Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mói đuợc phát hiện. Trong tuơng lai chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa cũng sẽ đuợc tìm ra vì đa số các vi sinh vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh đã đuợc nghiên cửu cho tới nay đều chỉ thuộc về các chi Streptomyces và Bacillus. Nhiều nhà nghiên cửu về các chất kháng sinh tin rằng sẽ có nhiều chất kháng sinh mới đuợc phát hiện nếu tìm thêm ở các nhóm vi sinh vật khác. Mặt khác các kỹ thuật của công nghệ di truyền sẽ cho phép thiết kế một cách nhân tạo các chất kháng sinh mới khi mà các chi tiết về bản đồ gen của các vi sinh vật sản sinh chất kháng sinh đã đuợc biết rõ.

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

Trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM

Khoa kỹ Thuật Hóa học

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Mục lục

1.1 Lời nói đầu 6

I Tổng quan về chất kháng sinh 6

1.2 Định nghĩa 6

1.3 Khái niệm về chất khảng sinh [1] 6

1.3.1Tác dụng của chất kháng sinh 6

1.5Phân loại thuốc kháng sinh [4] 9

1.6Sàn xuất thuốc khảng sinh 10

1.7Mặt trái của thuốc khảng sinh 10

1.8Một sổ thuốc kháng sinh thường gặp 12

1.8.1 Thuốc kháng sinh họ fluoroquinolone [10] 12

1.8.2 Chloramphenicol [13] 15

1.8.3 Penicillin [13] 19

II Các phương pháp xác định hàm lượng chất khảng sinh trong thực pham 21

2.1 Dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elừa thông qua phân tích khắng 1.4 định bằng LC - MS/MS [5] 21

2.1.1Giới thiệu 21

2.1.2Đối tượng 22

2.1.3Phương pháp phân tích 22

2.1.4Phân tích - nhận xét 23

2.2 Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh streptomycin [7] 25

2.2.1Đặc tinh chung 25

2.2.2Nguyên tắc 26

2.2.3Lẩy mau 26

2.2.4Dụng cụ, thiết bị và hoá chất 26

2.2.5Tiến hành thủ 28

2.3 Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm bằng phương pháp ELISA 1.5 [15] 29

2.3.4 Khả năng phát h iện của kít

2.3.5 Độ đặc hiệu, tỉnh chọn lạc và độ xác thực của phương pháp

2.3.6 Kết luận

2.4 Phương pháp kiếm tra nhanh Chloramphenicol [6]

2.4.1 Mục đích

2.4.2 Tóm tắt

2.4.3 Nguyên lí

2.4.4 Lưu ỷ

2.4.5 Bảo quản và độ on định

2.4.6 Thiết bị

2.4.7 Xử li mâu

2.4.8 Quy trình thực hiện

2.4.9 Đọc kết quà

2.4.10 Kiếm soát chất lượng

2.4.11 Hiệu suất

2.5 Phương pháp định lượng Sulfonamit trong sản phắm thuỳ sàn bang sắc ký lỏng hiệu năng cao [16]

2.5.1 Phạm vi áp dụng

2.5.2 Phương pháp tham chiểu

2.5.3 Nguyên tắc

Tài liệu tham khảo 32

33 34 34 34 34 34 35 35

Mục lục hình ảnh

Hình 1.1: Penicillin G

Hình 1.2 Sơ đồ thế hiện cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh trên vi khuắn

Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone

Hĩnh 1.4 Cân bang Acid Base của nhóm Acidic Quinolone

Hĩnh 1.5 Cân bang acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone

Hĩnh 1.6 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin

Hình 1.8 Công thức phân tử chung của họ chloramphenicol

Hình 1.9 Sơ đồ tong hợp chloramphenicol từ acid shikimic

Hĩnh 1.10 Sảnpham penicillin lén men tự nhiên nhờ p.chrysogenum

Bảng 2.5 Khả năng phát hiện của phương pháp ở nồng độ giới hạn phát hiện và giới hạn nồng độ toi

đa cho phép theo Quyết định 2377/90 CE của Uỷ ban Châu Au đoi với một sổ Quinolone Bảng 2.6 Các tham so độ mạnh của phương pháp đổi với các quinolone được thử tại ngưỡng phát hiện tồi thiếu Bảng 2.7: Chương trình pha động

Lời nói đẩu

Cùng vói sự phát hiển của công nghệ sinh học hiện đại, vi sinh vật học công nghiệp - mộtnhánh có vai trò hết sức trọng yếu trong ngành công nghệ sinh học đã thu đuợc rất nhiều thành tựu tolớn trong sản xuất sinh khối, duợc phấm, các chất điều vị thục phấm sử dụng trong công nghiệp, y,duợc học, nông nghiệp nhờ vi sinh vật - bộ máy sản xuất sinh khối kì diệu

Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh móiđuợc phát hiện Trong tuơng lai chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa cũng sẽ đuợc tìm ra

vì đa số các vi sinh vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh đã đuợc nghiên cửu cho tới nay đều chỉthuộc về các chi Streptomyces và Bacillus Nhiều nhà nghiên cửu về các chất kháng sinh tin rằng sẽ cónhiều chất kháng sinh mới đuợc phát hiện nếu tìm thêm ở các nhóm vi sinh vật khác Mặt khác các kỹthuật của công nghệ di truyền sẽ cho phép thiết kế một cách nhân tạo các chất kháng sinh mới khi màcác chi tiết về bản đồ gen của các vi sinh vật sản sinh chất kháng sinh đã đuợc biết rõ

Ngày nay, chất kháng sinh đuợc sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp nhu chăn nuôi,trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản, có tác dụng rất lớn là giúp cho vật nuôi hồng chống lại bệnh tật từ

vi sinh vật Tuy vậy, chất kháng sinh nhu một con dao hai luỡi Một mặt giúp sinh vật chông lại bệnhtật, mặt khác, có thế làm cho sinh vật xuất hiện phản úng phụ, và đặc biệt là luợng chất kháng sinh tồn

du sinh vật có thế ảnh huởng đến chất luợng thục phấm, nhất là súc khỏe nguôi tiêu dùng

Với một luợng thục phẩm khổng lồ từ động vật đang đuợc tiêu thụ trên thị truờng, song ít ainghĩ đến việc mỗi ngày trong cơ thế chủng ta đang phải tích lũy dần dần du luợng chất kích thíchtăng họng và thuốc kháng sinh trong từng miếng thịt động vật của các loại sản phấm này Bởi trongchăn nuôi gia súc, gia cầm hiện nay, nguời dân sử dụng rất tùy tiện các loại thúc ăn tăng trọng và thuốckháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn Hậu quả là du luợng chấtkích thích và thuốc kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm vuợt nguỡng cho phép gấp nhiều lần, tuykhông gây ngộ độc cấp tính túc thòi, nhung sẽ gây nguy hại về lâu dài cho súc khỏe của nguôi tiêudùng

I Tống quan về chất kháng sinh

1.1 Định nghĩa

1.2 Khái niệm về chất kháng sinh [1]

Từ ''antibiotics'' (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ ''antibiosis'' ''anti'' có nghĩa là

" c h ố n g l ạ i " và "biosis" có nghĩa là " c u ộ c s ắ n g " Chất kháng sinh tác động, chống lại một số

loại vi khuấn Thật vậy, chất kháng sinh là chất hoá học lấy từ cơ thế các vi sinh vật nhu vi khuấn, nấmmốc, hoặc một vài thục vật

1.3.1 Tác dụng của chất khảng sinh

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

Thuốc kháng sinh là những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lênbằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiếtcủa đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa

Thòi đại chất kháng sinh bắt đầu vào khoảng năm 1928 cùng với việc khám phá các loạiPenicillin của bác sĩ Alexandra Flemning Flemning đã đặt tên cho chat Penicillin Chất kháng sinh nàyrất hữu hiệu cho việc điều trị các bệnh như viêm phối, họ , viêm cuống họng, mụn mũ, đau nhức, v.v Streptomycin là một chất kháng sinh khác được dùng để điều trị bệnh lao phổi Ngoài ra còn có nhữngchất kháng sinh khác như ampicilin, tetracyclin, Chloromycetin, v.v được dùng để trị những căn bệnhkhác Một vài loại kháng sinh rất hữu hiệu trong việc chống lại một số vi sinh vật, vài loại khác hữuhiệu trong việc chống lại các vi sinh vật ở phạm vi lớn được gọi là chất kháng sinh phố rộng [1],

Mỗi năm hàng triệu bệnh nhân trên thế giới được chữa trị nhờ chất kháng sinh Năm 1930,20% đến 85% tống số tử vong ở Mỹ là do bệnh lao phối Năm 1960 con số này giảm xuống còn 5%.Tương tự, số tử vong do sốt thương hàn gây ra đã giảm từ 10% đến 2% Các bệnh truyền nhiễm cũng

đỡ đi nhiều nhờ chất kháng sinh Chất kháng sinh cũng hữu dụng trong việc ngăn ngừa những căn bệnhnhư nhiễm trùng cuống họng, bệnh sốt gây đau nhức các khớp xương và các bệnh lây qua đường tìnhdục, v.v [1]

1.4 Cơ chế động của chất khảng sinh [3].

Khi một chất kháng sinh được đưa vào cơ thể, nó sẽ giết chết các vi khuấn gây bệnh Khángsinh diệt trùng bằng nhiều cách:

• ức chế sự thành lập vách tế bào: Ngăn cản sự tống họp thành của tế bào vi trùng như

Hĩnh 1.1: Penicillin G

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

• ức chế sự tổng họp protein: ức chế sự tổng họp protein của vi trùng như tetracyclin,aminoglycosides, macrolides (erythromycin ),

• ức chế sự tổng họp acid nucleic: ức chế sự tổng họp và hoạt động của acid nucleicnhư fluoroquinolones và rifampicin

Hình 14.1 So đó cơ chế tác dộng của cíc họ kliáng sinh chinh

ưc chế chưyển mù

•ddfofccTnr»«

«wf»:

m

Ciqpcr^d 1 !

