Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn ưa nhiệt sinh α amylaza bền nhiệt phân lập ở việt nam

licheniformis 12 1.3 Đặc điểm của α-amylaza bền nhiệt từ một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt 14 3.1 Vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 25 3.2 Một số đặc điểm phân loại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-Ñ&Ð -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

Hà Nội – 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-Ñ&Ð -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

Người hướng dẫn : ThS.NCS Nguyễn Thế Trang

Sinh viên thực tập : Nguyễn Thị Thuỷ

Lớp : KSCNSH 0601

Hà Nội - 2010

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS NCS Nguyễn Thế Trang, PGS.TS Trần Đình Mấn - Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu hoàn thành khoá luận.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã giúp tôi trong quá trình học tập và thực hiện khoá luận.

Nhân dịp này tôi xin cảm ơn tập thể khoa học Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các nghiên cứu của khóa luận.

Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2010 Sinh viên

Nguyễn Thị Thuỷ

MỤC LỤC

TrangLời cảm ơn

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu α-amylaza bền nhiệt trên thế giới và ở

Việt Nam

1.1.1 Tình hình nghiên cứu α-amylaza bền nhiệt trên thế giới

1.1.2 Tình hình nghiên cứu α-amylaza bền nhiệt ở Việt Nam

1.2 Phân bố vi khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp α-amylaza bền

nhiệt ở Việt Nam

1.2.1 Vi sinh vật sinh α-amylaza bền nhiệt

1.2.2 Sự phân bố vi khuẩn ưa nhiệt sinh α-amylaza bền nhiệt ở

Việt Nam

1.3 Alpha - amylaza bền nhiệt từ vi khuẩn

1.3.1 Khái niệm về α-amylaza bền nhiệt

1.3.2 Đại lượng đặc trưng cho độ bền nhiệt của α-amylaza

1.3.3 Ảnh hưởng của Ca2+ lên hoạt tính và độ bền nhiệt của

α-amylaza

1.3.4 Ảnh hưởng của cơ chất lên độ bền nhiệt của

α-amylaza

1.3.5 Cơ chế bất hoạt hoá do nhiệt của α-amylaza

1.4 Alpha - amylaza bền nhiệt từ Bacillus

1.4.1 Đặc điểm phân loại của Bacillus

1.4.2 Alpha-amylaza bền nhiệt từ B licheniformis

iiivvivii122

234

46

7888

9

9101012

1.4.3 Alpha-amylaza bền nhiệt từ B stearothermophilus

1.4.4 Alpha-amylaza bền nhiệt từ B subtilis

1.4.5 Alpha-amylaza bền nhiệt từ B amyloliquefaciens

1.4.6 Alpha-amylaza bền nhiệt từ các loài Bacillus khác

1.5 Alpha-amylaza bền nhiệt từ các loại vi sinh vật khác

1.5.1 Alpha-amylaza bền nhiệt từ vi sinh vật cổ

1.5.2 Alpha-amylaza bền nhiệt từ vi khuẩn kỵ khí

1.5.3 Alpha-amylaza bền nhiệt từ xạ khuẩn

1.5.4 Alpha-amylaza bền nhiệt từ nấm mốc

1.5.5 Alpha-amylaza bền nhiệt từ nấm men

1.5.6 Sinh tổng hợp α-amylaza bền nhiệt từ Bacillus

1.6 Một số ứng dụng của α-amylaza bền nhiệt

1.6.1 Ứng dụng α-amylaza trong công nghiệp dệt

1.6.2 Ứng dụng α-amylaza trong một số ngành công nghiệp

khác

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật

2.1.2 Hóa chất dùng chính trong nghiên cứu

2.1.3 Thiết bị dùng chính trong nghiên cứu

2.1.4 Môi trường nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tuyển chọn chủng sinh α-amylaza cao

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn

2.2.3 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp α-amylaza từ chủng

tuyển chọn

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzym α-amylaza

2.2.5 Nghiên cứu tính chất của α-amylaza từ chủng Geobacillus

caldoxylosilyticus LP09

1313131315151515161616171717

19191919202020202022

2324

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp

α-amylaza cao

3.2 Đặc điểm sinh học của chủng LP09 sinh tổng hợp α-amylaza

cao

3.2.1 Đặc điểm hình thái

3.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

3.2.3 Phân loại chủng vi khuẩn LP09

3.3 Sinh tổng hợp α-amylaza từ chủng Geobacillus

caldoxylosilyticus LP09 tuyển chọn

3.3.1 Chọn môi trường chứa cơ chất thay thế thích hợp

3.3.2 Chọn nồng độ cơ chất thích hợp

3.3.3 Chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp

3.3.4 Chọn pH môi trường lên men thích hợp

3.4 Tính chất của α-amylaza từ chủng Geobacillus

caldoxylosilyticus LP09 tuyển chọn

3.4.1 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính α-amylaza

3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính α-amylaza

3.4.3 Ảnh hưởng của ion kim loại và chất hóa học lên hoạt tính

α-amylaza bền nhiệt của chủng Geobacillus caldoxylosilyticus

LP09

3.4.4 Khả năng dịch hóa tinh bột của α-amylaza bền nhiệt

3.4.5 Sơ đồ công nghệ lên men sinh tổng hợp α-amylaza bền

nhiệt từ chủng Geobacillus caldoxylosilyticus LP09

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

2525

272727283135

3536373839

394041

4243

4445

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DE Dextrose equivalent

to

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang 1.1 Nhiệt độ tối đa đối với sinh trưởng của một số nhóm vi sinh

vật

5

1.2 Đặc điểm của α-amylaza từ một số chủng B licheniformis 12

1.3 Đặc điểm của α-amylaza bền nhiệt từ một số chủng vi khuẩn

ưa nhiệt

14

3.1 Vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 25

3.2 Một số đặc điểm phân loại của chủng LP09 so với chủng

3.4 Ảnh hưởng của một số ion kim loại và chất hóa học lên hoạt

tính α-amylaza của chủng Geobacillus caldoxylosilyticus

3.1 Vòng phân giải tinh bột của 9 chủng nghiên cứu 26

3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của chủng LP09 29

3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng LP09 30

3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của chủng

LP09

31

3.7 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất lên hoạt tính α-amylaza 36

