KHOA HÓA HỌC VÀ CK KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG & THIẾT KẾ BỂ HỞ 50m3 NHẰM NUÔI SINH KHỐI VI TẢO

KHOA HÓA HỌC VÀ CK KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG & THIẾT KẾ BỂ HỞ 50m3 NHẰM NUÔI SINH KHỐI VI TẢO

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

KHOA HÓA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HUỲNH ĐĂNG NGUYÊN

NHẰM NUÔI SINH KHỐI VI TẢO

BÀ RỊA – VŨNG TÀU, NĂM 2012

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

KHOA HÓA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HUỲNH ĐĂNG NGUYÊN

NHẰM NUÔI SINH KHỐI VI TẢO

BÀ RỊA – VŨNG TÀU, NĂM 2012

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

-o0o -

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Huỳnh Đăng Nguyên

Ngày, tháng, năm sinh: 01/08/1990

Ngành: Công nghệ kỹ thuật Hóa học

MSSV: 0852010115

Nơi sinh: Bình Phước

I TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát mội trường & thiết kế bể hở 50m 3 nhằm nuôi sinh khối vi

tảo Nannochloropsis oculata

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

oculata

 Thiết kế bể hở 50m3 nhằm nuôi sinh khối vi tảo Nannochloropsis oculata

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2012

V HỌ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Đặng Tố Vân Cầm

Ths Nguyễn Quốc Hải

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Bà Rịa – Vũng tàu, Ngày 30 tháng 07 năm 2012

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TRƯỞNG BỘ MÔN TRƯỞNG KHOA

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ương nuôi ấu trùng tôm, cá và ấu trùng của các loài thủy sản khác là vấn đề phức tạp, đòi hỏi sự phát triển của kỹ thuật nuôi thức ăn tự nhiên Vi tảo là mắc xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn tự nhiên, là thức ăn cho luân trùng, artemia… làm thức ăn trực tiếp của ấu trùng tôm, cá biển; là thức ăn trực tiếp cho ấu trùng các loài nhuyễn thể, hay gián tiếp qua qui trình ương nuôi nước xanh

Nhu cầu sử dụng vi tảo biển cho sản xuất giống hải sản ở nước ta ngày càng nhiều và chất lượng vi tảo biển cũng đòi hỏi ngày càng cao Đặc biệt nhu cầu của loài

Nannochloropsis oculata cho sản xuất giống cá biển, do giá trị dinh dưỡng cao so với

các loài vi tảo khác Nghiên cứu tối ưu hóa các yếu tố môi trường của N.oculata nhằm

tìm ra điều kiện thích hợp nhất để nuôi sinh khối đã tiến hành tại Trung tâm Quốc Gia Giống Hải sản Nam Bộ với 3 nội dung: lưu giữ giống tảo, xác định môi trường dinh

dưỡng (thí nghiệm I) và độ mặn (thí nghiệm II) tối ưu cho sự phát triển của N.oculata

Kết quả thí nghiệm I: Khảo sát tốc độ tăng trưởng của hai loài vi tảo khi nuôi bằng môi trường dinh dưỡng Conway và F/2 cho thấy môi trường F/2 cho mật độ 397-435 triệu tb/mL và TĐTT 0,43-0,45/ngày cao hơn môi trường Conway 279-344 triệu tb/mL; 0,40-0,42/ngày

Kết quả thí nghiệm II: Khảo sát tốc độ tăng trưởng của hai loài vi tảo khi nuôi ở các độ

mặn 20, 25, 30 và 35‰ cho thấy loài N.oculta tăng trưởng tốt nhất ở độ mặn 20‰ đạt

mật độ 468-568 triệu tb/mL và TĐTT 0,45-0,47/ngày

Kết quả xác định môi trường dinh dưỡng và độ mặn tối ưu là cơ sở cho việc nuôi sinh

khối N.oculata ở bể hở 50m3 như được thiết kế trong phần 2 của nghiên cứu này

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình tìm hiểu kiến thức ở trường và thực tập tại Trung tâm Quốc Gia Giống Hải sản Nam Bộ đã giúp cho em củng cố lý thuyết và bước đầu làm quen với thực tế, đối với em - một sinh viên sắp ra trường- là một khoảng thời gian hết sức quí báu, giúp em hiểu biết sâu hơn về thực tế, giữa lý thuyết với thực hành vận dụng như thế nào để đạt hiệu quả cao nhất trong công việc Học hỏi thêm những công nghệ mới, tập cho em nắm bắt kỹ năng làm việc theo nhóm, làm việc một cách khoa học

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý Thầy cô khoa Hóa Học và Công Nghệ Thực Phẩm trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu với sự nhiệt tình, tâm huyết giảng dạy của Thầy cô đã giúp em hoàn thành đồ án tốt nghiệp thuận lợi

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Quốc Gia Giống Hải sản Nam Bộ đã đồng ý tiếp nhận em vào thực tập

Em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đặng Tố Vân Cầm, Cô đã tận tình truyền dạy kiến thức, tạo điều kiện cho em thực hiện nghiên cứu về tối ưu hóa các

điều kiện môi trường của loài vi tảo Nannochloropsis oculata, giảng giải, hướng dẫn

cho em rất nhiều về phương pháp luận trong nghiên cứu, cách viết luận văn khoa học

Chân thành cảm ơn chị Diêu Phạm Hoàng Vy, cùng toàn thể cô chú, anh chị làm việc tại Trung tâm đã tạo môi trường làm việc thân thiện, hỗ trợ giúp đỡ và nhiều động viên cho em trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Do hạn chế về thời gian và kiến thức nên đồ án không tránh khỏi những sai sót, xin quý Thầy cô, anh chị và các bạn đóng góp ý kiến

Kính chúc quý Thầy cô và anh chị luôn dồi dào sức khỏe, nhiều niềm vui trong công việc đào tạo và nghiên cứu!

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

DANH SÁCH CÁC BẢNG i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

TỪ VIẾT TẮT iii

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

I Tổng quan về vi tảo 1

I.1 Tầm quan trọng của vi tảo trong sản xuất giống hải sản 1

I.1.1 Giá trị dinh dưỡng của vi tảo 1

I.1.2 Sử dụng vi tảo trong sản xuất giống hải sản 2

I.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự biến động của quần thể tảo 4

I.2.1 Ánh sáng: 4

I.2.2 Nhiệt độ: 4

I.2.3 Độ mặn: 4

I.2.4 Độ pH: 5

I.2.5 Sục khí, đảo nước: 5

I.2.6 Môi trường dinh dưỡng: 6

I.3 Các hệ thống nuôi vi tảo 6

I.3.1 Các hệ thống nuôi ngoài nước 6

I.3.2 Các hệ thống nuôi trong nước 7

I.3.3 Tính bức thiết của hệ thống nuôi 50m 3 7

II Loài N.oculata 7

II.1 Phân loại 7

II.2 Các điều kiên nuôi của vi tảo N.oculata 7

II.3 Các công trình nghiên cứu 7

II.3.1 Các công trình nghiên cứu ngoài nước 8

II.3.2 Các công trình nghiên cứu trong nước 13

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

I Đối tượng, địa điểm nghiên cứu 15

II Nội dung nghiên cứu 15

III Phương pháp nghiên cứu 15

III.1 Các phương pháp lưu giữ giống vi tảo 15

III.1.1 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch 15

III.1.2 Phương pháp giữ giống trên môi trường lỏng 16

III.2 Các phương pháp nghiên cứu tìm môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tăng trưởng loài N.oculata 17

