Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm sinularia nanolobata, sinularia leptoclados, sinularia conferta thu thập ở vùng biển trung bộ việt nam

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Ninh Thị Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ BA LOÀI SAN HÔ MỀM SINULAR

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Ninh Thị Ngọc

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ BA

LOÀI SAN HÔ MỀM SINULARIA NANOLOBATA, SINULARIA

LEPTOCLADOS, SINULARIA CONFERTA THU THẬP Ở

VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2021

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Ninh Thị Ngọc

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ BA

LOÀI SAN HÔ MỀM SINULARIA NANOLOBATA, SINULARIA

LEPTOCLADOS, SINULARIA CONFERTA THU THẬP Ở

VÙNG BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9.42.01.16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

1 TS Nguyễn Hoài Nam

2 TS Trần Mỹ Linh

Hà Nội – 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Hoài Nam và TS Trần Mỹ Linh Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Ninh Thị Ngọc

Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo và các đồng nghiệp phòng Dược liệu biển - Viện Hóa Sinh biển đặc biệt là GS.VS Châu Văn Minh về sự chỉ bảo, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận

án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện Hóa sinh biển, Viện Công nghệ sinh học và Học viện Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học

Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng Tài nguyên sinh vật, Trung tâm Tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa sinh biển, Phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong việc định loài và thử hoạt tính

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Ninh Thị Ngọc

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ……… i

LỜI CẢM ƠN……… ii

MỤC LỤC……… iii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……… vii

DANH MỤC BẢNG……… x

DANH MỤC HÌNH……… xii

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư ……… 3

1.1.1 Các dòng tế bào ung thư ……… 3

1.1.2 Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống ung thư ……… 4

1.1.3 Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên apoptosis ……… 7

1.1.4 Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan tới chu kỳ tế bào ……… 10

1.2 Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thư …… 10

1.2.1 Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ sinh vật biển ……… 11

1.2.2 Tình hình nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính chống ung thư từ san hô mềm của Việt Nam……… 14

1.3 Giới thiệu chung về san hô mềm ……… 15

1.3.1 Đặc điểm của san hô mềm ……… 16

1.3.2 Tổng quan về chi Sinularia ……… 18

1.3.3 Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại san hô mềm ……… 18

1.3.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia ……… 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 34

2.1 Đối tượng nghiên cứu ……… 34

2.1.1 Loài san hô mềm S nanolobata ……… 34

2.1.2 Loài san hô mềm S leptoclados ……… 34

2.1.3 Loài san hô mềm S conferta … ……… 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu ……… 35

2.2.1 Xác định tên khoa học của các mẫu san hô mềm ……… 35

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất ……… 42

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ……… 47

2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào ung thư…… 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……… 56

3.1 Xác định loài bằng chỉ thị phân tử ……… 56

3.1.1 Giải trình tự đoạn gen 28S rARN và msh1 của 3 mẫu san hô mềm…… 56

3.1.2 So sánh trình tự của 3 mẫu san hô mềm bằng chương trình BLAST … 57 3.2 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất………… 59

3.2.1 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S nanolobata……… 59

3.2.2 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S leptoclados……… 61

3.2.3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S conferta……… 63

3.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ các mẫu san hô mềm……… 65

3.2.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S nanolobata……… 65

3.2.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S leptoclados……… 65

3.2.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài S conferta……… 66

3.2.4 Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE 27 và hợp chất SCO 27……… 67

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……… 75

4.1 Xác định loài của các mẫu san hô mềm dựa vào các trình tự ADN chỉ thị……… 75

4.2 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S nanolobata 77

4.2.1 Hợp chất SN 8: 3β,4α-dihydroxyergosta-5,24(28)-diene (hợp chất mới) 77

4.2.2 Hợp chất SN 6: 24(S),28-epoxyergost-5-ene-3β,4α-diol (hợp chất mới ) 80

4.2.3 Hợp chất SN 20: Nanolobatol B (hợp chất mới ) ……… 82

4.2.4 Hợp chất SN 30: Nanolobatol A (hợp chất mới ) ……… 84

4.2.5 Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại ……… 86

4.2.6 Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S nanolobata……… 86

4.3 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S leptoclados 87

4.3.1 Hợp chất SLE 10: Leptosteroid (chất mới) ……… 87

4.3.2 Hợp chất SLE 21: 5,6β-epoxygorgosterol (chất mới)……… 89

4.3.3 Hợp chất SLE 27: Ergosta-5,24(28)-dien-3β,7β-diol……… 92

4.3.4 Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại……… 94

4.3.5 Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S leptoclados……… 94

4.4 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S conferta 95

4.4.1 Hợp chất SCO 29: 7-methoxygorgosterol (chất mới) ………… 95

4.4.2 Hợp chất SCO 30: 7α-Methoxy-ergosta-5-ene-3β-ol (chất mới)……… 98

4.4.3 Hợp chất SCO 44: 3-hydroxyergosta-4-en-6-one (chất mới)………… 100

4.4.4 Hợp chất SCO 42: ergost-24(28)-ene-3β,5α,6β-triol-3-acetate (chất mới)……… 103

4.4.5 Hợp chất SCO 32: 3-hydroxyergosta-4,24(28)-dien-6-one (chất mới) 106

4.4.6 Hợp chất SCO 27: 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-6-monoacetate……… 107

4.4.7 Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại ……… 109

4.4.8 Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S conferta ……… 109

4.5 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được……… 110

4.5.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài S nanolobata……… 111

4.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài S leptoclados……… 112

4.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài S conferta……… 114

4.5.4 Nghiên cứu cơ chế chống ung thư của hợp chất SLE 27 và SCO 27…… 116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 121

TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN ……… 123

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ……… 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 126

PHỤ LỤC ………

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

13C-NMR Carbon Magnetic Resonance

Phổ tương tác proton-proton

1H-NMR Proton Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

5-EPA 5-Episinuleptolide Acetate 5-Episinuleptolide Acetate

ADC Antibody–drug conjugate Liên hợp thuốc kháng thể

ATCC American Type Culture

Collection

Ngân hàng chủng chuẩn của Mỹ

A-549 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư cổ tử cung người

Spectroscopy

Phổ lưỡng sắc tròn

DEPT Distortionless Enhancement by

DLD-1 Colon Cancer Cell Line Dòng tế bào ung thư ruột kết DMEM Dulbecco’s Modified Eagle

Medium

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

ADN Deoxyribo Nucleic Acid Axit Deoxyribo Nucleic

Hep-G2 Human hepatocellular Tế bào ung thư biểu mô gan

carcinoma cell HL-60 Human promyelocytic

leukemia cell

Tế bào ung thư máu

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HR-TOF-MS High Resolution Time of-Flight

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

iNOS Inducible Form of Nitric-Oxide

Synthase

Inducible Form of Nitric-Oxide Synthase

LC-MS Liquid chromatography – mass

Human breast cancer cell Tế bào ung thư vú ở người

MMAE Monomethyl auristatin E Monomethyl auristatin E

MMAF Monomethyl auristatin F Monomethyl auristatin F

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-bromide NF-B Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B

NOESY Nuclear Overhauser

Một đường tín hiệu nội bào quan trọng trong việc điều hòa chu kỳ

tế bào

PTP1B Protein tyrosine phosphatase

1B

Protein tyrosine phosphatase 1B

RAW264.7 Macrophage cell line Dòng tế bào đại thực bào

SK-Mel-2 Human Melanoma cell Tế bào ung thư da ở người

TCA Trichloro acetic acid axit trichloro axetic

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thông tin tóm tắt của một số loại thuốc chống ung thư có nguồn

gốc từ sinh vật biển (SVB) đã được cấp phép và đang ở các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha I, II, III ……… 14 Bảng 1.2 Một số hoạt chất phân lập từ san hô mềm chi Sinularia

Bảng 2.1 Các cặp mồi được sử dụng trong phân tích chỉ thị phân tử các

Bảng 3.6 Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SCO 27 trên dòng tế

Bảng 3.7 Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của SLE 27 trên dòng tế

Bảng 3.8 Tỉ lệ (%) tế bào MCF-7 trong pha G0/G1, S, G2/M và apoptosis

(sub-G1) sau 48 h xử lí với hợp chất SLE 27 ……… 73 Bảng 4.1 Số liệu phổ của hợp chất SN 8, tương tác chính trên HMBC … 78 Bảng 4.2 Số liệu phổ của hợp chất SN 6, tương tác chính trên HMBC … 81 Bảng 4.3 Số liệu phổ của hợp chất SN 20, tương tác chính trên HMBC … 83 Bảng 4.4 Số liệu phổ của hợp chất SN 30, tương tác chính trên HMBC … 85 Bảng 4.5 Số liệu phổ của hợp chất SLE 10, tương tác chính trên HMBC 88 Bảng 4.6 Số liệu phổ của hợp chất SLE 21, tương tác chính trên HMBC 90 Bảng 4.7 Số liệu phổ của hợp chất SLE 27, tương tác chính trên HMBC 93