3.8 Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tan đến hoạt tính

α-amylaza

37

3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính α-amylaza 38

3.10 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến hoạt tính

α-amylaza

39

3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính α-amylaza 40

3.13 Sơ đồ công nghệ lên men sinh tổng hợp α-amylaza bền

nhiệt từ chủng ưa nhiệt Geobacillus caldoxylosilyticus

LP09

43

MỞ ĐẦU

Enzym α-amylaza là một trong số những enzym được nghiên cứu sớmnhất trên thế giới Cùng với proteaza, α-amylaza có vai trò quan trọng cũng nhưđược sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp

Ngày nay có nhiều loại α-amylaza mới được tìm ra với các tính chất đặcbiệt như bền nhiệt, bền axit, thích nghi lạnh, kiềm tính Nhờ các tính chất này,lĩnh vực ứng dụng và nhu cầu về α-amylaza không ngừng tăng lên

Ở Việt Nam, những năm trước đây đã có một số kết quả trong nghiên cứuthu nhận α-amylaza để phục vụ sản xuất rượu, bia, đường glucoza từ tinh bột,đặc biệt là các nghiên cứu ứng dụng enzym những năm gần đây trong côngnghiệp thực phẩm và trong công nghiệp dệt Tuy nhiên từ khi mở cửa, α-amylaza của nước ngoài nhập vào đã làm cho các sản phẩm α-amylaza của ViệtNam mất khả năng cạnh tranh do năng suất của chủng giống không cao Cácnghiên cứu về α-amylaza bền nhiệt còn ít trong khi nhu cầu về loại enzym nàyngày càng lớn, nên hàng năm chúng ta vẫn phải nhập một lượng lớn α-amylazabền nhiệt ”Termamyl” của Đan Mạch

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vi sinh vật ưa nhiệt còn ít Đặc biệt chúng

ta có rất nhiều suối nước nóng ở hầu khắp cả nước, đây chính là nguồn lý tưởng

để phân lập các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, trong đó có các chủng sinh cácenzym bền nhiệt

Nghiên cứu những vi khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp α-amylaza bền nhiệt

từ suối nước nóng Việt Nam nhằm góp phần làm phong phú nguồn gen từ vi

sinh vật Chính vì vậy, chúng tôi được giao đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi

-(*) Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU α-AMYLAZA BỀN NHIỆT TRÊN THẾGIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.1.1 Tình hình nghiên cứu α-amylaza bền nhiệt trên thế giới

Endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolaza (α-amylaza, EC 3.2.1.1) là enzymđược sử dụng rộng rãi nhất trong nhiều ngành công nghiệp: sản xuất etanol từtinh bột, sản xuất siro fructoza-glucoza, sản xuất bột giặt và các chất tẩy rửa, rũ

hồ vải, sản xuất tinh bột biến tính và tái chế giấy …

Enzym α-amylaza đã được sản xuất từ lâu trên thế giới và đã được khẳngđịnh là enzym công nghiệp có tỷ trọng đứng đầu (chiếm khoảng 25% thị trườngthế giới) trong tổng số các loại enzym công nghiệp

Do tính chất của α-amylaza rất đa dạng, chúng được phân ra nhiều loàiphụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận: từ động vật, thực vật và đặc biệt là từ vi sinhvật Theo Vander Maarel và cộng sự (2002), α-amylaza được phân loại thuộc họ

13 và họ 57 các enzym thuỷ phân mối liên kết glucozit Đây là họ enzym phongphú nhất về chủng loại trong các họ enzym thuỷ phân [29]

Các tính chất đặc biệt được quan tâm nghiên cứu nhiều trên thế giới là độbền của enzym tương quan đối với nhiệt độ và pH Phần lớn các α-amylaza kể

cả từ thực vật và động vật có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 55 ÷ 60oC và ở vùng

pH trung tính từ 5,5 ÷ 7,5 Các enzym từ nấm mốc, nấm men và một số loại vikhuẩn thường hoạt động phổ biến ở vùng này

Trong số α-amylaza sản xuất từ vi sinh vật người ta quan tâm nhiều nhất

đến các chủng thuộc nhóm Bacillus bởi những chủng thuộc giống này chủ yếu

sinh enzym ngoại bào nên thuận tiện cho việc thu hồi sản phẩm sau lên men Đại

diện quan trọng nhất trong nhóm Bacillus được sử dụng sản xuất α-amylaza bền nhiệt là các chủng thuộc loài B licheniformis

Tiềm năng rất lớn trong phát triển α-amylaza bền nhiệt được khai thác từnhóm vi sinh vật ưa nhiệt đặc biệt là vi khuẩn cổ trong đó các chủng có nhiệt độphát triển cao từ 80 ÷ 100oC và nhiệt độ tối ưu của α-amylaza cũng tương ứng từ

80 ÷ 100oC: Desulfurcoccus mucsus (to sinh trưởng / to tối ưu của α-amylaza:

85/100); Pyrococcus furiousus (100/100), Pyrococcus sp KOD1 (85/100);

Pyrococcus woesei (100/100); Pyrodictium abyssi (98/100); Staphylothermus marinus (90/100); Thermococcus celer (85/100); Thermococcus profundus

(80/80); Thermococcus aggregans (85/100); Thermotoga maritime MSB8

(90/85-90) [17]

Hiện tại, hàng trăm gen α-amylaza của nhiều loài vi sinh vật khác nhau đãđược xác định trình tự Các enzym tái tổ hợp thu nhận từ các chủng tái tổ hợp vàbiểu hiện ở các chủng chủ khác nhau như trong vi khuẩn (Ryan, S M et al,2006; J Yun,et al, 2004; Leveque, E et al, 2000), nấm men, nấm mốc [20], [21],[22]