c¿t c*;*\jV3*r<wo

MonctiACL

Mi C4<Nf^ệT SrMh

toVtm

c-‘ T4v

T*udó n« S

Pt»n

»o<ViuiltiV.“e

*»»nMA*JO

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Ví dụ về cơ chế của việc ức chế sự tổng hợp protein Aminoglycosides : Streptomycin

• GĐ 1 : Thuốc gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S

• GĐ 2 : Phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên trong quá trinh thành lập chuỗi peptid

• GĐ 3 : Thông tin mRNA bị đọc sai -> 1 acid amine không phù họp

• GĐ 4 : Làm vỡ các polysomes thành monosomes -> không có chúc năng tống họp protein Tetracyclines

• Thuốc gắn vào tiếu đơn vị 30 s / Ribo thế -> ngăn chặn các amino acid mới gắn vào chuỗi peptid mới đuợc

Kháng sinh chống lại vi khuấn bằng cách làm hu hại thành phần cấu tạo của chủng nhu lớp vỏ bảo vệ,màng trao đổi chất v.v Tuy nhiên, trong phuơng diện điều trị, nguôi ta quan tâm đến hai loại tác dụng: tác dụngdiệt khuấn và tác dụng kìm khuấn (kìm khuấn có khi còn đuợc gọi là hãm khuấn, trụ khuấn, tĩnh khuấn) Khángsinh diệt khuấn có tác dụng giết chết vi khuấn, còn kháng sinh kìm khuấn chỉ làm cho vi khuấn ngung phát triến,không sinh sản chú không bị tiêu diệt Kháng sinh kìm khuấn đuợc dùng khi cơ thế nguôi bệnh còn súc đề kháng,

hệ thống miễn dịch còn đủ mạnh đế tiêu diệt vi khuấn đã bị thuốc làm cho yếu đi Neu cơ thế nguôi bệnh quá yếu,bắt buộc phải dùng các loại kháng sinh diệt khuẩn

1.5 Phân loại thuốc khảng sinh [4],

• Nhóm ß lactam các penicilin: Penicilin, Methicilin, Ampicilline, Amoxicilline, Cloxacilline, Sultamicillin,Piperacilline, Imipenem

• Nhóm ß lactam các cephalosporin:

Thế hệ 1: Cefadroxil, Cephalexin, Cefalothin, Cephazolin Thế hệ 2: Cefaclor

Thế hệ 3: Cefixime, Ceftriaxone, Ccfuroximc, Cefixime, Ceftazidime, Cefotaxime, Celpodoxime

• Nhóm tetracyline: Tetracycline, Doxycyline, Clotetracyclin, Oxytetracyclin,

Minocyclin, hexacyclin

• Nhóm aminosid: Amikacin, Tobramycin, Neomycin, Gentamycin, Kanamycin, Streptomycin

• Nhóm macrolid: Azithromycin, Roxithromycin, Erythromycin, rovamycin, Clarithromycin, Spiramycin

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

• Nhóm 5-nitro-imidazol: Clotrimazole, Metronidazole, Tinidazole, Secnidazole, Miconazole, ornidazole

• Nhóm Sulfamid: Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol, Sulfadiazin, Sulfasalazin

1.6 Sản xuất thuốc khảng sinh

Hầu hết các kháng sinh đều đuợc làm từ vi khuấn và nấm

• Penicillin đuợc sản xuất từ nấm mốc, vi sinh vật

• Kháng sinh vancomycin từ xạ khuấn Streptomyces orientalis

• Cloramphenicol ban đầu đuợc phân lập từ Streptomyces venezuaelae, nay đuợc sản xuất bằngphuơng pháp tổng họp

1 7 Mặt trái của thuốc kháng sinh

Với nhiều tác dụng có ý nghĩa thục tiễn nhu thế vậy phải chăng việc sử dụng càng nhiều thuốc kháng sinh

sẽ càng đem lại nhiều tác dụng tích cục?

Cơ thể nguời thuờng bị du thuốc kháng sinh khi sử dụng không đủng thuốc hoặc do luợng kháng sinh còntồn du trong thục phấm Đe điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh đế chọn kháng sinh thích họp

Vì thiếu hiếu biết và vì tin tuởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nuớc đang phát trien, nguôi ta

đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đủng cách Lạm dụng hoặcchua hợp lý, dẫn đến những hậu quả khôn luờng Không những chi phí tiền thuốc tăng do sử dụng nhiều loại khángsinh đắt tiền mà còn làm nhiều loại kháng sinh mới dần dần bị vô hiệu hóa

Chất kháng sinh cũng có những phản úng phụ, tạo ra phản úng của cơ the đối với chất kháng sinhchang hạn nhu chửng ban đỏ và các triệu chửng khác có the gây ra những căn bệnh khác Phản úng trầm trọngnhất là dẫn tới tử vong Đôi khi, chất kháng sinh không có hữu hiệu đối với một số vi khuấn mầm bệnh

Phó khoa Vệ sinh Trung tâm Y tế dụ phòng TPHCM, khang định kháng sinh thuộc dạng hóa chất nênphần lớn không phân hủy đuợc trong môi truờng nhiệt độ nhu nấu nuớng

