Nghiên cứu tác dụng của thạch tùng răng cưa (huperzia serrata (thunb ) trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến rugose

Từ đó, mở ra những nỗ lực lớn trong nghiên cứu để cố gắng làmsáng tỏ các yếu tố di truyền gây ra hội chứng này [68].Các rối loạn di truyền đơn gen liên quan đến ASD Trong nhiều nghiên cứ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

-*** -TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG

RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.)

TREVIS) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ

MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI-2021

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG

RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.)

TREVIS) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ

MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

LỜI CẢM ƠN

Em muốn được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Phạm Thị Nguyệt

Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung ương, người thầy đã

truyền cảm hứng, trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như kinhphí để em thực hiện đề tài khóa luận này

Em muốn gửi lời cảm ơn tới ThS Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học cơ

sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội Cô đã cho em cơ hội đượcnghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lờikhuyên quý báu, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Em muốn gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Y Dược học cơ sở, cô chủnhiệm và các thầy cô bộ môn khác của Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia

Hà Nội, trong suốt khoảng thời gian 5 năm qua, đã cung cấp cho bản thân em rấtnhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợicho em trong quá trình học tập

Em xin cảm ơn tập thể các anh chị, cán bộ khoa Dược lý - Sinh hóa, ViệnDược liệu Trung ương đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trong quá trình thựcnghiệm, cũng như chia sẻ những kinh nghiệm quý giá ứng dụng thực tế

Cuối cùng, em xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đãluôn động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi em gặp khó khăn trong họctập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóaluận này còn có nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy côbạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 29 tháng 5 năm 2021

Sinh viên

Trương Thị Hoài Phương

MỤC LỤC MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về hội chứng tự kỷ 2

1.1.1 Khái niệm về hội chứng tự kỷ 2

1.1.2 Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ 2

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ 3

1.1.3.1 Yếu tố di truyền học 3 1.1.3.2 Yếu tố nguy cơ từ môi trường 5 1.1.4 Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ 6

1.1.5 Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ 7

1.1.6 Một số mô hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ 7

1.2 Tổng quan về ruồi giấm 8

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển 8

1.2.2 Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm 9

1.2.2.1 Đặc điểm bên ngoài của ruồi giấm 9 1.2.2.2 Hệ gen của ruồi giấm 9 1.2.2.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm 9 1.2.3 Mô hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ 10

1.3 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa 11

1.3.1 Tên gọi – vị trí phân loại 11

1.3.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng 12

1.3.3 Thành phần hoá học và tác dụng sinh học 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Dược liệu nghiên cứu 15

2.2 Đối tượng nghiên cứu 15

2.3 Hoá chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 15

2.3.1 Hoá chất 15 2.3.2 Dụng cụ, thiết bị 16 2.4 Thiết kế thí nghiệm 16

2.4.1 Căn cứ để chọn mức liều 2 mg/ml và 4 mg/ml 16

2.4.2 Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu 16

2.4.3 Thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu 18

2.4.4.Chia lô thí nghiệm 18

2.5 Phương pháp nghiên cứu 18

2.5.1 Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 18

2.5.1.1 Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm 18 2.5.1.2 Thử nghiệm đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành 19 2.5.1.3 Thử nghiệm đánh giá hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành 20 2.3.1.4 Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành 21 2.5.2 Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa đối với khả năng sống sót của ruồi giấm Rugose trưởng thành 22

2.6 Phân tích kết quả 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với ruồi giấm Rugose đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 24

3.1.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối vớikhả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hộichứng tự kỷ 24

3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh đối

với khả năng trèo của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 26

3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa tới khảnăng cải thiện mức độ tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành đột biến genmang hội chứng tự kỷ 28

3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh tới sựthay đổi nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự

kỷ 303.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa tới

khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) 5

Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái 9

Hình 1.3: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm 10

Hình 1.4: Cây Thạch tùng răng cưa 12

Hình 2.1: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng 19

Hình 2.2: Thiết kế thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng của ruồi giấm 21

Hình 2.3: Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor 22

Hình 2.4: Mô hình đánh giá mức độ cải thiện khả năng sống sót 23

Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ 24

Hình 3.2: Kết quả đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành bằng thử nghiệm leo trèo ở các thời điểm 3, 7, 10 ngày tuổi 26

Hình 3.3: Khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 28

Hình 3.4: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng hoạt động của ruồi giấm Rugose 30

Hình 3.5: Kết quả phân tích mức độ vận động tại thời điểm buổi sáng của ruồi giấm trong 6 ngày 31

Hình 3.6: Đồ thị phân tích khả năng sống sót 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder- ASD) là một rối loạn thần kinhphức tạp với những rối loạn về hành vi thường xuất hiện trong những năm đầu đời của trẻ,được đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng giao tiếp, tương tác xã hội kết hợp với nhữnghành vi, sở thích hoặc hoạt động hạn chế và lặp đi lặp lại [34] Gần đây, có nhiều sự thayđổi về nhận thức cũng như tiêu chuẩn chẩn đoán kết hợp với các yếu tố sinh học và môitrường, tỷ lệ tự kỷ đang gia tăng một cách nhanh chóng ở tất cả các quốc gia