Bảng 4.8 Số liệu phổ của hợp chất SCO 29, tương tác chính trên HMBC 97 Bảng 4.9 Số liệu phổ của hợp chất SCO 30, tương tác chính trên HMBC 99 Bảng 4.10 Số liệu phổ của hợp chất SCO 44, tương tác chính trên HMBC 101 Bảng 4.11 Số liệu phổ của hợp chất SCO 42, tương tác chính trên HMBC 104 Bảng 4.12 Số liệu phổ của hợp chất SCO 32, tương tác chính trên HMBC 106 Bảng 4.13 Số liệu phổ của hợp chất SCO 27, tương tác chính trên HMBC 108

Hình 1.6 Sơ đồ minh họa cơ chế tác động của hợp chất Sinularin (18) lên

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa cơ chế của Sinulariolide gây ra apoptosis thông

qua con đường ty thể và p38MAPK trên các tế bào TSGH …… 23 Hình 1.8 Cấu trúc minh họa một số hợp chất cembranoid phân lập từ chi

Hình 1.9 Cấu trúc minh họa một số hợp chất cembranoid phân lập từ chi

Sinularia ……… 25 Hình 1.10 Cấu trúc minh hóa một số hợp chất norcembranoid diterpen

Hình 1.11 Cấu trúc minh họa một số hợp chất diterpenoid phân lập từ chi

Hình 1.12 Cấu trúc minh họa một số hợp chất steroid (123-139) phân lập

Hình 1.13 Cấu trúc minh họa một số hợp chất steroid (140-160) phân lập

Hình 2.1 Mẫu san hô mềm S nanolobata thu tại vùng biển Lăng Cô…… 34 Hình 2.2 Mẫu san hô mềm S leptoclados thu tại vùng biển Cồn Cỏ…… 35 Hình 2.3 Mẫu san hô mềm S conferta thu tại vùng biển Cồn Cỏ……… 35 Hình 2.4 Ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ các mẫu SN, SLE và

Hình 2.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn các đoạn gen chỉ thị từ 39

các mẫu san hô mềm nghiên cứu (A) đoạn gen 28S rARN sử dụng cặp mồi 28SF và 28SR (B) đoạn gen msh1 sử dụng cặp mồi MSHF và MSHR M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder SN, SLE, SCO ký hiệu tên của các mẫu san hô mềm nghiên cứu… Hình 2.6 Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau

khi biến nạp vector pTZ57R/T gắngen 28S rARN của các mẫu san hô mềm SN (giếng số 1-7), SLE (giếng số 8-14), SCO (giếng số 15-21) M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder………… 40 Hình 2.7 Ảnh điện di các sản phẩm PCR-colony từ một số khuẩn lạc sau

khi biến nạp vector pTZ57R/T gắn gen msh1 của các mẫu san

hô mềm SN (giếng số 22-28), SLE (giếng số 29-35), SCO (giếng số 36-42) M: GeneRulerTM 1kb ADN ladder………… 41 Hình 2.8 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S nanolobata 43 Hình 2.9 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S leptoclados 45 Hình 2.10 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu san hô mềm S conferta… 47 Hình 3.1 Một số hình ảnh về kết quả BLAST (so sánh) các trình tự gen

chỉ thị của mẫu nghiên cứu với các trình tự trên NCBI………… 58 Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài S

Hình 3.5 Hình thái tế bào A549 dưới tác động của SCO 27 ở các nồng độ

khác nhau và đối chứng dương (camptothecin 5 µM) ………… 68 Hình 3.6 Khả năng kích thích sản sinh caspase 3 của SCO 27 và đối

Hình 3.7 Tác động của SCO 27 đến quá trình apoptosis tế bào A549 ở

thời điểm 24h tại các nồng độ khác nhau 5 µM (C), 10 µM (D), đối chứng âm (A) và đối chứng dương (B) sử dụng phương

Hình 3.8 Tác động của hợp chất SLE 27 ở nồng độ 10, 30 và 100 µM lên 71

hình thái tế bào ung thư vú MCF-7 Mũi tên chỉ các tế bào ở trạng thái apoptosis……… Hình 3.9 Tác động của SLE 27 đến quá trình apoptosis tế bào MCF-7 ở

thời điểm 24 h tại các nồng độ khác nhau 10 µM (B), 30 µM (C), 100 µM (D) và đối chứng âm (A) sử dụng phương pháp

Hình 3.10 Ảnh hưởng của hợp chất SLE 27 (nồng độ 10; 30; 100 µM) đến

chu kì tế bào MCF-7 ở thời điểm 48h, sử dụng hệ thống Flow cytometer Novocyte (ACEA Biosciences Inc.) và phần mềm

Hình 4.1 Kết quả phân tích chủng loại theo phương pháp NJ

(Neighbor-Joining) trên MEGA6 của các mẫu San hô mềm dựa vào đa hình trình tự nucleotit đoạn gen msh1 của các mẫu nghiên cứu và các mẫu san hô mềm liên quan trên ngân hàng gen NCBI………… 75 Hình 4.2 Kết quả phân tích chủng loại theo phương pháp NJ trên MEGA6

của các mẫu san hô mềm dựa vào đa hình trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN của các mẫu nghiên cứu và các mẫu san hô mềm liên quan trên ngân hàng gen NCBI……… 76 Hình 4.3 Hợp chất tham khảo 3β-hydroxy-24-methylenecholest-5-en-7-

Hình 4.11 Cấu trúc của hợp chất SLE 27……… 94 Hình 4.12 Cấu trúc và các tương tác COSY (▬) và HMBC () chính của

Hình 4.13 Các tương tác NOESY quan trọng của hợp chất SCO 29……… 98 Hình 4.14 Cấu trúc và các tương tác HMBC () chính của hợp chất

SCO30……… 100 Hình 4.15 Cấu trúc và các tương tác HMBC () chính của hợp chất

SCO44 ……… 103 Hình 4.16 Cấu trúc và các tương tác HMBC () chính của hợp chất

SCO42……… 106 Hình 4.17 Cấu trúc và các tương tác HMBC () chính của hợp chất

SCO32……… 107 Hình 4.18 Cấu trúc và các tương tác HMBC ()chính của hợp chất

SCO27 ……… 109 Hình 4.19 Cấu trúc hóa học của hợp chất SN 6 và SN 8 ……… 111 Hình 4.20 Giá trị IC50 của hợp chất SLE 27 trên các dòng tế bào ung thư

thử nghiệm……… 113 Hình 4.21 Cấu trúc hóa học của các hợp chất SLE 10, SLE 27 và SLE 28 113 Hình 4.22 Giá trị IC50 của hợp chất SCO 27 trên ba dòng tế bào ung thư… 115 Hình 4.23 Cấu trúc hóa học của các hợp chất SCO27, SCO35 và SCO37… 115

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nhiều quốc gia đã khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển nhằm phục vụ các nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc chữa trị bệnh hiểm nghèo như: ung thư, viêm gan, các bệnh về viêm nhiễm và do virus gây ra Cho đến thời điểm này đã có một số dược phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biển đến được tay người sử dụng, điển hình như Cytarabine, Vidarabine, Eribulin, Trabectedin…Để có được thành quả này, các viện nghiên cứu trên thế giới

đã sàng lọc hoạt tính sinh học của hàng triệu hợp chất từ các loài sinh vật biển, đồng thời đầu tư nguồn lực tài chính và thời gian cho các giai đoạn nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đối với các hợp chất tiềm năng

Với lợi thế sở hữu đường bờ biển dài trên 3.260 km cùng với rất nhiều đảo

và vịnh, Việt Nam có tiềm năng lớn lao trong việc khai thác với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú cả về thành phần loài và trữ lượng Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất giá trị từ sinh vật biển Việt Nam

hiện còn chưa nhiều và hạn chế ở bước thử nghiệm hoạt tính in vivo và nghiên cứu

về cơ chế tương tác giữa thuốc và tế bào ung thư Các nghiên cứu hiện đang ở giai đoạn đầu so với các nuớc trong khu vực và lùi xa so với các nước tiên tiến Nguyên nhân là do còn một số khó khăn như: việc khảo sát và thu thập mẫu sinh vật ở biển yêu cầu trang thiết bị hiện đại và chuyên gia giàu kinh nghiệm, các hợp chất phân lập được từ sinh vật biển thường có hàm lượng rất nhỏ, cấu trúc phức tạp, một số hợp chất dễ phân hủy ngay trong quá trình phân tích Do đó, hiện nay yêu cầu cấp thiết đối với nước ta là cần phát triển nhiều nghiên cứu nhằm từng bước hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của những loài sinh vật biển