Sử dụng α-amylaza bền nhiệt trong rũ hồ vải đã được ứng dụng từ nhữngnăm 90 của thế kỷ trước Hiện nay vẫn được tiếp tục nghiên cứu ứng dụng cácenzym tái tổ hợp trong nhiều ngành công nghiệp khác (Van Ee JH, et al, 2002;Hendriksen HV, et al, 1999; Bruinenberg PM et al, 1996) và làm biến tính sợitrong công nghiệp dệt [7]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu α-amylaza bền nhiệt ở Việt Nam

Nghiên cứu α-amylaza ở Việt Nam đã được tiến hành và nhiều công trìnhnghiên cứu đã được công bố về khả năng thu nhận α-amylaza từ vi sinh vật.Nhưng chưa có nhiều các nghiên cứu về vi sinh vật ưa nhiệt nhất là các nghiêncứu về đánh giá khu hệ vi sinh vật ưa nhiệt ở các suối nước nóng để có thể thấyđược tiềm năng và vai trò của chúng đối với hệ sinh thái và con người Tuynhiên cũng có một số nghiên cứu chỉ tập trung vào từng nhóm vi sinh vật tại một

số khu vực có suối nước nóng điển hình

Các nghiên cứu của Đỗ Thị Giang (Viện Công nghiệp thực phẩm) là mộttrong số các nghiên cứu về α-amylaza đầu tiên ở Việt Nam Sau đó là hàng loạt

các nghiên cứu như của tác giả Lê Đức Mạnh (Viện Công nghiệp thực phẩm)

thu nhận α-amylaza từ B subtilis và của các tác giả Trần Đình Mấn, Viện Công

nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong đó có cácnghiên cứu về đa dạng α-amylaza từ các chủng vi khuẩn phân lập ở Việt Nam.Theo nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cộng sự (1994) đã phân lập được 4chủng vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng tổng hợp α-amylaza bền nhiệt từ mẫu đấtthải Nhà máy Rượu Hà Nội Nghiên cứu đã phân lập, tuyển chọn, nghiên cứuđặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn ưa nhiệt sinh enzym thủy phân bềnnhiệt từ các mẫu nước ở suối nước nóng Mỹ Lâm - Tuyên Quang và La Phù -Phú Thọ [1], [4], [8], [9]

Các nghiên cứu tập trung vào phân lập các chủng sinh α-amylaza bềnnhiệt, đặc biệt là đã xác định được tính chất bền nhiệt của α-amylaza từ chủng vi

khuẩn B licheniformis 3BT2 có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 85oC, bền ở 90oC(nửa chu kỳ sống > 90 phút), phổ pH hoạt động tối ưu là khá rộng từ 4,5 ÷ 8,5nên dễ dàng điều chỉnh theo yêu cầu của công nghệ rũ hồ vải [9], [10], [11],[12], [13], [14]

Nghiên cứu về α-amylaza tái tổ hợp được tiến hành ở Viện Công nghệsinh học do nhóm tác giả Trương Nam Hải chủ yếu tập trung vào biểu hiện genα-amylaza và gen glucoamylaza ở nấm men [5], [6]

1.2 PHÂN BỐ VI KHUẨN ƯA NHIỆT SINH TỔNG HỢP α-AMYLAZABỀN NHIỆT Ở VIỆT NAM

1.2.1 Vi sinh vật sinh α-amylaza bền nhiệt

Phân loại vi sinh vật sống dựa vào mối quan hệ của chúng với nhiệt độluôn được coi là yếu tố cơ bản nhất của phương pháp phân loại sinh học Dựavào nhiệt độ sinh trưởng tối ưu, vi sinh vật được chia theo ba nhóm chính: visinh vật ưa lạnh có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu < 20oC, vi sinh vật ưa ấm cónhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 20 ÷ 40oC và vi sinh vật ưa nhiệt có nhiệt độ sinhtrưởng tối ưu 50 ÷ 70oC

Thông thường, các vi sinh vật với nhiệt độ sinh trưởng tối đa cao hơn

50oC được coi là vi sinh vật ưa nhiệt, để tạo nên ranh giới của vi sinh vật ưanhiệt trên 60oC dựa vào 2 luận cứ: thứ nhất, nhiệt độ thấp hơn ranh giới nàythường trong tự nhiên nơi có nhiệt độ cao hơn chủ yếu là kết hợp với các hoạtđộng địa nhiệt hay công nghiệp; thứ hai, các động vật không xương sống có thểtồn tại ở nhiệt độ gần 100oC nhưng không thể sinh trưởng dưới 50oC Do đó, thếgiới của vi sinh vật ưa nhiệt chỉ là các vi sinh vật nhân sơ Phạm vi của vi sinhvật ưa nhiệt chiếm hơn một nửa dải nhiệt độ của sự sống hiện nay

Bảng 1.1. Nhiệt độ tối đa đối với sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật

 Thực vật có mạch

 Rêu

4550Sinh vật nhân chuẩn

 Protozoa (nguyên sinh)

Vi sinh vật ưa nhiệt có thể được chia tiếp thành hai nhóm do sự mở rộng

giới hạn trên của sự sống Việc tìm ra vi khuẩn cổ Pyrolobus fumarii hoặc

chủng 121, chúng có thể sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ theo thứ tự là 113oC và

121oC Hiện nay nhóm vi khuẩn sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ trên 80oC đến

85oC thường được xếp vào nhóm vi sinh vật ưa nhiệt cao, hầu hết vi sinh vật ưa

nhiệt cao thuộc nhóm vi khuẩn cổ Đối với vi khuẩn, chỉ có một số loài được coi

là vi khuẩn ưa nhiệt cao như Thermotoga và Aquifex, chúng có nhiệt độ tối ưu

khoảng 90 ÷ 95oC [19], [25]

