Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật sinh lipase

Đại học Nha Trang Viện công nghệ sinh học và môi trườngPhân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật sinh lipase GVHD: TS.. Doanh thuThực trạng sản xuất – sử dụng ở VN “Phân lập và t

Đại học Nha Trang Viện công nghệ sinh học và môi trường

Phân lập và tuyển chọn một số chủng

vi sinh vật sinh lipase

GVHD: TS Vũ Ngọc Bội

ThS Nguyễn Thị Thịnh SVTH : Nguyễn Thị Quỳnh Anh

Đề tài thực hiện tại Phân viện thú y miền Trung

BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nội dung

Đặt vấn đề

Vật liệu, phương pháp nghiên cứu

Kết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

Phần 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Doanh thu

Thực trạng sản xuất – sử dụng ở VN

“Phân lập và tuyển chọn một số chủng

vi sinh vật sinh lipase”

Tuyển chọn được chủng vi sinh vật sinh enzyme lipase từ tự nhiên làm cơ

sở cho quá trình sản xuất enzyme và góp phần lưu giữ bảo tồn nguồn gen vi sinh vật từ tự nhiên.

Mục tiêu đề tài

so sánh gen mã hóa 16S rRNA

Sơ bộ xác định một số yếu tố môi trường ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp enzyme lipase của chủng

vi sinh vật phân lập được

Nội dung đề tài

Phần 2 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Thiết

bị

Máy chuẩn pH tự động, cân điện tử, máy ly tâm eppendorf, máy PCR, hệ thống điện di, máy chụp ảnh điện di, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh -20oC, -80oC v.v

Phân lập vi sinh vật

Phân loại vi sinh vật

Đặc điểm hình thái tế bào

Tách chiết ADN tổng số

Nhân đoạn gen mã hóa

16S rARN

Tinh sạch sản phẩm PCR

Xác định trình

tự gen

Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

Xác định hoạt tính lipase

So sánh trình tự gen mã hóa 16S rARN

Phương pháp

Phần 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phân lập tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính lipase

Hoạt tính lipase của một số chủng VSV đã phân lập

 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng L9

Hình thái khuẩn lạc

chủng L9

Hình thái cuống sinh bào

tử của chủng L9 (phóng đại 1500 lần)

Phân loại chủng L9

 Tách chiết ADN tổng số

Phổ điện di kiểm tra ADN tổng số.

Giếng số 1: Marker ADN Giếng số 2: ADN tổng của chủng L9

 Nhân dòng phân đoạn gen mã hoá 16S rARN

500bp 250bp

550bp

2

1

Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rARN của chủng L9

Giếng số 1: Marker 1kb Giếng số 2: Sản phẩm PCR của chủng L9

So sánh trình tự gen mã hoá 16S rARN

 Giải trình tự gen mã hoá 16S rARN

CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAA GCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGCCTTCGGGT TGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCTCTTGAGTGACGGTAC CTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGTGATTATTGGGCGTAAA GAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGGCTGTGAAAGCCCGGGGC TTAACTCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGT AGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAT ATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGAT ACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTTT TATACCCCGGTAGTCCACGCCGTATACGGAGGGCACTAGGTGTG GGCGTATTCCACGTACGTACGTGCCGTAGCTTACGAATTAAGTG ACCCGCCTGGGGAGTACGGACGAAAGGCTAAAACTCTAAAGGA ATTGACGG

Trình tự phân đoạn 16S rARN của chủng L9.

So sánh trình tự gen mã hoá 16S rARN

 Mối quan hệ di truyền của chủng L9 với các chủng Genbank

Cây phân loại chủng L9

So sánh trình tự gen mã hoá 16S rARN

Tại 48h: hoạt tính cao nhất (13,24 U/ml).

ĐỘNG THÁI SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LIPASE

60.9 61.7

60.2 55.8

13.3

12.98 13.24

Khối lượng Hoạt tính

Hoạt tính (U/ml)

Môi trường bổ sung dầu olive: hoạt tính lipase cao nhất (12,79 U/ml).

Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng lên sinh tổng hợp lipase

MT LB (không

bổ sung cơ chất)

Hoạt tính (U/ml)

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

Môi trường bổ sung 1% dầu olive: hoạt tính lipase cao nhất (17,98 U/ml).

Ảnh hưởng của nồng độ dầu olive lên sinh tổng hợp lipase

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

Môi trường có nguồn nitơ là peptone: hoạt tính lipase cực đại (18,03 U/ml).

Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh tổng hợp lipase

2.65 1.34

4.89

18.03

14.68 13.22

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Peptone Cao thịt Tripton Urea (NH4)2SO4 NH4NO3

Nguồn nitơ

Hoạt tính (U/ml)

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

pH tối ưu: 6,5 (20,74 U/ml).

Ảnh hưởng của pH lên sinh tổng hợp lipase

15.64

7.76 10.23

19.09

20.74 17.91

8.1 7.97

6.4 6.09

18.12

0 5 10 15 20 25

4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9

pH

Hoạt tính (U/ml)

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

Nhiệt độ tối ưu: 40oC (25,64 U/ml).