Theo một tài liệu của Bộ môn Công nghệ thục phấm, Đại Học Bách Khoa TP HCM, luợng kháng sinh tồn

du trong gia súc, gia cầm cao sẽ chuyến hóa protein thành các histamins gây chửng nhúc đầu cho nguời sử dụng.Nguời thuờng xuyên sử dụng gia súc, gia cầm nhiễm kháng sinh sẽ rất dễ bị “nhờn” thuốc, khi bị bệnh khó chữa trị

do luợng kháng sinh này sẽ tích tụ trong cơ the gây nên hiện tuợng vi khuấn thích úng với kháng sinh

Các loại kháng sinh này thuờng không bị phân huỷ và tồn lưu trong môi trường nuôi trồng thuỷ sản trongthời gian dài, khiến các loại vi khuấn thích nghi với môi trường có kháng sinh Ket quả là các loại vi khuấn gâybệnh trong thuỷ sản lại có khả năng kháng thuốc kháng sinhNeu kháng sinh được trộn lẫn vào thức ăn nuôi thuỷ

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Khoa chăn nuôi Thủ y ĐH Nông Lâm TP HCM mới đây đã tiến hành khảo sát tình hình sử dụngkháng sinh trong chăn nuôi và du luợng kháng sinh trong thịt ở các quầy kinh doanh gia súc, gia cầm Đa sốnguời chăn nuôi sử dụng kháng sinh không họp lý nhu liều luợng cao, sử dụng liên tục đế phòng ngừa bệnhcho gia súc đến khi nào bán đuợc Xét nghiệm các mẫu thịt đuợc lấy trục tiếp tại các chợ cho thấy có 26 loạikháng sinh đuợc phát hiện Trong đó loại đuợc sử dụng nhiều nhất là chloramphenicol (chiếm 15,35%),tylosin (15%), colistin (13,24%), norfloxacin (10%), gentamycin (8,35%), nhóm tetracylin (7,95%),ampicillin (7,24%) Trong đó, chloramphenicol là kháng sinh hiện đã bị cấm sử dụng trên nhiều quốc gia[14],

Trong 149 mẫu thịt gà đuợc kiếm fra, phân tích có đến 44,96% số mẫu có du kháng sinh vuợt quámúc quy định cho phép từ 2,5 đến 1.100 lần so với tiêu chuẩn ngành Trong đó, loại kháng sinhchloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất đến 87,50%, flumequin chiếm 83,33%, chlortetracyline chiếm62,50%, amoxillin chiếm 60% [14]

Do đó cần phải biết đuợc phuơng pháp xác định du luợng thuốc trong tục phẩm để hạn chế đuợcnhững tác dụng nguy hại từ những thục phẩm chửa du luợng thuốc kháng sinh quá tiêu chuẩn cho phép

Bảng 1.1: Danh mục chất kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sàn [11]

1 Aristolochia spp và các chế phấm từ chủng

Thúc ăn, thuốc thủ y, hoá chất,chất xử lý môi truờng, chất tayrửa khử trùng, chất bảo quản, kembôi da tay trong tất cả các khâusản xuất giống, nuôi trồng độngthục vật duới nuớc và luỡng cu,dich vu nghề cá và bảo quản, chếbiến

18 Gentian Violet (Crystal violet)

19 Nhóm Fluoroquinolones (cam sử dụng trong sản xuất, kinh doanh

thuỷ sản xuất khấu vào thị truờng Mỹ và Bắc Mỹ)

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Bảng 1.2 Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích một sổ khảng sinh cam [5]

1.8 Một so thuốc khảng sinh thường gặp

1.8.1 Thuốc kháng sinh họ fluoroquinolone [10].

Quinolone là một kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị nhiễm trùng ở người vàđộng vật Mục tiêu chính của chủng là vi khuấn the bacterial enzyme DNA gyrase hay topoisomerase II.Quinolone có thành phần hóa học là dẫn suất của acid nalidixic Dựa trên phố kháng khuấn của nó,quinolone được chia thành nhiều thế hệ như:

• Quinolone thế hệ thử nhất: cinoxacin, flumequine, nalidixic acid, oxilinic,

• Quinolone thế hệ thử hai: ciprofloxacin., enoxacin, fleroxacin, lomefloxacin

• Quinolone thế hệ thử ba: balofloxacin, gatifloxacin, grepafloxacin

• Quinolone thế hệ thử tư: garenoxacin, clinafloxacin, gemifloxacin Fluoroquinolone là một

nhóm kháng sinh thuộc họ quinolone trong đó có một

nguyên tử F gắn ở vị trí số 6 của hệ thống trung tâm Cả Quinolones và Fluoroquinolones đều là thuốckháng sinh có khả năng giết chết vi khuấn

a Công thức cấu tạo

Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chửa N, vị trí thử 4 có gắnnhóm ketone, vị trí thử 3 có gắn nhóm carboxylic Các dẫn suất của quinolone gồm những họp chất mà: Vịtrí 1: có the gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có the gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có the gắn thêm mộtnguyên tử N

TT Kháng sinh cấm1.Chloramphenicol Chỉ tiêu kiểm tra Giới hạn phát hiện tối thiểu EU Mỹ Nhật