III.2.1 Thiết kế thí nghiệm 17

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

III.2.3 Xử lý số liệu 19

III.3 Các phương pháp nghiên cứu tìm độ mặn thích hợp cho tăng trưởng loài N.oculata 19

III.3.1 Thiết kế thí nghiệm 19

III.3.2 Thu thập số liệu 20

III.3.3 Xử lý số liệu 20

CHƯƠNG III QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHỐI VÀ THIẾT KẾ BỂ NUÔI 21

I Quá trình nhân sinh khối 21

II Thiết kế bể nuôi 50m 3 22

II.1 Chọn kích thước bể 22

II.2 Thiết kế và tính toán cánh khuấy, nhà xưởng 22

II.2.1 Khối lượng cánh khuấy 22

II.2.2 Vật liệu xây bể 27

II.2.3 Nhà xưởng và hệ thống đèn, mái che 27

II.2.4 Tính toán kinh tế cho bể nuôi 28

II.2.5 Vận hành bể nuôi tảo N.Oculata thể tích 50m 3 28

CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

I Lưu giữ tảo giống 31

II Nghiên cứu tìm môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tăng trưởng loài N.oculata 32

II.1 Lần thực hiện thứ 1 (Thí nghiệm I.1) 32

II.2 Lần thực hiện thứ 2 (Thí nghiệm I.2) 33

II.3 Lần thực hiện thứ 3 (Thí nghiệm I.3) 35

III Nghiên cứu tìm độ mặn thích hợp cho tăng trưởng loài N.oculata 35

III.1 Lần thực hiện thứ 1 (Thí nghiệm II.1) 35

III.2 Lần thực hiện thứ 2 (Thí nghiệm I.2) 37

III.3 Lần thực hiện thứ 3 (Thí nghiệm I.3) 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 43

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1: Các điều kiện môi trường phổ biến được dùng để nuôi trồng vi tảo (đã được sửa đổi

từ tài liệu của Anonymous,1991) 5

Bảng 2: Các điều kiện nuôi tảo N oculata được công bố bởi nhiều tác giả khác nhau 8

Bảng 3: Ưu và nhược điểm của các kỹ thuật nuôi tảo khác nhau (đã được sửa đổi từ tài liệu

của Anonymous 1991) 11

Bảng 4: Tốc độ tăng trưởng của N oculata khi nuôi bằng môi trường Conway và F/2 33 Bảng 5: Tốc độ tăng trưởng của N oculata khi nuôi ở các độ mặn khác nhau 36

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng TàuNgành Công nghệ kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1 Đơn vị nuôi tảo vô trùng 16

Hình 2 Buồng đếm Neubauer 18

Hình 3: Sơ đồ nuôi sinh khối 22

Hình 4: Nhà xưởng công nghiệp 28

Hình 5: Sơ đồ nhân sinh khối tảo từ phòng thí nghiệm ra bể nuôi 29

Hình 6: Sơ đồ cấp nước cho bể nuôi tảo 29

Hình 7: Tảo N.oculata phát triển trên môi trường thạch 31

Hình 8: Lưu giữ tảo giống 32

Hình 9 Mật độ của N oculata nuôi bằng môi trường Conway và F/2 trong thí nghiệm I.1 33 Hình 10: Mật độ của N oculata nuôi bằng môi trường Conway và F/2 trong thí nghiệm I.2 34

Hình 11; Mật độ của N oculata nuôi bằng môi trường Conway và F/2 trong thí nghiệm I.3 34

Hình 12: Mật độ của N oculata nuôi ở các độ mặn khác nhau trong thí nghiệm II.1 36

Hình 13: Mật độ của N oculata nuôi ở các độ mặn khác nhau trong thí nghiệm II.2 37

Hình 14: Mật độ của N oculta nuôi ở các độ mặn khác nhau trong thí nghiệm II.3 38

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

TỪ VIẾT TẮT

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Tổng quan về vi tảo

I.1 Tầm quan trọng của vi tảo trong sản xuất giống hải sản

Năm 1999, sản lượng vi tảo sản xuất cho ngành nuôi trồng thủy sản (NTTS)

là 1000 tấn, trong đó 62% cho nhuyễn thể, 21% cho tôm và 16% cho cá (Muller–

Feuga, 2004) Vi tảo biển cần thiết cho dinh dưỡng của ấu trùng, là nguồn thức ăn trực tiếp cho các loài nhuyễn thể hoặc tôm he, hoặc gián tiếp cho các loài cá biển (Brown et al., 1997; Muller–Feuga 2000) Các loài tảo thường được sử dụng nhất

cho NTTS là Chlorella, Tetraselmis, Isochrysis, Pavlova, Phaeodactylum,

Chaetoceros, Nannochloropsis, Skeletonema và Thalassiosira (Yamaguchi 1997; Borowitzka, 1997; Apt and Behrens, 1999)

I.1.1 Giá trị dinh dưỡng của vi tảo

Để sử dụng trong NTTS, vi tảo phải hội tụ đầy đủ những yếu tố: dễ nuôi, không độc tố, kích thước và hình dạng thích hợp cho con mồi, có giá trị dinh dưỡng cao, thành tế bào có thể tiêu hóa được (Brown 1999; Renaud et al., 2002) Hàm lượng protein và các acid béo không no HUFAs (như eicosapentaenoic acid [EPA], arachidonic acid [AA] and docosahexaenoic acid [DHA]) là yếu tố chính quyết định giá trị dinh dưỡng của tảo (Reitan et al., 1997) Nhưng tỉ lệ DHA, EPA và AA quan trọng hơn là hàm lượng của các HUFAs này (Apt and Behrens 1999) Hàm lượng vitamin cũng đóng vai trò quan trọng không kém (Brown et al., 1999; Yamaguchi 1997)

Vi tảo thường được sử dụng kết hợp các loài kể trên để đảm bảo dinh dưỡng tối đa và tốt hơn cho sự phát triển của vật nuôi (Yamaguchi 1997; Becker 2004) Tốc

độ sinh trưởng của vật nuôi cho ăn bằng hỗn hợp các loài tảo khác nhau thường cao hơn vật nuôi chỉ được cho ăn bằng một loài tảo Một loài tảo cá biệt có thể thiếu một chất dinh dưỡng nào đó, trong khi loài tảo khác có thể chứa chất dinh dưỡng đó và thiếu chất dinh dưỡng khác

