Khảo sát khả năng tạo nhiên liệu sinh học từ vi tảo SCENEDESMUS

HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO NHIÊN LIỆU SINH HỌC TỪ VI TẢO SCENEDESMUS TRONG MÔI TRƯỜ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨMTP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGÀNH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO NHIÊN LIỆU

SINH HỌC TỪ VI TẢO SCENEDESMUS

TRONG MÔI TRƯỜNG DỊ DƯỠNG

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nhiên liệu sinh học 3

1.1.1 Khái niệm về nhiên liệu sinh học 3

1.1.2 Ưu nhược điểm của nhiên liệu sinh học 3

1.1.3 Biodiesel 3

1.2 Tổng quan về vi tảo 5

1.3 Nhiên liệu sinh học từ vi tảo 5

1.3.1 Các nghiên cứu về nhiên liệu sinh học vi tảo 5

1.3.2 Ưu và nhược điểm của nhiên liệu sinh học tạo từ sinh khối tảo 5

1.4. Tảo Scenedesmus 6

1.4.1 Phân loại tảo Scenedesmus 6

1.4.2 Đặc điểm sinh học của tảo Scenedesmus 6

1.4.3 Cấu tạo tảo Scenedesmus 7

1.4.4 Sinh sản của tảo Scenedesmus 8

1.4.5 Một vài nghiên cứu ứng dụng tảo Scenedesmus 8

CHƯƠNG 2 10

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Vật liệu 10

2.2 Phương pháp nghiên cứu 10

2.2.2 Địa điểm và thời gian thí nghiệm 13

2.2.3 Điều kiện nuôi 14

2.2.4 Nuôi vi tảo 14

2.2.5 Đo quang phổ 16

2.2.6 Xác định sinh khối tảo 16

2.2.7 Xác định số lượng tế bào 16

2.2.8 Phương pháp xác định lipid 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Kết quả phân lập tảo 19

3.2 Hàm lượng sinh khối trong các điều kiện môi trường khác nhau 19

3.2.1 Trường hợp tự dưỡng 19

3.2.2 Trường hợp dị dưỡng 23

3.3 Hàm lượng lipid trong các điều kiện môi trường khác nhau 28

3.3.1 Môi trường tự dưỡng 28

3.3.2 Trường hợp dị dưỡng 32

3.4.1 Kết quả phân tích 37

3.4.2 So sánh với một số dầu thực vật khác 39

3.4.3 So sánh hàm lượng dầu của Scenedesmus sp1 với một số loài tảo khác 40

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

Hình 2.6.Mô hình nuôi tự dưỡng (trái) và mô hình nuôi dị dưỡng (phải) 15

Hình 2.7 Máy đo quang Photolab 6100 VIS 16

Hình 2.8.Sinh khối tảo khô 18

Hình 2.9 Lipid còn lại sau bay hơi dung môi 18

Hình 3.1 Tế bào vi tảo Scenedesmus sp1 quan sát dưới kính hiển vi

Hình 3.14 Sự biến đổi lipid tảo trong môi trường dị dưỡng bổ sung Glucose 33

Hình 3.15 Sự biến đổi lipid tảo trong môi trường dị dưỡng bổ sung Glycerine 34

Hình 3.16 Sự biến đổi lipid tảo trong môi trường dị dưỡng bổ sung Natri Acetate 36

Hình 3.17.So sánh hàm lượng lipid tảo của 3 loại môi trường dị dưỡng 38

Bảng 3.9 Hàm lượng lipid tảo (%) trong môi trường thiếu gốcNitơ 28

Bảng 3.10 Hàm lượng lipid tảo (%) trong môi trường thiếu gốc Phospho 29

Bảng 3.11 Hàm lượng lipid tảo(%) trong môi trường thiếu gốcNitơ và Phospho 30

Bảng 3.12 Hàm lượng lipid tảo (%) trong 3 môi trường tự dưỡng 31

Bảng 3.13 Hàm lượng lipid tảo (%) trong môi trường bổ sung Glucose 33

Bảng 3.14 Hàm lượng sinh khối tảo (%) trong môi trường bổ sung Glycerine 34

Bảng 3.15 Hàm lượng lipid tảo (%) trong môi trường bổ sung Natri Acetate 35

Bảng 3.16 Hàm lượng lipid tảo (%) của 3 loại tảo trong môi trường dị dưỡng 37

Bảng3.17 Các thành phần và tỉ lệ trong dầu tảo 38

Bảng3.18 Các thành phần tỉ lệ acid béo trong một số loại dầu thực vật 39

Bảng 3.19 So sánh hàm lượng dầu của Scenedesmus sp1 với một số loài tảo khác .