Chi Sinularia là một trong các chi san hô mềm được nhiều nhà khoa học trên

thế giới quan tâm nghiên cứu Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học của nhiều hợp chất phân lập được từ các đối tượng san hô mềm thuộc chi này Tuy nhiên, các nghiên cứu đối với nhiều

loài san hô mềm thuộc chi Sinularia như S nanolobata, S leptoclados, S conferta

ở Việt Nam rất ít và hầu như chưa có các nghiên cứu một cách hệ thống và bài bản về các loài nêu trên Xuất phát từ thực tế trên, NCS đã lựa chọn đề tài luận án

“Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất

phân lập từ ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados,

sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam”

Mục tiêu của luận án:

- Xác định được thành phần hóa học của ba loài san hô mềm S nanolobata, S conferta, S leptoclados thu thập ở vùng biển Trung bộ Việt Nam

- Phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có trong các loài san

hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các nghiên cứu y sinh dược học

Nội dung luận án bao gồm:

1 Xác định tên khoa học của ba loài san hô mềm thu thập ở vùng biển Trung Bộ

Việt Nam bằng chỉ thị phân tử

2 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ ba loài san hô mềm S

nanolobata, S conferta, S leptoclados

3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập

được

4 Đánh giá cơ chế gây độc tế bào của một số hợp chất tiêu biểu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

1.1.1 Các dòng tế bào ung thư

Lịch sử nghiên cứu ung thư và việc thành lập các dòng tế bào ung thưcó liên quan chặt chẽ với nhau [1] Nhiều nhà nghiên cứu đã tìm hiểu các cơ chế phức tạp biến đổi từ một tế bào bình thường thành tế bào ung thư Năm 1951, những cải tiến trong việc xác định các yêu cầu sinh hóa đối với sự phát triển của các tế bào sinh lý

và biến đổi đã cho phép Tiến sĩ George Otto Gey tại Bệnh viện Johns Hopkins thành lập dòng tế bào ung thư đầu tiên và nổi tiếng từ người, được đặt tên là HeLa [2] Tên “HeLa” là từ viết tắt của Henrietta Lacks, một phụ nữ trẻ da đen bị ảnh hưởng bởi ung thư biểu mô cổ tử cung, từ đó tế bào HeLa được tạo ra Sự ra đời của dòng tế bào HeLa có thể coi là một cột mốc quan trọng khác trong lịch sử sinh học

tế bào, đồng thời nó đã mở ra những hướng mới trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư Bắt đầu từ sự ổn định của chúng, các tế bào HeLa đã tạo thành ví dụ đầu tiên về

“bệnh ung thư ở người trong ống nghiệm” Dòng tế bào HeLa rất ổn định và tăng sinh mạnh – điều này dẫn đến việc chúng dễ nhiễm chéo vào nhiều dòng tế bào khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu Sự tăng sinh ổn định của dòng tế bào HeLa và đặc tính dễ bị nhiễm virus bại liệt nên đến năm 1954, Jonas Salk đã phát triển một loại vacxin phòng bệnh bại liệt bằng việc sử dụng các tế bào HeLa

Ngày nay, các dòng tế bào ung thư đã được sử dụng rộng rãi cho các mục đích nghiên cứu và được chứng minh là một công cụ hữu ích để tìm hiểu về mặt di truyền của các bệnh ung thư, thực tế cho thấy chúng là một mô hình tuyệt vời cho việc nghiên cứu các cơ chế sinh học gây ra căn bệnh này [3] Nghiên cứu ứng dụng các dòng tế bào ung thư đã cho phép tìm hiểu thông tin về sự tăng hoặc giảm sự biểu hiện của các gen liên quan và các con đường truyền tín hiệu trong tế bào ung thư [4] Hơn nữa, việc sử dụng mô hình tế bào là cơ sở cho sự phát triển và thử nghiệm các loại thuốc chống ung thư hiện đang được sử dụng [5, 6] và cũng là một phương pháp thay thế cho cấy ghép khối u động vật trong thử nghiệm hóa trị liệu

[7] Trên thực tế, việc sử dụng mô hình tế bào in vitro trong nghiên cứu ung thư là

rất quan trọng để điều tra các con đường di truyền, di truyền ngoài gen (epigenetics), sự tăng sinh, quá trình tự chết (apoptosis) và sự tiến triển của ung thư,

từ đó giúp xác định được các chỉ thị phân tử tiềm năng [4, 8] và sàng lọc, tối ưu hóa các phương pháp điều trị ung thư [6, 9] Các kết quả nghiên cứu trong các dòng tế

bào ung thư thường được ngoại suy cho các khối u in vivo [8] và tầm quan trọng của

nó như là các mô hình thử nghiệm thuốc và nghiên cứu dịch mã đã được nhiều công

ty y sinh và dược phẩm công nhận [5] Các dòng tế bào ung thư khác nhau thể hiện các phản ứng đa dạng với các loại thuốc chống ung thư gây độc tế bào, ví dụ như các dòng tế bào ung thư ruột kết có khả năng kháng lại các loại thuốc liên kết với ADN trong khi các dòng tế bào ung thư vú hoặc bệnh bạch cầu thì lại nhạy hơn [10]

Việc sử dụng bảng dòng tế bào (cell line panel) là một công cụ hữu ích để thử nghiệm thuốc chống ung thư Sự phát triển các bảng dòng tế bào ung thư này được khởi xướng cho nhóm NCI60 (Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ với 60 dòng tế bào ung thư) nhằm khắc phục việc sử dụng các mô hình động vật để thử nghiệm thuốc chống ung thư [7] Sau đó, Nakatsu và cộng sự (2005) đã thành lập một nhóm nghiên cứu gồm 45 dòng tế bào ung thư (JFCR-45) từ các bộ phận khác nhau (vú, gan và dạ dày) để xác định các gen liên quan Họ cũng cố gắng tìm hiểu cơ chế hoạt động của các loại thuốc này để phân loại Nghiên cứu này liên quan đến phương pháp tiếp cận thông tin sinh học tích hợp sử dụng các mảng cADN, đã tiết lộ nhiều gen ứng cử viên liên quan đến độ nhạy đối với các loại thuốc hóa trị liệu [6] Gần đây, Garnett và các đồng nghiệp (2012) đã sàng lọc một bảng gồm hàng trăm dòng

tế bào ung thư (đại diện cho phần lớn sự đa dạng về loại mô và di truyền của bệnh ung thư ở người) với 130 loại thuốc đang được nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng và xác minh rằng các gen ung thư bị đột biến có liên quan đến phản ứng của tế bào với các loại thuốc được sử dụng phổ biến nhất Kết quả này như một hồ sơ sinh dược học về các dòng tế bào ung thư giúp định hướng các chiến lược điều trị ung thư hợp lý hơn [11]

1.1.2 Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống ung thư

Thử nghiệm sinh học (bioassay) là những thử nghiệm được thiết kế để phân tích tác động sinh học của một hợp chất bằng cách sử dụng các hệ thống sinh học phù hợp như tế bào, mô, vi khuẩn, động vật, thực vật Thử nghiệm sinh học được định nghĩa là một sự tính toán để xác định nồng độ hay đánh giá hiệu lực của một

tác nhân vật lý, hóa học hay sinh học bằng việc đo lường, kiểm chứng mức độ phản ứng của thí nghiệm trên hệ sinh học phù hợp dưới điều kiện tiêu chuẩn khi so sánh với một chất chuẩn Thử nghiệm sinh học theo nghĩa rộng là quy trình để xác định mối quan hệ giữa một tác nhân với ảnh hưởng mà tác nhân này tạo ra trên cơ thể sống

Thử nghiệm sinh học có vai trò quan trọng trong những chương trình kiểm soát việc phát triển và sản xuất các dược phẩm sinh học chất lượng một cách hiệu quả Thử nghiệm sinh học có thể chia thành nhiều loại và các mức độ khác nhau dựa trên đối tượng sinh học được sử dụng như các chủng vi sinh vật, tế bào nuôi cấy, các loại mô có nguồn gốc từ con người và động vật, thậm chí trên toàn bộ cơ thể động vật [12] Tuy nhiên, dựa vào đặc điểm kỹ thuật sử dụng có thể chia thành 4

nhóm lớn như sau: Các phép thử in vitro, các phép thử in vivo, các phép thử ex vivo

và các phép thử xenograph

Các phép thử sinh học in vitro có vai trò quan trọng trong việc định hướng

phân tách các thành phần có hoạt tính từ nhiều nguồn tự nhiên khác nhau Vì vậy,

phát triển hệ thống sàng lọc in vitro các dịch chiết hay hợp chất sạch nhằm phát

hiện ra các loại thuốc mới hoặc các chất dẫn đường là một chiến lược quan trọng trong tiến trình tìm kiếm nguồn dược phẩm mới Các phép thử sinh học được lựa chọn dựa vào bản chất và hoạt tính sinh học cần đánh giá của hợp chất thử Các

phép thử sinh học in vitro được chia thành 2 loại: phép thử dựa trên mô hình nuôi

cấy tế bào (cell-based assays) và phép thử dựa vào cơ chế (mechanism-based assays) [13]

a Phép thử dựa trên mô hình nuôi cấy tế bào (cell-based assays)

