 612.624 đvc Novobiocin là một hợp chất vòng thơm.Novobiocin có thể bị tách thành 3 chất: Một dẫn xuất của axit benzoic

( vòng A), một dẫn xuất của coumarin ( vòng B), và đường novobiose (vòng C) Đường noviose (vòng C) được gắn vào vào vị trí số 7’ của dẫn

xuất của coumarin( vòng B) bởi liên kết glycorit

Phương pháp X quang đã tìm ra phức hợp thụ thể của novobiocin

và ADN Gyrase chỉ ra ATP và novobiocin có vị trí bám trên phân tửGyrase giống nhau[6] Sự trùng khớp về điểm bám của coumarin và ATP

là cơ sở vững chắc để kháng sinh aminocoumarin là nhân tố ức chế cạnhtranh với hoạt động của enzyme ATPase

1.2.2 Cơ chế hoạt động

Cơ chế phân tử sự hoạt động của novobiocin, và những kháng sinhclorobiocin khác và coumermycin A1 đã được nghiên cứu Nhóm

Aminocoumarin có hiệu lực ức chế rất mạnh enzyme rất mạnh ADNgyrase của vi khuẩn và tấn công vào tiểu phần GyrB của enzym tham giavào việc di truyền tính trạng Novobiocin cũng mạnh như các kháng sinhaminocoumarin khác hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh với phảnứng xúc tác của enzym ATPase bởi GyrB Hoạt lực của novobiocin đượccho rằng cao hơn fluoroquinolones, cũng có mục tiêu tấn công là enzymeADN gyrase, nhưng tại một vị trí khác của enzym này Tiểu phần GyrA

có liên quan tới việc quá trình tháo xoắn của phân tử ADN

1.2.3 Ứng dụng novobiocin.

Novobiocin là một kháng sinh chống lại sự hoạt động củaStaphylococcus epidermidis và có thể đã được dùng để nhận biết vi khuẩn

coagulase-negative Staphylococcus saprophyticus – Một vi khuẩn kháng

lại được với novobiocin Trong nuôi cấy novibiocin được đặt và dùng vớicái tên albamycin (Pharmacia And Upjohn) năm 1960 Hiệu quả của nó

đã được chứng minh thử nghiệm trong các thuốc điều trị bệnh cho người

và gia súc Novobiocin có hiệu lực trong điều trị MRSA resistant Staphylococcus aureus )

(Methicillin-1.3 Đường khử trong cấu trúc Novobiocin

1.3.1.Giới thiệu chung về đường khử

Đường khử là gốc đường đặc biệt được tìm thấy rất nhiều trong cấutrúc tế bào vi khuẩn, trong tế bào nấm, trong cấu trúc của rất nhiều cácchất có hoạt tính sinh học và trong thành phần cấu trúc của rất nhiềuthuốc kháng sinh hay các chất chống ung thư Về cấu tạo các chất đườngkhử là chất mà trong phân tử của chúng có một hay nhiều hơn một nhómhydroxyl (OH) được thay thế bởi nguyên tử H hay các nhóm chức khácnhư amino, methyl, alkyl….Các loại đường khử này có thể tồn tại ở dạngđường đơn hay đường đa hoặc phân nhánh và là dẫn xuất của các sảnphẩm trao đổi chất bậc 2 trong các hợp chất tự nhiên (8)

Trong các chất có hoạt tính sinh học đuờng khử đóng vai trò quantrọng đối với xác định hoạt tính của các chất này, có rất nhiều các nghiêncứu đã chứng minh rằng các chất hoạt tính sinh học sẽ bị mất hoàn toànhoạt tinh nếu như gốc đừờng trong cấu trúc bị loại bỏ.(9)

Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật đường khử tham gia tạo thành cấutrúc peptidoglycon là thành phần của lớp thành tế bào của rất nhiều loài

vi sinh vật đặc biệt là một số vi khuẩn gram dương hoặc hình thành lớpLipopolyscharide trong cấu trúc màng tế bào của nhóm gram âm

Theo như nghiên cứu (10) gốc đường khử trong nhóm kháng sinh enedine

có vai trò quyết định hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng khuẩn, nghiêncứu cho thấy gốc đường rhamnose trong kháng sinh calicheamicin đóngvai trò làm cầu nối liên kết phân tử kháng sinh với enzyme tham gia vàoquá trình sao mã hay sinh tổng hợp mRNA

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gốc đường khử trong nhóm khángsinh macrolide như erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai trò tronggắn kháng sinh này với các enzyme tham gia tổng hợp protein của vi

khuẩn (11)

Việc nghiên cứu vai trò của gốc đường đã chỉ ra rằng nếu mất đigốc đường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật sẽ gây ức chế

sự sinh truởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật (6)

Xu hướng nghiên cứu về hoá dược hiện nay trên thế giới đó lànghiên cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốcđường mới vào gốc đường cũ của một số nhóm kháng sinh (7) Vì vậykháng sinh thế hệ mới này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh đựơchiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đồng thời khả năng thải trừ củathuốc nhanh hơn

1.3.2 Vai trò của đường noviose trong kháng sinh novobiocin

Gốc đường noviose (ring C) có vai trò rất lớn trong việc xác địnhphổ kháng khuẩn của gốc coumarin bởi các 3 nhóm methyl tromg phân tửđường và chính phân tử noviose giúp cho gốc coumarin của kháng sinhnày tương tác tốt hơn với enzim gyrase (GyrB)