Giá trị dinh dưỡng của bất kỳ loài vi tảo nào đối với một sinh vật nào đó phụ thuộc vào kích thước tế bào, tính tiêu hóa, việc sản sinh các hợp chất độc hại và thành phần sinh hóa Mặc dù có sự khác biệt rõ rệt trong thành phần các loài vi tảo, nhưng protein luôn là thành phần hữu cơ chủ yếu (6–52%), tiếp đến là lipid (7–23%)

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

rồi đến carbohydrate (5–23%) Tất cả các loài vi tảo đều rất giàu và có thành phần cấu tạo amino acid giống nhau Polysaccharides ở các loài vi tảo thay đổi ở hàm lượng đường, nhưng hầu hết rất cao glucose (21–87%) Diatoms, prymnesiophytes, cryptomonads và eustigmatophytes có hàm lượng cao PUFAs, ở một hoặc cả hai dạng đó là EPA 20:5(n–3) (Eicosapentaenonic acid), và DHA 22:6(n–3) (Docosahexaenoic acid) rất cần thiết cho ấu trùng cá biển (chiếm 5–35% lượng acid béo) Ở prasinophytes chỉ có một dạng PUFA với hàm lượng chỉ ở mức thấp–trung bình (4–10%) Chlorophytes thì ở mức rất thấp (0–3%) Tất cả các loài đều có hàm lượng ascorbic acid và riboflavin cao (l–16mg/g và 20–40µg/g trọng lượng khô) (Brown and et al., 1997)

Hàm lượng protein, lipid và carbohydrate (tính theo % trọng lượng khô) ở loài

N oculata lần lượt là 35, 18 và 7,8; ở loài I galbana lần lượt là 29, 23 và 12,9

Tuy nhiên giá trị dinh dưỡng của vi tảo có thể biến đổi đáng kể theo điều kiện nuôi

I.1.2 Sử dụng vi tảo trong sản xuất giống hải sản

Hiện nay, trên thế giới có trên 40 loài tảo khác nhau được phân lập và nuôi để làm các chủng tảo thuần khiết trong các hệ thống thâm canh (Lavens and Sorgeloos,

 Tôm he

Vi tảo biển là nguồn thức ăn cho ấu trùng tôm từ giai đoạn 2 (zoea) đến 3 (mysis)

Các loài thường được dùng là Skeletonema, Chaetoceros, Tetraselmis, Chlorella và

Isochrysis Muller–Feuga (2000) ước tính khoảng 1m3 tảo có mật độ 3x106 tế bào/mL cần thiết để sản xuất 1 triệu postlarvae

 Cá biển

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

Vi tảo biển sử dụng trong sản xuất giống cá biển cần thiết ở 2 khía cạnh: (i) nuôi con mồi sống cho ấu trùng cá, (ii) sử dụng trực tiếp trong các bể ương ấu trùng bằng “kỹ thuật nước xanh” Ảnh hưởng của sự có mặt của vi tảo trong bể nuôi ấu trùng hiện vẫn chưa được hiểu đầy đủ và bao gồm (Chuntapa et al., 2003; Rodolfi et al., 2003):

(i) Làm ổn định chất lượng nước trong các hệ thống tĩnh (lấy đi các sản phẩm chuyển hóa phụ, sản sinh oxy), (ii) là nguồn thức ăn trực tiếp thông qua sự hấp thụ tích cực của ấu trùng, các polysaccarit có ở vách tế bào làm kích thích hệ thống miễn dịch không đặc trưng ở ấu trùng, (iii) là nguồn chất dinh dưỡng gián tiếp cho ấu trùng cá thông qua thức ăn tươi sống (duy trì giá trị dinh dưỡng của các sinh vật ăn mồi sống

ở trong bể), (iv) làm tăng số lần ăn bằng việc tăng cường sự tương phản thị giác và

sự tán xạ ánh sáng, (v) kiểm soát vi khuẩn bằng các dịch tảo tiết ra trong nước bể và/hoặc trong ruột ấu trùng

Luân trùng Brachionus plicatilis, là thức ăn không thể thay thế cho ấu trùng của hầu

hết các loài cá biển, là điều kiện tiên quyết cho sự thành công của trại sản xuất giống

cá biển Có thể thay thế tảo tươi bằng thức ăn tổng hợp cho nuôi luân trùng, nhưng hiệu quả kém hơn rất nhiều so với vi tảo Vi tảo khi sử dụng làm thức ăn cho luân trùng sẽ: (i) phục hồi quần thể luân trùng bị tàn rất nhanh, (ii) cải thiện chất lượng

dinh dưỡng của luân trùng, (iii) giảm thiểu việc nhiễm vi khuẩn, đặc biệt là Vibrio

Một trong những nhu cầu quan trọng cho bất kỳ trại SXG cá biển nào là tạo được chất lượng tảo cao và ổn định với giá thành chấp nhận được (Herrero et al., 1991) Tốc độ phát triển và tỷ lệ sống của ấu trùng có liên quan mật thiết đến chất lượng tảo (Hirayama and Funamoto, 1983; James and Abu-Rezq, 1988; Ferreiro et al., 1991; Korstad et al., 1995)

Nannochloropsis, Tetraselmis và Isochrysis là 3 loài tảo sử dụng phổ biến trong SXG

cá biển nhằm cung cấp các acid béo cần thiết cho ấu trùng thông qua luân trùng (Watanabe et al., 1978, 1983; Yufera et al., 1983)

Nannochloropsis có hàm lượng cao của EPA, nuôi trong các trại SXG cá biển dùng

làm thức ăn cho luân trùng và ương cá bằng “kỹ thuật nước xanh” Vai trò của N

oculata trong ương nuôi ấu trùng các loài cá biển là cải thiện sức khỏe và nâng cao tỷ

lệ sống ấu trùng đã được chứng tỏ bởi nhiều tác giả (Eda et al., 1990; Murashige et al., 1991; Tamaru et al., 1994) Gần đây Okauchi (2004) tiếp tục cho thấy vai trò của

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

loài tảo này trong ương nuôi ấu trùng cá Pagrus major, dùng để quản lý chất lượng

nước bể ương và làm thức ăn cho luân trùng Cụ thể là khi duy trì trong bể ương ở mật độ 5–10×105tế bào/mL, nồng độ ammonia tổng số NH4-N, nitrite NO2-N,nitrate

NO3-N và phosphate PO4-P giảm 1,5–2,0 lần so với bể bể đối chứng Luân trùng trong bể ương mang nhiều trứng hơn và hàm lượng EPA và (n-3) HUFA cao hơn Ở

Nhật, từ cách đây hơn 20 năm, N oculata được sử dụng là nguồn thức ăn chính cho

luân trùng trong các trại sản xuất giống (SXG) cá biển Nhưng thời gian gần đây,

việc sử dụng N oculata ngày càng giảm dần bởi sản phẩm tảo cô đặc trên đối tượng

Chlorella nước ngọt ngày càng phổ biến Tuy nhiên Chlorella nước ngọt có hàm

lượng n–3(HUFA) thấp, là acid béo cần thiết cho nhu cầu của cá biển, khó sống trong môi trường bể ương là nước biển, vách tế bào cứng không thích hợp cho tiêu

hóa của vật nuôi Vì vậy, việc nuôi loài N oculata vẫn phải duy trì trong các trại