1.2.2 Sự phân bố vi khuẩn ưa nhiệt sinh α-amylaza bền nhiệt ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các suối nước nóng được phân bố rộng rãi trên khắp chiềudài lãnh thổ, ở các tỉnh từ miền Bắc tới miền Nam do địa hình nằm ở khu vựcnhiệt đới gió mùa, có nhiều tàn dư của các núi lửa họat động Các chấn động địachất đã xảy ra làm vỏ trái đất rạn nứt, nước trên mặt đất ngấm sâu vào lòng đất

và được làm nóng bởi đá địa nhiệt hoặc dòng macma, sau đó mạch nước dướisâu được đẩy kênh tạo suối nước nóng Theo công bố của Hội địa chất Thuỷ vănViệt Nam, hiện cả nước có khoảng 264 nguồn suối nước nóng, phần lớn cácsuối có nhiệt độ nóng trung bình 45 ÷ 50oC

Các suối nước nóng ở Việt Nam rất đa dạng cả về loại hình và thành phầnkhoáng cũng như các yếu tố về pH và nhiệt độ Một số suối nước nóng là cácsuối lộ thiên, một số suối khác ở dạng suối khoan Suối nước nóng cũng đượcphân loại theo thành phần khoáng chất, độ pH và nhiệt độ Một số suối nướcnóng điển hình: suối nước nóng Bình Châu - Bà Rịa Vũng Tàu, suối nước nóngSơn La, suối nước nóng Bang - Quảng Bình, suối nước nóng Kênh Gà - NinhBình …

Suối nước nóng Bình Châu thuộc huyện Xuyên Mộc tỉnh Bà Rịa - VũngTàu nằm ở vùng đồi đất đỏ bazan miền Đông Nam Bộ Nhiệt độ tại miệng phun

là 82oC tương đối ổn định, hệ thực vật phong phú, pH 7,7 Thành phần hoá họcnhư sau (mg/l): Li - 1.1, Na - 1100, K - 38, Cu - 290, Fe - 0.1, Mg - 11.4, Cl- -

1790, F- - 3,8, Br- - 34, SO42- - 394, HCO3- - 68, Bo - 0,56, SiO2- - 111 và NH4+ 0,088

-Hình 1.1 Suối nước nóng Bình Châu - Bà Rịa Vũng Tàu

Suối nước nóng Sơn La: nằm ở vùng Tây Bắc - Việt Nam cách thị xã Sơn

La 5 km có nhiệt độ tại miệng phun là 55 ÷ 60oC, pH 7,5 ÷ 7,8, thành phần hoáhọc chưa xác định

Suối nước nóng Bang: thuộc huyện Lệ Thủy - Quảng Bình nằm ở khu vựcthuộc dãy núi Trường Sơn Suối nước nóng Bang đại diện cho loại suối lộ thiên,nhiệt độ của nước ổn định ở 105oC Các thành phần hóa học chủ yếu như: Na+,

Ca+, Mg2+, K+, HCO3-, SiO2, NH4+

Suối nước nóng Kênh Gà: nằm ở khu vực núi đá thuộc tỉnh Ninh Bình.Nước suối Kênh Gà có hàm lượng cao các muối natriclorua, kaliclorua,canxiclorua, magieclorua và muối bicacbonat Nước suối không màu, khôngmùi, có vị chát, nước có nhiệt độ ổn định là 53oC

1.3 ALPHA - AMYLAZA BỀN NHIỆT TỪ VI KHUẨN

Alpha - amylaza (EC 3.2.1.1) có danh pháp quốc tế là glucanohydrolaza, là loại quan trọng nhất trong nhóm các enzym thuỷ phân tinhbột Hai trong số ba giai đoạn của quá trình đường hoá tinh bột là làm loãng tinhbột (dịch hoá) và dextrin hoá phụ thuộc vào α-amylaza

α-1,4-glucan-Alpha - amylaza thuỷ phân các liên kết α-1,4-glucozit nội mạch của tinhbột hay glucogen tại nhiều vị trí ngẫu nhiên giải phóng ra sản phẩm chủ yếu làdextrin có phân tử lượng thấp và một lượng nhỏ glucoza và maltoza do thuỷ

phân cục bộ Ngày càng có nhiều loại α-amylaza được tìm thấy ở hầu hết cácloại sinh vật: động vật, thực vật và đặc biệt là ở vi sinh vật.

1.3.1 Khái niệm về α-amylaza bền nhiệt

Alpha - amylaza từ các nguồn gốc và tính chất rất khác nhau Thường gặpcác loại α-amylaza có pHopt nằm trong khoảng 4,6 ÷ 4,9 và to

opt 40 ÷ 50oC Tuynhiên có một số loại α-amylaza có tính chất đặc biệt như: bền axit (acid stable α-amylaza: pHopt < 4,5), kiềm tính (alkaline α-amylaza: pHopt > 7,5), thích nghilạnh (cold adapted α-amylaza: to

opt < 30oC) và đặc biệt là α-amylaza bền nhiệtđược quan tâm nhiều trong những năm gần đây [7], [27], [28]

Giới hạn phân biệt giữa α-amylaza bền nhiệt với các loại enzym khácchưa có tác giả nào xác định cụ thể Tuy nhiên, hầu hết các công bố có liên quanđến enzym này đều cho thấy chúng có to

opt > 65oC và bền ở nhiệt độ lớn hơn

70oC [27], [28], [29], [30]

1.3.2 Đại lượng đặc trưng cho độ bền nhiệt của α-amylaza

Đại lượng đặc trưng cho độ bền nhiệt là nửa chu kỳ sống tương ứng vớithời gian bảo tồn được 50% hoạt tính ở nhiệt độ và pH xác định Nửa chu kỳsống của α-amylaza thường được xác định ở nhiệt độ bằng hoặc cao hơn to

opt.