1 -aminohydantoin (AHD)Semicarbazide (SEM)

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

Hĩnh 1.3 Cấu trúc cơ bản của nhóm Quinolone

b Tỉnh chat Acid - Base nhóm quinolone

Quinolone có một nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên đây là một hợp chất có tính acid Một số quinolone

có chửa thêm nhóm amine khác nên có thêm tính base Dựa vào pKa có thể chia nhóm quinolone thành hai loại:Acidic quinolone (AQ) và Piperazinyl Quinolone (PQ)

Acidic quinolone (AQ): chỉ có một giá trị pKa thuộc khoảng 6.0 đến 6.9 Trong nuớc chủng tồn tại ở dạngtrung hòa hoặc dạng anion Thuờng AQ gồm những Quinolone thuộc thế hệ thử nhất

Hĩnh 1.4 Cân bằng AcidBase của nhóm Acidic Quinolone

Piperazinyl quinolone (PQ): có hai giá trị pKa, pKal khoảng 5.5 - 6.6 và pKa2 khoảng 7.2 - 8.9 Trongnuớc chủng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ làDanofloxacin, Difloxacin, Norfloxacin, Ofloxacin, Benofloxacin, Marbofloxacin, Pipemidic acid

Hĩnh 1.5 Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl Quinolone

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

c Ciprofloxacin

Ciprofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi khuân gram

dương và gram âm

• Tên gọi: 1 - cyclopropyl - 6 - fluoro - 1,4 - dihydro - 4 - 0X0- 7 - 1 - piperazinyl 3 - quinolinecarboxylicacid

• Công thức hóa học: C19H22FN3O3

• Trọng lượng phân tử: 359.4 g/mol

• Nhiệt độ nóng chảy: 219 - 221°c

Hĩnh 1.6 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

• Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có hai giá trị pKa: khoảng 5 và

8 - 9

e Nguồn gốc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin trong thực pham

Ciprofloxacin và Enrofloxacin được đưa vào thịt gà, cá dưới dạng nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, hoặc

do người chăn nuôi trộn vào thức ăn gia súc, gia cầm, hoặc cho vào môi trường sống của các động vật thủy sản.Khi động vật ăn, hoặc sống trong môi trường đấy hoặc tiêm để chữa bệnh thì kháng sinh sẽ xâm nhập vào cơ thể

f Ưng dụng và ảnh hưởng của Ciprofloxacin và Enrofloxacin

Ciprofloxacin và Enrofloxacin được dùng làm kháng sinh cho người và động vật Hai loại kháng sinh nàyđược con người sử dụng khi mắc các chửng bệnh về đường hô hấp, nhiễm trùng huyết xương khớp, viêm nhiễm cơquan sinh dục Nhóm fluoroquinolone nói chung (Ciprofloxacin, Enrofloxacin nói riêng) là nhóm kháng sinh cóđộc tính cao, chỉ sử dụng với liều nhất định, được quy định rất chặt chẽ và đều thuộc nhóm kháng sinh hạn chế sửdụng đối với trẻ em vì ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng Nhóm fluoroquinolone nếu dùng liều cao và kéo dài

sẽ làm ảnh hưởng trên sụn đầu xương và quá trình tăng trưởng của bé chậm lại, bị lùn (Theo bác sĩ Đào Thị YenPhi- Trung tâm đào tạo - bồi dưỡng cán bộ y tế Tp HCM)

Trường họp tồn dư 5ppb fluoroquinolone, nếu một người ăn trung bình 150 - 200g thịưngày thì lượngfluoroquinolone đưa vào cơ thể khoảng 2pg/ngày Với lượng này sẽ không gây độc tính ngay, nhưng nếu tích lũylâu dài hoặc ăn quá nhiều sẽ bị tác hại

Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan cho vật nuôi các loại kháng sinh trong danh mục thuốc dùng cho người hoàntoàn có khả năng dẫn tới kháng thuốc ở vi khuấn Như vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng điều trị các bệnh lýnhiễm trùng trong cộng đồng loài người

1.8.2 Chloramphenicol [13]

a Lịch sử

Chloramphenicol là chất kháng sinh được phát hiện đồng thời do ba nhóm nghiên cửu độc lập với nhau:

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

đơn giản nhất và ngay từ khi phát hiện rất nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu sản xuất các chất khángsinh này Nhờ vậy chỉ trong vòng hai năm nguòi ta đã xác định đuợc cấu trúc phân tử và hiển khai thành công nghệsản xuất ra loại thuốc kháng sinh này

Hĩnh 1.8 Câng thức phân tử chung của họ chloramphenicol Trong đó :

Chloramphenicol là chất độc màu trắng hoặc có ánh vàng vàng, không mùi, vị rất đắng, ít tan trong nước,tan nhiều trong cồn và chất béo, dung dịch chloramphenicol bền vững trong môi trường hơi acid hay trung tính bền

vững với nhiệt chịu nhiệt độ đến 100°c.