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh tổng hợp lipase

25.64

8.61

1.28

19.07 17.09

16.99

0 5 10

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

Phần 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

chủng

Streptomyces sp

L9 đã được xác định: môi trường

LB có bổ sung 1%

cơ chất cảm ứng dầu olive, thời gian nuôi cấy 48h, nhiệt

độ 40 o C, pH môi trường 6,5.

Kết luận

độ bền nhiệt, độ bền pH của lipase chủng Streptomyces sp L9.

1 Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại,

2 Nghiên cứu sản xuất và tinh sạch lipase ngoại bào chủng

Streptomyces sp L9.

3 Tiến hành phân tích, so sánh một đoạn gen của chủng

Streptomyces sp L9 với kích thước lớn hơn (1500 bp) để có sự

phân loại chính xác hơn nữa chủng Streptomyces sp L9.

Kiến nghị

Phân loại chủng L9 dựa vào đặc điểm hình thái tế bào

trên kính hiển vi điện tử quét

• Chủng L9 được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có chứa

nguồn cơ chất thích hợp

• Hình thái tế bào được quan sát sau hai ngày Sinh khối được

lấy từ đĩa thạch tách khuẩn lạc, lọc qua giấy lọc rồi đem ly tâm

5000 vòng/phút trong 5 phút, rửa tách lấy tế bào Tế bào được

hòa tan trong glutaraldehyt 2,5% trong đệm photphatnatri 100

mM (pH 7,2) trong 30 phút Lấy một giọt tế bào đã xử lý

(khoảng 106-108 tế bào/ml) đưa lên lưới đồng và để 1 phút để mẫu bám vào lưới vàng Rửa nhẹ nhàng với vài giọt nước và

mẫu được làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100% Chuyển qua

T-butyl Sau đó các mẫu được làm khô bằng máy đông khô và phủ bằng vàng Mẫu được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

quét JEOL 5410 LV

Tách chiết ADN tổng số

• Bước 1: Sau khi nuôi tế bào L9 trong môi trường LB lỏng ở

30oC qua đêm, lắc 200 vòng/phút, đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu tủa tế bào

• Bước 2: Bổ sung 400 µl đệm lysis buffer, voltex kỹ cho tan tủa

• Bước 3: Bổ sung 50 µl lysozyme, ủ 370C trong 30 phút

• Bước 4: Bổ sung 20 µl protease K, ủ 560C trong 2 giờ

• Bước 5: Bổ sung 400 µl chloroform : isoamyalcol (24:1), trộn đều, ly tâm lạnh 40C, 12000 vòng/phút trong 15 phút

• Bước 6: Chuyển pha trên sang eppendorf mới, kết tủa bằng 1

ml ethanol 100%, để ở -20oC khoảng 2h

• Bước 7: Thu tủa bằng ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, rửa lại bằng ethanol 70oC

Nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN

• Để khuếch đại phân đoạn 16S rARN của chủng L9, phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần: 2,5 µl Buffer Taq 10x; 2,5 µl dNTPs (10 mM); 1 µl Mồi xuôi (GM5F); 1 µl Mồi ngược (907R);

0,2 µl Taq polymerase (5 unit/l); 1 µl ADN (10-15 ng); 3 µl

MgCl2 (25mM); 13,8 µl Nước khử ion; tổng thể tích: 25 µl

• Trình tự mồi được sử dụng trong phản ứng PCR là:

• Mồi xuôi (GM5F): 5’- CTTACGGGAGGCAGCAG -3’

• Mồi ngược (907R): 5’-CCGTCAATTCCTTRAGTTT- 3’

Tinh sạch sản phẩm PCR

• Ở thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng sử dụng bộ kit QIAquick PCR Purification Kits của hãng QIAGEN

• Sản phẩm PCR được tinh sạch theo các bước sau:

 Bước 1: Nắp cột theo hướng dẫn của nhà sản xuất

 Bước 2: Cho 2 ml nước khử ion vào cột

 Bước 3: Cho toàn bộ lượng mẫu vào trong cột

 Bước 4: Ly tâm ở 2000 vòng/phút trong 15 phút

 Bước 5: Loại bỏ toàn bộ dịch nước ở phần dưới của cột

 Bước 6: Đảo ngược cột, ly tâm 500 vòng/phút trong 2 phút để thu mẫu (lượng mẫu thu được thường khoảng 40 - 60 µl)

 Bước 7 Thêm nước khử ion vào dung dịch mẫu thu được cho bằng thể tích mẫu ban đầu

• Xác định trình tự gen bằng máy tự động

Việc xác định trình tự nucleotide được thực hiện

theo phương pháp của Sanger sử dụng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic

Analyzer.

• Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Sau khi đã có kết qủa xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rARN, chúng tôi tiến hành so sánh với các trình tự đã có trên ngân hàng gen EMBL (The

European Molecular Biology Laboratory) Tiếp đó sử dụng phần mềm tin sinh học Clustal X để xây dựng cây phát sinh chủng loại cho đối tượng nghiên cứu.

Loài, dưới loài, chủng

nhau­vµ­kh¸c­víi­nhãm­kh¸c

Tài liệu này được cung cấp bởi trang web

Svntu.net

http://svntu.net

(Nguồn: ĐH Nha Trang)