1.3.3 Ảnh hưởng của Ca 2+ lên hoạt tính và độ bền nhiệt của α-amylaza

Phần lớn α-amylaza có hoạt tính và độ bền nhiệt phụ thuộc vào Ca2+

nhưng ở mức độ khác nhau Ở một số α-amylaza cả hoạt tính và độ bền nhiệtphụ thuộc vào Ca2+ Ở một số α-amylaza khác, Ca2+ chỉ làm tăng độ bền nhiệt màkhông ảnh hưởng tới hoạt tính enzym Ở trường hợp đầu Ca2+ vừa đóng vai trò

ổn định cấu trúc vừa đóng vai trò là chất hoạt hoá dị lập thể Còn ở dạng thứ hai

Ca2+ chỉ tham gia ổn định cấu trúc bậc ba của enzym

Theo Nielsen, Ca2+ chỉ có tác dụng làm tăng độ bền nhiệt và hoạt tính củaα-amylaza ở nhiệt độ cao Ở nhiệt độ thấp Ca2+ hoàn toàn có thể được thay thếbằng các ion kim loại hoá trị 2 thuộc nhóm kiềm thổ, trong khi đó ở nhiệt độ cao

Ca2+ không thể thay thế được bằng các ion khác Ở một số ít α-amylaza của vi

sinh vật cổ, Ca2+ không ảnh hưởng tới hoạt tính cũng như độ bền nhiệt của

enzym Alpha-amylaza của chủng B licheniformis MY10 bị ức chế và giảm độ

bền nhiệt bởi Ca2+ [18], [23], [24]

1.3.4 Ảnh hưởng của cơ chất lên độ bền nhiệt của α-amylaza

Trong điều kiện có cơ chất α-amylaza thường bền nhiệt hơn Ở một sốtrường hợp tính bền nhiệt của α-amylaza tăng lên khoảng 5 ÷ 10oC Cơ chế làmtăng độ bền nhiệt của α-amylaza khi có mặt của cơ chất có thể là khi được gắnvào phân tử α-amylaza, cơ chất làm cho enzym ổn định được cấu trúc bậc ba,bảo vệ các tương tác không hoá trị

1.3.5 Cơ chế bất hoạt hoá do nhiệt của α-amylaza

Độ bền nhiệt phụ thuộc vào tốc độ bất hoạt hoá của α-amylaza dưới tácđộng của nhiệt Cơ chế bất hoạt hóa sẽ giải thích tính bền nhiệt của α-amylaza

Theo Jerebxov cơ chế bất hoạt hóa do nhiệt của α-amylaza tương tự như

cơ chế bất hoạt hóa bởi ion H+ tức là bất hoạt xảy ra giữa các ion Ca2+ bị tách rakhỏi phân tử enzym Khi cầu nối canxi bị phá vỡ và tiếp đến là các liên kếthydro cũng sẽ bị phá vỡ do quá trình ion hoá phân tử enzym dưới tác động củanhiệt dẫn đến làm biến dạng phân tử protein Tuy nhiên các nghiên cứu trên mới

chỉ thực hiện với α-amylaza của đại mạch, A oryzae và B subtilis là những

enzym kém bền nhiệt và ở pH 4 ÷ 4,5 thấp hơn pH tối ưu của các enzym này Vìvậy, cơ chế trên không thể giải thích tính chịu nhiệt cao của các α-amylaza bềnnhiệt, đặc biệt là các enzym kiềm tính bền nhiệt

Các nghiên cứu sau này cho thấy quá trình bất hoạt của α-amylaza bởinhiệt diễn ra qua giai đoạn hình thành các dạng cấu trúc trung gian phụ thuộcvào nhiệt độ Vì thế có thể tồn tại rất nhiều dạng biến hình có hoạt tính Hoạttính enzym ở mỗi một nhiệt độ phụ thuộc vào dạng cấu trúc trung gian củaprotein hình thành ở nhiệt độ đó Ion canxi cần thiết để làm giảm hằng số vậntốc biến hình phân tử protein của cả dạng nguyên thuỷ và dạng trung gian củaenzym

Vận tốc biến dạng cấu trúc của α-amylaza phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố:lực tĩnh điện, lực liên kết hydro, tương tác với cơ chất, tương tác kị nước và cảcác liên kết đồng hóa trị (cầu nối SH) Ảnh hưởng của các yếu tố trên đã đượcchứng minh bằng thực nghiệm khi sử dụng các tác nhân làm suy yếu hoặc tăngcường các tương tác trên.

Ở mỗi α-amylaza các tương tác trên phụ thuộc vào thành phần và vị trícủa các axit amin trong mạch polypeptit hay nói đúng hơn phụ thuộc vào gen α-amylaza Giải thích về sự thay đổi tính bền nhiệt của enzym khi thu nhận ở cácnhiệt độ khác nhau của cùng một chủng vi sinh vật chỉ ra rằng các tương tác nàycòn phụ thuộc vào cách đóng gói phân tử enzym

1.4 ALPHA - AMYLAZA BỀN NHIỆT TỪ Bacillus

Giá trị các loại enzym công nghiệp trên thế giới hiện nay là 1 tỷ USD,

trong đó các loại enzym công nghiệp được sản xuất từ Bacillus chiếm khoảng

một nửa

Bacillus là loại vi khuẩn phổ biến nhất trong tự nhiên Trong số các vi

sinh vật sinh α-amylaza bền nhiệt có lẽ Bacillus có số loài lớn nhất và đa dạng

nhất Hầu như tất cả các loài thuộc giống này đều có thể tìm thấy các chủng sinh

α-amylaza Trừ các chủng B stearothermophilus và một vài chủng khác sinh trưởng ở nhiệt độ cao, phần lớn các chủng Bacillus sinh trưởng ở nhiệt độ bình

thường như những vi sinh vật ưa ấm

Theo quy luật thì những chủng sinh trưởng ở nhiệt độ cao sinh α-amylaza

bền nhiệt cao hơn Nhưng trong giống Bacillus lại thường gặp rất nhiều chủng

phát triển ở nhiệt độ không cao nhưng lại sinh α-amylaza bền nhiệt Tính chất

này của Bacillus làm cho nó thu hút sự quan tâm nghiên cứu để thu nhận nhiều

loại enzym công nghiệp trong đó có α-amylaza bền nhiệt

1.4.1 Đặc điểm phân loại của Bacillus

Đặc trưng cơ bản của giống Bacillus là hiếu khí hoặc kị khí không bắt

buộc, tế bào hình que, sinh nội bào tử

Bacillus thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng và phần lớn các loài là ưa ấm

(mesophiles) Tuy nhiên cũng có nhiều loại là ưa nhiệt (thermophiles), ưa lạnh (psychrophiles), ưa kiềm (alkadophiles) và ưa axit (acidophiles).