c Tác hại của cloramphenicol

Khi sử dụng trong chăn nuôi, một phần kháng sinh chưa đào thải sẽ tồn dư sang sản phấm thực phấm gâynguy hại đến cơ thể con người và một lượng đáng kể trong thức ăn thừa sẽ thoát ra và lắng động vào môi trường,theo thời gian có thể dẫn tới các biến đối về hệ sinh thái Gây ô nhiểm môi trường, làm cho vật nuôi và cả conngười kháng lại thuốc khi sử dụng thục phẫm có nhiễm thuốc, làm cho các vi khuấn gây bệnh lờn thuốc, và như

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Chloramphenicol khi đi vào cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra “hội chứng xanh tím xám”, đặc biệt là trẻ sinhnon Trẻ bị xanh tái dần rồi trị tim mạch và tử vong Chloramphenicol còn ngộ độc cho tủy xương nếu dùng kéodài Ngoài ra chloramphenicol còn có thể gây suy tỷ, thiếu máu không hồi phục

Bị nhiễm kháng sinh thuộc nhóm chloramphenicol có the làm giảm bạch cầu, vàng da

Chloramphenicol không chỉ tiêu diệt vi khuấn gây bệnh đường ruột mà còn diệt luôn vi khuấn có lợi choruột gây tiêu chảy dẫn đến thiếu nước nghiêm trọng và làm xuất hiện các bệnh thiếu vitamin

Phơi nhiễm hóa chất độc hại trong lương thực, các mặt hàng thủy sản nuôi hồng (tôm, lươn, cá Basa )như chloramphenicol, nitrofuran vào cơ the con người sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ miễn nhiễm, làm mấtkhả năng kháng thuốc khi tích tụ lâu ngày và có khả năng gây đột biến, rối loạn nội tiết

d Sản xuất chloramphenicol

Cơ chế sinh tong hợp chloramphenicol:

Ngày nay người ta có khả năng phân lập được nhiều nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tống họp chất

kháng sinh thuộc họ chloramphenicol như: S t r e p t o m y c e s , N o c a r d i a , A r t h r o b a c t e r,

C o r y n e b a c t e r i u m ,

Trong đó các chủng có hoạt lực cao thường thuộc loài: Streptomyces venezuelae, S.omiyaensis Streptomycesphaeochromogenes, Streptsporangium viridogriseum và Corynebacterium hydrocarboclastus.

Do trong phân tử chloramphenicol có chửa vòng phenylpropenoid nên về cơ chế chất kháng sinh nàycũng

có the được tống họp qua các acid amin vòng, phenyl alanin, tyrosine

Trong môi trường nghèo vói muối nitrat là nguông thức ăn nito, sinh tống họp chloramphenicol được cảm ứng rõrệt mỗi khi bố sung vào môi trường một trong hai acid này Tuy nhiên hiệu ứng cảm ứng cũng xảy ra cả khi bốsung một so acid không vòng khác Đồng thời khi sử dụng nguồn dinh dưỡng đánh dấu 14 c, kết quả thực nghiệm

không tìm thấy bằng chửng hai acid amin vòng trên sản phấm trung gian cho quá trình sinh tống hợp Từ các dữliệu trên người ta cho rằng ở s v e n e z u e l a e , trong sơ đồ tống họp các acid amin vòng có đường rẽ nhánh sinh

tống hợp chloramphenicol tại vị trí acid shikimic

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

COOH

Hình 1.9 Sơ đồ tống hợp chloramphenicol từ acid shikimic

Lên men và tinh chế Chlorampenicol

Công nghệ lên men sản xuất Chloramphenicol được hoàn thiện chủ yếu cho đến thòi kì đầu thế kỷ XX

Từ khi công nghệ tống họp hóa học xuất hiện, với hiệu quả kinh tế cao hơn, đã dần thay thế hoàn toàn công nghệlên men Trong vài năm gần đây, việc áp dụng thành tựu và khoa học công nghệ mới đã mở ra hiến vọng hoànthiện công nghệ lên men sản xuất chloramphenicol với hiệu quả kinh tế có khả năng cạnh tranh được với phươngpháp tống họp hóa học

Đe lên men chloramphenicol người ta thường sử dụng các chủng có hoạt tính cao thuộc loài s.

CHCI2

I

0=c CH2OH

HN—CH HC-OH

CHC 12

I

0=c CH2OH

HN—CH HC-OH

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

amoniac, asparagin, glutamine Cảm ứng sụ phát triển sinh khối, nhưng không cải thiện hiệu quả tích tụ kháng sinh Trong khi bổ sung phanlalnine, locine hay izolocine xạ khuẩn tích tụ chậm nhưng cải thiện dược lượng kháng sinh tích tụ Trong việc sản xuất, với nguồn nitơ người

ta thường sử dụng nguyên liệu thay thế rẻ tiền hơn như: dạ dày lọn, nấm men thủy phân, dịch nấm men đồng thời cung cấp thêm chất khoáng.