[24].Nguyên nhân của tự kỷ đến nay vẫn chưa được xác định chính xác cũng nhưchưa có phương pháp hay thuốc điều trị đặc hiệu [11] Trong khi đó, các thuốc tândược hiện đang sử dụng mới chỉ giúp cải thiện triệu chứng, tuy nhiên, lại gây ra nhiềutác dụng không mong muốn nguy hiểm [32] Do đó, nhu cầu nghiên cứu phát triển cácloại thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu không hoặc có ít tác dụng không mong muốn

để hỗ trợ và điều trị hội chứng tự kỷ là rất cần thiết và đang được thế giới quan tâm

Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis họ

Thạch tùng (Thông đất) (Lycopodiaceae) Ở Việt Nam, cây mọc hoang dã tại một sốvùng núi cao từ 1000 m trở lên, như là Lào Cai, Cao Bằng,… Theo kinh nghiệm dângian, toàn cây Thạch tùng răng cưa được sử dụng để điều trị suy nhược thần kinh, mấttrương lực cơ, cầm máu [70] nhờ có các thành phần hoá học như alkaloid Huperzin

A, Triterpen, Flavoles, và những acid Phenoliques…[21]

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu thuốc từ dược liệu nói chung và Thạch tùng răngcưa nói riêng nhằm hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ còn rất hạn chế Do đó, chúng tôi

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata

(Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose” với hai

mục tiêu cụ thể sau:

Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm đột

biến gen mang hội chứng tự kỷ

thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa

(Huperzia serrata (Thunb.) Trevis).

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hội chứng tự kỷ

1.1.1 Khái niệm về hội chứng tự kỷ

Tự kỷ - “Autism” là tên gọi chứng rối loạn phát triển, đặc trưng bởi khiếm khuyết

về mặt thiết lập các mối quan hệ, tương tác với xã hội, do nhà tâm lý học Leo Kannerđặt ra vào năm 1943 [49] Chi tiết hành vi của nhóm trẻ mắc bệnh này được mô tả baogồm: "Thiếu quan hệ tiếp xúc về mặt tình cảm với người khác; các thói quen thườngngày rất giống nhau về tính cách kỳ dị và tỉ mỉ; không có ngôn ngữ nói hoặc ngôn ngữnói khác thường; rất thích xoay các đồ vật hình tròn; có kỹ năng mức cao về nhìn nhậnkhông gian hoặc giỏi trí nhớ "vẹt", hình thức bên ngoài có vẻ hấp dẫn, nhanh nhẹn,thông minh" [34, 35, 40, 55, 59]

Năm 1979, Lorna Wing đã đưa ra thuật ngữ “Rối loạn phổ tự kỷ” (tên tiếng anh

là “Autism Spectrum Disorder (ASD)”), do sự đa dạng triệu chứng biểu hiện [66].Ngày nay, một thuật ngữ khác nữa được gọi để chỉ nhóm các rối loạn phức tạpnày là “Hội chứng tự kỷ” Người ta chia rối loạn phổ tự kỷ thành 5 phân loại bao gồm:rối loạn tự kỷ, rối loạn Asperger, rối loạn Rett, rối loạn Disintegrative và rối loạn pháttriển lan toả không được chỉ định khác [8, 34]

Năm 2008, Liên hiệp quốc đưa ra khái niệm: “Tự kỷ là một dạng khuyết tật pháttriển tồn tại suốt cuộc đời, thường xuất hiện trong 3 năm đầu đời Tự kỷ là do rối loạn thầnkinh, gây ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của não bộ Tự kỷ có thể xảy ra ở bất cứ cánhân nào, không phân biệt giới tính, chủng tộc hoặc điều kiện kinh tế - xã hội Đặc điểmcủa tự kỷ là những khiếm khuyết về tương tác xã hội, giao tiếp ngôn ngữ, phi ngôn ngữ và

có hành vi, sở thích, hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại” Đây được coi là kháiniệm tương đối đầy đủ và được đưa vào sử dụng phổ biến nhất

Những khiếm khuyết liên quan đến ASD hiện diện trong suốt cuộc đời và đượccoi là có tác động đáng kể về mặt chức năng, xã hội và tài chính đối với các cá nhân bịảnh hưởng, gia đình và xã hội [23]

1.1.2 Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ

Theo thống kê mới nhất của Tổ chức Y tế Thế giới WHO (2021), người ta ướctính rằng trên toàn thế giới cứ 270 người thì có một người mắc ASD Ước tính này đạidiện cho một con số trung bình và tỷ lệ hiện mắc được báo cáo khác nhau đáng kể giữacác nghiên cứu Tuy nhiên, một số nghiên cứu được kiểm soát tốt đã báo cáo nhữngcon số cao hơn đáng kể Tỷ lệ mắc ASD ở nhiều quốc gia có thu nhập thấp và trungbình vẫn chưa được biết rõ [65]

Tỷ lệ trẻ em mắc ASD ngày càng tăng ở mọi quốc gia Một công bố của Trungtâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) vào năm 2014 đã cho biết tỷ lệrối loạn phổ tự kỷ là 1/68, tức cứ 68 trẻ thì có 1 trẻ mắc ASD, tăng 30% so với năm

và điều trị ngày càng tăng lên, nếu tính theo cách tính của Tổ chức Y tế Thế giới, con

số này ước chừng 500000 người [1] Nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và cộng sự năm