Mô hình nuôi cấy tế bào là thuật ngữ được dùng để nói đến những thử nghiệm dựa trên việc sử dụng tế bào sống, bao gồm những phép thử đánh giá ảnh hưởng của chất hay nhóm chất nghiên cứu đến sinh lý của tế bào bao gồm những thay đổi về hình thái và sự phát triển của chúng Thử nghiệm dựa trên tế bào miêu

tả khá chính xác mô hình của sự sống bởi tế bào được xem là đơn vị sống nhỏ nhất

nhưng hoàn chỉnh nhất của thế giới sinh vật Trong hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro, thuật ngữ “gây độc tế bào” (cytotoxicity) dùng để chỉ khả năng làm thay đổi

hình thái, tốc độ sinh trưởng hoặc làm chết tế bào của hợp chất thử hoặc tác nhân thử [14] Các phép thử gây độc tế bào là phương pháp hữu hiệu nhất trong việc sàng

lọc phát hiện những phân tử thuốc mới phân lập từ nguồn tự nhiên cũng như thuốc tổng hợp

Với sự thành công vượt bậc trong việc phân lập và nuôi cấy in vitro thường

qui các dòng tế bào khác nhau, hàng loạt các thử nghiệm sinh học dựa trên mô hình

tế bào đã được thiết lập Những phép thử này thường liên quan đến tương tác giữa

tế bào và thuốc, dùng để đo độ độc tế bào, đánh giá khả năng giết chết hay kìm hãm

sự phát triển của tế bào nuôi cấy Với hướng nghiên cứu này, mỗi phân đoạn tách chiết chứa các hợp chất hóa học đều được thử nghiệm sơ bộ về hoạt tính và chỉ những phân đoạn nào thể hiện hoạt tính sinh học mới được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn Chu trình phân tách và thử nghiệm được lặp lại cho đến khi chất sạch có hoạt tính mong muốn được phân lập Hạn chế của loại thử nghiệm này là sự tương

quan giữa hoạt tính gây độc tế bào trong mô hình thử nghiệm in vitro với in vivo

b Phép thử dựa vào cơ chế tác động (mechanism-based assays)

Phép thử dựa vào cơ chế liên quan đến việc đánh giá những hoạt tính cụ thể của thuốc theo hướng tác động cụ thể của một enzym, ADN hay thụ thể (receptor) đặc trưng Đây là phương pháp hữu hiệu cho nghiên cứu phát hiện thuốc, dùng để tìm kiếm các tác nhân chống u tiềm năng với cơ chế đặc trưng theo cách thức chọn lọc Ưu điểm chính của phép thử này khi một hợp chất có hoạt tính được thử nghiệm thì cơ chế hoạt động của nó sẽ được giải thích rõ ràng

Enzym đóng vai trò quan trọng trong chu kì tế bào và được coi là đích tương tác hấp dẫn của các phân tử thuốc Rất nhiều các công trình nghiên cứu cho thấy họ enzym caspase đóng vai trò trung tâm trong việc truyền tín hiệu apoptosis xảy ra trong các sinh vật đa bào Các caspase thuộc nhóm enzym protease Trong tế bào sống, các enzym caspase được giữ ở dạng không hoạt động bởi các protein trên bề mặt tế bào Khi một tế bào tiếp xúc với các tác nhân như hóa trị liệu, bức xạ hoặc các tín hiệu gây chết thì chức năng của các protein này bị khóa và kích hoạt caspase khởi phát quá trình tự chết Do vậy các nhà nghiên cứu hiện nay đang tập trung theo hướng sàng lọc các hoạt chất có khả năng điều trị ung thư theo cơ chế cảm ứng và kích hoạt quá trình apoptosis bởi họ enzym này Cho đến nay đã xác định được 15 loại caspase, chia thành 2 nhóm chính là caspase gây viêm và caspase liên quan đến apoptosis (gồm caspase 2, 3, 6, 7, 8, 10, 15) Trong đó caspase 3, 7 tham gia vào quá trình cắt một số protein mở đầu cho quá trình apoptosis của tế bào Việc xác

định khả năng kích hoạt enzym caspase này có thể cho ta biết cơ chế tác động của một số hoạt chất có tiềm năng điều trị ung thư [15, 16]

Trong lĩnh vực tìm kiếm các chất chống ung thư, việc tìm kiếm, sàng lọc chủ yếu dựa trên khả năng gây độc các dòng tế bào ung thư thực nghiệm Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết đặt ra là cần một phương pháp thử nghiệm nhằm đánh giá nhanh

và chính xác tác dụng gây độc cho tế bào của các hợp chất nghiên cứu

1.1.3 Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên apoptosis

Mục đích của hầu hết các loại thuốc hóa trị liệu ung thư hiện đang được sử dụng lâm sàng là tiêu diệt các tế bào khối u ác tính bằng cách ức chế một số cơ chế liên quan tới quá trình phân chia tế bào Theo đó, các hợp chất chống khối u được phát triển theo hướng này thường có tác dụng kìm hãm sự phát triển tế bào hoặc gây độc tế bào Một trong những cơ chế của thuốc chống ung thư hiện đang được nghiên cứu là khai thác các con đường tín hiệu để kích hoạt quá trình tự chết của tế bào (apoptosis)

Apoptosis là quá trình tự chết của tế bào ở dạng đã được lập trình từ trước (Programmed cell death - PCD) Thuật ngữ “Apoptosis” có nghĩa cây rụng lá vào mùa thu trong tiếng Hy Lạp Apoptosis ban đầu được mô tả dựa vào các đặc điểm hình thái của tế bào ở trạng thái apoptosis, bao gồm co rút tế bào, ngưng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân tế bào [17-19] Sự ức chế quá trình apoptosis có thể dẫn đến nhiều loại bệnh ung thư, bệnh tự miễn, bệnh sưng viêm và bệnh do nhiễm virus Ban đầu việc số lượng các tế bào tăng bất thường và tạo ra khối u được cho là

do việc sinh sôi nảy nở của tế bào tăng sinh mạnh; tuy nhiên hiện nay các nghiên cứu cho thấy việc suy giảm tốc độ chết của tế bào cũng là nguyên nhân của hiện tượng này Loại bệnh phổ biến nhất trong nhóm này là ung thư, một căn bệnh trong

đó tế bào sản sinh quá mức, thông thường được mô tả như là sự biểu hiện quá mức của protein ức chế apoptosis của tế bào (IAP) Vì vậy, các nhà khoa học hiện nay đang nghiên cứu sàng lọc các hoạt chất có khả năng điều trị ung thư theo cơ chế cảm ứng và kích hoạt quá trình apoptosis

Apoptosis là chương trình gây chết tế bào được quy định chặt chẽ hiệu quả

và liên quan đến nhiều yếu tố Tất cả mọi tế bào đều có một cơ chế nội tại để kiểm soát sự sống chết của tế bào Bất kì một sự mất cân bằng nào của cơ chế này đều ảnh hưởng đến apoptosis

Hình 1.1 Quá trình apoptosis thông qua con đường nội bào và ngoại bào [20]

Cơ chế của quá trình apoptosis rất phức tạp và liên quan đến nhiều con đường sinh hóa (hình 1.1) Tìm hiểu cơ chế này rất cần thiết và là cơ sở để nghiên cứu cơ chế, điều kiện hình thành các bệnh do rối loạn apoptosis, cũng như việc phát triển các loại thuốc điều trị hướng đích vào con đường apoptosis

Caspase đóng vai trò quan trọng và trung tâm trong cơ chế apoptosis vì chúng tham gia vào cả hai vai trò là khởi đầu/khởi động và thực hiện Có 3 con đường apoptosis mà đều có mặt caspase: Hai con đường chính là con đường nội bào (con đường ty thể) và con đường ngoại bào (các thụ thể chết), con đường thứ 3 gọi

là con đường lưới nội chất nội bào [21] Một số gen liên quan đến quá trình apoptosis được phát hiện là bị biển đổi trong tế bào ung thư (đặc biệt là gen họ BCL2 và caspase) Apoptosis được gây ra bởi một nhóm cysteine là các protease cụ thể là caspase, phân cắt cơ chất của chúng tại các gốc axit aspartic Caspase được tạo ra dưới dạng không hoạt động, được kích hoạt bằng phản ứng thủy phân tại các vị trí Asp