40

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BBM (Bold’s Basal Medium) : Môi trường dinh dưỡng

TSS (Total Suspended Solid) : Tổng chất rắn lơ lửng trong nước

MỞ ĐẦU

Khi nhận thức về sựu hữu hạn của các nguồn tài nguyên và hậu quả từ việc khai thác, sử dụng không kiểm soát nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày càng sâu sắc thì nhu cầu tìm kiếm nguồn năng lượng thay thế với tiêu chí thân thiện với môi trường ngày càng quan trọng

Năng lượng sinh học là một hướng đi tiềm năng đã được các nhà khoa học quan tâm

và nghiên cứu từ nhiều năm Ngành nhiên liệu sinh học thế giới đã trải qua 3 thế hệ phát triển với những tiến bộ nhất định Ở thế hệ thứ nhất, nghiên cứu và sản xuất nhiênliệu sinh học được làm từ mỡ động vật (cá basa) hay dầu thực vật (dầu cọ, dầu cây đậunành, dầu cây hướng dương, dầu dừa…) Tuy nhiên, lượng dầu tạo ra khá ít và nguyên liệu là nguồn thức ăn cho con người và động vật, không mang giá trị kinh tế cao Thế

hệ thứ hai của nhiên liệu sinh học được sản xuất từ nguồn sinh khối

lignocellulose (gồm có cellulose, hemicellulose và lignin) từ phụ phẩm nông nghiệp, lâm nghiệp qua quá trình sinh hóa hoặc nhiệt hóa thành “nhiên liệu sinh học” Nhưng thế hệ thứ hai có nhược điểm làm ảnh hưởng đến môi trường và giá thành cao Thế hệ thứ ba có tiềm năng hơn khi sử dụng tảo, vi tảo, nấmvà vi khuẩn để sản xuất trực tiếp nhiên liệu sinh học có lợi cho môi trường và hiệu quả kinh tế cao Lượng dầu tạo ra trên cùng một diện tích cao hơn so với các thế hệ trước

Để khắc phục nhược điểm về diện tích nuôi trồng của tảo tự dưỡng, tảo dị dưỡng là một lựa chọn thích hợp với khả năng tạo dầu cao hơn đồng thời có thể tiết kiệm được phần lớn diện tích nuôi trồng Loài tảo lục được sử dụng để nghiên cứu trong môi

trường này là Scenedesmus sp Do đó đề tài “Khảo sát khả năng tạo nhiên liệu sinh

học từ vi tảo Scenedesmus trong môi trường dị dưỡng” đã được chọn.

CHƯƠNG 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhiên liệu sinh học

1.1.1 Khái niệm về nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học là loại nhiên liệu được hình thành từ các hợp chất có nguồn gốc động thực vật (sinh học) như nhiên liệu chế xuất từ chất béo của động thực vật (mỡ động vật, dầu cọ… ), ngũ cốc (mì, ngô, đậu tương…), chất thải nông nghiệp (rơm,

trấu, mùn cưa…) Phân loại thành: diesel sinh học (Biodiesel), xăng sinh học

(Biogasoline), khí sinh học (Biogas).