I.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự biến động của quần thể tảo

I.2.1 Ánh sáng:

Giống như nhiều loài thực vật, vi tảo cũng cần có quá trình quang hợp, hấp thụ cacbon vô cơ để chuyển hóa thành các chất hữu cơ cần thiết Ánh sáng là nguồn năng lượng điều khiển các phản ứng này, vì vậy các khía cạnh cường độ ánh sáng (CĐAS), phổ ánh sáng và thời gian chiếu sáng là các yếu tố cần được xem xét CĐAS đóng vai trò quan trọng, nhưng yêu cầu về CĐAS thay đổi rất lớn theo độ sâu của môi trường nuôi và mật độ tảo nuôi Tảo chỉ chịu được ánh sáng mặt trời trực tiếp khi mật độ tảo đạt được khá cao (Guillard, 1975) CĐAS quá lớn có thể ức chế quá trình quang hợp (Lavens and Sorgeloos, 1996) Có thể là ánh sáng tự nhiên hoặc đèn huỳnh quang Tốt nhất là dùng đèn huỳnh quang phát sáng ở phổ ánh sáng xanh

da trời hoặc đỏ vì đó là những phần tích cực nhất của phổ ánh sáng đối với sự quang hợp Dù là ánh sáng tự nhiên hay nhân tạo cũng cần tránh làm nóng quá mức

I.2.2 Nhiệt độ:

Nhiệt độ tối ưu cho thực vật phù du thường từ 20oC đến 24oC, có thể thay đổi theo thành phần của môi trường nuôi và loài nuôi Nếu nhiệt độ cao hơn 35oC thì vi tảo có thể bị chết và nếu thấp hơn 16oC thì tảo chậm phát triển

I.2.3 Độ mặn:

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

Mỗi loài tảo khác nhau thường thích nghi với một khoảng dao động độ mặn khác nhau Hầu hết các loài sinh trưởng trong khoảng độ mặn từ 12 đến 40mg/L, nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn 20 đến 24mg/L Mặc dù có khả năng thích nghi, nhưng sự thay đổi độ mặn một cách đột ngột sẽ làm thay đổi nhanh chóng áp suất thẩm thấu của tế bào, thậm chí sẻ bị chết hàng loạt

I.2.4 Độ pH:

Biên độ pH đối với hầu hết các loài tảo nuôi là 7 đến 9 và biên độ tối ưu là 8,2 đến 8,7 Việc nuôi có thể bị thất bại do cấu trúc tế bào bị phá vỡ do duy trì pH không thích hợp, có thể khắc phục bằng các sục khí hoặc CO2 làm đệm dung dịch trong quá trình nuôi

I.2.5 Sục khí, đảo nước:

Đảo nước là việc làm cần thiết để ngăn ngừa tảo không bị lắng nhằm đảm bảo tất cả các tế bào của quần thể đều tiếp xúc được với ánh sáng các chất dinh dưỡng như nhau, nhằm tránh hiện tượng phân tầng nhiệt và cải thiện sự trao đổi khí giữa môi trường nuôi và không khí Không khí là yếu tố quang trọng vì nó chứa carbon dạng CO2 phục vụ cho quá trình quang hợp Đối với trường hợp nuôi rất dày,

CO2 bay ra từ không khí (chứa 0,03%) sẻ sủi bọt làm hạn chế sức sinh trưởng của tảo

và có thể bổ sung CO2 tinh khiết vào việc cung cấp không khí (với tỉ lệ bằng 1% không khí) Việc bổ sung CO2 có tác dụng làm đệm nước chống lại những thay đổi

về pH trong môi trường nước do sự cân bằng giữa CO2 và H2CO3

Bảng 1: Các điều kiện môi trường phổ biến được dùng để nuôi trồng vi tảo (đã được sửa đổi từ tài liệu của Anonymous,1991)

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

I.2.6 Môi trường dinh dưỡng:

Dinh dưỡng là yếu tố quang trọng ảnh hưởng mạnh tới sinh trưởng và phát triển của vi tảo trên phương diện số lượng và chất lượng Mỗi loài tảo khác nhau có nhu cầu về chất dinh dưỡng khác nhau, số lượng từng chất dinh dưỡng cũng khác nhau Nhu cầu về đạm giảm dần từ tảo Lục, tảo Lam và tảo Silic có nhu cầu về đạm

là thấp nhất, silic rất cần thiết cho sự phát triển của tảo Silic vì nó tham gia vào cấu tạo màng tế bào

Muối Nitơ rất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tảo Bởi vì nitơ là thành phần cơ bản tạo nên các loại protein (protein cấu trúc và protein chức năng) và tham gia vào cấu tạo của nhiều loại vitamin

Photpho được coi là chìa khóa của quá trình trao đổi chất Hàm lượng photpho không cần cao, nhưng phải có nếu thiếu tảo không thể phát triển

Việc bổ sung các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết có tác dụng đến quá trình trao đổi chất của vi tảo Các nguyên tố vi lượng gồm một số muối kim loại có nồng độ thấp như: CuSO4, CoCl2, ZnSO4, FeCl3… trong đó sắt được bổ sung nhiều nhất

Ngoài ra vitamin cũng được bổ sung vào môi trường nuôi tảo (B1, B12, Biotin) dù chỉ là lượng rất nhỏ nhưng thúc đẩy gia tăng sinh khối

I.3 Các hệ thống nuôi vi tảo

I.3.1 Các hệ thống nuôi ngoài nước

Vi tảo được nuôi bằng các hệ thống bịch nhựa, trong bể nhỏ, hoặc trong ao (Lee and Tamaru, 1993; Liao etal., 1993) Năng suất trong các hệ thống này rất thấp

và không ổn định mặc dù chi phí nhân công rất cao (Sato, 1991) Có nhiều thiết kế cho hệ thống nuôi tảo như hệ thống ống dẫn, hệ thống ống xoắn ốc được sử dụng trong phòng thí nghiệm cho mật độ cao, nhưng chi phí tốn kém thể tích thu được tương đối nhỏ

Các hệ thống nuôi liên tục sử dụng ánh sáng nhân tạo đều cho thấy rằng mật

đô cao nhưng chi phí và giá thành sản phẩm vi tảo cao Gần đây N.oculata được nuôi

sinh khối ngoài trời bằng các tấm kính mỏng và ống dẫn, cho mật độ cao

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

Hệ thống kích thước và vận tốc dòng chảy được Ami Ben- Amotz đưa ra cho

bể nuôi tảo như sau: chiều dài 10 đến 300m, rộng 1 đến 20m, diện tích có thể từ 300 đến 4000m2 Dùng chất liệu làm bể như xi măng, lót nhựa, tráng lớp keo vào thành

bể, một số vật liệu khác Tạo dòng chảy gồm: cánh khuấy, bơm, xục khí, vòng xuyến

ở hai đầu bể, vận tốc dòng 5 đến 40cm/s Có điều chỉnh pH trong quá trình nuôi.Chiều cao mực nước trong bể 5 đến 100cm Xử lý bể nuôi sau khi nuôi bằng thiết bị làm ráo nước, bơm, rửa bể bằng dung dịch hóa chất