Mối liên quan giữa apoptosis và tế bào ung thư

Các tế bào ung thư thường có nguồn gốc từ các tế bào bình thường biến tính tạo thành dưới sự ảnh hưởng của một hay nhiều tác động nào đó Nếu apoptosis có hiệu quả với tế bào ung thư thì chúng sẽ tự tiêu biến đi như các tế bào bình thường khác Tuy nhiên, bản chất của các tế bào ung thư không chịu tác động của apoptosis, do đó chúng không bao giờ tự chết đi Tất cả các tế bào bình thường đều

có vòng đời nhất định và sẽ không bao giờ tự phân chia một cách bất thường Ngược lại, các tế bào ung thư sẽ không tự chết mà còn phân chia liên tục để gia tăng về kích thước lẫn số lượng Tế bào ung thư có thể phát sinh trong bất kỳ một bước nào trên con đường của apoptosis [22, 23]

Hình 1.2 Các cơ chế góp phần làm tránh quá trình apoptosis và gây ung thư [24]

Hiện nay các nhà khoa học quan tâm tới việc tìm kiếm các hợp chất mới sẽ tiêu diệt ung thư bằng cách kích hoạt một quá trình chết tự nhiên của tế bào ung thư Nói cách khác là sử dụng các hoạt chất đó nhằm thúc đẩy tế bào ung thư tự chết theo chương trình cài đặt sẵn trong gen Ngay từ những năm 1970, Kerr và cộng sự

đã liên kết apoptosis với việc loại bỏ các tế bào ác tính tiềm tàng, tăng sản và tiến triển khối u [17] Do đó, giảm apoptosis đóng một vai trò quan trọng trong việc gây

ung thư Một tế bào ung thư có thể có nhiều phương thức để giảm quá trình apoptosis hoặc ngược lại Nói chung, các cơ chế tránh apoptosis xảy ra có thể được chia thành: 1) phá vỡ sự cân bằng của protein tiền apoptosis và chống apoptosis, 2) giảm chức năng caspase và 3) suy giảm tín hiệu thụ thể gây chết Tóm tắt các cơ chế góp phần tránh quá trình apoptosis và gây ung thư được trình bày ở hình 1.2 [24]

Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên tác động vào các đích trong quá trình apoptosis vẫn là một hướng triển vọng chiến lược trong lĩnh vực ung thư sẽ tiếp tục phát triển trong tương lai thực hành lâm sàng

1.1.4 Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan tới chu kỳ tế bào

Chu kỳ tế bào là chu kỳ sống bao gồm nhiều bước, nhiều giai đoạn mà cả các

tế bào bình thường lẫn các tế bào ung thư đều phải trải qua để phân chia tạo nên những tế bào mới Đó là quá trình rất quan trọng cơ bản của tế bào ở tất cả các sinh vật sống Chu kỳ tế bào là một nhân tố quan trọng, ảnh hưởng tới hiệu quả chữa trị bệnh của các biệt dược Nhiều loại thuốc hóa trị chỉ gây độc cho tế bào ung thư ở giai đoạn phân chia (mà không tác động lên tế bào ở giai đoạn nghỉ G0) Một số loại thuốc tấn công đặc hiệu các tế bào ung thư vào một giai đoạn cụ thể của chu kỳ (ví dụ các giai đoạn M hoặc S) gọi là thuốc gây độc đặc hiệu lên chu trình tế bào Một số khác tấn công vào một vài giai đoạn của chu trình tế bào gọi là thuốc gây độc không đặc hiệu lên chu trình tế bào Một số loại thuốc điều trị ung thư tiêu biểu

có nguồn gốc từ tự nhiên tác động vào chu kì tế bào có thể kể đến như: Các hợp chất alkaloid vinca (Vincristine, Vinblastine…), nhóm các hợp chất taxane (Paclitaxel, Docetaxel) đều có đích tác động vào tubulin, nhóm Epidopophyllotoxin (Topotecan, Irinotecan; Etoposide, Teniposide) tác động vào pha G2 và ức chế enzym Topoisomerase I; II; nhóm Kháng sinh gây độc tế bào (Doxorubicin, Daunorubicin, Epirubicin, Idarubicin Bleomycins, Mitomycin C, Actinomycin D;) tác động vào pha S, G2 và ức chế Topoisomerase [25]

1.2 Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thư

Bệnh ung thư mang đến nhiều hệ lụy về sức khoẻ, thường gây chết nếu bệnh nhân không được chẩn đoán và điều trị kịp thời Tìm kiếm các loại thuốc mới có khả năng ức chế hoạt động của các tế bào ung thư, đồng thời giảm thiểu tác dụng phụ của thuốc là yêu cầu cấp thiết hiện nay Có nhiều con đường để tìm kiếm các

thuốc điều trị ung thư mới trong đó hướng tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc tự nhiên

có hoạt tính chống ung thư được nhiều nhà khoa học lựa chọn và hứa hẹn nhiều

triển vọng

Các hợp chất tự nhiên thường có các hoạt tính sinh học rất chọn lọc và có đích sinh học cụ thể, mỗi chất có tác dụng hướng đích khác nhau và có một cơ chế tác động riêng Chúng thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với các hợp chất tổng hợp hóa học như độc tính thấp và khả năng dung nạp cao trên cơ thể sinh vật Nguồn khai thác các chất tự nhiên có hoạt tính sinh học khá đa dạng, có thể từ các đối tượng trên cạn như các cây dược liệu và động vật làm thuốc, hay những sinh vật dưới biển như san hô mềm, hải miên, sao biển Đặc biệt, các sinh vật biển sống trong môi trường đáy biển sâu với nồng độ muối cao, ít tiếp xúc với ánh sáng, phải

tự bảo vệ trước sự tấn công của kẻ săn mồi, sự khan hiếm về nguồn thức ăn, mật độ dày đặc nên để tồn tại cần sự cạnh tranh cao, nên chúng thường chứa những hợp chất có cấu trúc đặc biệt hoặc duy nhất với các hoạt tính sinh học giá trị Trong một vài thập kỷ gần đây, rất nhiều hợp chất được phân lập từ sinh vật biển có hoạt tính gây độc cao đối với các dòng tế bào ung thư, ít độc với tế bào thường, do vậy đã thu hút sựi quan tâm trong lĩnh vực nghiên cứu tìm kiếm dược liệu mới, đặc biệt trong điều trị và phòng bệnh ung thư

1.2.1 Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ sinh vật biển

Các nghiên cứu về sinh vật biển dùng làm dược liệu đã được tác giả Blunt và đồng nghiệp thống kê cụ thể: Động vật thân lỗ (37%) (Sponges), Động vật ruột khoang (21%) (Coelenterates) và các Vi sinh vật (18%) (Microorganisms) như những nguồn chính, theo sau là Tảo (9%) (Algae), Động vật da gai (6%) (Echinoderms), Tunicate (6%), Động vật thân mềm (2%) (Molluscs) và Động vật hình rêu (1%) (Bryozoans) Dựa vào các công cụ dự báo, phân tích số liệu, các nhà khoa học dự đoán rằng tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển có tỷ lệ tăng khoảng 10% mỗi năm [26]

Từ các nghiên cứu trên, đến cuối năm 2020, chín loại dược phẩm có nguồn gốc từ biển đã được FDA chấp thuận cho sử dụng lâm sàng điều trị ung thư (Bảng 1.1) [27] Đáng chú ý là vào đầu năm 2018, thống kê về về lĩnh vực thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ biển, chỉ có bốn loại thuốc có nguồn gốc từ biển được chấp

thuận để điều trị ung thư và các bệnh liên quan đến ung thư, đó là cytarabine (Cytosar-U), trabectedin (Yondelis®), eribulin mesylate (Halaven®) và liên hợp kháng thể - thuốc (ADC) brentuximab vedotin (Adcetris®) Chỉ trong vòng ba năm

kể từ năm 2018 đến nay, năm loại thuốc mới đã được phê duyệt để điều trị các loại ung thư khác nhau trên toàn thế giới; hai trong số chúng chỉ mới được phê duyệt

gần đây vào năm 2020 [27]

Cytarabine (Ara-C) được phân lập đầu tiên từ Hải miên, được sử dụng để điều trị bệnh bạch cầu tủy cấp tính, bệnh bạch cầu lymphocytic cấp tính, bệnh bạch cầu tủy xương mãn tính [28] Cytarabine được cấp bằng sáng chế vào năm 1960 và được FDA phê duyệt vào tháng 6 năm 1969 dưới tên thương mại Cytosar-U [29] Cytarabine can thiệp vào quá trình tổng hợp ADN, nó nhanh chóng được chuyển đổi thành cytosine arabinoside triphosphate trong cơ thể, thay thế cho cytidine triphosphate Ngoài ra, Cytarabine cũng ức chế các enzym quan trọng trong quá trình tổng hợp ADN đó là ARN polymerase và nucleotide reductase [30]