2019 cho thấy: tỷ lệ mắc ASD ở trẻ 18-30 tháng tuổi ở miền Bắc Việt Nam là khoảng75.2/10000 trẻ Tỷ lệ mắc ASD ở trẻ em được tìm thấy trong nghiên cứu này khá tươngđồng với tỷ lệ mắc ASD trung bình trên thế giới với tỷ lệ khoảng 0.76% Cũng trongnghiên cứu này, kết quả cho thấy những trẻ em sống ở thành phố có tỷ lệ mắc rối loạnphổ tự kỷ cao hơn trẻ em sống ở nông thôn Mức độ đô thị hóa ngày càng tăng, dẫnđến trẻ có nguy cơ mắc hội chứng càng cao hơn Một điểm đáng lưu ý nữa là tỷ lệ mắcASD cao hơn ở những trẻ có mẹ làm nông nghiệp Phát hiện này cho thấy có thể cómối quan hệ giữa ASD và thực hành canh tác, đặc biệt là việc sử dụng thuốc bảo vệthực vật phổ biến ở Việt Nam [31]

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ

Nguyên nhân gây ra rối loạn phổ tự kỷ hiện vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ

Vì rối loạn rất phức tạp và không có hai người mắc chứng tự kỷ giống hệt nhau nên có

lẽ có nhiều nguyên nhân gây ra hội chứng này Các bằng chứng khoa học hiện có chothấy có thể có nhiều yếu tố khiến trẻ có nhiều khả năng mắc ASD, bao gồm các yếu tố

về môi trường và di truyền

1.1.3.1 Yếu tố di truyền học

Theo một nghiên cứu về khả năng di truyền của các rối loạn phổ tự kỷ năm 2015,tiền sử gia đình là một trong những yếu tố đáng chú ý làm tăng khả năng mắc ASD Ướctính có từ 64% đến 91% rủi ro là do tiền sử gia đình có người mắc hội chứng [8]

Mặc dù, đã chỉ ra rằng ASD có nguyên nhân đa yếu tố phức tạp, nhưng các nghiêncứu song sinh đã chứng minh được có sự đóng góp mạnh mẽ về mặt di truyền Các nghiêncứu về sự liên hệ giữa tỷ lệ tự kỷ với các anh chị em trong gia đình có trẻ tự kỷ cho thấy,trong các trẻ sinh đôi cùng trứng, khi có một đứa trẻ bị tự kỷ thì nguy cơ mắc chứng tự kỷcủa đứa trẻ còn lại có thể lên tới 70-90% Tỷ lệ này ở trẻ sinh đôi khác trứng

chỉ khoảng 30% và 3-19% ở anh chị em nói chung Hơn nữa, tỷ lệ là gấp đôi giữa cácanh chị em cùng huyết thống so với các anh chị em cùng mẹ khác cha Những kết quảnày đã cung cấp bằng chứng cho thấy yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong sựphát triển của ASD Từ đó, mở ra những nỗ lực lớn trong nghiên cứu để cố gắng làmsáng tỏ các yếu tố di truyền gây ra hội chứng này [68].

Các rối loạn di truyền đơn gen liên quan đến ASD

Trong nhiều nghiên cứu, các rối loạn đơn gen đã được phát hiện xuất hiện đồngthời với ASD Một số được báo cáo phổ biến nhất là bệnh xơ cứng củ và hội chứngFragile X, ít gặp hơn là bệnh Phenylketon niệu và hội chứng Smith-Lemli-Opitz Tỷ lệASD gặp trong các rối loạn này cũng tăng lên nhưng không tìm thấy ở tất cả các cá thểmang đột biến [25]

Nguyên nhân dẫn đến hội chứng Fragile X là sự mở rộng của bộ ba nucleotid

CGG lặp lại trong vùng 5’ chưa được dịch mã của gen Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) [28] Biết rằng hai trong bốn loại nucleotid là Adenin và Cytosin có thể bị methyl hóa, do đó, sự mở rộng này dẫn đến sự siêu methyl hoá promoter của FMR1 và

đi kèm với đó là sự ức chế phiên mã [61] Trong khi 1-3% trẻ em được chẩn đoán tự

kỷ có hội chứng Fragile X thì khoảng 18-33% số trẻ mắc hội chứng Fragile X có hành

vi tự kỷ [34]

Phức hợp xơ cứng củ - Tuberous Sclerosis Complex (TSC) là một chứng rốiloạn di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi các khối u lành tính trongnão và nhiều mô, cơ quan khác, chứng động kinh và suy giảm nhận thức TSC là do

đột biến gen TSC1 hoặc TSC2 mã hóa hamartin và tuberin tương ứng Tỷ lệ hiện mắc

ASD ở TSC được ước tính nằm trong khoảng từ 36% đến 50% [61]

Nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen

Các nhà khoa học đã phát hiện được nhiều gen liên quan đến hội chứng tự kỷkhi nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen và phân tích toàn bộ vùng mã hoá Chúng cóchức năng và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như phiên mã và tái cấutrúc sợi nhiễm sắc, tổng hợp và phân huỷ protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương

tế bào và hình thành các synap thần kinh (Hình 1.3) [14, 25, 61, 68].

Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) với các

chức năng sinh học khác nhau [61].

Các nghiên cứu di truyền gần đây đã xác định gen Neurobeachin (NBEA) là gen

đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của ASD Gen này bị phá vỡ ở bệnhnhân mắc chứng tự kỷ vô căn [67] Báo cáo ban đầu cho thấy đột biến chuyển đoạn

nhiễm sắc thể với điểm đứt gãy trên gen NBEA là nguyên nhân dẫn đến tự kỷ vô căn ở

trẻ nam [13, 62] Kết quả một nghiên cứu năm 2009 còn cho biết đột biến mất đoạn

gen này cũng liên quan đến hội chứng tự kỷ [48] NBEA mã hóa protein neo A-kinase

(AKAP) liên kết với tiểu đơn vị điều hòa của protein kinase A (PKA), được xác định làprotein đặc hiệu của tế bào thần kinh, có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển

não Các nghiên cứu trên mô hình động vật chỉ ra vai trò của NBEA trong nhiều quá

trình của tế bào như cấu tạo võng mạc, trao đổi và giải phóng các chất dẫn truyền thầnkinh qua màng tế bào, tham gia duy trì trí nhớ ngắn hạn [61, 62]

1.1.3.2 Yếu tố nguy cơ từ môi trường

Các yếu tố môi trường có thể đóng vai trò nhất định trong cơ chế bệnh sinhASD Một số đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp đã mô tả các yếu tố nguy cơtrước khi sinh và chu sinh, cũng như các yếu tố chế độ ăn uống và lối sống của bà mẹ

Trong nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã chỉ ra tuổi cha và tuổi mẹ cao cóliên quan độc lập tới nguy cơ mắc ASD Điều này cũng làm tăng nguy cơ mắc ASD ởđời con [19]

Các yếu tố trước khi sinh bao gồm tình trạng trao đổi chất của mẹ, tăng huyết áp,tiểu đường thai kỳ, chảy máu khi mang thai hoặc tiền sử gia đình mắc bệnh tự miễn cũng

có liên quan đến nguy cơ mắc ASD và chậm phát triển kết hợp Hơn nữa, nguy cơ gia tăngcũng được tìm thấy đối với trẻ sinh ra đầu tiên so với trẻ sinh ra thứ ba trở lên [26].

Nhiễm trùng tử cung có liên quan đến sự gia tăng đáng kể nguy cơ mắc bệnh tự

kỷ Mối liên hệ giữa nhiễm trùng của mẹ trong thời kỳ mang thai và sinh con với nguy

cơ tự kỷ cũng được củng cố bởi các kết quả trên mô hình động vật Nhiễm virus thai

kỳ kích hoạt phản ứng miễn dịch của mẹ, có thể gây ảnh hưởng tới sự phát triển não bộcủa thai nhi [30]

Một số phân tích gộp được đề cập gần đây cho thấy quá trình phơi nhiễm vớithuốc trong thời kỳ mang thai có thể làm tăng nguy cơ tự kỷ với trẻ được sinh ra

[26].Phơi nhiễm trước khi sinh với Valproat đã được xác nhận là một trong những yếu

tố nguy cơ đối với ASD, đặc biệt là trong ba tháng đầu của thai kỳ [16] Thai nhi tiếpxúc với Valproat có nguy cơ mắc ASD cao gấp 8 lần [40] Đối với thuốc chống trầmcảm, bao gồm các chất ức chế tái hấp thu serotonin có chọn lọc, các nghiên cứu đượckiểm soát tốt cho thấy không có rủi ro không rõ ràng [40], mặc dù có ý kiến cho rằngviệc tiếp xúc với thuốc chống trầm cảm khi mang thai làm tăng nhẹ nguy cơ mắc ASD,đặc biệt là trong 3 tháng đầu

1.1.4 Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ

ASD có thể ảnh hướng tới sự phát triển sớm của não và tái tổ chức thần kinh Hiệnnay, vẫn chưa có dấu ấn đặc hiệu để chẩn đoán ASD do vậy việc xác nhận chẩn đoán ASDvẫn phải dựa trên đánh giá rối loạn hành vi được ghi trong cẩm nang thống kê và chẩnđoán rối loạn tâm thần của Hiệp hội Tâm thần Hoa Kỳ (DSM-5), được xuất bản năm 2013[10] Trẻ mắc hội chứng này thường biểu hiện sự suy giảm và bất thường

lặp lại Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm việc xuất hiện của ít nhất 3 dấu hiệucủa sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp đi lặp lại các hành vi cóphản ứng quá mức Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng giao tiếp baogồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm khuôn mặthay ngôn ngữ cơ thể Các hành vi của trẻ có tính lặp đi lặp lại và dập khuôn Trẻ khônghứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội Trẻ tự kỷ cũng có những thiếu hụttrong khả năng học tập và nhận thức, thiếu hụt ngôn ngữ, động kinh, bất thường vậnđộng, lo lắng và các vấn đề về đường tiêu hóa [45, 61] đi kèm với rối loạn giấc ngủ vàthay đổi nhịp sinh học [51] Ngoài ra, DSM-5 nhận định rằng ASD có thể đi kèm vớicác rối loạn khác, bao gồm các rối loạn di truyền (ví dụ, hội chứng Fragile X) và cácvấn đề về sức khoẻ tâm thần (ví dụ, rối loạn tăng động giảm chú ý - Attention deficithyperactivity disorder - ADHD) [40]