Theo Gordon, khoá phân loại Bacillus dựa trên các đặc điểm sinh lý, sinh

hoá, hình thái, đặc biệt là khả năng hình thành bào tử và được chia làm ba nhóm:

Nhóm I: bào tử hình oval, nằm ở giữa, không phình

Nhóm II: bào tử hình oval, nằm ở giữa, phình

Nhóm III: bào tử hình cầu, nằm ở đầu, phình

Tuy nhiên phân loại theo cách trên không thể xác định được mối quan hệ

họ hàng giữa các loài Sự phân biệt này sau đó được bổ sung bằng các phân tíchADN của chúng (tỷ lệ % mol G + C, 16S ARN-riboxom) Dựa vào các phân tích

trên Priest và cộng sự chia Bacillus thành 6 nhóm:

Nhóm I: hay còn gọi là nhóm B polymyxa, có bào tử hình oval,

phình, kỵ khí không bắt buộc, vừa lên men sinh butanediol vừa phát triểntrên các loại đường, kể cả các polysacarit

Nhóm II: đại diện là B subtilis sinh bào tử hình oval, không phình Nhóm này có các loài hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc như loài B.

licheniformis.

Nhóm III: đại diện là B brevis sinh bào tử hình oval, phình, hiếu

khí bắt buộc

Nhóm IV: đại diện là B sphaericus có bào tử hình cầu hiếu khí bắt

buộc, thành tế bào có chứa axit mesodiaminnopimelic

Nhóm V: bao gồm các loài ưa nhiệt (thermophiles) Nhóm VI: đại diện là B acidocaldarius và các loài vừa ưa axit vừa

ưa nhiệt Nhóm này sau đó được chuyển sang giống Alicyclobacillus.

Dựa trên các đặc điểm sinh lý sinh hoá các Kit phân loại được xây dựng

để định tên đến loài Một trong số các Kit chuẩn được sử dụng phổ biến là

API-50 - CHB

1.4.2. Alpha - amylaza bền nhiệt từ B licheniformis

Đại diện quan trọng nhất trong nhóm Bacillus sinh α-amylaza bền nhiệt là các chủng thuộc loài B licheniformis Chính α-amylaza bền nhiệt mang tên

thương phẩm nổi tiếng “Termamyl” của hãng Novo cũng được thu nhận từ loài

này Các chủng B licheniformis phát triển ở nhiệt độ không cao (37 ÷ 50oC)nhưng α-amylaza của các chủng này lại có to

opt rất cao (75 ÷ 90oC) và rất bền

nhiệt Có lẽ đây là loài có α-amylaza bền nhiệt cao nhất trong nhóm Bacillus.

Điều đặc biệt là các chủng trong loài này lại sinh α-amylaza bền nhiệt có tínhchất rất khác nhau: có loại hoạt động ở vùng pH trung tính, có loại chịu axit và

có loại kiềm tính

Bảng 1.2 Đặc điểm của α-amylaza từ một số chủng B licheniformis

Các nghiên cứu về α-amylaza của các chủng B licheniformis vẫn còn tiếp

tục gây sự chú ý rất lớn bởi tính chất đặc biệt của nó Câu hỏi đặt ra cho các nhà

nghiên cứu là nguyên nhân nào dẫn đến tính chất đa dạng đặc biệt của chúng và tại sao phát triển ở nhiệt độ thấp nhưng chúng lại sinh ra α-amylaza có tính bền nhiệt, bền axit, ưa kiềm… Enzym này là đối tượng của nhiều nghiên cứu về cấu trúc để giải thích tính bền nhiệt của α-amylaza

1.4.3 Alpha - amylaza bền nhiệt từ B stearothermophilus

Các chủng của loài này thuộc loại ưa nhiệt, có to

opt ở 60 ÷ 70oC Ở dưới

40oC, B stearothermophilus không phát triển Vì phát triển ở nhiệt độ cao nên

hầu hết α-amylaza từ các chủng của loài này đều có tính bền nhiệt Mặc dù cónhiệt độ phát triển cao nhưng α-amylaza của chúng lại kém bền nhiệt hơn enzym

của các chủng thuộc loài B stearothermophilus Nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu

của α-amylaza ở chúng nằm trong khoảng 70 ÷ 75oC và 4,5 ÷ 8,0 Tuy nhiên

cũng có những biến chủng B stearothermophilus sinh ra những α-amylaza có

tính chất khác biệt như chủng TRBF 14 có pHopt ở vùng kiềm 7,5 ÷ 9,5, chủng

AK-2 có to

opt ở 80oC và đặc biệt vùng pH opt rất rộng 6,5 ÷ 10,5

1.4.4 Alpha - amylaza bền nhiệt từ B subtilis

Các chủng B subtilis có hệ α-amylaza rất phong phú Alpha- amylaza từ

các chủng của loài này được đưa vào sản xuất rất sớm và được ứng dụng nhiềutrong công nhiệp thực phẩm Tuy nhiên hầu hết α-amylaza của các chủng nàyđều kém bền nhiệt Alpha - amylaza của chúng có to

opt 40 ÷ 55oC và pHopt 5 ÷ 7,

MV 47.000 ÷ 49.000 Da

1.4.5 Alpha - amylaza bền nhiệt từ B amyloliquefaciens

Alpha - amylaza của các chủng thuộc loài này có khả năng dịch hoá rấtmạnh hồ tinh bột nhưng độ bền nhiệt của enzym không cao Chỉ có một số ítchủng có khả năng sinh α-amylaza bền nhiệt