Ziconotide (ω-conotoxin MVIIA) - một chuỗi peptit có nguồn gốc từ loài Ốc nón nhiệt đới Thuốc này được FDA chứng nhận vào năm 2004 có tên thương mại

là Prialt để điều trị đau mãn tính nghiêm trọng ở những bệnh nhân bị ung thư, AIDS hoặc một số rối loạn thần kinh [31]

Trabectedin trở thành hợp chất chống ung thư đầu tiên có nguồn gốc từ biển được Hội đồng Châu Âu chứng nhận [31] Hợp chất được tìm thấy trong dịch chiết

loài Hải tiêu Ecteinascidia turbinate là Trabectedin (có tên thương mại là Yondelis)

được dùng để điều trị ung thư mô mềm và ung thư buồng trứng trong trường hợp bệnh nhân đã kháng các thuốc ung thư thế hệ cũ [31]

Eribulin mesylate (Halaven®) được công nhận bởi FDA trong việc điều trị cho các bệnh nhân ung thư vú di căn, những người mà trước đó không đáp ứng tốt với hoá trị bởi Anthracycline và Taxane Eribulin mesylate (E7389, ER-086526, NSC 707389, Halaven) là một dạng cấu trúc đơn giản hoá của Macrolide

halichondrin B, được phân lập từ Halichondria okadai, một loài hải miên sống ở

vùng biển Nhật Bản [32]

Vedotin được phân lập lần đầu tiên từ sên biển Dolabella auricularia, sau đó

chúng được tìm thấy do vi khuẩn lam sản xuất [33] Liên hợp thuốc kháng thể Brentuximab vedotin được FDA công nhận vào năm 2011 dưới tên thương mại

Adcetris®, dùng để điều trị ung thư hạch ác tính tế bào T lớn và ung thư hạch Hodgkin [34]

Plitidepsin (Aplidin®), là một depsipeptide ascidian liên kết với eEF1A2 và gây ra stress oxy hóa trong tế bào ung thư; thuốc được phê duyệt lần đầu tiên vào năm 2018 tại Úc để điều trị bệnh đa u tủy, bệnh bạch cầu và ung thư hạch [35] Polatuzumab vedotin (PolivyTM) là một liên hợp thuốc kháng thể (ADC-antibody–drug conjugate) bao gồm MMAE (monomethyl auristatin E, một chất tương tự của dolastatin 10, là một độc tố peptit của vi khuẩn lam biển cộng sinh) được kết hợp với polatuzumab kháng thể đơn dòng đặc hiệu CD76b Kháng thể này cung cấp khả năng phân phối MMAE cụ thể đến các tế bào ung thư, nơi mà sau khi phân cắt ADC phân giải protein và giải phóng MMAE, có thể ức chế quá trình trùng hợp tubulin dẫn đến tế bào ung thư chết Thuốc đã được FDA chấp thuận vào năm

2019 để điều trị u lympho tế bào B, u lympho không Hodgkin và bệnh bạch cầu lymphocytic mãn tính [36]

Enfortumab vedotin (PADCEVTM) là một ADC khác bao gồm MMAE và một kháng thể đặc hiệu cho nectin-4 Nó đã được phê duyệt vào năm 2019 để điều trị ung thư biểu mô di căn [37]

Belantamab mafodotin (BlenrepTM) là một ADC khác bao gồm MMAF (monomethyl auristatin F, một trong những dẫn xuất của MMAE) liên kết với kháng thể nhắm mục tiêu vào BCMA (kháng nguyên trưởng thành tế bào B) Tương

tự như MMAE, MMAF nhắm mục tiêu vào quá trình trùng hợp tubulin Thuốc đã được phê duyệt vào năm 2020 để điều trị bệnh đa u tủy [38]

Lurbinectedin (ZepzelcaTM) là một dẫn xuất tổng hợp của trabectedin liên kết với rãnh nhỏ của DNA và có tác dụng chống ung thư thông qua ức chế và phân hủy ARN polymerase II Thuốc đã được phê duyệt vào năm 2020 để điều trị ung thư phổi tế bào nhỏ di căn [39]

Ngoài ra còn có 19 hợp chất biển đang trong các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư, hầu hết chúng là các phân tử dạng liên hợp thuốc- kháng thể [40] Tính đến nay có hơn 10.000 hợp chất khác nhau được phân lập từ các sinh

vật biển đã thể hiện hoạt tính sinh học trong các thử nghiệm in vitro, trong đó có

1500 phân tử tự nhiên có hoạt tính sinh học in vivo mạnh đã được nghiên cứu [41]

Do đó, các sinh vật biển là một kho tàng chứa các hợp chất có cấu trúc phong phú

và độc đáo hứa hẹn nhiều hoạt tính sinh học quý báu, là nguồn nguyên liệu tiềm năng để phát triển các loại thuốc chống ung thư trong tương lai

Bảng 1.1 Thông tin tóm tắt của một số loại thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ

sinh vật biển (SVB) đã được cấp phép

Tên hợp chất Tên thuốc Nguồn

SVB Lớp chất

Cơ chế tác động

Tài liệu tham khảo

Cytarabine

ADN polmerase

[28] [29] [30]

mềm/vi khuẩn xyano

Liên hợp thuốc

(MM auristatin E)

CD30 &

microtubules

[33] [34]

Plitidepsin Aplidin® Hải tiêu Depsipeptide Rac1 & JNK

mềm/vi khuẩn xyano

mềm/vi khuẩn xyano

mềm/vi khuẩn xyano

cembranoid, steroid có tiềm năng trong nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính diệt tế bào

ung thư [42-49] Trong đó, hai loài Sarcophyton pauciplicatum và Menella woodin chứa các biscembranoid và steroid có hoạt tính diệt tế bào ung thư tốt trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm in vitro [50, 51] Tiếp theo, các hoạt chất này

đã được nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thí nghiệm chuột và thỏ và kết quả cho thấy sản phẩm thử nghiệm không ảnh hưởng đến các cơ quan gan, lách, thận của đối tượng thử nghiệm ở mức liều nghiên cứu (100-200 mg/1kg trọng lượng cơ thể) Từ nguồn san hô mềm Việt Nam, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc sàng lọc các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hiện chưa có nghiên cứu sâu về cơ chế cũng chưa có thực phẩm chức năng nào từ san hô mềm hỗ trợ điều trị ung thư Tuy nhiên, các hợp chất phân lập từ san hô mềm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào khá tốt, trong tương lai cần thiết có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về cơ chế dựa trên những nghiên cứu sàng lọc này

1.3 Giới thiệu chung về san hô mềm

San hô mềm ở Việt Nam phân bố hầu hết ở vùng biển Việt Nam từ vùng đảo ven bờ tới vùng biển đảo Hoàng Sa, Trường Sa Các công trình nghiên cứu chủ yếu

đã thực hiện ở từ năm 1950 tới năm 1994 do các tác giả nước ngoài cùng hợp tác thực hiện và khảo sát Chỉ từ năm 2002 san hô mềm bắt đầu được nghiên cứu như một nội dung trong một số đề tài cấp nhà nước, cấp bộ nhưng các kết quả chỉ mang tính chất đơn lẻ, từng khu vực và chỉ đề cập đến một số loài phổ biến còn các đặc điểm khác như đặc điểm phân bố, độ phủ, đặc tính khu hệ vẫn còn bỏ ngỏ San hô mềm là quần xã sinh vật dưới biển có sinh khối lớn và phân bố với diện tích rộng đóng vai trò quan trọng đối với các sinh vật biển trong cân bằng sinh thái và đa dạng sinh học

Hiện nay, các hoạt chất có hoạt tính kháng viêm, kháng vi rút, diệt tế bào ung thư được tách chiết và tìm ra từ nhóm san hô mềm ngày càng có giá trị và ý nghĩa trong ngành dược phẩm, y học Nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học từ san hô mềm ở Việt Nam bước đầu mang lại các kết quả rất khả quan Vì vậy, cùng với các nghiên cứu về thành phần loài, phân bố, hướng nghiên cứu hoạt chất của nhóm san hô mềm ở Việt Nam đã bổ sung các dữ liệu mới về nghiên cứu cơ bản, đồng thời góp phần ứng dụng nguồn dược liệu biển quý giá trên một cách hiệu quả

và bền vững

1.3.1 Đặc điểm của san hô mềm

San hô mềm thuộc giới động vật (Animalia), ngành ruột khoang (Cnidaria - Coenlenterata), lớp san hô (Anthozoa), phân lớp san hô tám ngăn (Octocorallia), bộ san hô mềm (Alcyonacea)