I.3.2 Các hệ thống nuôi trong nước

Quá trình nuôi trong nước hầu hết là các bịch nhựa dung tích nhỏ, bể ximăng,

ao nhỏ được nuôi ngoài trời Hầu hết các quá trình nuôi này dễ lây nhiễm, dễ đến pha tàn lụi của tảo, không nuôi được mật độ cao

I.3.3 Tính bức thiết của hệ thống nuôi 50m 3

Là hệ thống dung tích lớn được nuôi trong nhà xưởng công nghiệp khép kín, quá trình xử lý nước được triệt để Cung cấp tảo sinh khối lớn cho nuôi trồng thủy sản Kết hợp được việc lấy ánh sáng tự nhiên và ánh sáng nhân tạo, phi phí cho nhân công vận hành thấp

II Loài N.oculata

II.1 Phân loại

Ngành Heterokontophyta Hocck, Mann và Jahns, 1985

Lớp Eustigmtophyceae Hibberd, 1981

Bộ Eustigmatales Hibberd, 1981

Họ Monopsidaceae Hibberd, 1981

II.2 Các điều kiên nuôi của vi tảo N.oculata

N.oculata là loài quang tự dưỡng có khả năng sản xuất Eicosapentaenoic

(EPA, [20:5(n-3)]) cao nhất, là loài có khả năng thích nghi với sự biến động nhiệt độ rộng, phát triển tốt trong nhiệt độ từ 10 - 30ºC, là loài rộng muối, thích nghi được

trong khoảng độ mặn 7 - 30‰ Điều kiện nuôi N.oculata được công bố bởi nhiều tác

giả khác nhau như được trình bày ở bảng 1

II.3 Các công trình nghiên cứu

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

II.3.1 Các công trình nghiên cứu ngoài nước

 Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng

Cho đến nay, có 3 môi trường dinh dưỡng được công bố cho nuôi vi tảo phục vụ ngành NTTS (giữ giống ở phòng thí nghiệm hay sinh khối) là Conway (Walne, 1966), Walne (Laing, 1991) và F/2 (Guillard và Ryther, 1962) Không có khác biệt giữa hai môi trường Conway và Walne, môi trường Conway thực chất là môi trường Walne có hàm lượng Thiamin (B1), Cyanocobalamin (B12) cao hơn và được bổ sung thêm Biotin (H)

Bảng 2: Các điều kiện nuôi tảo N oculata được công bố bởi nhiều tác giả khác nhau

Ánh sáng(µmol photon/m2/s)

Độ mặn (‰)

2000

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

Laing và Utting (1980) khi nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn trên tăng

trưởng của loài I galbana cho rằng độ mặn 15-25‰ là khoảng thích hợp nhất

Nghiên cứu tiếp theo của Fabregas và ctv (1984) cho thấy độ mặn và nồng độ các chất dinh dưỡng ảnh hưởng chặt chẽ đến sự phát triển của loài này, trong đó khoảng

độ mặn 15-35‰ là phù hợp

Abu-Rezq và ctv (1999) đã khảo sát tăng trưởng của hai loài N oculta và I

galbana ở dãy độ mặn từ 5 đến 40‰ (cách nhau 5‰) ở điều kiện cường độ ánh sáng

4500-5000lux cho kết quả N oculta đạt mật độ cực đại 24-32 triệu tb/mL, tương ứng với tốc độ tăng trưởng 0.11-0.13/ngày ở độ mặn 20-40‰ I galbana đạt mật độ cực

đại ở 4,5 triệu tb/mL, tương ứng với tốc độ tăng trưởng 0.14/ngày ở độ mặn 30‰ Nghiên cứu của các tác giả Brown và ctv (1993); Renaud và Parry (1994) trên hai

loài N oculata và I galbana cũng cho kết quả tương tự

Gần đây nhất của tác giả Sen và ctv (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ

mặn trên hai loài N oculata và I galbana Tác giả đã bố trí thí nghiệm ở 3 độ mặn

25, 30 và 35‰ trong điều kiện ánh sáng liên tục 2000-3000lux, 24ºC, pH 7,5 (cung

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

cấp CO2), kết quả cho thấy loài N oculata đạt mật độ cực đại là 720, 780 và 275

triệu tb/mL lần lượt ở các độ mặn 25, 30 và 35‰ Tác giả đã kết luận độ mặn 25 và 30‰ thích hợp hơn 35‰ cho cả hai loài vi tảo

 Công nghệ nuôi

Vi tảo thường được nuôi sinh khối bằng các hệ thống là nuôi trong bịch nhựa, trong bể, hoặc ao (raceway) (Lee and Tamaru, 1993; Liao et al., 1993) Năng suất tảo trong các hệ thống này rất thấp và không ổn định mặc dù tốn nhân công quản lý cao (Sato, 1991) Vào thập kỷ trước, nhiều tiến bộ kỹ thuật đã ứng dụng vào kỹ thuật nuôi vi tảo không những trong hệ thống hở mà còn trong hệ thống kín (closed bioreactor) (Tredici and Materassi 1992; Chaumont, 1993; Borowitzka, 1996) nhưng

kỹ thuật này chưa được tiếp nhận vào ngành NTTS Có nhiều thiết kế cho hệ thống nuôi này, như thiết kế bằng ống dẫn (tubular) dường như ổn định và hiệu quả nhất

năm 1976 và sau đó nhiều công trình khắp nơi trên thế giới đã nghiên cứu (Chaumont et al., 1988; Tredici and Materassi, 1992; Pulz, 1994; Borowitzka, 1996;

Hu et al., 1996) Trong số các thiết kế bằng hệ thống ống dẫn, hệ thống ống dẫn hình xoắn ốc Biocoils của công ty Biotechna (Robinson et al., 1988) là hiệu quả nhất sử dụng trong phòng thí nghiệm, dung tích pilot và nuôi sinh khối ngoài trời cho nhiều

loài tảo như Tetraselmis, Isochrysis, Chaetoceros, Pavlova, Nannochloropsis,

Spirulina, Chlorella … thực hiện ở Anh và Úc (Chrismadha and Borowitzka, 1994; Borowitzka, 1996; Watanabe and Hall, 1996) Hệ thống này được quản lý chặt, không những không nhiễm tạp mà còn có thể nuôi liên tục ở mật độ cao hơn rất nhiều so với hệ thống cũ Khả năng duy trì việc nuôi liên tục, sử dụng ánh sáng tự nhiên, không những giảm giá thành mà còn giúp cung cấp một lượng sinh khối lớn

