Tổng hợp và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt tế bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học TT

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- NGUYỄN NGỌC THỂ TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MANG THUỐC VÀ TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỆ NANOGEL TRÊN CƠ SỞ POLYSAC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN NGỌC THỂ

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MANG THUỐC VÀ TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỆ NANOGEL TRÊN CƠ SỞ

POLYSACCHARIDE SULFATE (HEPARIN, FUCOIDAN) GHÉP CÁC COPOLYMER TƯƠNG

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Trần Ngọc Quyển Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Thị Thanh Thủy

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án:

Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum (II)) là một trong những thuốc chống ung thư chủ lực được sử dụng rộng rãi và hiệu quả để điều trị nhiều loại khối u rắn Tuy nhiên, nghiên cứu tác dụng lâm sàng của cisplatin về sau bị hạn chế bởi tính chọn lọc kém của thuốc giữa mô bình thường và mô khối u Đồng thời, độc tính của thuốc cũng đã gây ra nhiều tác dụng phụ trên thận, suy tủy, nhiễm độc thần kinh mãn tính,… từ đó dẫn đến tình trạng kháng thuốc và hạn chế liều lượng trong quá trình điều trị [2-4]

Vì vậy, để khắc phục những hạn chế trên, các chất mang thuốc dạng hạt nano đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước phát triển mạnh mẽ, trên cơ sở làm tăng sự tích tụ thuốc tại tế bào ung thư và từ đó giảm được các tác dụng phụ bất lợi của thuốc Nanogel là hệ chất mang nanopolymer đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới Nanogel có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với các hệ chất mang nano khác như: có hình dạng

và kích thước nano linh hoạt, có khả năng đáp ứng đồng thời với nhiều kích thích từ môi trường ngoài như nhiệt độ, pH, cường độ ion, góp phần tăng cường hiệu quả trong việc giải phóng thuốc

có kiểm soát [5-7]

Do đó, hướng nghiên cứu điều chế các chất mang nanogel nhằm tạo ra sự tương thích sinh học cao của chất mang, giảm độc tính của thuốc, góp phần nâng cao hiệu quả mang thuốc và điều trị sẽ có nhiều ý nghĩa khoa học và ứng dụng Ngoài ra, việc sử dụng cisplatin dạng hydrate tạo phức với chất mang cũng có thể

làm tăng khả năng mang thuốc và tiêu diệt hiệu quả tế bào ung thư

Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện

đề tài “Tổng hợp và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt tế

bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

Tổng hợp và đánh giá các đặc tính của chất mang nanogel trên

cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép với các pluronic khác nhau với mục tiêu khảo sát hiệu quả mang thuốc chống ung thư cisplatin và cisplatin hydrate Từ đó, ứng dụng điều chế hệ nanogel trong dẫn truyền thuốc kết hợp cisplatin hydrate và nanocurcumin nhằm mục đích giảm thể tích khối u

ung thư vú trên mô hình chuột (Mus musculus var Albino) mang

khối u ghép dị loài từ người

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:

1 Tổng hợp và đánh giá cấu trúc, hình thái các nanogel trên

cơ sở heparin liên hợp pluronic P123, F127, F68 và F87 với các

4 Tổng hợp và đánh giá cấu trúc, hình thái của nanogel trên

cơ sở polysaccharide sulfate fucoidan liên hợp pluronic P123

5 Khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ nanogel Fud-P123 mang thuốc

6 Tổng hợp và khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ nanogel Hep-F127 mang thuốc kết hợp cisplatin hydrate và nanocurcumin

7 Đánh giá hiệu quả tiêu giảm thể tích khối u ung thư vú trên

mô hình chuột mang khối u ghép dị loài từ người của hệ nanogel mang thuốc kết hợp