Giống xạ khuấn được nuôi hoạt hóa thu bào tử, rồi cấy chuyền sang môi trường lỏng trong bình tam giác

và nuôi ở 25°c trong vòng 72h, tiếp theo cấy chuyền sang fermentor dung tích lon hơn đến khi đủ giống đế sản

xuất Quá trình sinh tống họp chloramphenicol xảy ra gần như đồng thời với sự phát trien sinh khối và phần lớnlượng kháng sinh được sinh tống họp và tích tụ trong pha cân bằng Với các chủng hoạt lực cao, nồng độchloramphenicol trong dung dịch thường đạt khoảng 130 - 150 mg/1 sau khoảng 3 ngày lên men Nồng độ

chloramphenicol được định lượng bằng phương pháp sinh hoạc (sử dụng s a r c i n a l u t e ) , phương pháp khử

vitamin hóa, phương pháp đo phổ hấp phụ cục đại ở 278nm, phương pháp sắc ký khí và hiệu quả nhất là phương

pháp HPLC

Ket thúc quá trình, dịch lên men được acid hóa nhẹ xuống pH = 4.0, lọc tách sinh khối, rồi điều chỉnh pHkiềm nhẹ (pH = 8.5 - 9.0) đế trích ly sang ethylacetat hay amin acetate Sau khi phân ly, dịch trích ly được cô chânkhong loại dung môi rồi hòa tan lại bằng dầu lửa Dung dịch này được rửa tiếp bằng dung dịch acid acetic, dungdịch natri bicacbonat loãng rửa nước và sau khi phaanly pha sẽ được cô chân không loại dầu lửa Sau khi rửa phầnkhông bay hơi còn lại (bằng ete dầu lửa đế loại lipid) người ta thu được bột chloramphenicol thô Bột kháng sinhthô này được hòa tan lại trong dung môi hữu cơ đế xử lý tay màu qua cột than hoạt tính hay cột nhôm trong nướcnóng, tay màu lại qua than hoạt tính, lộc, cô chân không rồi làm lạnh xuống nhiệt độ thấp đế kết tinh thuchloramphenicol dạng tinh the Đe đạt độ tinh sạch cao hơn, có the hòa tan và kết tinh lại trong ethylene dicloridehoặc trong dung môi hỗn họp ethel - ethel dầu lửa

1.8.3 Penicillin [13] a.

Lịch sử

Penicilin được tìm ra năm 1928 và được sử dụng trong lâm sàng lần đầu tiên vào năm 1941 Năm 1941,

penicilin G là kháng sinh có hiệu quả cao, thậm chí chống được hầu hết các chủng S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s

Tuy nhiên, đến năm 1947, phần lớn các các vi khuấn phân lập được trong bệnh viện đều biếu hiện tính khángpenicilin Trong một nỗ lực nhằm vào vấn đề này, các penicilin "bán tống họp" đã được trien khai Methicilin, một

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

Ngày nay, một số đáng ke E c o l i và H i n f l u e n z a e đả kháng ampicilin, và ampicilin không còn là liệu pháp hàng đầu chống lại N g o n o r r h e a nữa.

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

-2-penlenvlpenicillin (penicillin F) H 3 C-(CH 2 ) 4 - n-ainylpenici/lin (dihydrapenicillin F)

H 3 C-(CH 2 ) 6 -CO- n-heplylpenicilUn (penicillin K) HO O CH 2 - p-hydroxybenzvlpenicHlin (penicillin X)

Hình 1.10 Sảnphampenicillin lên men tự nhiên nhờ p.chrysogenum

Carbenicilin được cho phép sử dụng năm 1970 và là một penicillin bán tống phố rộng đầu tiên

Thuốc có hoạt tính cao chống lại các vi khuấn gam âm ở ruột và P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a Nhóm

penicilin này còn được gọi là các penicilinkháng pseudomonas và được chia theo cấu trúc thành 2 nhóm:Nhóm carboxypennicillin (ticarcillinvà carbenicillin) và nhóm acylureidopenicillin(piperacillin vàmezlocillin).Nhóm carboxypenicillin có tỷ lệ gây bất thường tiểu cầu và xuất huyết trên lâm sàng cao hơnnhóm acylureidopenicillin

b Cơ chế hoạt động

Đe đạt được hiệu quả, penicillin phải thấm qua màng tế bào và gắn với các protein gắn penicillin.Các protein gắn penicillin chịu trách nhiệm nhiều bước trong quá trình sinh tống họp của màng tế bào và cómặt trong hàng hăm đến hàng nghìn phân tử hên một tế bào vi khuấn

Các protein gắn penicillin rất khác nhau giữa các chủng vi khuấn Các kháng sinh beta - lactam cản trở việctổng hợp màng tế bào qua trung gian PBP, cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào Sự ly giải diễn ra qua trung gian

là các enzym tự ly giải thành tế bào vi khuấn (ví dụ: các autolysin)

Còn chưa rõ mối liên quan giữa các PBP và các autolysin, nhưng có lẽ kháng sinh beta - lactam gây cản trởbằng một chất ức chế autolysin

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

sulbactam, sẽ tái lập hoạt tính của penicillin chống lại vi sinh vật sản sinh beta - lactamase Tuy nhiên, các cơchế khác với sản sinh beta - lactam có vẻ là trung gian tạo ra tính kháng của Staph.aureus kháng methicillin

f Các đặc điếm phân biệt

Sự khác biệt rõ ràng giữa các penicillin bao gồm khác biệt trong phố hoạt động của chủng.Penicillin trong các muối và các dạng liều khác nhau, ampicillin, và amoxicillin có hoạt

