Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm sinularia nanolobata, sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển trung bộ việt nam TT

MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nhiều quốc gia đã khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển nhằm phục vụ các nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc chữa trị bệnh hiểm nghèo n

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

THẬP Ở VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9.42.01.16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2021

- Viện Công nghệ sinh học

- Viện Hóa sinh biển

Người hướng dẫn khoa học 1: TS Nguyễn Hoài Nam

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Trần Mỹ Linh

Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Đình Thắng

Phản biện 2: PGS TS Trần Thu Hương

Phản biện 3: TS Bùi Thị Thúy Luyện

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ , ngày tháng năm 2021

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Viện Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nhiều quốc gia đã khai thác các chất

có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển nhằm phục vụ các nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc chữa trị bệnh hiểm nghèo như: ung thư, viêm gan, các bệnh về viêm nhiễm và do virus gây ra Cho đến thời điểm này đã có một số dược phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biển đến được tay người sử dụng, điển hình như Cytarabine, Vidarabine, Eribulin, Trabectedin…Để có được thành quả này, các viện nghiên cứu trên thế giới đã sàng lọc hoạt tính sinh học của hàng triệu hợp chất từ các loài sinh vật biển, đồng thời đầu tư nguồn lực tài chính và thời gian cho các giai đoạn nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đối với các hợp chất tiềm năng

Với lợi thế sở hữu đường bờ biển dài trên 3.260 km cùng với rất nhiều đảo và vịnh, Việt Nam có tiềm năng lớn lao trong việc khai thác với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú cả về thành phần loài và trữ lượng Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất giá trị từ sinh vật biển Việt Nam hiện còn

chưa nhiều và hạn chế ở bước thử nghiệm hoạt tính in vivo và nghiên

cứu về cơ chế tương tác giữa thuốc và tế bào ung thư Các nghiên cứu hiện đang ở giai đoạn đầu so với các nuớc trong khu vực và lùi

xa so với các nước tiên tiến Nguyên nhân là do còn một số khó khăn như: việc khảo sát và thu thập mẫu sinh vật ở biển yêu cầu trang thiết

bị hiện đại, các hợp chất phân lập được từ sinh vật biển thường có hàm lượng rất nhỏ, cấu trúc phức tạp, một số hợp chất dễ phân hủy ngay trong quá trình phân tích Do đó, yêu cầu cấp thiết đối với nước

ta là cần phát triển nghiên cứu nhằm từng bước hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của những loài sinh vật biển

Chi Sinularia là một trong các chi san hô mềm được nhiều nhà

khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học của nhiều hợp chất phân lập từ các đối tượng san hô mềm thuộc chi này Tuy nhiên, các nghiên cứu đối với các loài san hô mềm

thuộc chi Sinularia như S nanolobata, S leptoclados, S conferta ở

Việt Nam rất ít và hầu như chưa có nghiên cứu một cách hệ thống và bài bản về các loài nêu trên Xuất phát từ thực tế trên, tôi đã lựa chọn

đề tài luận án “Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm

Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam”

Mục tiêu của luận án:

- Xác định được thành phần hóa học của ba loài san hô mềm S nanolobata, S conferta, S leptoclados thu thập ở vùng biển Trung bộ

Việt Nam

- Phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có trong các loài san hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các nghiên cứu y sinh dược học

Nội dung luận án bao gồm:

1 Xác định tên khoa học của ba loài san hô mềm thu thập ở vùng

biển Trung Bộ Việt Nam bằng chỉ thị phân tử

2 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ ba

loài san hô mềm S nanolobata, S conferta, S leptoclados

3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp

chất phân lập được

4 Đánh giá cơ chế gây độc tế bào của một số hợp chất tiêu biểu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Bao gồm phần tổng quan về các nghiên cứu trong nước và quốc tế về việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thu, nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư, đặc điểm chung của san

hô mềm và chi Sinularia, về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của san hô mềm chi Sinularia

1.1 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

1.1.1 Các dòng tế bào ung thư

1.1.2 Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống ung thư

1.1.3 Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên apoptosis

1.1.4 Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan đến chu kỳ tế bào

1.2 Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thư

1.2.1 Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ sinh vật biển

1.2.2 Tình hình nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính chống ung thư từ san hô mềm của Việt Nam

1.3 Giới thiệu chung về san hô mềm

1.3.1 Đặc điểm của san hô mềm

1.3.2 Tổng quan về san hô mềm chi Sinularia

1.3.3 Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại san hô mềm 1.3.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia

Thống kê các nghiên cứu đã công bố cho thấy các hợp chất phân

lập từ san hô mềm chi Sinularia chủ yếu bao gồm các hợp chất

sesquiterpen, diterpen và steroid Nhiều hợp chất trong số này thể hiện hoạt tính sinh học thú vị như hoạt tính gây độc tế bào, kháng

viêm, kháng khuẩn, kháng vi rút, bảo vệ thần kinh và chống oxy

hóa…

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu san hô mềm S nanolobata Verseveldt, 1977 được thu thập ở

vùng biển Lăng Cô, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng 4 năm

2015

Mẫu san hô mềm S leptoclados Ehrenberg, 1834 được thu thập ở

vùng biển quanh đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam vào tháng 5 năm 2016