ổn định (Borowitzka, 1997) Ưu điểm rõ rệt của hệ thống nuôi kín như Biocoil là có thể duy trì các điều kiện thủy–hóa thích hợp cho tốc độ phát triển tối ưu của tế bào

Đạt được năng suất cao này là nhờ ổn định các điều kiện nuôi ở mức tối ưu như ánh sáng, nhiệt độ và sự khuấy trộn Không những cho năng suất cao, hệ thống nuôi này còn cung cấp sinh khối tảo với chất lượng cao, tối ưu hóa thành phần sinh hóa học của tế bào Bởi vì tất cả các yếu tố như: dinh dưỡng, ánh sáng, pH, nhiệt độ, giai đoạn phát triển/pha đều ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa học tế bào (Renaud et

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

al., 1991; Dunstan et al., 1993) và những yếu tố này đều được điều khiển và duy trì

ổn định trong hệ thống nuôi

Không dễ dàng để thiết kế hệ thống nuôi vi tảo quang tự dưỡng một cách hiệu quả, bởi vì ánh sáng bị yếu đi rất nhanh qua cột nước, ánh sáng chỉ tồn tại ở tầng nước mặt, vì vậy chỉ đạt được mật độ nuôi ở mức giới hạn Thậm chí các kiểu nuôi trong hệ thống kín, nhưng có tỷ lệ thể tích/diện tích cao (chẳng hạn 200L/m2) vẫn cho mật độ thấp Vì vậy đã xuất hiện hệ thống nuôi kín quang phản ứng sinh học có

độ sâu/chiều rộng cột nước (gọi là đường dẫn ánh sáng, light–path) hẹp để đảm bảo ánh sáng xuyên qua Richmond and Zou (1999) đã kết luận rằng đường dẫn ánh sáng càng hẹp thì tốc độ phát triển và năng suất của tảo càng cao Ngoài ra tác giả này con cho thấy rằng trong điều kiện thủy lý hóa tối ưu, mật độ cao và tốc độ khuấy trộn có mối liên quan tỷ lệ thuận với nhau

Bảng 3: Ưu và nhược điểm của các kỹ thuật nuôi tảo khác nhau (đã được sửa đổi từ tài liệu của Anonymous 1991)

đoán trước được)

Tốn kém

trước được)

Nuôi liên tục

Hiệu quả, cung cấp đều đặn các

tế bào chất lượng cao, tự động hóa được, tốc độ sản xuất cao nhất trong thời gian dài

Khó, chỉ có thể áp dụng khi nuôi với số lượng nhỏ, thiết bị phức tạp, chi phí có thể cao

tin cậy

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

lượng có thể thất thường

Nuôi sinh khối tảo Nannochloropsis đòi hỏi phải sử dụng hệ thống kín quang

phản ứng sinh học, bởi vì hệ thống nuôi hở trong ao (raceway) không ổn định trong thời gian dài, tảo bị tàn lụi sau một vài tuần do nhiễm nguyên sinh động vật, vi khuẩn hoặc các loài tảo khác (Okauchi 1991; Sukenik 1999) Việc sử dụng kháng sinh hoặc chlorine không khắc phục được các vấn đề trên (Sukenik 1999) Hình thức phổ biến

ở các trại SXG là nuôi trong bịch nhựa hoặc bể sợi thủy tinh bằng ánh sáng nhân tạo (Fulks and Main 1991) Hình thức này rẻ tiền, dễ vận hành và chi phí thấp nhưng kết quả có nhiều hạn chế: mật độ thấp nên quần thể dễ bị lấn át, năng suất thấp < 0.05 g

TL khô/L/ngày và hiệu quả sử dụng ánh sáng không cao (Tredici 1999)

Có nhiều thiết kế khác nhau cho hệ thống nuôi kín quang phản ứng sinh học Chini Zittelli et al (2000) sử dụng hệ thống nuôi bảng (modular flat panel photobioreactor) có đường dẫn ánh sáng 1,6cm với CĐAS 230µmol photon/m2/s ở

cả hai mặt, cho năng suất 1,45g TL khô/L/ngày, cao gấp 30 lần so với năng suất nuôi

Nannochloropsis trong bể sợi thủy tinh 200L sử dụng ánh sáng nhân tạo của James and Al–Khars (1990) Zou et al (2000) sử dụng hệ thống tấm (flate plate reactor) có

2,9g TL khô/L/ngày

Gần đây Nannochloropsis sp đã được nuôi sinh khối ngoài trời bằng hệ thống

các tấm kinh mỏng (glass plates) và ống dẫn (horizontal tubular) Chini Zittelli et al (1999) ở Florence, Ý đã sử dụng hệ thống ống dẫn ngoài trời để nuôi sinh khối

Nannochloropsis sp mật độ cao, hoạt động từ tháng 3 đến tháng 9, cho năng suất

0,6g TL khô/L/ngày, sản xuất EPA cho năng suất 32mg/L/ngày Hệ thống bao gồm các ống nhựa mềm có chiều dài 6,4 m, đường kính 43 mm, dày 0,15 mm nối với nhau bằng ống PVC đặt trên mặt nền song song theo chiều nằm ngang trong nhà có mái che bằng tấm nhựa trong

Zhang et al (2001) sử dụng hệ thống tấm có dung tích 500–1000L, hoạt động quanh năm, cho mật độ 5–6x108 tế bào/mL hoặc năng suất 0,21 và 0,27g TL khô/L/ngày và mùa đông và mùa hè (hình 3,4)

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

Chini Zittelli et al., 2003 đã thiết kế hệ thống nuôi hình vành khuyên (annular reactor) có thể sử dụng ánh sáng tự nhiên, nhân tạo hoặc kết hợp được cả hai nguồn

ánh sáng để nuôi sinh khối Nannochloropsis sp Hệ thống bao gồm 2 ống thủy tinh

hình trụ cao 2m với đường kính khác nhau đặt lồng vào nhau tạo nên thể tích nuôi hình vành khuyên 120L (hình 5) Đèn để cung cấp ánh sáng nhân tạo được đặt bên trong hình trụ nhỏ Hệ thống sử dụng 1 bóng đèn halogen 400W và ánh sáng tự nhiên cho năng suất lần lượt là 34g trọng lượng (TL) khô/ngày và 16,6 – 34,1g/TL khô/ngày; năng suất cao nhất 41,3 – 48,3g/TL khô/ngày đạt được ở hệ thống sử dụng kết hợp cả hai nguồn sáng Trong suốt 2 năm hoạt động, 1200L (=120x10) hệ thống

hình vành khuyên đã cung cấp lượng Nannochloropsis sp ổn định ở mức trung bình

270g TL khô/ngày, tạo ra 2000L tảo cô đặc (50g TL khô/L) góp phần thành công cho các trại SXG cá seabream bằng kỹ thuật nuôi nước xanh