1.1.5 Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ

Hiện nay, bệnh nhân được chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ có thể tiếp cận với haiphương thức điều trị là: dùng thuốc hoặc không dùng thuốc:

Với hướng điều trị không dùng thuốc, các phương pháp can thiệp đã được pháttriển và nghiên cứu để điều chỉnh hành vi cho trẻ nhỏ Những can thiệp này có thể làmgiảm các triệu chứng, cải thiện khả năng nhận thức, kỹ năng sống hàng ngày và tối đahóa khả năng hoạt động và tham gia vào cộng đồng của trẻ Liệu pháp quản lý hành viđược sử dụng để cố gắng củng cố các hành vi mong muốn và giảm các hành vi khôngmong muốn Trị liệu hành vi thường dựa trên phân tích hành vi ứng dụng (ABA) đãđược chấp nhận rộng rãi giữa các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và được sử dụngtrong nhiều trường học và phòng khám điều trị Sự tiến bộ của trẻ được theo dõi và đolường theo thời gian trị liệu thông qua các bảng kiểm tra hành vi và ngôn ngữ [71]

Với hướng điều trị bằng thuốc, hiện tại, chưa có loại thuốc nào có thể điều trịtriệt căn cho rối loạn phổ tự kỷ Nhưng vẫn có một số loại thuốc đã được chứng minh

là có thể hỗ trợ điều trị một số triệu chứng liên quan đến ASD, đặc biệt là một số hành

vi nhất định Risperidon và Aripiprazol thuộc nhóm thuốc chống loạn thần đã được xácnhận là có thể cải thiện các triệu chứng khó chịu hoặc kích động ở trẻ em và thanhthiếu niên mắc ASD Phần lớn trẻ em sử dụng hai loại thuốc này được cải thiện về việccáu kỉnh và kích động, bao gồm gây hấn, tự gây thương tích và các hành vi gây rốikhác Nhưng cả hai loại thuốc này cũng có thể gây ra tác dụng không mong muốn, baogồm an thần và tăng cân, làm tăng nguy cơ mắc các vấn đề sức khỏe sau này Một vàiloại thuốc như Methylphenidat, Atomoxetin và Guanfacin thường được sử dụng đểđiều trị rối loạn tăng động giảm chú ý (ADHD), cũng cho thấy lợi ích đối với các triệuchứng ADHD ở khoảng 25% trẻ mắc ASD Tuy nhiên, với mỗi loại thuốc này, khảnăng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn ở những người mắc ASD lại cao hơn sovới những người mắc ADHD nói chung [40]

Các chuyên gia cũng khuyến cáo việc sử dụng thuốc điều trị cho bệnh nhânASD cần thận trọng, nên ưu tiên cho các phương pháp điều trị có nguy cơ thấp hơn,bao gồm các can thiệp về hành vi hoặc tâm lý xã hội [33]

1.1.6 Một số mô hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ

Trong thập kỷ qua, các mô hình động vật bao gồm các loài linh trưởng, loàigặm nhấm (điển hình là chuột) và ruồi giấm đã góp phần không nhỏ trong việc nghiêncứu để tìm hiểu đặc tính, chức năng của các gen liên quan đến ASD

Tìm hiểu các mô hình loài gặm nhấm cho nghiên cứu ASD, nhìn chung có 2 loại

mô hình chính là mô hình di truyền và mô hình không di truyền [61] Các mô hình di

truyền ASD gây ra ở chuột có thể được thiết lập bằng cách nhắm mục tiêu vào các gen

tương đồng của chuột với các gen có liên quan tới ASD ở người như FMR1, NBEA,

Cụ thể, chuột đực bị loại bỏ gen FMR1 có biểu hiện thiếu tương tác xã hội, sự hiếu

động và suy giảm nhận thức Những điều này là tương đồng với các triệu chứng tự kỷ

ở người NBEA đơn bội có thể gây ra rối loạn chức năng nhận thức và kiểu hình giống ASD, bao gồm những thiếu hụt trong hành vi xã hội, phản ứng sợ hãi có điều kiện, học

tập không gian và trí nhớ ở chuột [61]

Mặt khác, các mô hình tự kỷ không di truyền trên chuột cũng được nhiều nhà khoahọc trên thế giới nghiên cứu Các mô hình này được gây ra do phơi nhiễm trước khi sinhvới các tác nhân hóa học như Axit Valproic (VPA), Thalidomid và Ethanol trong khi mangthai, nhiễm virus hoặc viêm [61] Trong số các yếu tố này, phơi nhiễm VPA, một loạithuốc chống động kinh và ổn định tâm trạng dùng cho bệnh nhân khi mang thai có thể làmtăng đáng kể tỷ lệ ASD ở con sinh ra [17, 44] Nghiên cứu lâm sàng đã xác định các yếu tốnguy cơ liên quan đến việc sử dụng VPA, bao gồm dị tật bẩm sinh, chậm phát triển, giảmchức năng nhận thức và tự kỷ Hội chứng tự kỷ do VPA gây ra có thể do khiếm khuyếttrong sự phát triển tế bào thần kinh của tiểu não, hệ limbic và thân não gây ra sự gián đoạntrong kết nối synap giữa các tế bào thần kinh [61]