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh vật

Hầu hết đường khử trong cấu trúc kháng sinh đựợc sinh ra từ visinh vật là đường 6- deoxyhexose Tiền chất đầu tiên tham gia quá trìnhsinh tổng hợp các gốc đường này đều bắt đầu từ glucose -1- phosphatequa một chuỗi các phản ứng sinh hoá trong tế bào được xúc tác bởi nhómenzyme và kết quả là tạo ra đựoc gốc đừờng khử có thể 1 hay nhiều hơn 1nhóm OH bằng các nguyên tử H, nhóm -CH3, nhóm =O, hay nhómCHO- … (hình 3)

O HO

HO

OH

OH OPO - 3

O HO

HO

OH

OH OdTDP

O O

HO

OH OdTDP

deoxy-1.3.4 Đặc điểm chức năng riêng biệt của novS liên quan đến quá

trình sinh tổng hợp đường L-noviose

Nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp novbiocin từ xạ khuẩnStreptomyces spheroids được tách dòng và giải trình tự 5 orfs tạo nênphân tử đường deoxysugar dTDP-noviose Quá trình sinh tổng hợp đường

Noviose gồm 5 gen tham gia, đó là các gen novV, novT, novW, novS và

novU Các gen này tổng hợp nên các enzyme tương ứng là dTDP-glucose

synthase (novV); dTDP-glucose 4,6-dehydratase (novT); dTDP-glucose 3,5-epimarase (novW), dTDP-glucose reductase (novS); và dTDP-glucose C-methyltransferase (novU).

`Từ các gen tương đương với novS có thể dự đoán gen novS mã

hóa cho protein enzym có chức năng như 4-ketoreductase của keto 6-deoxyglucose

dTDP-4-CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Hóa chất

Trong đề tài này có sử dụng một số hóa chất sau để nghiên cứu là:Enzyme cắt giới hạn EcoRI và NdeI, emzyme RANase được cungcấp bởi công ty Takara (Nhật Bản) được dùng trong cloning và các phảnứng cắt ADN

Kháng sinh ampicillin (Mo, U.S.A), dùng trong nuôi cấy vi khuẩn,tạo môi trường có kháng sinh trong nuôi cấy chủng vi sinh vật có khảnăng kháng sinh, thử kháng sinh

TE buffer, cồn 70 và 90 độ, sử dụng trong tách plasmid

Cao nấm men, trypton, NaCl, agar dùng để pha môi trường nuôicấy vi sinh vật

Tris.Cl, EDTA, NaOH, SDS, potassium, acetate, nước cất dùngpha dung dich solution I, II, III dùng trong tách plasmid

TBE 5X dùng pha dung dịch chạy điện di

Buffer loading, Ethybromine dùng trong chạy điện di ADN

2.1.2 Thiết bị

Máy nhân gen PCR dùng nhân gen

Máy chạy điện di ADN dùng chạy điện di ADN

Máy soi ADN UV-high performance ultraviolet transilluminatordùng soi ADN

Máy lắc vortex, Dùng lắc, trộn, hòa tan dung dich

Máy ly tâm dùng ly tâm

Nồi hấp vô trùng dùng hấp vô trùng thiết bị và môi trường nuôicấy

Tủ cấy UV dùng trong cấy vi sinh vật

Tủ ấm dùng nuôi vi sinh vật trong môi trường LB đặc

Tủ lắc dùng nuôi vi sinh vật trong môi trường LB lỏng

Tủ lạnh, tủ đông dùng trong bảo quản môi trường, hóa chất và giữgiống vi sinh vật

Thiết bị khác như bình ổn nhiệt, cân điện tử, pipet, ống nghiệm,bông, đĩa pettri,

2.1.3 Vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy

2.1.3.1 Chủng vi sinh vật

Trong đề tài chủ yếu sử dụng hai chủng vi khuẩn là chủng E coli XL1 Blue và chủng E.coli BL21 DE3

2.1.3.2 Điều kiện nuôi cấy:

Chủng E coli XL1 Blue nuôi trong điều kiện nhiệt độ là 370C,trong môi trường LB lỏng có chế độ lắc và LB đặc trong tử ấm 370C, vớichủng đã chuyển gen thì có thể sống trong môi trường LB có bổ sungthêm kháng sinh ( 1mg/ml)

2.1.4 Vector biểu hiện và vector tách dòng

Vector pGEM -3Z dùng làm vector tách dòng

pET -32a (+) dùng làm vector biểu hiện

2.1.4.1 Vector tách dòng pGEM -3Z (hình 4)

pGEM®-3Z là vector tách dòng có hiệu quả cao dùng trong tổnghợp ARN in vitro Vector mang gen lacZ α-peptide và vùng gắn gen, có 2promotor là SP6 vàT7 RNA polymerase

Trình tự Vector pGEM®-3Z

Vị trí khởi đầu sao chép T7 RNA polymerase 1

Vùng tách dòng 5–61

Promoter SP6 RNA polymerase (–17 to +3) 67–86

Vị trí bắt đầu sao chép của SP6 RNA polymerase 69

Trình tự điều hòa lac 94–323; 2564–2724

Mã khỏi đầu lacZ 108

Gen điều hòa lacZ 128–144

Vùng β-lactamase (Ampr) 1265–2125

Promoter T7 RNA polymerase (–17 to +3) 2727–3