II.3.2 Các công trình nghiên cứu trong nước

Phạm Thị Lam Hồng (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn, ánh sáng

và tỷ lệ thu hoạch lên một số đặc điểm sinh học, thành phần sinh hóa của N.oculata

trong điều kiện thí nghiệm, đã góp phần thêm những hiểu biết quang trọng về

N.oculata và ứng dụng nuôi bán lien tục để cung cấp tảo cho việc sản xuất động vật

phù du, trong quá trình ương các loại ấu trùng động vật biển

Lục Minh Diệp (1999) đã có những công bố quan trọng khi nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phân bón, tỷ lệ thu hoạch lên sự phát triển của hỗn hợp tảo tự nhiên

và thử nghiệm nuôi tảo N.oculata

Hồng Thị Kiều Nga (2002) ảnh hưởng của chế độ phân bón đến sinh trưởng

của quần thể N.oculata

Mai Thị Thuỳ Linh (2004), nuôi thu sinh khối hai loài tảo N oculata và I

galbana ở quy mô túi nylon 50 lít và 2m3

Nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Thủy sản Nha Trang sử dụng hệ thống nuôi kín quang phản ứng sinh học có thiết kế ống dẫn để nghiên cứu ảnh hưởng của

mật độ ban đầu và tỷ lệ thu hoạch lên sinh trưởng của vi tảo N.oculata nuôi ngoài

trời Kết quả nghiên cứu cho thấy mật độ ban đầu thích hợp là 8.106 tế bào/mL đạt mật độ cực đại 61.106 tế bào/mL tỷ lệ thu hoạch 10% thể tích nuôi thì ít ảnh hưởng đến quần thể tảo (Bùi Bá Trung và ctv, 2009)

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Hiện tại công trình nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II

“Nghiên cứu công nghệ nuôi, thu sinh khối vi tảo Isochrysis galbana,

Nannochloropsis oculata phục vụ sản xuất giống hải sản” đã triển khai từ năm 2011

đến 2013, nhằm xây dựng qui trình công nghệ nuôi thâm canh và tạo sản phẩm cô

đặc của hai loài vi tảo biển Isochrysis galbana và Nannochloropsis oculata Cụ thể là

xác định được hệ thống nuôi kín quang phản ứng sinh học tối ưu cho hai loài vi tảo

biển là Isochrysis galbana đạt mật độ 20-30 triệu tế bào/mL và loài Nannochloropsis

oculata đạt mật độ >150 triệu tế bào/mL Xác định được qui trình công nghệ để tạo

sản phẩm vi tảo Isochrysis galbana và Nannochloropsis oculata cô đặc ở dạng lỏng

và nhão có thời gian bảo quản theo thứ tự >1 tháng và >2 tháng để thay thế vi tảo tươi (Đặng Tố Vân Cầm, 2011)

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Đối tượng, địa điểm nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: vi tảo Nannochloropsis oculata (N.oculata)

Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Quốc Gia Giống Hải sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, 167 đường Thùy Vân, phường Thắng Tam, thành phố Vũng Tàu

II Nội dung nghiên cứu

1 Lưu giữ giống vi tảo N oculata trên môi trường thạch và trên môi trường

lỏng

2 Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho sự phát triển của

N.oculata

3 Nghiên cứu tối ưu hóa độ mặn cho sự phát triển của N.oculata

III Phương pháp nghiên cứu

III.1 Các phương pháp lưu giữ giống vi tảo

III.1.1 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch

a Phương pháp đổ đĩa thạch

Chuẩn bị đĩa petri: đĩa petri sau khi được rửa sạch, để khô, lau qua bằng cồn

90o, bọc lại bằng giấy nhôm, sấy ở nhiệt độ 198oC trong 2 giờ

Chuẩn bị môi trường agar: lượng agar cần dùng là 15g/ L nước biển Khuấy agar trong nước ấm đến khi agar trong thì bổ sung môi trường dinh dưỡng, hàm lượng gấp 10 lần khi giữ giống trên môi trường lỏng, hấp tiệt trùng ở 121ºC trong vòng 20 phút (HVE 50, HIRAYAMA, Nhật)

Đổ thạch: dung dịch agar và môi trường dinh dưỡng sau khi hấp ở nhiệt độ

50oC đến 60oC thì bổ sung hàm lượng Vitamine, hơ nóng miệng chai có chứa agar trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó đổ lên đĩa petri, lượng agar chiếm 2/3 thể tích đĩa, tất

cả thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng (SANYO, Nhật)

Sau khi thạch nguội, đậy nắp đĩa petri và hàn kín đĩa thạch bằng parafin dẻo Đĩa thạch được cất giữ ở nhiệt độ phòng, sau 3 đến 4 ngày (tránh trường hợp đĩa thạch bị nhiễm, chưa phát hiện khuẩn lạc) mới có thể sử dụng để cấy tảo

b Phương pháp cấy tảo giống

Ly tâm tảo: tảo được quay ly tâm lạnh ở vận tốc 3000 vòng trong 2 phút

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Cấy tảo: tảo sau khi ly tâm tách bỏ phần nước bên trên chỉ lấy phần tảo cô đặc bên dưới, dùng que cấy vô trùng lấy phần tảo cô đặc, quét nhẹ đầu bông có chứa tảo lên mặt thạch theo hình ziczắc Sau đó hàn kín bằng parafin dẻo, tất cả thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng

c Phương pháp lưu giữ đĩa thạch

Đĩa thạch sau khi cấy được lưu giữ trong tủ chuyên dụng hiệu MLR-350H (SANYO, Nhật), điều chỉnh ở nhiệt độ 18ºC, cường độ ánh sáng 1000-3000lux, độ

ẩm 70% Các đĩa thạch được đặt dưới ánh đèn trong tủ giữ giống sao cho diện tích nhận được ánh sáng là lớn nhất

III.1.2 Phương pháp giữ giống trên môi trường lỏng

a Phương pháp thu hoạch tảo giống từ đĩa thạch

Chọn đĩa thạch: sau quá trình nuôi trong tủ chuyên dụng, chọn những đĩa thạch có vi tảo phát triển tốt, không bị nhiễm khuẩn để thu hoạch

Thu hoạch tảo giống: thực hiện trong tủ cấy vô trùng, tháo băng parafin hàn kín, dùng nước biển đã hấp cho vào đĩa petri một lượng vừa đủ, dùng que cấy khử trùng quẹt nhẹ lên mặt thạch đã cấy, thao tác nhẹ nhàng cẩn thận không để rách thạch

b Nhân giống ra chai vô trùng

Đơn vị nuôi vô trùng: chai thủy tinh hình trụ, thể tích 1L, có nắp đậy kín, sử dụng lọc khí 0.2µm (SARTORIUS, Đức) để đảm bảo cho hệ thống nuôi vô trùng như hình 1 (Đặng Tố Vân Cầm, 2011)