Bên cạnh đó, trong những năm gần đây, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiêncứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mô hình để mô phỏng chứng rối loạn tự kỷ ởngười với mục tiêu xác định được tác động của các yếu tố về gen, môi trường đến cáchành vi, biểu hiện, khả năng vận động, các thay đổi về nhịp sinh học của ruồi giấm.Một số gen có liên quan và đã được sử dụng để gây mô hình ruồi giấm tự kỷ trên thế

giới như: gen Rugose, dFMR… [61] Việc tổng hợp nhiều dữ liệu nghiên cứu sử dụng

mô hình ruồi giấm biến đổi gen cho hội chứng tự kỷ cũng góp phần xác định được vai

trò của các nhóm gen liên quan, làm sáng tỏ cơ chế phân tử của ASD

1.2 Tổng quan về ruồi giấm

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển

Ruồi giấm có tên khoa học Drosophila melanogaster thuộc họ Drosophilidae, là

sinh vật được sử dụng trong lĩnh vực di truyền học từ đầu những năm 1900 Nó phân bố

hình được sử dụng rộng rãi không chỉ trong di truyền học cổ điển và phân tử, mà cònvới nhiều kỹ thuật sinh hóa, sinh học tế bào và sinh lý học mới, để nghiên cứu các vấn

đề đòi hỏi cách tiếp cận đa ngành, chẳng hạn như sinh học phát triển và sinh học thầnkinh [22, 54]

1.2.2 Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm

1.2.2.1 Đặc điểm bên ngoài của ruồi giấm

Ruồi giấm có màu vàng nâu với các vòng đen ngang bụng Con cái trưởngthành có kích thước dài khoảng 2.5 mm, con đực nhỏ hơn với phần bụng sẫm màu Dễdàng phân biệt được con đực và con cái nhờ sự khác nhau về màu sắc với mảng đen rõrệt ở bụng [42]

Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái [18].

1.2.2.2 Hệ gen của ruồi giấm

Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 139.5 triệu cặp base gồm khoảng 17000 genphân bố trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặpnhiễm sắc thể giới tính trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể Sự đơn giản này

là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sửdụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [7, 50]

1.2.2.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm

Vòng đời của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởngthành Một con ruồi cái có thể đẻ tới 2000 trứng trong suốt cuộc đời của nó Trứng sau khithụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 18-24h Phôi này, sau đó, lột xác 2 lần qua bagiai đoạn ấu trùng khác nhau trước khi hoá nhộng và trải qua quá trình biến thái, cuốicùng, trở thành ruồi giấm trưởng thành Ở 25°C, sự phát triển để thành một con ruồitrưởng thành chỉ mất khoảng 10 ngày kể từ khi xảy ra hiện tượng thụ tinh Tuổi thọ trungbình của ruồi giấm trưởng thành khi là khoảng 60-70 ngày [22, 29, 50]

Hình 1.3: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm [22].

1.2.3 Mô hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ

Năm 2015, tác giả Wise và cộng sự đã nghiên cứu và xác định được mối liên quan

giữa đột biến gen Rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện của

rối loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm [67] Nghiên cứu khác cũng cho thấy các đột biến

mất chức năng của gen Rugose thể hiện cấu trúc synap bất thường ở ấu trùng và khiếm

khuyết trong các tương tác xã hội và suy giảm vận động ở ruồi trưởng thành

[67].Những phát hiện này chỉ ra rằng đột biến gen Rugose biểu hiện các đặc điểm kiểu hình tương tự như ASD ở con người Do đó, sử dụng ruồi giấm đột biến gen Rugose có

thể là một mô hình phù hợp để nghiên cứu ASD, đồng thời qua đó, chúng ta có thể

hiểu biết rõ ràng hơn về vai trò của gen NBEA trong rối loạn phổ tự kỷ ở người.

Với những ưu điểm của mình, ruồi giấm (Drosophila melanogaster) đã được

đưa vào sử dụng trong lĩnh vực di truyền học rất sớm từ những năm đầu thế kỉ XX:

hiện có khoảng 60% gen tương đồng với bộ gen của người, khoảng 75% các gen bệnh

ruồi giấm trong nghiên cứu ít vấp phải các vấn đề liên quan đến đạo đức trong nghiêncứu y sinh học hơn

thành), đẻ trứng nhiều (có thể tới 100 trứng/ngày) nên cho phép có thể tạo ra lượng lớnruồi trong một thời gian ngắn, nghiên cứu nhiều thế hệ trong vòng vài tuần [7, 29]

không gian khi làm thí nghiệm

trong sàng lọc dược chất và thuốc

- Dễ dàng và an toàn khi gây mê ruồi giấm Hơn nữa, hình thái ruồi cũng rất dễ nhận biết khi được gây mê.

chỉ có

tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [29]

Sử dụng ruồi giấm làm đối tượng nghiên cứu, T.H Morgan – cha đẻ của môhình này đã phát hiện ra quy luật di truyền liên kết gen và liên kết giới tính, từ đó, đặtnền móng cho di truyền học hiện đại Đến ngày nay, đã có rất nhiều công trình nghiêncứu sử dụng ruồi giấm để xây dựng mô hình nghiên cứu bệnh trên người Trong đó, cócác bệnh thoái hóa thần kinh, ví dụ các mô hình ruồi giấm chuyển gen mã hóa cácprotein gây bệnh Alzhermer như β- amyloid, Tau, … [60]