1.1.2 Ưu nhược điểm của nhiên liệu sinh học

Ưu điểm

- Nhiên liệu sinh học thân thiện với môi trường do sử dụng nguồn nhiên liệu tái sinh giúp giảm sức ép với nhu cầu nhiên liệu hóa thạch và có chỉ số phát thải thấp hơn nhiên liệu hóa thạch

Nhược điểm

- Nếu sản xuất từ nguồn tinh bột của cây lương thực sẽ ảnh hưởng đến vấn đề an ninh lương thực

- Phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu không ổn định nên có nhiều khó khăn

- Giá thành sản xuất cao

1.1.3 Biodiesel

Diesel sinh học (Biodiesel): là loại nhiên liệu lỏng có tính chất tương tự diesel

truyền thống Dầu diesel sinh học được điều chế từ một số loại dầu mỡ sinh học (dầu thực vật, mỡ động vật) thường được thực hiện thông qua quá trình transester hóa bằng cách cho phản ứng với methanol

Phản ứng tạo dầu diesel sinh học giữa acid béo và methanol:

Hình 1.1.Phương trình phản ứng tạo dầu Biodiesel.

Bảng 1.1.Một số đặc tính chọn lọc của Diesel và Biodiesel.

Vi tảo là các vi sinh vật đơn bào kích thước hiển vi Sinh trưởng bằng quang tự dưỡng nhờ quá trình quang hợp, hoặc dị dưỡng, hoặc cả hai hình thức Có thể tìm thấy

vi tảo ở cả nước nặm và nước ngọt Trong điều kiện thiếu ánh sáng, một số giống tảo

tự dưỡng có thể chuyển từ dạng sống tự dưỡng sang dị dưỡng nhờ vào sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường thay cho việc tự tổng hợp chất dinh dưỡng

Vi tảo là sinh vật sản xuất đóng vai trò rất quan trọng trong hệ sinh thái thủy vực.Chúng là nguồn thức ăn có chất lượng dinh dưỡng cao và số lượng dồi dào Thành phần các chất dinh dưỡng có trong tảo rất cao, bao gồm protein (chiếm 50 -70% trọng lượng khô với các acid amin thiết yếu, glucid (20 -30%), lipid (10 – 20%), và các vitamin như B1, B6, B12, …

1.3 Nhiên liệu sinh học từ vi tảo

1.3.1 Các nghiên cứu về nhiên liệu sinh học vi tảo

Một số nghiên cứu của viện vi sinh vật và công nghệ sinh học: Nghiên cứu kết hợp thành tựu nghiên cứu VSV, công nghệ lên men, sinh học phân tử để phát triển các sản phẩm mới phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu như: nhựa sinh học, nhiên liệusinh học và các dung môi hữu cơ có giá trị khác,…

Sản xuất Biodiesel từ vi tảo, kĩ thuật nuôi cấy vi tảo thu lipid - Bùi Ngọc Đoan Chiêu(2010) - Đại học Bách Khoa

Nghiên cứu ảnh hưởng cúa các điều kiện nuôi trồng đến sinh trưởng và năng suất thu dầu của vi tảo chlorella vulgaris nhằm làm nguyên liệu sản xuất biodiesel - Nguyễn Minh Tuấn – Lê Thị Bích Yến – Nguyễn Phước Hải (2012– Đại học Đà Nẵng)

1.3.2 Ưu và nhược điểm của nhiên liệu sinh học tạo từ sinh khối tảo

Ưu điểm

- Giải quyết nhu cầu sử dụng nhiên liệu, thân thiện với môi trường

- Bị thoái hóa sinh học nên không làm hư hại môi trường xung quanh

- Giá thành cao hơn so với nhiên liệu truyền thống.

- Chưa được sử dụng phổ biến

- Yêu cầu kiểm tra khắt khe, người điều chế phải có kinh nghiệm, hiểu biết

- Chưa được nhiều người biết đến, chưa có nhiều doanh nghiệp, công ty áp dụng sản xuất