Bố cục của luận án: luận án gồm phần Mở đầu, kết luận, kiến

nghị và 3 chương (Chương 1: Tổng quan, Chương 2: Nghiên cứu, Chương 3: Kết quả và bàn luận) Luận án có 25 bảng số liệu, 71 hình vẽ và đã có 3 công trình có liên quan được công bố Phần phụ lục bao gồm 32 hình vẽ và 21 bảng số liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nanogel

Thuật ngữ “nanogel” được định nghĩa là những hạt có kích thước nano được tạo thành bởi các liên kết ngang có tính chất vật

lý hoặc hóa học của các mạng lưới polymer Kích thước của các nanogel thường trong khoảng từ 20-200 nm, do đó giảm được sự thanh thải của thận và kéo dài thời gian bán thải trong huyết thanh [21-22]

Các nanogel này có thể bẫy các phân tử kỵ nước (các thuốc chống ung thư), các protein (enzyme, insulin, protein kháng nguyên), và các acid nucleic (plasmid ADN), vì thế chúng được

sử dụng như các nano polymer trong lĩnh vực điều trị ung thư, phân phối protein và các vaccine nhân tạo [23]

1.2 Ung thư và thuốc chống ung thư cisplatin

Ung thư xảy ra do sự đột biến trong ADN, dẫn đến tế bào tăng sinh vô hạn độ, vô tổ chức, không tuân theo các cơ chế kiểm soát

về phát triển cơ thể Vấn đề quan trọng nhất trong bệnh lý ung thư là sự phân biệt giữa các khối u lành tính và ác tính Thông qua các nghiên cứu trong thời gian gần đây, ung thư được chứng minh có liên quan đến yếu tố di truyền, nghĩa là do sự biến đổi trong các gene dẫn đến những thay đổi trong chức năng và sự phân chia tế bào

Cisplatin đã được sử dụng trong lâm sàng để điều trị các bệnh ung thư Đến nay, cisplatin được chứng minh là một trong những thuốc hóa trị liệu chống ung thư hiệu quả nhưng cần kết hợp với các thuốc khác trong quá trình điều trị và cần nhiều nghiên cứu thêm để cải thiện các phương pháp điều trị nhằm cắt giảm tác dụng phụ của thuốc Trong đó hướng nghiên cứu chất mang vận chuyển nhả chậm thuốc với kích thước nano được xem là một trong những giải pháp hiệu quả nhất nhằm giải quyết những hạn chế do các tác dụng phụ và sự kháng thuốc của cisplatin

1.3 Những nghiên cứu trước đây

Trong nước: đã có một vài nhóm nghiên cứu đối với chất mang nano để vận chuyển thuốc cisplatin hoặc phức platin (II) tiêu biểu gồm: nhóm nghiên cứu của Nguyễn Cửu Khoa và Trần Ngọc Quyển tổng hợp hạt nano dendrimer mang thuốc chống ung thư 5-fluouroacil và cisplatin; Trần Ngọc Quyển, Nguyễn Đại Hải và nhóm nghiên cứu ở Hàn Quốc đã tổng hợp thành công chất mang nanogel âm điện - nhạy nhiệt trên cơ sở heparin

Ngoài nước: các nhóm tác giả Xiang-Hong Peng (2011), Liu (2012), Yoon Ki Joung (2013), Lili Liu (2014), Yi Zhang (2018), Seyed Ebrahim Alavi (2019), Pai-An Hwang (2017), Merve Tutuncu (2018) nghiên cứu kết hợp thuốc chống ung thư cisplatin

và chất mang nano Nghiên cứu kết hợp curcumin với thuốc chống ung thư cisplatin có các nhóm tác giả Mendonça (2013), Baharuddin (2016), Parveen Kumar (2017)

Chưa có công trình khoa học trong và ngoài nước về điều chế

và ứng dụng nanogel từ fucoidan, cũng như sử dụng hệ chất mang nanogel trên cơ sở heparin-pluronic tạo phức trực tiếp với cisplatin dạng hydrate cùng kết hợp với nanocurcumin

CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp các nanogel trên cơ sở heparin, fucoidan liên hợp

pluronic P123, F127, F68 và F87 với các tỉ lệ ghép khác nhau

- Xác định cấu trúc, hình thái các sản phẩm

- Khảo sát nồng độ CMC của các nanogel tổng hợp được

- Khảo sát hiệu quả mang thuốc cisplatin (Cis) và cisplatin hydrate (CisOH) của các nanogel tổng hợp được

- Khảo sát khả năng tiêu diệt dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ nanogel Hep-P123 (1:3) mang Cis và CisOH; Fud-P123 (1:3) mang Cis và CisOH

- Khảo sát khả năng nhả thuốc của nanogel Hep-P123-CisOH (1:3) và Fud-P123-CisOH (1:3)

- Tổng hợp và khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ nanogel Hep-

F127 mang thuốc kết hợp cisplatin hydrate và nanocurcumin (Hep-F127-CisOH-Cur)

- Tạo mô hình chuột mang khối u

- Đánh giá hiệu quả điều trị hệ nanogel Hep-F127-CisOH-Cur trên chuột mang khối u ghép dị loài từ người

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình tổng hợp các copolymer ghép P123, F127, Hep-F68, Hep-F87, Fud-P123 được thực hiện qua 4 giai đoạn, phương pháp được tham khảo theo công bố trước đây của nhóm nghiên cứu [50]

Hep Cấu trúc sản phẩm được xác định bằng phương pháp phổ n

- Mô hình chuột mang khối u bằng phương pháp Xenograft

- Đánh giá kích thước khối u trên chuột bằng phương pháp đo kích thước và tính thể tích khối u Đánh giá hiệu quả điều trị bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch SOD2 và nhuộm H&E

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-P123

Các sản phẩm Hep-P123 với 4 tỉ lệ ghép khác nhau (1:3; 1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol) được tổng hợp từ các sản phẩm trung gian NPC-P123-NPC, NPC-P123-Ami và Hep-DAB, có màu trắng, dạng keo Các sản phẩm được xác định cấu trúc bằng phổ FT-IR, phổ 1H-NMR, TGA, TEM và CMC

3.1.1 Kết quả xác định thành phần, cấu trúc các copolymer Hep-P123

3.1.1.1 Kết quả phân tích phổ FT-IR

Dữ liệu phổ FT-IR sản phẩm P123, P123-NPC và

NPC-P123-Ami ở hình 3.1 được thống kê qua bảng 3.1

Dữ liệu phổ FT-IR ở hình 3.1 được thống kê qua bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả FT-IR của P123, NPC-P123-NPC, NPC-P123-Ami

b C-O-C 1108 1108 1108

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của các chất bảng 3.1, cho thấy

tín hiệu dao động đặc trưng ở vị trí a, b luôn xuất hiện trong phân

tử P123, NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami Tín hiệu dao động

ở vị trí e chỉ xuất hiện ở sản phẩm NPC-P123-Ami do sự hình

thành liên kết urethane từ sự thay thế một đầu NPC của phân tử NPC-P123-NPC thành Ami

Dữ liệu phổ ở hình 3.6 được thống kê qua bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả FT-IR của NPC-P123-Ami, Hep-DAB, Hep-P123

Vị trí Nhóm chức

Số sóng (cm -1 ) NPC-

trí a, b và trên phân tử P123 ở vị trí c, d luôn xuất hiện trong phân

tử Hep-P123 sau khi tổng hợp Sự dịch chuyển tín hiệu dao động

ở vị trí f về vị trí g cho thấy sự hình thành liên kết urethane từ phản ứng giữa Hep-DAB và NPC-P123-Ami, và đi theo là sự

biến mất của tín hiệu e

3.1.1.2 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR

Dữ liệu phổ ở hình 3.2 và 3.3 được thống kê qua bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả 1 H-NMR của NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami

NPC-ở vị trí a, b, c, d, e còn có sự xuất hiện thêm tín hiệu mới tại vị trí

f do sự thay thế một đầu NPC từ NPC-P123-NPC thành Ami

Dữ liệu phổ ở hình 3.5 và 3.7 được thống kê qua bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả 1 H-NMR của NPC-P123-Ami, DAB và

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của sản phẩm Hep-P123 được tổng hợp từ NPC-P123-Ami và Hep-DAB ở bảng 3.4, cho thấy

có sự lặp lại các tín hiệu proton đặc trưng trên phân tử P123 ở vị trí a, b và trên phân tử heparin ở vị trí g, i, j Phản ứng nối thành công giữa Hep-DAB và NPC-P123-Ami dẫn đến sự mất hoàn toàn tín hiệu proton ở vị trí c, d, e, chỉ còn lại tín hiệu tại vị trí f

3.1.1.3 Kết quả phân tích TGA của Hep-P123

Sự ổn định nhiệt của copolymer ghép Hep-P123 cùng với heparin và P123 được phân tích bằng phép đo TGA Từ kết quả thực nghiệm trên giản đồ TGA, ta tính được phần trăm khối lượng pluronic P123 được ghép vào heparin phù hợp với các tỉ lệ ghép, theo báo cáo của Hong liang Kang [121]

3.1.1.4 Kết quả phân tích giá trị CMC của Hep-P123

Kết quả thực nghiệm cho thấy CMC của các copolymer ghép

đo được từ 0,028 - 0,041 (%wt) lớn hơn so với giá trị CMC của P123 tinh khiết, pluronic P123 sau khi ghép vào heparin sẽ làm tăng phần vỏ ưa nước của micelle dẫn đến làm tăng giá trị CMC của dung dịch mẫu

3.1.1.5 Kết quả phân tích TEM và DLS của Hep-P123

Kết quả TEM ở hình 3.11 cho thấy các hạt nano có dạng hình cầu, đường kính sắp xếp trong khoảng từ 45-153 nm Sự phân bố kích thước trong khoảng từ 94,4 nm đến 182,4 nm bằng DLS, ở

25oC và phụ thuộc vào lượng pluronic P123 được liên hợp

Hình 3.10 Kết quả TEM của pluronic P123

Hình 3.11 Kết quả TEM và DLS của (a): P123; (b): Hep-P123 (1:3);

(c): Hep-P123 (1:7); (d): Hep-P123 (1:10); (e): Hep-P123 (1:14)

3.1.2 Kết quả tổng hợp nanogel Hep-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

3.1.2.1 Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-P123 mang thuốc Cis và CisOH

Dữ liệu phổ FT-IR ở hình 3.13 được thống kê qua bảng 3.6

Hình 3.13 Phổ FT-IR của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH

Bảng 3.6 Kết quả FT-IR của heparin, P123, P123-Cis,

Hep- Cis

CisOH

Hep-P123-tỏ có sự tạo phức của CisOH và nhóm carboxylate, sunfate trên heparin Trong khi phổ đồ của Hep-P123-Cis chỉ xuất hiện tín hiệu dao động tại vị trí A Điều này chứng minh hợp chất Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH đã tổng hợp thành công

3.1.2.2 Kết quả phân tích ICP-OES của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH

Hình 3.14 Hiệu quả mang thuốc của hệ chất mang Hep-P123

Kết quả hình 3.14 thử nghiệm khả năng mang thuốc của 4 loại chất mang nano Hep-P123 cho thấy khi lượng pluronic P123 được ghép vào heparin càng nhiều sẽ tạo ra tương tác kỵ nước trên phân tử Hep-P123 càng lớn làm cho kết quả mang Cis cao hơn và sự hình thành phức CisOH thấp hơn Ngược lại, trên mạch cấu trúc của heparin có chứa các nhóm anion (carboxylate/sulfate), các nhóm này sẽ tạo liên kết hóa học với phần platinum hydroxide của CisOH, khi lượng P123 được liên hợp vào heparin càng nhiều, tương ứng với số lượng các nhóm anion càng giảm, kết quả làm cho sự hình thành phức thấp hơn khi tăng tỉ lệ ghép