Mẫu san hô mềm loài S conferta Dana, 1846 được thu thập ở

vùng biển quanh đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam vào tháng 5 năm 2015

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định tên khoa học của các mẫu san hô mềm bằng các chỉ thị phân tử (msh1 và 28S RNA)

2.2.1.2 Khuyếch đại và xác định trình tự các đoạn ADN chỉ thị

M SN SLE SCO M SN SLE SCO

A B

Hình 2.5 Ảnh điện di sản

phẩm PCR nhân đoạn các đoạn gen chỉ thị từ các mẫu san hô mềm nghiên cứu (A)

đoạn gen 28S rARN sử dụng

cặp mồi 28SF và 28SR (B)

đoạn gen msh1 sử dụng cặp

mồi MSHF và MSHR M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder

Hình 2.6 Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau khi biến

nạp vector pTZ57R/T gắn gen 28S rARN của các mẫu san hô mềm SN (giếng số

1-7), SLE (giếng số 8-14), SCO (giếng số 15-21) M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder

Hình 2.7 Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau khi biến

nạp vector pTZ57R/T gắn gen msh1 của các mẫu san hô mềm SN (giếng số 22-28),

SLE (giếng số 29-35), SCO (giếng số 36-42) M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder

2.2.1.3 Xác định loài và phân tích đa dạng di truyền

từ loài S nanolobata

2.2.1.2 Phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S leptoclados

Hình 2.9 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài S leptoclados

2.2.1.2 Phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S conferta

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào ung thư

Kết quả phân tích trình tự đoạn gen msh1 và 28S rARN của các

mẫu nghiên cứu với các các trình tự tham khảo trên ngân hàng gen quốc tế NCBI đã cho thấy các trình tự của gen chỉ thị của các mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao với các trình tự tương ứng trên ngân hàng gen, cụ thể:

- Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SN có độ tương đồng 100% so

với trình tự tương ứng (mã số FJ621451.1) của mẫu S nanolobata

vourcher RMNH coel.38441 trên ngân hàng gen NCBI

- Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SLE có độ tương đồng 100%

so với trình tự tương ứng (mã số KC542857.1) của mẫu S leptoclados vourcher ZMTAU:CO35308 trên ngân hàng gen NCBI

- Trình tự đoạn gen msh1 của mẫu SCO có độ tương đồng 100%

so với trình tự tương ứng (mã số FJ621389.1) của mẫu S conferta

vourcher NTM C13972 trên ngân hàng gen NCBI

- Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SN có độ tương đồng

99,8% so với trình tự tương ứng (mã số KF915519.1) của mẫu

Sinularia sp voucher RMNH:Coel.41326 trên ngân hàng gen NCBI

- Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SLE có độ tương đồng

100% so với trình tự tương ứng (mã số KC542837.1) của mẫu S leptoclados voucher ZMTAU:CO34095 trên ngân hàng gen NCBI

- Trình tự đoạn gen 28S rARN của mẫu SCO có độ tương đồng 99,6% so với trình tự tương ứng (mã số MF817932.1) của mẫu

Sinularia sp trên ngân hàng gen NCBI

Bảng 3.1 Kết quả phân loại các mẫu san hô mềm nghiên cứu dựa

vào phân tích độ tương đồng (%) trình tự các đoạn ADN chỉ thị (gen

28S rARN và msh1) của các mẫu nghiên cứu với các trình tự tham

khảo trên ngân hàng gen

độ tương

độ tương đồng

Sinularia leptoclados

SCO Sinularia

conferta 100% Sinularia sp ≥ 99.6% Sinularia

conferta

3.2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

3.2.1 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S nanolobata

HO

1

3 5 6 9 10

11 13 15 18 19 20

21 22

23 25 28

3.2.1 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S conferta

HO

1

3 5 69 10

11 13 16 18 19 20

21 22

23 25 26 27 28

*: Đối chứng dương; “-“: Không có hoạt tính

Kết quả đánh giá 10 hợp chất SN cho thấy: Hợp chất mới SN 6

thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình trên dòng 3 tế bào HL-60, HepG2 và SW480 (IC 50 từ 33.53-71.02 µM) Hợp chất SN 4

thể hiện hoạt tính gây độc yếu trên dòng tế bào HL-60 Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính

3.3.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S leptoclados

Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất SLE

SLE 27 19,03± 2,92 21,79± 2,20 17,29± 1,91 21,21± 1,47 13,45± 1,81 14,4± 1,88 29,01± 3,21 17,13± 1,81 SLE 28 32,86±

*: Đối chứng dương;” -“: Không có hoạt tính

Kết quả đánh giá 15 hợp chất SLE cho thấy: 3 hợp chất SLE 10, SLE 27 và SLE 28 (IC 50 trong khoảng từ 1,78 đến 78,33 µM) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư thử nghiệm