Bộ san hô mềm Alcyonacea có 35 họ, 308 giống, khoảng 3000 loài được mô

tả, phân bố ở khắp các vùng biển trên thế giới, trong đó có 23 họ phân bố ở các vùng nước nhiệt đới [52, 53]

Tập đoàn san hô mềm (Colony): Từ một cá thể ban đầu mọc nhiều nhánh

rỗng, trên đó hình thành các cá thể mới Tiếp theo tầng keo ở nách của các nhánh phát triển mạnh, liên kết cá thể con và cá thể mẹ thành một khối, trong khi hệ thống ống nối các khoang vị được hình thành cùng với sự liên kết các vi xương tạo thành một hệ thống chung của quần thể [54] Lớp ngoài của tập đoàn là các polyp và lớp

mô bảo vệ, lớp bên trong chứa các mô, khoang dạ dày, kênh nội bào, vi xương [55] San hô mềm có có cấu tạo đơn giản, chúng liên kết các cá thể (polyp) với nhau thành dạng tập đoàn Toàn bộ tập đoàn được nâng đỡ bởi các vi xương nhỏ nằm rải rác trong cơ thể, các vi xương này có kích thước hiển vi không liên kết với nhau nên

cơ thể san hô rất mềm Vì vậy chúng được gọi là san hô mềm khác hẳn với san hô cứng có bộ xương đá vôi cứng và vững chắc [55]

Cấu tạo polyp: Phần lớn san hô mềm có dạng một loại polyp, gọi là

autozooid, với chức năng chính là bắt mồi và sinh sản Với các loài có duy nhất một loại polyp thì được gọi là loài đơn polyp – monomorphic Một số ít các loài với tập đoàn lớn có một loại polyp khác - siphonozooid với kích thước nhỏ hơn, với ít hoặc không có các tua miệng có chức năng chính là lưu thông nước biển bên trong cơ thể tập đoàn và mang chất dinh dưỡng lơ lửng đến các phần khác của tập đoàn Các loài này được gọi là loài lưỡng polyp [55] Cấu tạo của một polyp bao gồm một rãnh hầu, 1 vành với 8 tua miệng dạng lông chim và 8 vách ngăn tạo thành 8 khoang vị ứng với 8 tua miệng phía ngoài Ngăn cạnh rãnh hầu gọi là ngăn định hướng Hai

gờ cơ của vách ngăn giới hạn ngăn này xếp hướng vào nhau ở mặt trong của ngăn Các gờ cơ ở trên vách ngăn còn lại được xếp theo hai hướng ngược nhau kể từ ngăn định hướng, theo kiểu đuổi nhau từ vách ngăn này sang vách ngăn tiếp theo Số lượng tua miệng và vách ngăn không thay đổi trong quá trình sinh trưởng [54]

Hình 1.3 Cấu trúc tập đoàn san hô mềm

(Nguồn: http://research.calacademy.org/redirect)

Hình thái tập đoàn: Hình thái tập đoàn: Trong khi hình thái của polyp là

khá đồng nhất ở các loàisan hô mềm thì hình thái của mỗi tập đoàn lại rất đa dạng, ngay kể cả trong một loài cũng có những sai khác tùy thuộc vào môi trường sinh sống Các hình dạng tập đoàn có thể chia thành các nhóm chính sau: dạng khảm nạm, dạng màng, dạng phiến gấp, dạng phễu, dạng khối, phân thùy, dạng ngón, dạng cây, dạng quạt, dạng bụi và trong thực tế có những dạng tập đoàn với hình dạng chuyển tiếp giữa các dạng trên

Hình 1.4 Các dạng tập đoàn chủ yếu của san hô mềm

A: dạng phiến bám; B: dạng phễu; C: dạng cây; D: dạng cây bụi

1.3.2 Tổng quan về chi Sinularia

Chi Sinularia thuộc họ Alcyoniidae, lớp Alcyonaria, ngành Cnidaria Trong

họ Alcyoniidae, chi Sinularia là một trong những nhóm san hô mềm được phân bố

rộng rãi nhất Nó tạo thành một phần chủ yếu của sinh khối trong các rạn san hô

biển nhiệt đới San hô mềm thuộc chi Sinularia phát triển rất mạnh mẽ, chúng phân

bố rộng rãi từ Đông Phi đến Tây Thái Bình Dương, ở các rạn san hô hay trên đá ở

vùng nước nông, nhưng hiếm khi hình thành những quần thể lớn Chi Sinularia

bao gồm khoảng 138 loài, trong đó có khoảng 50 loài đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Ở Việt Nam có khoảng 66 loài, trong đó mới có

6 loài được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Theo các công trình nghiên cứu đã công bố, các hợp chất phân lập từ chi này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quý giá như hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng viêm và gây độc tế bào, chúng có liên quan chặt chẽ đến đa dạng sinh học của môi trường biển Các hợp chất này thuộc các nhóm chất sesquiterpen, diterpen, polyhydroxylate steroid và các hợp chất polyamine Cấu trúc và tiềm năng dược liệu của các hợp chất này luôn thu hút sự chú ý của các nhà hóa học và sinh dược học

1.3.3 Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại san hô mềm

Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử và tin sinh học, phân tích đa dạng di truyền và phân loại dựa vào chỉ thị dựa trên sự đa dạng về trình tự ADN chỉ thị đã hỗ trợ tích cực cho phân loại theo các đặc điểm hình thái Hiện nay, gen ty thể

(mitochrondia ADN: mtADN) và gen mã hóa rARN (rARN) (rARN = ARN

ribosome) được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu phân loại học phân tử Trong những nghiên cứu đầu tiên về phân loại phân tử san hô mềm, từng phân đoạn hoặc toàn bộ trình tự gen của tiểu đơn vị ribosome 18S, 28S hoặc 16S đã được sử dụng

nhằm tìm kiếm những chỉ thị đặc trưng Nghiên cứu 16S rARN cho thấy các sự khác

biệt giữa các loài thuộc họ này chỉ từ 2,7-6,3 %, thấp hơn khoảng 5-10 lần so với

các lớp khác trong ngành Cnidaria [56] Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 28S rARN mới chỉ dừng lại ở phân loại đến chi, chưa đủ cơ sở làm chỉ thị phân loại nên

thường được dùng kết hợp với các chỉ thị khác để so sánh [57] Trong họ san hô mềm việc ứng dụng gen ty thể để phân loại cũng có những khó khăn bước đầu do tốc độ tiến hóa rất chậm ở vùng gen này Phân tích một vài gen mã hóa cho các protein khác nhau trên ty thể cho thấy tính bảo thủ trong hệ gen ty thể của san hô mềm [58] Tuy nhiên, việc phát hiện ra gen mã hóa cho một protein đơn phân

(unique protein-coding gene) như msh1 trong bộ gen ty thể của san hô mềm đã tạo

cơ sở cho những nghiên cứu phân loại phân tử bộ Alcyonacea Gen msh1 có độ đa

dạng gấp hai lần các gen mã hóa cho các protein khác trên ty thể và hơn nữa được tìm thấy trong ADN ty thể của tất cả các chi san hô mềm đã công bố trên ngân

hàng gen hiện nay [59, 60] Mức độ đa dạng của gen msh1 cũng rất khác biệt giữa

các loài trong một chi và đã được ứng dụng để khảo sát quan hệ trong và ngoài loài

san hô mềm ở vùng biển Châu Á Thái bình dương [61] Ngoài msh1, một vài gen ty

thể thông dụng khác trong phân loại học phân tử như COI (cytochrome oxidase I), ND2 (NADH dehydrogenase subunit 2), ND3, ND4, ND6 cũng được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở san hô mềm[62-64] Nhiều vùng không mã hóa trong ty thể của san hô mềm cũng đã được thử nghiệm để khả năng phân biệt các

loài trong các chi khác nhau như vùng indel#2 của 16S rARN [65], vùng nối giữa COI–COII (igr1) và vùng nối (igr4) giữa cyt-b và ND6 Nhiều thử nghiệm sử dụng

gen ty thể như là các mã vạch (barcode) di truyền đặc trưng loài trong bộ san hô mềm cho thấy rằng không có một vùng gen duy nhất nào đủ đa dạng để phân biệt tất cả các loài [66]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia

Thống kê các nghiên cứu đã công bố cho thấy các hợp chất phân lập từ san

hô mềm chi Sinularia chủ yếu bao gồm các hợp chất sesquiterpen, diterpen và

steroid Nhiều hợp chất trong số này thể hiện hoạt tính sinh học thú vị

1.3.4.1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất Sesquiterpen

Các hợp chất sesquiterpen phân lập từ san hô mềm chi Sinularia (hình 1.5)

chủ yếu thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hoạt tính kháng viêm, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định [67-75]