1.4 Tảo Scenedesmus

Hình 1.2.Tảo Scenedesmus sp 1.4.1 Phân loại tảo Scenedesmus

1.4.2 Đặc điểm sinh học của tảo Scenedesmus sp1

Scenedesmus sp1 có tiềm năng trong sản xuất dầu và các chất chuyển hóa thứ cấp

như carotenoids Nhiều dòng sản sinh ra nhiều carotenoids khác nhau trong quá trình tăng trưởng logarit hoặc trong điều kiện thiếu chất dinh dưỡng, mặc dù không bao giờ vượt quá 1% trọng lượng khô Một trong những carotenoid quan trọng là lutein Các tếbào phát triển theo cấp số nhân có hàm lượng protein cao (lên đến 50%), chất béo ít

hơn 10%, còn lại là tinh bột và các thành phần thành tế bào Trong điều kiện thiếu dinh

dưỡng, loài Scenedesmus có thể tích lũy một lượng lớn chất béo lưu trữ (TAG) trong

giọt dầu tế bào chất Thành phần acid béo trong tăng trưởng logarit bao gồm một lượng lớn acid béo không bão hòa đa ngắn như linolenic và acid gamma stearidonic Nếu trong điều kiện bất lợi, TAG tích lũy chủ yếu là C16 và C18 không bão hòa và

một số acid béo không bão hòa đơn Scenedesmus là một trong những loại tảo xanh

phát triển mạnh mẽ nhất và vượt trội các loài tảo khác nhất là trong điều kiện dinh dưỡng cao

Nhiệt độ: Quiang Hu và Milton (2004), trích bởi Đào (2007), cho rằng

Scenedesmuscó thể chịu được khoảng nhiệt độ rộng cho sự tăng trưởng là từ 15 – 42oCvới nhiệt độ tối ưu là 30 – 35oC cho thấy phù hợp với điều kiện sinh trưởng của

Scenedesmus.Nhiệt đột hấp hơn 15oC có thể làm chậm tốc độ sinh trưởng và nhiệt độ cao hơn 42oC sẽ gây chết

pH: pH tăng dần theo thời gian nuôi, đạt giá trị lớn nhất khi tảo đạt đỉnh sinh khối

và giảm xuống theo sự suy thoái của tảo Liên quan đến độ pH, Scenedesmus chịu

đựng một phạm vi rộng độ pH, 5-10 pH dao động từ 7,0 – 8.5 khá thích hợp với sự phát triển của tảo vì biên độ pH tối ưu đối với hầu hết các loài tảo nuôi thường từ 8,2 –8,5 (Lavens & Sorheloos, 1996) pH không thích hợp có thể phá vỡ các quá trình sinh hóa trong tế bào)

Cường độ ánh sáng: duy trì khoảng 1.000 – 2.000 lux tương đối thích hợp vì theo Lavens & Sorheloos (1996) cường độ ánh sáng khi nuôi trong các bình tam giác nhỏ khoảng 1000 – 10.000 lux Cường độ ánh sáng quá lớn có thể làm ức chế quang hợp ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tảo

1.4.3 Cấu tạo tảo Scenedesmus

Scenedesmus là tảo xanh nước ngọt đơn bào kích thước lớn thường xuất hiện với bộ

bốn với 4 đến 16 tế bào kéo dài kết nối, mặc dù các tế bào cũng có thể xuất hiện đơn lẻ

ở dạng hình bầu dục

Nó đặc biệt có liên quan đến khả năng chịu đựng của Scenedesmus với điều kiện pH kiềm của nước thải và nước để lọc khí thải Do thực tế là Scenedesmus rất mạnh mẽ và

phát triển nhanh chóng nên nó đã được sản xuất ngoài trời sử dụng cả hai hệ thống mở

và kín Trong raceways mở, năng suất sinh khối cao hơn 0,5 g/L/ngày đã được báo cáo, trong khi đó, năng suất sinh khối lên đến 1,2 g/L/ngày khi sử dụng hệ thống kín Tổng thể năng suất trung bình hàng năm 0,6 g/L/ngày thu được trong mô hình thí điểmống quang sinh học (30 m3) với Scenedesmus almeriensis Giá trị này là khoảng 3%

hiệu quả năng lượng mặt trời.Hiệu quả năng lượng mặt trời từ 1-3% đã được báo cáo

cho Scenedesmus.Scenedesmus có thể được nuôi ở cả hai chế độ không liên tục hoặc liên tục Mặc dù tế bàoScenedesmuslớn hơn tế bào vi tảo khác, tốc độ tự lắng bằng trọng lực thấp, trong khoảng 10 m/s Do đó, các tế bào Scenedesmus không thể được

thu hoạch bằng phương pháp tự lắng Cần phải sử dụng ly tâm hoặc lọc Các tế bào

của Scenedesmus có thể dễ dàng thu hoạch bằng cách ly tâm.

