Tiểu luận Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong phong lữ thảo

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân,lá cây Phong lữ thảo bằng phản ứng hóa học...12... Phân lập và xác định cấu trúc một sốhợp chất trong mẫu thử có tác dụng xua muỗi thân,

TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU

Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ

có trong Phong lữ thảo

MỤC LỤC

1 SƠ ĐỒ THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 3

2 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 4

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

CHƯƠNG 1 5

1.1 Thẩm định tên khoa học 5

1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 5

1.2.1 Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong Phong lữ thảo 5

1.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong cây Phong lữ thảo 6

CHƯƠNG 2 8

2.1 Nghiên cứu thử tác dụng xua muỗi Aedes aegypti 8

2.1.1 Kỹ thuật thu thập muỗi và bọ gậỵ 8

2.1.2 Kỹ thuật thử tác dụng xua 10

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 11

3.1 THẨM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC 11

3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 12

3.2.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân,lá cây Phong lữ thảo bằng phản ứng hóa học 12

3.2.2 Các cao chiết xuất cồn 96% và cao phân đoạn của dịch chiết cồn 96% từ

thân,lá cây Phong lữ thảo, tinh dầu tổng 12

3.2.3 Phân lập và xác định cấu trúc một sốhợp chất trong mẫu thử có tác dụng xua muỗi thân, lácây Phong lữ thảo 12

3.3 NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 12

3.4 BÀN LUẬN 12

3.4.1 Về việc chọn đề tài và mục tiêu của đề tài 12

3.4.2 Về thẩm định tên khoa học 13

3.4.3 Về hóa học 13

3.4.4 Về tác dụng sinh học 14

KIẾN NGHỊ VỀ VIỆC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 14

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 15

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 16

1 SƠ ĐỒ THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU

Gồm nghiên cứu mô tả cắt ngang và nghiên cứu thử nghiệm thể hiện qua

sơ đồ thiết kế nghiên cứu sau:

Thu thập bọ gậyvà

muỗi Ae.aegypti

Thẩm định tên khoa học Phong lữ

thảoThu hái, chế biến, bảo quản dược

liệu Phong lữ thảo

Trứng muỗi Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ

thân, lá phong lữ thảo

Bọ gậy

Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn

(n-hexan, ethyl acetat, nước) của cao cồn

96%, cất tinh dầu tổng hợp của thân, lá

Phong lữ thảo

Muỗi trưởng thành

F1

Thử tác dụng xua với

muỗi Ae.aegypti

Đánh giá tác dụng xua

muỗi

Sơ đồ 2.3: thiết kế nghiên cứu

2 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU

 Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của Phong lữ thảo:

- Thẩm định tên khoa học Phong lữ thảo

- Thu hái, chế biến, bảo quản Phong lữ thảo

- Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ thân, lá cây phong lữ thảo

- Điều chế cao cồn 96%, cao phân đoạn (n-hexan, ethyl acetat, nước) của cao cồn 96%, cất tinh dầu tổng hợp của thân, lá cây Phong lữ thảo

- Phân lập và xác định cấu trúc các thành phần hóa học trongthân, láPhong

lữ thảo

 Nghiên cứu đánh giá một số tác dụng sinh học: Thử và đánh giá tác dụng xua muỗi với các mẫu thử được điều chế từ thân, lá phong lữ thảo

- Thu thập bọ gậy

- Nuôi bọ gậy

- Nuôi muỗi trưởng thành

- Cho đẻ trứng

- Nuôi bọ gậy F1

- Nuôi muỗi trưởng thành F1 bằng glucose 10 %

- Thử tác dụng xua muỗi với các mẫu thử được điều chế từ thân, lá phong lữ thảo

Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ mẫu thử có tác dụng xua muỗi

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 1

1.1 Thẩm định tên khoa học.

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây Phong lữ thảo tại thực địa

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản

Xác định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh các khóa phân loại của thực vật chí Việt Nam, Trung Quốc dưới sự hướng dẫn của chuyên gia thực vật

1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học.

1.2.1 Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong Phong lữ thảo.

- Thực hiện các phản ứng định tính nhóm chất có trong dược liệu bằng các phản ứng định tính trong ống nghiệm và sắc ký lớp mỏng[1],theo sách Thực tập Dược liệu (phần định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học) – Bộ môn Dược liệu – Trường ĐH Dược Hà Nội

+ Nhóm Alcanoid : Phản ứng với thuốc thử Mayer

Phản ứng với thuốc thử Dragendorff

Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

+ Nhóm Flavonoid: Phản ứng với Cyanidin

Phản ứng với hơi NH3

Phản ứng với kiềm loãng

Phản ứng với FeCl3 5%

+ Nhóm Saponin: Hiện tượng tạo bọt

Phản ứng Liebermann

Phản ứng Baljet

Phản ứng Legal

Phản ứng Keller – Kiliani

+ Nhóm Coumarin : Phản ứng mở đóng vòng lacton.