Các phươngphéip xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram duơng và một số vi khuẩn kỵ khí Các chất này dễ bị beta-lactamase pháhuỷ và do đó không có hiệu quả chống tụ cầu và các vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase Ampicillin vàamoxicillin có hoạt tính chống lại một số vi khuẩn hiếu khí gram âm, nhung penicillin thì không Amoxicillin đãthay thế penicillin V làm loại penicillin lý tuởng để phòng viêm nội tâm mạc do sinh khả dụng ưu việt của nó

Methicillin, nafcillin, mezlocillin, và dicloxacillin là các chất giống hệt nhau ngoại trừ đường dùng củachủng Chủng có hoạt tính chống lại các vi khuấn hiếu khí gram âm, nhưng chủng được dành để điều trị nhiễm tụcầu Chủng không có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram âm

Carbenicillin, ticarcillin, mezlocillin và piperacillin có hoạt tính rộng chống lại các vi khuẩn hiếu khí gam

âm nhưng không có hiệu quả chống tụ cầu Các penicillin phổ rộng được sử dụng chủ yếu trong điều trị nhiễm

khuấn nghi ngờ hoặc biết chắc là do vi khuấn hiếu khí gram âm Đe chống lại P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ,

chủng thường được phối hợp với một aminoglycosid Trong số các penicillin phố rộng hay các penicillin khángpseudomonas, hiệu lực tương đối chống lại Pseudomonas là: Piperacillin > Mezlocillin = Ticarcillin >

Carbenicillin Trừ carbenicillin, các thuốc này được dùng ngoài đường tiêu hóa

g Các phản ứng có hại

Các phản úng có hại của penicillin bao gồm những phản úng có hại của tất cả các thuốc kháng sinh (như:nhờn thuốc, các phản úng quá mẫn) cũng như một số phản úng huyết học và thần kinh Nhiều, nhưng không phảitất cả các penicillin có liên quan với giảm bạch cầu trung tính và giảm tiếu cầu, và các carboxypenicillin có thế gâyrối loạn chúc năng tiếu cầu Khi dùng liều cao cho bệnh nhân rối loạn chúc năng thận, penicillin có thế gây ra cơn

co giật Methicillin có liên quan với viêm thận kẽ Được sử dụng đủng, các penicillin là những thuốc cực kỳ antoàn và hiệu quả

II Các phương pháp xác định hàm lượng chất kháng sinh trong thực pham

2.1 Dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elừa thông qua phân tích khắng định bằng LC MS/MS [5].

-2.1.1 Giới thiệu

Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC - MS, GC - MS/MS, LC - MS, LC

- MS/MS đều đáp úng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận Tuynhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và hình độ của kiếmnghiệm viên Do vậy nó không phù họp cho các phòng kiếm nghiệm qui mô nhỏ hay những phòng kiếm nghiệmcủa địa phương Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa hên phản úng giữa khángnguyên - kháng the (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu vàđược cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method).Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các

Các phương pháp xác định lượng dư thuốc khảng sinh trong thực phẩm

Từ năm 2002 đến nay, phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểmnghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Thú y Thuỷ sản vùng đối với các chỉ tiêu CAP, AOZ vàAMOZ Tất cả các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được kiểm tra khẳng định trên LC - MS/MS

Đe có cơ sở xem xét tính hữu dụng của các phép thử hên ELISA trong kiếm tra và chửng nhận chấtlượng thực phấm thuỷ sản, trong phạm vi báo cáo này, chủng tôi sẽ đưa ra những đánh giá về kết quả phân tíchCAP trên ELISA Nội dung của báo cáo sẽ xem xét đến hai vấn đề chính là tỉ lệ phát hiện dương giả trênELISA; và độ tương đồng kết quả kiếm nghiệm giữa hai phương pháp phân tích trên ELISA và LC-MS/MS.Ket quả đánh giá dựa trên số liệu thống kê kết quả phân tích tại phòng kiếm nghiệm của NAFIQAVED 4 - Tp

• Thủy sản khô các loại (242 mẫu)

• Chả giò, há cảo (125 mẫu)

• Mắm hải sản các loại (3 5 mẫu)

2.1.3 PhĩEĨEng pháp phân tích

a Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực nghiệm

• K í t t h ử E l i s a ' Kít thử của các hãng R-Biopharm và TAPB.

• Q u i t r ì n h c h u ấ n b ị m ẫ u : Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly hích bằng 6ml ethyl acetate.

Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50°c dưới dòng nitơ Cặn khô được hoà tan trong lml đệm và làm sạch

bằng lml hexan Hàm luợng CAP trong dịch chiết đuợc phân tích với kít thử ELISA

• Q u i t r ì n h t h ử n g h i ệ m v ớ i E L I S A : Qui trình xác định hàm lượng CAP trong dịch chiết hên

Elisa tuân thủ theo đủng hướng dẫn của nhà sản xuất Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫuchửng âm và chửng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm

• Giới hạn phát hiện: 0, lppb