1.4.6 Alpha - amylaza bền nhiệt từ các loài Bacillus khác

Ngoài các loài quan trọng đã nêu ở trên, nhiều loài khác thuộc giống

Bacillus có khả năng sinh α-amylaza bền nhiệt Cùng với khả năng bền nhiệt

cao, các α-amylaza này có các vùng pHopt rất đa dạng

Đặc điểm của α-amylaza bền nhiệt từ một số chủng vi khuẩn ưa nhiệtđược trình bày ở bảng 1.3.

Bảng 1.3 Đặc điểm của α-amylaza bền nhiệt từ một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt

1.5 ALPHA-AMYLAZA BỀN NHIỆT TỪ CÁC LOẠI VI SINH VẬT KHÁC

1.5.1 Alpha - amylaza bền nhiệt từ vi sinh vật cổ

Vi sinh vật cổ gặp ở những nơi có nhiệt độ rất cao 80 ÷ 100oC trong điềukiện kỵ khí tuyệt đối Nhiệt độ phát triển cao nhất của những chủng này có thểlên tới 100oC Vi sinh vật cổ là nhóm nằm ở đỉnh rễ của cây di truyền và là đốitượng được quan tâm nghiên cứu ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới về cấutrúc và chức năng của protein siêu bền nhiệt

Alpha - amylaza bền nhiệt từ vi sinh vật cổ đã được tìm thấy ở các chủng

Pyrococus sp KOD1, P woesei DSM 3773, P furiosus, Thermococcus sp Rt3,

T profundus, T litoralis, Dictyolglomus thermophilum, Fervidobacterium sp., Natronococcus amylolyticus, Thermotoga mairima Hầu hết α-amylaza của các

loài này có to

opt 90 ÷ 100oC Nhiệt độ hoạt động tối đa có thể cao hơn 120oC Cóloại ở 130oC vẫn còn 20% hoạt tính Apha-amylaza của P woesei ở 120oC sau 8

h mới bị bất hoạt hoàn toàn.

1.5.2 Alpha - amylaza bền nhiệt từ vi khuẩn kỵ khí

Nhóm vi sinh vật kị khí rất phổ biến và có vai trò quan trọng trong tựnhiên Hệ enzym thuỷ phân của chúng cũng rất phong phú Tuy nhiên α-amylazabền nhiệt của những vi sinh vật này chỉ tập trung ở những loài ưa nhiệt thuộc

các giống Clostridium, Thermoanaerobacterium Trong giống Clostridium đã thu được α-amylaza bền nhiệt từ các chủng thuộc loài: C.

thermosaccharolyticum, C thermosulfruricum, C thermosulfurogenes Phần lớn

α-amylaza của nhóm này có to

opt 75 ÷ 90oC, pH 5,5 ÷ 6,5 Các α-amylaza này có

MW khoảng 165.000 Da, riêng α-amylaza của chủng C thermosaccharolyticum

có MW tới 450.000 Da

1.5.3 Alpha - amylaza bền nhiệt từ xạ khuẩn

Rất nhiều loài xạ khuẩn có khả năng bền nhiệt Trong đất, trong bể ủ rác

xạ khuẩn có số lượng khá lớn Chúng sinh ra enzym thuỷ phân trong nhiều chutrình chuyển hoá các hợp chất cacbon có phân tử lượng cao trong tự nhiên Tuy

nhiên α-amylaza bền nhiệt của xạ khuẩn mới chỉ thu nhận được ở một số chủng

thuộc các giống Streptomyces và Thermoactinomyces.

1.5.4 Alpha - amylaza bền nhiệt từ nấm mốc

Nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật nhân chuẩn, nhiệt độ phát triển củachúng không cao Tuy nấm mốc có hệ α-amylaza rất phong phú nhưng enzymcủa chúng thường kém bền nhiệt Chỉ có một số ít chủng nấm mốc sinh α-

amylaza bền nhiệt: Aspergillus sp K-27, Myceliophthora therrmophila D14 và

Talaromyces emersonii CBS 814.70 Ưu điểm của các α-amylaza này là thuỷ

phân tinh bột sâu hơn các α-amylaza từ vi khuẩn và bền ở vùng pH thấp (4.0 ÷5.0).

1.5.5 Alpha - amylaza bền nhiệt từ nấm men

Tương tự như nấm mốc, α-amylaza bền nhiệt của nấm men cũng còn ít

được nghiên cứu Alpha - amylaza bền nhiệt của chủng Cryptococcus sp S-2 có

đặc điểm là có khả năng thuỷ phân tinh bột sống Các tác giả cho rằng chínhđoạn axit amin tạo nên vùng gắn với cơ chất tinh bột sống đã làm tăng tính bềnnhiệt của enzym.