Với nhiều ưu điểm đã được ghi nhận, kết hợp yếu tố dễ quan sát và định lượng,

chúng tôi quyết định sử dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen Rugose để nghiên cứu tác

dụng sinh học và đánh giá khả năng kéo dài tuổi thọ của cao chiết cồn TTRC

Mặc dù, có nhiều lợi thế cho việc sử dụng D melanogaster để nghiên cứu các

bệnh ở người, nhưng vẫn tồn tại một số nhược điểm :

người

Tóm lại, việc sử dụng D melanogaster làm sinh vật mẫu rất tốt vì nhiều lý do,

nhưng chúng cũng có những nhược điểm chưa thể khắc phục Thế nhưng, mô hình sửdụng ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ này vẫn rất quan trọng khi cungcấp được những bằng chứng khoa học làm tiền đề tiếp tục đánh giá tác dụng điều trị tự

kỷ của các dược liệu Việt Nam trên mô hình động vật thực nghiệm trong thời gian tới

1.3 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa

1.3.1 Tên gọi – vị trí phân loại

Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.

thực vật: Ngành: Thạch tùng (Lycopodiophyta);

Lớp: Thạch tùng (Lycopodiopsida);

Bộ: Thạch tùng (Lycopodiales);

Họ: Thông đất (Lycopodiaceae) [69] hoặc Huperziaceae [21];

Chi: Huperzia;

Loài: H Serrata.

1.3.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng

Cây thân đứng, mọc ở đất cao từ 10-40 cm, thân đơn hay lưỡng phân 1-2 lầnhình trụ, đường kính khoảng 2mm Lá hình bầu dục đầu nhọn, dài 15 mm, rộng 3 mm;phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cưa Túi bào tử ở nách lá,hình thận, màu vàng tươi [5]

Hình 1.4: Cây Thạch tùng răng cưa [3].

1: Ảnh chụp tại thực địa; 2: Phần ngọn của cây; 3: Lá; 4: Túi bào tử mọc ở nách lá; 5,6: Túi bào tử đã mở; 7: Túi bào tử hình thận.

Cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt

đá, đất mùn ở dưới tán rừng quanh năm ẩm ướt, độ mùn cao, ở độ cao 1000m so vớimặt nước biển Loài thực vật này được biết nhiều ở Trung Quốc dưới tên gọi là QianCeng Ta, trong các bài thuốc chữa bệnh như: cầm máu, lợi tiểu… Còn ở các nướcphương Tây, đặc biệt là Hoa Kỳ, Thạch tùng răng cưa được sử dụng như thức ăn bổtrợ, bán rộng rãi trên thị trường Loại cây này hiện nay còn được nghiên cứu nhiều vớitác dụng tăng cường trí nhớ và điều trị bệnh Alzheimer Ở Việt Nam, cây Thạch tùngrăng cưa được tìm thấy nhiều ở Sapa (Lào Cai) và Đà Lạt (Lâm Đồng) [6]

Bộ phận dùng là phần thân cây trên mặt đất, có thể dùng tươi hoặc sấy khô đểbảo quản lâu dài [69]

1.3.3 Thành phần hoá học và tác dụng sinh học

Một số thành phần hoá học có tác dụng dược lý trong Thạch tùng răng cưa gồmalkaloid Huperzin A, Triterpen, Flavoles, và những acid Phenoliques Trên thế giới córất nhiều nhóm nghiên cứu đã tách chiết được các thành phần hoạt tính này

Nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc phân lập được 2 alkaloid là Huperzin A vàHuperzin B Các nghiên cứu tiếp theo phân lập được các alkaloid: Huperzin E và F,Huperzin G, Huperzin I, Huperzin J, Huperzin K và Huperzin L, Huperzin R, Huperzin

P, Huperzin Q và N-oxyhuperzin Q, Huperzin S, T và U, Huperzin O, Huperzin W,Huperzin B [21]

Chang-Heng Tan và cộng sự đã phân lập được 9 alkaloid: Huperzin P,Fawcettimin và Phlegmariunin B Huperzin Q N-oxyhuperzin Q serratadin, 6f-hydroxycerratadin, 4f-hydroxyserratadin và 4f,6f-dihydroxycerratidin, Phlegmariurin

B, 2f- hydroxyphlegmariurin B, 2-oxyphlegmariuni B và 11-oxophlegmariurin [58]

Nhóm nghiên cứu tại Nhật Bản đã phân lập được 17 alkaloid:

Lycoposerramin-C, -D, -E, -P, -Q, -S, -U Lycoposerramin-G, -H, -I, -J, -K, -M, -N, -O [57]

Kazuaki Katakawa và cộng sự phân lập được 8 alkaloid: Lycothunin, Serratin,Serratanidin, 11alpha-hydrofawcettidin, 2alpha,11alpha-dihydroxy-fawcettidin,