1.4.4 Sinh sản của tảo Scenedesmus

Chu kì phát triển: chu kì của Scenedesmus kéo dài khoảng 9 ngày, đạt mật độ cao

nhất là ngày thứ 4 – 5 của chu kì trong khi ở phòng thí nghiệm của Đào (2007) thì mật

độ đạt cao nhất vào ngày 9 – 11 của chu kì khoảng 13 ngày, chu kì và thời điểm đạt cực đại của hai thí nghiệm khác nhau

Mật độ ban đầu: trong nuôi tảo, mật độ ban đầu cũng có ảnh hưởng không nhỏ, nếu mật độ ban đầu quá thấp thì thời gian nuôi dài mới đủ sinh khối cần thiết còn nếu mật

độ ban đầu quá cao sẽ gây lãng phí nguồn tảo giống, tìm được mật độ ban đầu phù hợp

sẽ giúp việc nuôi thận lợi và có hiệu quả hơn

Từng có báo cáo về tốc độ tăng trưởng tối đa cao hơn 0,12/h vềScenedesmussp

1.4.5 Một vài nghiên cứu ứng dụng tảo Scenedesmus

Mặc dù Scenedesmus có khả năng sản xuất nhiều loại nhiên liệu sinh học như

hydrogen sinh học, dầu diesel sinh học, ethanol sinh học… Nghiên cứu sâu rộng nhất

đã được thực hiện trên việc sử dụng tảo Scenedesmus để sản xuất dầu diesel sinh

học Giống như tất cả các loài tảo, việc thực hiện sản xuất nhiên liệu sinh học tổng hợp

của tảo Scenedesmus trong phòng thí nghiệm có những thách thức trong sản xuất quy

mô lớn Những thách thức lớn như: cung cấp dinh dưỡng và tái sử dụng, chuyển khí vàtrao đổi, kiểm soát môi trường, nguồn nước và kỹ thuật di truyền và chuyển hóa

Ngoài ra, tảo Scenedesmus còn có thể được sử dụng để xử lý nitơ và phospho trong

nước thải

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

Vật liệu trong nghiên cứu này là tảo Scenedesmussp1 là một chi của tảo lục đơn

bào, nước ngọt, được phân lập ở địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu của đề tài được thể hiện một cách tổng quát trong sơ đồdưới (hình 2.1)

2.2.1 Thu mẫu, phân lập (TN1)

+ Thu mẫu:Vi tảo được thu tại các địa điểm ở Thành phố Hồ Chí Minh và Bình

Dương Vị trí các điểm thu mẫu được trình bày trong bảng phụ lục (PL.1)

Hình 2.1.Sơ đồ quá trình nghiên cứu

TN1: Thu mẫu, phân lập, chọn vi

TN2.3:

Môi trường -NP

TN3.1:

Môi trường + Glucose

TN3.2:

Môi trường + Glycerine

TN3.3: Môi trường + Acetate

TN4: Khảo sát sự tăng sinh khối và

sự tạo dầu theo thời gian

+ Phương pháp thu mẫu:

Mẫu được thu bằng lưới vớt phiêu sinh, kích thước mắt lưới Đối với ao, hồ, kéo lưới một đoạn từ 10m đến 20m để thể tích nước thu được chứa vi tảo là lớn nhất, chuyển mẫu vào chai PE sạch, bảo quản ở , lưu trữ trong phòng thí nghiệm để tiến hành quá trình phân lập vi tảo

+ Phân lập:

Nuôi mẫu trong môi trường BBM (Basal Medium, Bischoff and Bold, 1963), bổ sung Glycerine / Natri Acetate (mỗi mẫu sẽ nuôi thử nghiệm thành 2 chai, một chai dùng nguồn cacbon từ Glycerine, một chai dùng nguồn cacbon từ Natri Acetate): rút

50 mL mẫu gốc, nuôi dị dưỡng trong chai thủy tinh có sẵn môi trường gồm: 100mL dung dịch BBM + 0,3mL dung dịch Glycerine/0,3g Natri Acetate

Bảng 2.1 Thành phần môi trường BBM (tính trên 1L, pha với nước cất).