Hình 1 Đơn vị nuôi tảo vô trùng

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

Chuẩn bị nước nuôi: nước biển (điều chỉnh độ mặn thích hợp) đã qua xử lý lắng, khử trùng bằng Chlorine nồng độ 30ppm, trung hòa bằng Natrithiosunfat, đem lọc qua giấy lọc 0,45µm, sau đó đem đi hấp ở ở 121ºC trong vòng 20 phút Nước nuôi hấp tiệt trùng sau 2 ngày mới sử dụng, đảm bảo đủ thời gian để cân bằng CO2

(Banerjee và ctv, 2011)

Nhân giống: tảo giống sau khi thu hoạch thì tiến hành nuôi trong các đơn vị

vô trùng bằng nguồn nước nuôi và môi trường dinh dưỡng đã hấp tiệt trùng Các đơn

vị nuôi vô trùng được đặt trên hệ thống nuôi có sục khí liên tục và cường độ ánh sáng 10.000 lux, nhiệt độ 25ºC

III.2 Các phương pháp nghiên cứu tìm môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tăng trưởng loài N.oculata

III.2.1 Thiết kế thí nghiệm

a Các nghiệm thức:

Khảo sát tốc độ tăng trưởng của vi tảo N oculata trên 2 môi trường dinh

dưỡng khác nhau F/2 (Guillard and Ryther, 1962) và Canway (Laing, 1991)

Thí nghiệm bao gồm 8 đơn vị nuôi (2 môi trường dinh dưỡng x 4 lần lập lại/nghiệm thức)

Thí nghiệm được kéo dài cho đến khi mật độ tảo một trong các nghiệm thức

bị giảm và được lập lại 3 lần

b Điều kiện thí nghiệm:

Tảo giống từ phòng thí nghiệm Thức ăn tự nhiên tại Trung tâm Quốc Gia Giống Hải sản Nam Bộ, được lấy ở pha tăng trưởng, mật độ ban đầu là 5 triệu tb/mL,

bố trí ở điều kiện nhiệt độ 25±1ºC, nước nuôi độ mặn 25‰ đã qua xử lý tiệt trùng, sục khí liên tục qua lọc 0.2µm, ánh sáng liên tục 10.000lux (máy đo cường độ ánh sáng hiệu SPER SCIENTIFIC, Đài Loan)

III.2.2 Thu thập số liệu

a Thu mẫu:

Mẫu được lấy hàng ngày để xác định mật độ và tốc độ tăng trưởng, sử dụng pasteur pipette riêng biệt cho mỗi đơn vị nuôi vô trùng

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

b Phương pháp xác định mật độ

Sử dụng buồng đếm Neubauer (hình 2) dùng để đếm các loài vi tảo có kích thước 2-30µm, mật độ 104-107tb/mL

Hình 2 Buồng đếm Neubauer Cấu tạo buồng đếm Neubauer:

Thể tích của 5 blog A, B, C, D, E là bằng nhau

Blog A, B, C, D: mỗi blog chia làm 4x4 ô như nhau

Blog E chia làm 5x5 ô và mỗi ô chia làm 16 ô nhỏ

Mỗi ô nhỏ có diện tích là 0,0025mm2 và độ sâu 0.1mm Nên diện tích trong 25 ô của blog E: 0,0025 x 16 = 0,04 mm2Thể tích mỗi ô là 0,04 x 0,1 = 0,0004mm3 = 4.10-3 mm3 = 4.10-6ml

Vậy: nếu gọi số tế bào trung bình của 5 ô nhỏ đếm được trong blog E là X, hệ

số pha loãng là f

Ta có mật độ tế bào là: (X /4 x 106) x f tế bào/ml

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học Khóa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

Cách đếm tảo: Lắc đều mẫu tảo, dùng pipet nhỏ 1 giọt vào vị trí buồng đếm

đã đặt miếng lame trên bề mặt buồng đếm (để tạo ổn định tế bào tảo) Ban đầu chỉnh vật kính bằng 4X để xác định vị trí buồng đếm, tăng dần vật kính lên 10X để quang sát rõ hơn, tăng vật kính lên 40X để đếm mật độ tảo Trong buồng đếm có 3 đường

kẻ song song trong mỗi blog nhỏ: với đường kẻ thứ nhất từ trong ra tính như bên trong, đường kẻ thứ 2 nếu vi tảo nằm nửa trong nửa ngoài đường kẻ thì 2 vi tảo đếm

là 1, nếu vi tảo lệch vào trong trên 50% kích thước thì tính là 1, lệch ra ngoài trên 50% kích thước thì không đếm, đường kẻ thứ 3 nếu có vi tảo cũng không đếm Mật

độ tảo đo được là giá trị trung bình của 4 lần đếm Đếm bằng kính hiển vi có ưu điểm

là kiểm soát được chất lượng tảo nuôi

c Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng

Công thức tính tốc độ tăng trưởng (K) theo Abu-Rezq et al (1999)

K = (LnNt – LnN0)/t

Nt là mật độ cuối, N0 là mật độ đầu và t là thời gian (ngày)

III.2.3 Xử lý số liệu

khác biệt về tốc độ tăng trưởng giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm môi trường dinh dưỡng

Vẽ đồ thị: tính ra mật độ trung bình cho một lần thí nghiệm, từ đó vẽ đồ thị biểu diễn các đường tăng trưởng vi tảo trong quá trình phát triển Dùng phần mềm Microsoft Excel 2007, hàm Average để tính mật độ trung bình cho một lần thí nghiệm, biểu diễn đồ thị trong Insert chọn Line with Markers

III.3 Các phương pháp nghiên cứu tìm độ mặn thích hợp cho tăng trưởng loài N.oculata

III.3.1 Thiết kế thí nghiệm

a Các nghiệm thức

Khảo sát tốc độ tăng trưởng của vi tảo N oculata trên 4 độ mặn khác nhau

20‰,25‰,30‰,35‰

Thí nghiệm bao gồm 16 đơn vị nuôi (4 độ mặn x 4 lần lập lại/nghiệm thức)

Thí nghiệm được kéo dài cho đến khi mật độ tảo một trong các nghiệm thức

bị giảm và được lập lại 3 lần

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

b Điều kiện thí nghiệm

Tảo giống từ phòng thí nghiệm Thức ăn tự nhiên tại Trung tâm Quốc Gia Giống Hải sản Nam Bộ, được lấy ở pha tăng trưởng, mật độ ban đầu là 5 triệu tb/mL,

sử dụng môi trường dinh dưỡng từ kết quả của Thí nghiệm I, bố trí ở điều kiện nhiệt

độ 25±1ºC, nước nuôi đã qua xử lý tiệt trùng, sục khí liên tục qua lọc 0.2µm, ánh sáng liên tục 10.000lux (máy đo cường độ ánh sáng hiệu SPER SCIENTIFIC, Đài Loan)

III.3.2 Thu thập số liệu

Như được trình bày ở phần III.2.2

III.3.3 Xử lý số liệu

Sử dụng phân tích One-Way ANOVA và phép thử Duncan (SPSS version 16.0) để so sánh sự khác biệt về tốc độ tăng trưởng giữa các nghiệm thức độ mặn