Hợp chất SLE 20 và SLE 30 thể hiện hoạt tính trên 2-3 dòng tế bào

ung thư thử nghiệm Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính

3.3.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S conferta

Kết quả đánh giá 12 hợp chất SCO cho thấy hợp chất SCO 27, SCO 35 và SCO 37 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên cả

3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất

3.3.4.1 Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất

SCO27 trên tế bào ung thư phổi A549

a Đánh giá tác động của SCO 27 đến sự thay đổi hình thái tế bào

c Xác định khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư phổi A549

của SCO 27

Bảng 3.2 Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SCO 27 trên dòng

tế bào ung thư phổi A549

Mẫu thử

Tỉ lệ tế bào sống (%)

Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm (%)

Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn (%)

Tỉ lệ tế bào hoại

tế bào A549 ở thời điểm 24h tại các nồng độ khác nhau

5 µM (C), 10 µM (D), đối chứng âm (A) và đối chứng dương (B) sử dụng

ở các nồng độ tương ứng Đối chứng: mẫu phân tích không được

bổ sung hợp chất SCO 27 Camptothecin: mẫu phân tích được

bổ sung camptothecin

3.3.4.2 Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE

27 trên tế bào ung thư vú MCF-7

a Đánh gá tác động của hợp chất SLE 27 lên sự thay đổi hình thái

tế bào ung thư

b Xác định khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư vú MCF-7

của hợp chất SLE 27

Bảng 3.3 Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SLE 27 trên dòng

tế bào ung thư vú MCF-7

Mẫu thử

Tỉ lệ tế bào sống (%)

Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm (%)

Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn (%)

Tỉ lệ tế bào hoại

Mẫu thử Tỉ lệ tế bào ở các pha của chu trình phân bào (%)

Pha sub-G1 Pha G0/G1 Pha S Pha G2/M

ở trạng thái apoptosis

Độ phóng đại 10X và

chứng âm – Tế bào MCF-7 không bổ sung

hợp chất SLE 27

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Xác định loài của các mẫu san hô mềm dựa vào các trình tự

DNA chỉ thị

Sau khi tách dòng và giải trình tự của các đoạn gen chỉ thị từ 3

mẫu san hô mềm, các trình tự DNA của Sinularia leptoclados (MW077896, MW077906); Sinularia conferta (MW077897, MW077907) và Sinularia nanolobata (MW077898, MW077908) đã

được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI

Novocyte

Sinularia-abruptaMF817864 Sinularia-slieringsiMH516803 Sinularia-penghuensisJX991181 Sinularia-molestaJX991172 Sinularia-abrubtaFJ621374 Sinularia-abruptaJX991168 Sinularia-leptocladosKC542857 SLE

Sinularia-compactaFJ621384 Sinularia-bisulcaFJ621378 Sinularia-acutaFJ621375 Sinularia-verseveldtiKC542859 Sinularia-robustaFJ621473 Sinularia-diffusaFJ621399

Sinularia-sp.KF915757 Sinularia-abhishiktaeFJ621373 Sinularia-tumulosaFJ621482 Sinularia-siaesensisFJ621478 Sinularia-polydactylaKU230374 Sinularia-confertaFJ621389 SCO

Sinularia-peculiarisJX023274 Sinularia-ornataJX991173 Sinularia-nanolobataFJ621451 SN

Sinularia-brassicaKF915724

90 90

65

43 64

64 50

99

66

46

30 37

99 46 48

0.01

Hình 4.1 Kết quả phân tích chủng loại theo phương pháp NJ

(Neighbor-Joining) trên MEGA6 của các mẫu san hô mềm dựa vào đa hình trình tự

nucleotit đoạn gen msh1 của các mẫu nghiên cứu và các mẫu san hô mềm

liên quan trên ngân hàng gen NCBI Các số đầu nhánh cây chủng loại là giá trị Bootdtrap thể hiện độ tin cậy phân nhánh di truyền các trình tự và nhóm

trình tự

Phân tích chủng loại dựa trên 3 trình tự đoạn gen msh1 nghiên cứu

và 23 trình tự tham khảo trên NCBI Kết quả trên hình 4.1 cho thấy

mẫu SLE có quan hệ di truyền tương đồng cao với loài đã được công

bố trình tự trên ngân hàng gene quốc tế đó là Sinularia leptoclados

KC542857 (bootstrap 66%) Mẫu SCO có quan hệ di truyền tương đồng cao với loài S conferta FJ621389 (bootstrap 90%) Mẫu SN có

quan hệ di truyền tương đồng cao với các loài S nanolobata

FJ62621451 (bootstrap 90%)

Tương tự như thế, phân tích phát sinh chủng loại dựa vào trình tự

nucleotit đoạn gen 28S rARN được thực hiện trên 3 trình tự nghiên

cứu và 21 trình tự tham khảo trên NCBI Kết quả cho thấy mẫu SLE