+ Nhóm Tanin : Phản ứng với FeCl3 5%

Phản ứng chì acetat 10%

+ Nhóm Anthranoid: Phản ứng Borntrager

+ Nhóm Acid hữu cơ: Phản ứng với Na2CO3

+ Nhóm đường khử: Phản ứng với thuốc thử Felling A và B

+ Nhóm chất béo: vết mờ trên giấy lọc

+ Nhóm Sterol: Phản ứng Salkopski

Phản ứng Liberman

+ Nhóm Caroten: Với H2SO4 đặc

+ Polysaccharid: với thuốc thử Lugol

+ Acid amin: Với thuốc thử Nihydrin

+ Định lượng tinh dầu:

Dược liệu đã xác định độ ẩm Tinh dầu được tách ra bằng phương pháp cất kéo hơi nước, hàm lượng tinh dầu tính theo công thức sau:

HLT.D(%)=¿ a × 100

A ×(100−x) × 100

Trong đó: a: số ml tinh dầu thu được

A: Khối lượng dược liệu đem định lượng

X: Hàm ẩm của dược liệu Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê.[5]

1.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong cây Phong lữ thảo.

- Chiết xuất các hoạt chất trong dược liệu bằng cồn công nghiệp Cất thuhồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn cồn toàn phần

- Chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết cồn toàn phần bằng các dung môi có

độ phân cực tăng dần (n-Hexan, Ethyl acetat), thu được các phân đoạn tương ứng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân lập các chất

- Phân lập các hợp chất trong mẫu cao dược liệu bằng sắc kí cột với chất hấp phụ là silica gel, cỡ hạt 0,04 - 0,063mm hoặc sắc ký điều chế.Theo dõi các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng

+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G

F254(Merck) (silica gel, 0.25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại có hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

+ Phân tích các phân đoạn bằng SKLM để lựa chọn dung môi phù hợp cho việc phân tách các chất bằng sắc ký cột

+ Sắc ký cột được tiến hành với chất phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063mm, Merck) vàsilica gel pha đảo YMC (30-50µm, FuJisilisa Chemical Ltd.) Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng việc phân tích các đặc điểm hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và dựa trên số liệu các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

+Chiết 3 lần với EtOH 96%

+ Cất thu hồi dung môi

Phong lữ thảo (thân, lá)

Cao tổng

Bổ sung nước Bổ sung nước Lắc với n-hexan

Lắc với EtOAc

Chạy cột tinh chế

Sơ đồ 3.2:thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh khiết từ thân, lá

củaPhong lữ thảo

CHƯƠNG 2

2.1 Nghiên cứu thử tác dụng xua muỗi Aedes aegypti.

2.1.1 Kỹ thuật thu thập muỗi và bọ gậỵ

 Kỹ thuật thu thập muỗi:

-Tay phải cầm ống nghiệm, tay trái cầm đèn pin ( nơi sáng không cần đèn) đi nhẹ nhàng để muỗi khỏi bay Vừa đi vừu rọi đèn pin vào tường để soi muỗi Đèn thường cách tường 30cm, chiếu qua chiếu lại tránh kích thích ánh sáng trực tiếp vào muỗi Khi thấy muỗi, tay cầm ống nghiệm bằng ngón tay cái và ngón giữa

úp nhanh ống nghiệm lên muỗi, theo phản xạ muỗi bay vào ống Lấy ít bông để

Cao n-hexan Dịch nước

Cao nước Cao EtAc

Chất tinh khiết

lên miệng ống.Mỗi ống nghiệm chừng 4-5 con Khi miếng bông cuối cùng cách miệng ống 2 cm Ghi nhãn: Địa điểm bắt, thời gian bắt ( giờ, ngày, tháng), người bắt:

-Vị trí bắt muỗi:

+ Tùy theo đặc điểm sinh lý, sinh thái: sinh địa cảnh, vật chủ thích hợp, nơi trú ẩn tiêu máu, nơi rình mồi để hút máu…của từng loài muỗi mà xác định vị trí bắt muỗi

+ Thường tìm bắt muỗi ở nơi tối, ẩm như ngầm giường, ngầm tủ, ngầm cầu thang, hay trong chuồng gia súc hoặc các lùm cây rậm rạp quanh nhà, bờ rào, nơi kìn gió và có nước

+ Có thể bắt muỗi khi muỗi mới nở từ quăng, muốn vậy phải bắt từ 5-6 giờ, tìm bắt muỗi trên mặt nước ở các vũng nước dụng cụ chứa nước

-Dung mồi để bắt muỗi:

+ Mồi người: có thể bắt muỗi ở trong nhà hoặc ngoài nhà, thường mồi ở những nơi kín gió Người ngồi và vén quần lên trên đầu gối, tay cầm đèn pin soi bắt muỗi

+ Mồi động vật: Mắc màn trên một tấm ván hoặc tấm đan nhốt động vật vào lồng (khỉ, chuột…) đặt lồng vào trong màn và vén của màn lên cho muỗi bay vào đốt động vật Buông màn xuống bắt muỗi trong màn

 Kỹ thuật thu thập bọ gậy:

+Dùng đèn pin soi vào trong các DCCN và vợt bọ gậy Lật ngược vợt ra khay men có chứa nước sẵn để bắt Dùng ống hút để hút bọ gậy tập trung vào lọ Điều tra bọ gậy ở hốc cây, hốc đá khó dùng vợt thì dùng ống hút có quả bóp cao su dài Hút nước trong hốc cây ra, đổ vào khay men để tìm bọ gậy

+ Dùng vợt và ống hút thu thập bọ gậy, lăng quăng ở tất cả các DCCN trong nhà

và quanh nhà

+ Cho bọ gậy bắt được vào bình nước sạch

- Kỹ thuật nuôi bọ gậy:

+ Cho bọ gậy vào bocan chứa nước, đặt trong lồng có phủ màn che

+ Cho thức ăn nuôi bọ gậy vào trong nước

+ Chờ bọ gậy phát triển thành muỗi trưởng thành và đẻ trứng, phát triển thành bọ gậy thế hệ F1, rồi thành muỗi thế hệ F1

- Kỹ thuật nuôi muỗi:

+ Muỗi thế hệ F1 được bắt cho vào lồng nuôi muỗi

+ Cho muỗi hút máu chuột nhắt trắng [3]

2.1.2 Kỹ thuật thử tác dụng xua.

- Kỹ thuật tiến hành:

+Chuẩn bị muỗi: Muỗi cái (chọn muỗi cái dựa vào đặc điểm hình thể bên ngoài) khoẻ, đủ chân, cánh, bay bình thường, cho vào lồng để muỗi ở nơi yên tĩnh

30 phút

+ Bôi dược chất xua vào tay trái (từ cổ tay đến hết bàn ngón tay), thường có

2 người: một người theo dõi và một người thử

+ Người thử cho hai tay vào lồng muỗi, tay trái có thuốc, tay phải đối chứng ( không có thuốc)

+ Mỗi khi cho đậu vào tay ( kể cả tay có thuốc hay tay ko có thuốc) người thử nghiệm tung tay cho muỗi bay đi, người theo dõi đếm số muỗi đậu vào tay

và ghi vào sổ

+ Mỗi giờ thử 15 phút, sau đó cả người và muỗi đều nghỉ, cứ tiếp tục cho đến khi muỗi đậu vào hai tay bằng nhau là thuốc hết tác dụng

Trên thực địa, có thể hai người cùng thử, một chân xoa thuốc ( xoa đều ra

cổ chân ra mu và ngón chân), một chân đối chứng không xoa thuốc Khi nào có

số muỗi đốt hai chân ngang nhau thì thuốc hết tác dụng

Để đánh giá tác dụng của muỗi mỗi loại thuốc theo giờ thử nghiệm, tính kết quả theo hệ số giảm đốt K (Gladkix S.G, 1964)

K=a−b a ×100 K: hệ số giảm đốt (%)

a: số muỗi đậu vào tay, chân không có thuốc

b: số muỗi đậu vào tay, chân có thuốc

Nếu K = 100% : tác dụng của thuốc xua muỗi rất tốt

K ≥ 50% : có tác dụng xua muỗi

K< 50% : không có tác dụng xua.[3]

2.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU.

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học,

sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel

- Kết quả thí nghiệm được hiển thị bằng trị số trung bìnhcộng/trừ độ lệch chuẩn (M ± SE)

- Đánh giá, so sánh thống kê giữa các lô thí nghiệm bằng phương pháp T test-Student Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 THẨM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC.

- Tiến hành thu hái mẫu đầy đủ thông tin về cây, hoa, lá, cành để giám định tên khoa học của dược liệu nghiên cứu

- Văn bản xác định tên khoa học

3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC.

3.2.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân,lá cây Phong lữ thảo bằng phản ứng hóa học.

3.2.2 Các cao chiết xuất cồn 96% và cao phân đoạn của dịch chiết cồn 96%

từ thân,lá cây Phong lữ thảo, tinh dầu tổng.