3.1.3 Kết quả đánh giá khả năng nhả thuốc của Hep-P123

Kết quả khả năng nhả thuốc của hệ nano Hep-P123-CisOH cho thấy sự giải phóng CisOH ở pH 5,5 (gần 75%) thì cao hơn ở

pH 7,4 (65%) sau 24 giờ Sự giải phóng CisOH chỉ ra rằng phức Hep-P123-CisOH bị thủy phân nhanh trong điều kiện acid Kết quả này có ích cho hệ thống mang thuốc bởi vì pH ở một số vị trí khối u thấp hơn tại vị trí mô bình thường

3.1.4 Kết quả độc tính tế bào (trên dòng tế bào MCF-7 và nguyên bào sợi)

Kết quả thực nghiệm sau 48 giờ cho thấy nanogel platinum thể hiện hoạt tính tăng sinh cao chống lại dòng tế bào ung thư vú người MCF-7 Hep-P123 khi tạo phức với cisplatin dạng hydrate cũng làm tăng đáng kể khả năng gây độc tế bào so với hệ nano Hep-P123-Cis

Hệ chất mang nano Hep-P123 (1:3) cũng được đánh giá thử nghiệm khả năng gây độc nguyên bào sợi bằng phương pháp nhuộm SRB Kết quả cho thấy hệ chất mang nano Hep-P123 ở nồng độ 100 µg/mL, sau 48 giờ có tỉ lệ sống của tế bào khoảng 90%

3.2 Kết quả tổng hợp và khảo sát nanogel F127, F87 và Hep-F68

Hep-Từ kết quả mang thuốc của các hệ chất mang Hep-P123 với 4

tỉ lệ ghép khác nhau (mmol/mmol), chúng tôi tiếp tục tiến hành tổng hợp các nanogel trên cơ sở heparin liên hợp với các pluronic khác nhau gồm F127, F87 và F68 với 2 tỉ lệ ghép 1:3 và 1:14 (mmol/mmol) để so sánh

3.2.1 Kết quả xác định thành phần, cấu trúc các copolymer Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

3.2.1.1 Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1

H-NMR của sản phẩm

Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR các sản phẩm Plu-NPC và NPC-Plu-Ami, Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 cho kết quả tương tự với NPC-P123-NPC, NPC-P123-Ami, và Hep-P123

NPC-3.2.1.2 Kết quả phân tích TGA của F127, F87 và F68

Hep-Kết quả thực nghiệm trên giản đồ TGA cũng cho thấy phần trăm khối lượng pluronic được liên hợp phù hợp với các tỉ lệ ghép

3.2.1.3 Kết quả phân tích giá trị CMC của Hep-F127, Hep-F87

và Hep-F68

Trong thực nghiệm này, kết quả giá trị CMC của các copolymer ghép đo được từ 0,046 - 0,34 (%wt) đều lớn hơn so với giá trị CMC của các pluronic tinh khiết, khi heparin được ghép vào pluronic sẽ làm tăng phần vỏ ưa nước của micelle dẫn

đến làm tăng giá trị CMC của dung dịch mẫu

3.2.1.4 Kết quả phân tích TEM của F127, F87 và

Hep-F68

Hình 3.20 Hình thái và kích thước của các nanogel bởi TEM

(a): F127; (b): Hep-F127 (1:3); (c): Hep-F127 (1:14); (d): Hep-F87 (1:3); (e): Hep-F87 (1:14); (f): Hep-F68 (1:3); (g): Hep-F68 (1:14) Kết quả hình 3.20 cho thấy các hạt nanogel có dạng hình cầu với kích thước từ 100 nm -367 nm, kích thước hạt của các hệ nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 cũng phụ thuộc vào