1.5.6 Sinh tổng hợp α - amylaza bền nhiệt từ Bacillus

Tổng hợp α-amylaza bền nhiệt từ Bacillus theo cơ chế cảm ứng Tinh bột,

dextrin và một số loại cơ chất khác đều đóng vai trò làm chất cảm ứng để tổnghợp α-amylaza Ngược lại, các loại đường đơn, đường đôi thường là các chất ức

chế sinh tổng hợp α-amylaza ở Bacillus Tùy thuộc vào đặc điểm sinh lý sinh

hóa của tùng chủng, các thành phần khác của môi trường đều được xác định chophù hợp Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp α-amylaza là nhiệt độ và pH

Các phương pháp lên men được sử dụng để thu nhận α-amylaza từ

Bacillus bao gồm :

- Lên men tĩnh trên môi trường xốp

- Lên men chìm

- Lên men kỵ khí

- Lên men bằng tế bào cố định

1.6 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA α-AMYLAZA BỀN NHIỆT

Alpha - amylaza được sử dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệpnhư: công nghiệp thực phẩm, dệt, bia rượu, tẩy rửa, tinh bột …

1.6.1 Ứng dụng α - amylaza trong công nghiệp dệt

Alpha-amylaza được sử dụng nhiều trong công nghiệp dệt Trong côngnghiệp dệt các loại vải sản xuất từ sợi coton đều sử dụng tinh bột để hồ sợi nhằmlàm tăng độ mịn của sợi tránh bị xơ và làm trơn sợi trong quá trình dệt Tinh bộttrên sợi được loại bỏ khi hoàn thiện vải được gọi là công đoạn rũ hồ Trước đây,

rũ hồ vải dùng phương pháp axit ở nhiệt độ cao nên có nhiều nhược điểm: chấtlượng vải bị ảnh hưởng, thiết bị bị ăn mòn, khó khăn trong đảm bảo vệ sinh antoàn lao động cho công nhân, nước thải sau rũ hồ gây ô nhiễm môi trường Từnhững năm 80 của thế kỷ trước, hầu hết các nước phát triển đã chuyển sang rũ

hồ vải bằng enzym Ở Việt Nam, ứng dụng công nghệ rũ hồ vải được thực hiện

từ những năm 90 và đã mang lại hiệu quả rõ rệt cả về mặt kinh tế và bảo vệ môitrường Trong công nghiệp dệt, α-amylaza được sử dụng chủ yếu trong rũ hồ vảitrước khi tẩy trắng và nhuộm Alpha - amylaza có tác dụng làm vải mềm, có khảnăng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt Rũ hồ bằng enzym không nhữngnhanh, không hại vải, độ mao dẫn tốt mà còn đảm bảo vệ sinh, do đó tăng đượcnăng suất lao động

Ứng dụng công nghệ rũ hồ vải bằng enzym đã được thực hiện ở hầu hếtcác công ty dệt may ở Việt Nam Công ty dệt may Phong Phú là đơn vị đầu tiên

ở Việt Nam sản xuất máy rũ hồ bằng công nghệ enzym và là đơn vị đầu tiên sửdụng công nghệ rũ hồ và cắt lông vải Jeans bằng tích hợp nhiều loại enzym

1.6.2 Ứng dụng α - amylaza trong một số ngành công nghiệp khác

+ Trong sản xuất tinh bột

Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong

kỹ thuật và trong đời sống con người Trong chế biến tinh bột và đường, công

đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các dạng đường đơn giản Sau đóchủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men người ta sẽ nhận được rất nhiều cácnhóm sản phẩm quan trọng như rượu cồn, rượu vang, bia, các loại axit amin,axit hữu cơ… Ví dụ như quy trình công nghệ sản xuất siro fructoza có sự thamgia của α-amylaza.

Ngành công nghiệp tinh bột là một trong những ngành sử dụng enzym lớnnhất để thuỷ phân và chuyển hoá một cách hiệu quả nguyên liệu thô Polymetinh bột cũng giống như các polyme khác cần có sự kết hợp của hệ enzym đặcbiệt là α-amylaza để thuỷ phân hoàn toàn Enzyme thuỷ phân tinh bột chiếm30% lượng enzym tiêu thụ trên thế giới

+ Trong sản xuất cồn

Trong sản xuất cồn từ tinh bột enzym α-amylaza VTP dạng lỏng với hoạtlực 600 SKB/ml có khả năng thay thế hoàn toàn phương pháp dịch hoá nấu bằngaxit sunfuric, giảm được áp lực hơi từ 4 kg/cm2, giảm được thời gian om 20phút/1 nồi nấu, có khả năng tăng sản lượng nấu 12 ÷ 20% tuỳ loại nguyên liệu,

có khả năng tăng hiệu suất lên men 2,24 ÷ 85% so với quy trình cũ

+ Trong sản xuất bia

Sử dụng enzym dịch hoá α-amylaza (Termamyl) với lượng 0,5 kg/tấngạo; glucoamylaza (Fungamin) với lượng 0,2 kg cho 1 tấn malt; proteaza(Neutraza) với lượng 0,2 kg cho 1 tấn malt khi nâng hàm lượng gạo thay thế từ

30 ÷ 50% không làm thay đổi lượng dịch đường thu được và không làm thay đổichất lượng của bia thành phẩm

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn ký hiệu: ML04, ML05, ML06, ML07, ML08, ML09,LP09, LP10 và LP11 được phân lập từ mẫu nước ở suối nước nóng Mỹ Lâm -tỉnh Tuyên Quang và suối nước nóng La Phù - Phú Thọ trong Bộ sưu tập giốngPhòng Công nghệ vật liệu sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học

2.1.2 Hóa chất dùng chính trong nghiên cứu

Đường: glucoza, sacaroza, Việt Nam

Cao thịt (Meat extract) - Biokar Dianogstique, Pháp

Cao men (Yeast extract) - Biokar Dianogstique, Pháp

Axetat natri CH3COONa, Trung Quốc

Dipotassium hydrogen photphat K2HPO4, Trung Quốc

Potassium hydrogen photphate KH2PO4, Trung Quốc

Ammonium citrat, Trung Quốc

Sunfat magiê MgSO4.7H2O, Trung Quốc

Sunfat mangan MnSO4.4H2O, Trung Quốc

Pepton, Trung Quốc

Ammonium chloride NH4Cl, Trung Quốc

Calcium chloride CaCl2, Trung Quốc

Natri chloride NaCl, Trung Quốc

Axit dinitrosalixylic (DNSA) , Trung Quốc

Tinh bột tan - BHD, Anh

Agar - Việt Nam

Potassium chloride KCl, Trung Quốc

Ammonium sulfat (NH4)2SO4, Trung Quốc