Năm 2009, hợp chất đã biết dạng khung furanosesquiterpen là methyl

5-[(1E,5E)-2,6-dimethylocta-1,5,7-trienyl]13furan-3-carboxylate (3) được nghiên cứu

sâu về hoạt tính gây độc tế bào (IC50 trên dòng THP-1 là 29,59 µM), kết quả cho

thấy hợp chất 3 gây ra apoptosis thông qua con đường ty thể, từ đó cho thấy hợp

chất này có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh ung thư ở người, đặc biệt là các tế

bào ung thư bạch cầu [70] Hợp chất Peroxygibberol (4) phân lập từ loài từ loài S

gibberosa thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô gan người ở mức trung

bình với giá trị IC50 là 8,2 µg/mL [71] Hai hợp chất sesquitepen mới

1S*,4R*,5S*,6R*,7S*,10S*-1(5), 6(7)-diepoxy-4-guaiol (5) và

1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-guaianediol (6) phân lập từ san hô mềm Sinularia sp ở vùng biển Hải Nam,

đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên B16 và HT-29 với giá trị IC50 của hợp

chất 5 là 1,2 và 3,5 µg/mL, tương ứng của hợp chất 6 là 2,2 và 5,7 µg/mL [72]

Hình 1.5 Cấu trúc minh họa một số hợp chất sesquiterpen phân lập từ chi Sinularia

Hợp chất ∆9(15) africanene (9), được phân lập lần đầu tiên từ S polydactyla

(Brackman,1980) và cũng được phân lập từ S erecta (Kashmann,1980) Là một

phần của nghiên cứu dược phẩm (Reddy và cộng sự, 1999 hợp chất 9 đã được thử

nghiệm hoạt tính độc tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư biểu mô Ehrlich

(EAC) và tế bào u ác tính Dalton (DLAT) ở nồng độ 10 µg/mL, gây chết tế bào

EAC và DLAT 100% và 92% Trong thử nghiệm gây độc tế bào của hợp chất 9 trên

khối u cổ họng Ehrlich cấy trên chuột người ta quan sát thấy rằng tuổi thọ của chuột tăng 22,68% và 53,32% ở nồng độ 10 và 20 mg/kg trọng lượng cơ thể [75]

1.3.4.2 Hoạt tính sinh học của các hợp chất Diterpen

Cembranoid diterpen là nhóm chất chuyển hóa thứ cấp thường gặp nhất ở các

loài san hô mềm chi Sinularia Những cấu trúc này đặc trưng bởi một nhóm

isopropyl và 3 nhóm methyl ở C14 bị thế, với những thay đổi cấu trúc ở vị trí liên kết đôi, epoxy hóa, allylic và quá trình oxy hóa isopropyl Các hợp chất thuộc nhóm này cũng thể hiển hoạt tính gây độc tế bào ung thư và một số hoạt tính khác như kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh [76-85] Cấu trúc hóa học một số hợp chất Diterpen phân lập từ chi này có hoạt tính sinh học được trình bày ở hình 1.8, 1.9, 1.10, 1.11

Năm 1977, hai cembranolide mới có hoạt tính gây độc độc tế bào là sinularin

(18), dihydrosinularin (19) và hợp chất đã biết Sinulariolide (20), lần đầu tiên được

phân lập từ S flexibilis Liều hiệu quả để ức chế 50% (IC50) trên dòng 2 dòng tế bào

ung thư là KB và PS bởi sinularin (18), dihydrosinularin (19) và Sinulariolide (20)

là 0,3 và 0,3; 1,6 và 1,1; 2,0 và 7,0 µg/mL [86] Một báo cáo khác, sinularin (18)

thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư ở mức trung bình trên các dòng Hep-2, MDA-MB231 và MCF-7 với giá trị IC50 lần lượt là 12,6; 13,5 và 17,5 µg/mL [85]

Ngoài ra, Sinularin (18) còn thể hiện hoạt tính kháng viêm, hợp chất này ức chế

đáng kể sự biểu hiện của protein tiền viêm iNOS và COX-2 cũng như TGF-β trong các đại thực bào bị kích thích Các kết quả in vitro này cũng được chuyển sang các nghiên cứu in vivo, trong đó đã quan sát được tác dụng giảm đau dưới da của hợp

chất này ở liều 80 mg/kg [87]

Năm 2016, Yu-Jen Wu lần đầu tiên đã nghiên cứu sâu về cơ chế tác động

của hợp chất 18 trên 2 dòng tế bào ung thư dạ dày AGS và NIC-N87 (Hình 1.6), kết quả chứng minh rằng 18 có tác dụng chống ung thư chủ yếu thông qua tác dụng gây

độc tế bào và cảm ứng apoptosis, được thực hiện bằng cách kích thích rối loạn chức năng ty thể và ức chế con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt/mTOR [88] Kết quả

nghiên cứu của Tzu-Rong Su thấy hợp chất 18 làm tăng các tế bào u ác tính apoptotic và gây ra sự tích lũy tế bào khối u ở pha G2/M, cho thấy hợp chất 18 tác

động lên quá trình apoptosis gây ra sự chậm chễ trong chy kỳ tế bào u ác tính A2058 [89] Một nghiên cứu khác trên dòng tế bào ung thư miêng Ca9‐22 đã chứng

tỏ rằng hợp chất 18 gây ra stress oxy hóa - trung gian chống tăng sinh tế bào, bắt

giữ tế bào ở pha G2/M và gây ra apoptosis trên các tế bào ung thư miệng [90]

Hình 1.6 Sơ đồ minh họa cơ chế tác động của hợp chất Sinularin (18) lên tế bào

ung thư dạ dày [88]

Năm 2017, Ting-Wen Chung và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các tác dụng gây độc tế bào trong tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2 kết quả cho

thấy hợp chất 18 kích hoạt tổn thương ADN và sau đó gây ra bắt giữ chu kỳ tế bào

ở pha G2/M, kết hợp với tăng sự biểu hiện của p-ATM (Ser (1981)), p-Chk2 (Tyr (68)), p-cdc2 ( Tyr (15)) và p53 kết hợp với sự tăng biểu hiện của các protein p21

và giảm sự biểu hiện của của p-cdc25 (Ser (216)) Hơn nữa, kết quả phân tích apoptosis và Western blot chỉ ra rằng hoạt tính gây độc tế bào có thể liên quan đến apoptosis thông qua ty thể, đặc trưng bởi sự giảm biểu hiện Bcl-2, sự rối loạn chức năng màng ty thể, và kích hoạt bước tiếp theo của caspases và Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) [91]

Năm 2018, Hurng-Wern Huang và cộng sự đã tập trung nghiên cứu khả năng

tiêu diệt tế bào ung thư có chọn lọc và cơ chế tác động của 18 lên tế bào ung thư vú (SKBR3 và MDA-MB-231), kết quả cho thấy 18 gây ra sự bắt giữ ở pha G2/M của

tế bào SKBR3, gây ra apoptosis trên tế bào SKBR3 [92]

Hợp chất Sinulariolide (20) cũng được nghiên cứu sâu về cơ chế gây độc tế bào (hình 1.7) Sinulariolide (20) có các hoạt tính chống tăng sinh, chống di truyền

và hoạt hóa quá trìn apoptosis chống lại tế bào ung thư bàng quang TSGH

Sinulariolide (20) ức chế sự tăng trưởng và di chuyển của các tế bào ung thư biểu

mô bàng quang một cách phụ thuộc vào liều, cũng như gây ra hiện tượng apoptosis

sớm và muộn Cơ chế của quá trình apoptosis do 20 gây ra có liên quan đến rối loạn chức năng ty thể thông qua các con đường phụ thuộc enzym caspase, do 20 làm mất

chức năng màng ty thể, giải phóng cytochrome C, hoạt hóa caspase-3/-9, Bax và Bad cũng như ức chế sự biểu hiện của Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1 Việc phát hiện ra PARP-1 đã được hoạt hóacho thấy có sự tham gia một phần của các con đường độc lập caspase Hơn nữa, sự ức chế hoạt động của p38MAPK dẫn đến việc giải phóng

độc tố tế bào của các tế bào TSGH được điều trị bằng 20, điều đó chỉ ra rằng con

đường p38MAPK cũng tham gia vào quá trình apoptosis Từ những kết quả nghiên

cứu, các nhà khoa học đã đưa ra được cơ chế tác động của hợp chất 20 lên tế bào

ung thư bàng quang là gây ra apoptosis thông qua con đường ti thể và con đường tín hiệu p38MAPK [93]

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa cơ chế của Sinulariolide gây ra apoptosis thông qua con

đường ty thể và p38MAPK trên các tế bào TSGH [93]

Hình 1.8 Cấu trúc minh họa một số hợp chất cembranoid phân lập từ chi Sinularia