8alpha-hydroxylycothunin Sau đó nhóm tiếp tục phân lập được 7 alkaloid khác từ cây gồmLycoposerramin-R, -T, dẫn chất N-methyl và N-formyl của Lycoposerramin-T, -N-dimethyl-beta-obscurin, lycodin và fawcettimin [36]

Trong nhóm các alkaloid, thành phần hoá học có tác dụng lên hoạt động của hệthần kinh, tác dụng hướng thần hoặc chống lại chứng mất trí nhớ là Huperzin A [6]

Huperzin A có tên khoa học là

(1R,9S,13E)-1-amino-13-ethylidene-11-methyl-6-azatricyclo[7.3.1.0 2,7 ]trideca-2(7),3,10-trien-5-one Huperzin A được tìm thấy trong

phần chiết ra của loài Thạch tùng răng cưa là một alkaloid có khả năng ức chế mạnhenzym Acetylcholinesterase (AChE) nên sự có mặt của Huperzin A làm giảm lượngenzym AChE có trong não Nhờ đó, hàm lượng Acetylcholin tăng lên làm cải thiện trínhớ cho bệnh nhân Một số báo cáo lâm sàng cũng nhận định Huperzin A tạo điều kiệndẫn truyền thần kinh cholinergic bằng cách tăng nồng độ Acetylcholin trong hệ thầnkinh trung ương có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh [6, 21]

Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu cũng cho thấy Huperzin A có vai trò như mộtchất bảo vệ thần kinh Nó hoạt động như một chất chống oxy hóa và tăng cường hoạt độngcủa các enzym chống oxy hóa não khác, ngăn ngừa tác hại của các gốc tự do trong tế bàonão và tăng tuổi thọ của tế bào não Điều này có liên quan đến khả năng điều

chỉnh biểu hiện của apoptotic protein, hỗ trợ ty thể tế bào não – trung tâm năng lượngchính mỗi tế, bảo vệ não khỏi độc tính của glutamat bằng cách hoạt động như một chấtđối kháng thụ thể NMDA và điều chỉnh chuyển hoá protein tiền thân beta-amyloid(beta-amyloid ảnh hưởng đến mức ATP trong ty thể và làm rối loạn các chức năng cóthể dẫn đến các bệnh như Alzheimer) [21].

Ngoài ra, khả năng chống viêm của Huperzin A cũng được đề cập trong nhiềunghiên cứu Nó được báo cáo là có hoạt tính chống viêm như các chất ức chế AchEkhác, đồng thời, cũng có khả năng ngăn chặn một số phản ứng viêm như tăng sinh tếbào T và sản xuất cytokin [21]

Tuy nhiên, trên thế giới, Huperzin A chưa có nhiều nghiên cứu trên mô hìnhruồi giấm, mà chủ yếu được nghiên cứu trên chuột Và kết quả cho thấy Huperzin Acòn có các tác dụng khác như chống ung thư, chống co giật …[21] Điều đó có nghĩakhi thử nghiệm trên ruồi giấm cũng có thể cho kết quả tương tự

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Dược liệu nghiên cứu

Cao chiết cồn 90% từ toàn cây TTRC (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis ) với

hiệu suất chiết 5.18%

Nguồn gốc: TTRC do khoa Tài Nguyên - Viện Dược liệu thu hái, sau đó được

khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu tách chiết tổng hợp và cung cấp Mẫu nghiên cứu

được lưu và bảo quản tại Phòng Tiêu bản - Khoa Tài Nguyên, Viện Dược Liệu

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) trong các giai đoạn của chu kỳ phát triển

do giáo sư Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản

Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản với điều kiện phòng thí

nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ

2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

2.3.2 Dụng cụ, thiết bị

ăn, nuôi ấu trùng

2.4.1 Căn cứ để chọn lựa mức liều 2mg/ml và 4mg/ml

Chúng tôi đã tiến hành dò liều trên một dải nồng độ từ 1 mg/ml đến 10 mg/ml

Dựa vào khả năng sống sót và mô hình tương tác cộng đồng của ruồi trưởng thành với

từng nồng độ trên dải, chúng tôi nhận thấy nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml là phù hợp để

đưa vào nghiên cứu chính thức

2.4.2 Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu

Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái 1:1 các cặp bố mẹ chủng Rugose để tạo dòng ruồi

tự kỷ và chủng Canton-S để tạo dòng ruồi đối chứng sinh lý Chủng ruồi lai tạo được

chia thành các nhóm như sau:

Nhóm sinh lý: Ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong

môi trường thức ăn cơ bản

Nhóm mang hội chứng tự kỷ: Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và

nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản

Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm Tất cả ruồi mang gen nghiên cứu đều được nuôi

nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ Các chủng ruồi saukhi lai tạo được kiểm tra ngẫu nhiên kiểu gen và đột biến gen tại Bộ môn Y Sinh học ditruyền, Trường Đại học Y Hà Nội để đảm bảo chủng ruồi dùng triển khai mô hình làchính xác

Thành phần thức ăn (cho 500 ml)

Thành phầnĐường

Nấm menSữa bộtAgarAcid PropionicAcid Benzoic 20%

hoặc Natri Benzoate20%

Quy trình chuẩn bị thức ăn

lăn tăn trong 10 phút

khuấy đều Bổ sung thêm nước nóng đủ 500 ml, khuấy đều

trong 1 tháng)