Bảng 2.2 Thành phần PIV* (tính trên 1L, pha với nước cất)

Phân lập giống vi tảo: sau khi tìm được những mẫu có sự phát triển của tảo dị dưỡng Tiến hành cấy mẫu vào đĩa thạch petri.

Phương pháp phân lập mẫu:

- Pha môi trường đổ đĩa: dung dịch BBM, agar và chất khử trùng (tỉ lệ 1L BBM – 15g Agar – 500Ampicilin – 500 Cloramphenicol) Nấu hỗn hợp môi trường trên bằng bếp điện đến khi agar tan hoàn toàn Sau đó, hấp khử trùng môi trường và đĩapetri ở nhiệt độ trong 1,5 giờ Đổ đĩa thạch, để nguội, gói giấy bảo quản trước khi

sử dụng

- Cấy mẫu vào đĩa petri: pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-1;10-2; 10-3;10-4;10-5 Rút 0,1mL dung dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa thạch petri, dùng que trang trải đều mẫu khắp mặt thạch Ủ đĩa đã cấy mẫu ở nhiệt độ môi trường, trong một tuần ta sẽđược các khuẩn tảo riêng lẻ

- Chọn một loài tảo dị dưỡng có khả năng sống được trong tối làm thí nghiệm: Sau

khi đã tiến hành phân lập tảo, chọn được tảoScenedesmussp1 phát triển tốt nhất

trong môi trường dị dưỡng đã nuôi cấy

+ Khử mẫu và bảo quản mẫu

Sau khi phân lập, Scenedesmus sp1được chuyển sang môi trường BBM có bổ sung

thêm chất khử khuẩn chloramphenicol với nồng độ 30 µg/mL môi trường (Eik Lee Fang, 2009) Sau 24 - 48h, chuyển toàn bộ tế bào đã xử lý sang bình tam giác 100mL trong môi trường BBM không có chất khử khuẩn, kiểm tra sự nhiễm vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy sau 3 tuần, mẫu sau đó được giữ nuôi trong môi trường BBM, điều kiện 29ºC, cường độ ánh sáng 2500 lux, chu kì chiếu sáng là 12:12

Hình 2.2.Tảo Scenedesmus sp1đã phân lập được

2.2.2 Địa điểm và thời gian thí nghiệm

- Các trường hợp được tiến hành đo trong phòng thí nghiệm CNSH và KTMT tại

Cơ sở thí nghiệm Gò Mây, trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm

- Đề tài được thực hiện trong 8 tháng, từ tháng 10/2015 đến 06/2016

- Lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu hằng ngày vào 10h sáng hằng ngày

2.2.3 Điều kiện nuôi

- Mô hình tự dưỡng: cung cấp oxi, sục khí liên tục cường độ ánh sánh 2500 lux, chu

kì chiếu sáng 12:12

- Mô hình dị dưỡng: không ánh sáng, không sục khí, khuấy trộn 4 lần/ngày, bổ sungkháng sinh Ampiciline (1g/L).