3.2.3 Phân lập và xác định cấu trúc một sốhợp chất trong mẫu thử có tác dụng xua muỗi thân, lácây Phong lữ thảo.

3.3 NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC.

- Thử tác dụng xua muỗi của các mẫu thử được điều chế từthân, lá câyPhong lữthảo

3.4 BÀN LUẬN.

3.4.1 Về việc chọn đề tài và mục tiêu của đề tài.

Phong lữ thảo có tên khoa học là Pelargonium hortorum Bailey thuộc họ

Mỏ hạc (Geraniaceae), theo các tài liệu cho thấy ở nước ta Phong lữ thảo chưa được nghiên cứu ở góc độ y học hiện đại cả tác dụng dược lý và thành phần hóa học cũng như không có ghi nhận nào chú ý một số tính chất rất độc đáo là Phong

lữ thảo không những là cây hoa đẹp lại có thể làm sạch môi trường đất có kim loại nặng và có tác dụng xua đuổi muỗi, làm thuốc trị viêm tai giữa…Nhu cầu đặt ra là cần có những nghiên cứu có giá trị khoa học để làm sáng tỏ thành phần hóa học, tác dụng sinh học và giá trị sử dụng của cây thuốc này

Kiểm soát muỗi là một vấn đề quan trọng trong thời đại ngày nay với số lượng ngày càng tăng của các bệnh truyền qua muỗi Trong lịch sử thế giới, nhiều người đã chết vì các bệnh lây truyền qua muỗi hơn tất cả các cuộc chiến tranh.Bệnh sốt xuất huyết Dengua ở Việt Nam ngày càng gia tăng trong những

năm gần đây, vai trò truyền bệnh chủ yếu là muỗiAedes aegypti Trong khi đó,

vấn đề kiểm soát và phòng chống muỗi đã chứng minh là hiệu quả cao trong phòng chống các bệnh truyền qua muỗi.[15]

Việc sử dụng các dược chất được chiết xuất từ thực vật đã thực sự có tác dụng trong phòng chống muỗi, hơn nữa chúng lại không độc cho người, động vật và môi trường Để góp phần phòng chống muỗi và các bệnh do muỗi truyền

chúng tôi tiến hành đề tài:“Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng

xua đuổi muỗi Aedes aegypticủa Phong lữ thảo (Pelargonium hortorum

Bailey)” Để góp phần vào những nghiên cứu sâu rộng về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Phong lữ thảo

3.4.2 Về thẩm định tên khoa học.

Về tên khoa học:Phong lữ thảocó tên khoa học là Pelargonium hortorum

Bailey thuộc họ Mỏ hạc (Geraniaceae) Cây thường trồng với tên trên là loài lai

củaloài thứ nhất là Pelargonium zonale L’ Hérit Ex Soland vàloài thứ hai là

Pelargonium inquinans Ait.Từ hai loài được trồng này, người ta đã tạo ra loài lai

có dạng màu của loài thứ nhất, có hoa gần với loại thứ hai, ra hoa gần như liên tục trong mùa khô Bây giờ thì sự lai giống đã đến khó phân biệt sự gần gũi với

tổ tiên nào hơn Do vậy , hiện nay có nhiều nòi khác nhau do lai tạo.[2]

Tuy nhiên theo “ Từ điển cây thuốc Việt Nam” Võ Văn Chi thì đưa ra tên cây là Phong lữ có tên khoa học là Pelargonium hortorum Bailey thuộc họ

Phong lữ (Geraniaceae) Các tài liệu tôi tham khảo chủ yếu là tài liệu về loài

Pelargonium hortorum Bailey.

3.4.3 Về hóa học.

- Về định tính: Sơ bộ xác định nhóm hoạt chất chính có trong thân , lá của cây Phong lữ thảobằng phương pháp hóa học [1] Ưu điểm của phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh

- Điều chế các mẫu thử để thử tác dụng xua muỗi từ đó làm cơ sở để phân lập một số hợp chất chính trong mẫu thử có tác dụng nhằm định hướng sau này nghiên cứu sâu hơn tạo sản phẩm ứng dụng trong xã hội

3.4.4 Về tác dụng sinh học.

- Kết hợpvới phần nghiên cứu hóa học để tìm kiếm phân đoạn có hoạt tính

cũng như hợp chất chính từ phân đoạn có hoạt tính định hướng cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng sau này

KIẾN NGHỊ VỀ VIỆC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

- Nghiên cứu quy trình phân lập các chất đã tìm ra với hiệu suất cao

- Tiến hành thử tác dụng dược lý của chất đã phân lập được

- Tiếp tục nghiên cứu xác định thành phần hóa học của cây Phong lữ thảo và tiến hành thử tác dụng dược lý của các chất phân lập được từ Phong lữ thảo

- Nghiên cứu chiết xuất nhóm hoạt chất có tác dụng sinh học và phối hợp với một số dược liệu để bào chế dạng cream xua đuổi côn trùng

- Nghiên cứu, chế tạo ra phương pháp pha chế thuốc, đo lường khả năng có thể gây chết, tiến hành những thí nghiệm về hiệu quả diệt trừ côn trùng gây