2.2.4 Nuôi vi tảo

+ Mô hình nuôi vi tảo

Với mục đích thu một lượng sinh khối vi tảo đáng kể để thực hiện quá trình tách dầu, vi tảo được nuôi theo các bước sau:

- Nuôi tự dưỡng trong bình tam giác 250mL

- Khi tảo phát triển tốt, chuyển sang nuôi tự dưỡng trong chai 5L

- Tiếp đó, chuyển sang nuôi trong bể lớn, bể được thiết kế dạng máng, có sử dụng máy sục khí để tạo dòng chảy khuấy đều môi trường nuôi vi tảo Bể có kích thước 2,5m x 0.5m và chiều cao môi trường nuôi là 0.1m Tổng thể tích nuôi trong bể là 125 lít Trong quá trình nuôi, bổ sung định kì (2 lần/ tuần) chất dinh dưỡng trong môi trường BBM Sinh khối vi tảo thu sau 20 ngày nuôi

- Thu sinh khối, vi tảo được bỏ vào thùng thu sinh khối, để lắng sau 24 giờ, loại bỏ lớp nước mặt, thu sinh khối vào bình 5L Bổ sung soda (NaHCO3), khử khuẩn trong 24h, lọc lấy sinh khối đặc

- Tiến hành chuẩn bị mô hình dị dưỡng và thực hiện theo các trường hợp:

+TN1: Môi trường tự dưỡng không bổ sung gốc Nitơ

+TN2: Môi trường tự dưỡng không bổ sung gốc Phospho

+TN3: Môi trường tự dưỡng không bổ sung gốc Nitơ và Phospho

+TN4: Môi trường dị dưỡng bổ sung Glucose (3g/L BBM)

+TN5: Môi trường dị dưỡng bổ sung Glycerine (3mL/L BBM)

+TN6: Môi trường dị dưỡng bổ sung Natri Acetate (3g/L BBM)

Hình 2.3 Tảo Scenedesmus nuôi

2.2.5 Đo quang phổ

- Tắt hệ thống sục khí, lắc mẫu trong 5 phút

- Lấy mẫu cho vào cuvet

- Sử dụng máy đo quang phổ với cùng một lượng mẫu và cùng thời gian tiến hành

đo với λ = 670nm[5]

- Đo mẫu bằng máy đo quang Photolab 6100 VIS

Hình 2.7.Máy đo quang Photolab 6100 VIS.

2.2.6 Xác định sinh khối tảo

Lượng thể tích dịch vi tảo (50 – 100 mL) được lọc qua giấy lọc đã biết khối lượng (m1) Giấy lọc chứa sinh khối tảo được làm khô đến khối lượng không đổi ở 105ºC, sau đó cân khối lượng (m2)

Sinh khối tảo được tính theo công thức:

C (mg/L) = (m2-m1)/Vmẫu(mg/L)

2.2.7 Xác định số lượng tế bào

Mật độ tế bào được xác định nhờ kình hiển vi quang học dựa trên cơ sở đếm số tế bào có trên một thể tích xác định sau khi các tế bào đã bám dính vào một mặt phẳng trong độ sâu thị trường của hệ thống thị kính – vật kính

Mẫu được đếm trên buồng đếm hồng cầu có độ sau 0.1mm, lưới đếm gồm 400 ô vuông nhỏ có diện tích bằng nhau, và tổng diện tích là 1mm2, diện tích ô vuông nhỏ

nhất là 1/400mm2 Đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ) dưới kính hiển

vi ở độ phóng đại x10, x40 Mẫu đếm được lấy hằng ngày ở thời điểm cố định sai lệch không quá một giờ Số lượng tế bào được tính theo công thức sau:

N (tế bào/mL) = [(a/b)  400/0,1]  103 10n

N: Số lượng tế bào trong 1mL mẫu nghiên cứu

a : số tế bào trong 5 ô lớn

b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn ( 165=80 ô vuông nhỏ)

400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm

0.1: thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm

Bước 1: Cho một lượng sinh khối tảo vào hộp petri đã biết trước khối lượng, nung

trên bếp đun đến gần cạn, tiếp tục sấy ở nhiệt độ 55ºC hoặc phơi dưới ánh nắng đến khô cạn nước

Bước 2: Cân khối lượng tảo sau nung.Dùng dao lam cạo sạch sinh khối tảo dính

trên đáy petri

Bước 3: Cho hỗn hợp dung môi Chloroform/methanol (tỉ lệ 2:1) vào đĩa, dùng đũa

thủy tinh khuấy điều đến khi sinh khối hòa tan

Dùng màng bao thực phẩm bọc kín đĩa petri, lưu trong 24 giờ

Bước 4: Lọc hỗn hợp quagiấy lọc đã biết khối lượng, sau từ 10-15 phút, dung môi

bay hơi, còn lại là lipid, xác định bằng phương pháp cân

Bước 5: Lipid vi tảo được xác định trực tiếp bằng phương pháp khối lượng và thể

hiện bằng tỉ lệ phần trăm trọng lượng sinh khối thô theo công thức sau:

Hàm lượng lipid (%) = (lượng lipid (g) / khối lượng mẫu (g)) x 100 (%)

Hình 2.8 Sinh khối tảo khô Hình 2.9 Lipid còn lại sau bay hơi dung môi

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập tảo

Sau 2 – 3 tuần phân lập, vi tảo phát triển thành chủng tảo Scenedesmussp1 Mẫu vi

tảo được quan sát dưới kính hiển vi quang học cho hình như sau:

Hình 3.1 Tế bào vi tảo Scenedesmussp1 quan sát dưới kính hiển vi

3.2 Hàm lượng sinh khối trong các điều kiện môi trường khác nhau

3.2.1 Trường hợp tự dưỡng

+ Môi trường trường thiếu Nitơ

Hàm lượng sinh khối vi tảo trong môi trường thiếu Nitơ trình bày trong bảng sau:

Bảng 3.1.Hàm lượng sinh khối tảo (g/L) trong môi trường thiếu gốc Nitơ

Thời gian (ngày)

0 2 4 6 8 10 12 0.00

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

Thời gian (ngày)

Hình 3.2.Sự biến đổi hàm lượng sinh khối tảo trong môi trường thiếu Nitơ

Sinh khối nuôi trong môi trường không bổ sung Nitơ tăng tương đối đều trong thời gian khảo sát từ ngày 1 (1.583 g/L) đến ngày 10 (3.167g/L)

+ Môi trường trường thiếu Phospho

Hàm lượng lipid vi tảo trong môi trường thiếu Phospho trình bày trong bảng sau:

Bảng 3.3.Hàm lượng sinh khối tảo (g/L) trong môi trường thiếu gốc Phospho

Thời gian (ngày)

0 2 4 6 8 10 12 0.00

Hình 3.3.Sự biến đổi hàm lượng sinh khối tảo môi trường thiếu gốc Phospho

Sinh khối nuôi trong môi trường không bổ sung Phosphocó chiều hướng tăng trong thời gian khảo sát từ ngày 1 (1.583 g/L) đến ngày 10 (3.217g/L)

Sinh khối tăng nhanhtrong những ngày đầu từ ngày 1 (1.586 g/L) đến ngày 7 (2.967g/L), và tăng chậm hơn từ ngày 7 đến ngày 10 (3.217g/L)

+ Môi trường trường thiếu Nitơ và Phospho

Hàm lượng lipid vi tảo trong môi trường thiếu Nitơ và Phospho được trình bày trong bảng sau:

Bảng 3.3.Hàm lượng sinh khối tảo (g/L) môi trường thiếu gốc Nitơ và Phospho

Thời gian (ngày)

0 2 4 6 8 10 12 0

0.5 1 1.5 2 2.5

Thời gian (ngày)

Hình 3.4.Sự biến đổi hàm lượng sinh khối tảo môi trường thiếuNitơ và Phospho.

Sinh khối nuôi trong môi trường không bổ sung Nitơ và Phospho tăng trung bình từ ngày 1 (1.433 g/L) đến ngày 10 (2.317 g/L)

Sinh khối tảo tăng chậm trong những ngày đầu từ ngày 1(1.433 g/L) đến ngày 4 (1.517 g/L) và tăng nhanhhơn từ ngày 4 đến ngày 10 (2.317 g/L)

+ So sánh sự tăng sinh khối của tảo trong 3 loại môi trường tự dưỡng:thiếu Nitơ, thiếu Phospho, thiếu Nitơ và Phospho

Bảng 3.4.Hàm lượng sinh khối tảo (g/L) trong 3loại môi trường tự dưỡng

Thời gian (ngày)