28 6 NGHIÊN cứu CÔNG NGHỆ sản XUẤT nước UỐNG có KHẢ NĂNG CHỐNG OXY hóa từ cây lá ĐẮNG (VERNONIA AMYGDALINA)

Đề tài nghiên cứu về nước giải khát có chất chống oxy hóa từ nguyên liệu cây lá đắng hay còn gọi là cây mật gấu, tổng quan về chất chống oxy hóa và các gốc tự do, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, phương pháp phân tích và xác định hàm lượng chất chống oxy hóa ở sản phẩm cuối

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ÁNH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG

CÓ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA TỪ CÂY LÁ

3 Nguyễn Thùy Trang 2005130101

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT

⊠ Khóa luận tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp

1 Những thông tin chung: Họ và tên sinh viên được giao đề tài (Số lượng sinh viên: 03) La Thị Hiền MSSV: 2005130112 Lớp:04DHTP4 Nguyễn Thùy Trang MSSV: 2005130101 Lớp:04DHTP4 Trần Thị Minh Nhung MSSV: 2005130127 Lớp:04DHTP4 Tên đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất nước uống có khả năng chống oxy hóa từ cây lá đắng (Vernonia amygdalina). 2 Nhận xét của giảng viên hướng dẫn: - Về tinh thần, thái độ làm việc của sinh viên:

- Về nội dung và kết quả nghiên cứu:

- Ý kiến khác:

3 Ý kiến của giảng viên hướng dẫn về việc SV bảo vệ trước Hội đồng:

TP Hồ Chí Minh, ngày…tháng …năm 2017

GVHD

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong bài báo cáo là do tôi thực hiện dưới sựhướng dẫn của cô Đỗ Mai Nguyên Phương Các kết quả nghiên cứu và các kết luậntrong bài báo cáo này là trung thực, không sao chép từ bất cứ một nguồn nào và dướibất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn vàghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả bài báo cáo

(Ký tên và ghi rõ họ tên)

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Polyphenol là một nhóm hợp chất tự nhiên rất phổ biến trong thực vật được quantâm nhiều do chúng có đặc tính chống oxy hoá và khả năng kháng khuẩn mạnh có thể

ứng dụng nhiều trong dược phẩm cũng như thực phẩm Đề tài “Nghiên cứu công nghệ

sản xuất nước uống có khả năng chống oxy hóa từ cây lá đắng (Vernonia amygdalina)” được thực hiện nhằm tạo ra sản phẩm mới với khả năng chống oxy hóa

đáp ứng thị hiếu của người tiêu dùng hiện nay

Đề tài nghiên cứu tập trung trên hai quá trình chính là xử lý nguyên liệu và trích

ly để thu được hàm lượng polyphenol tổng (TPC), flavonoid tổng (TFC) và khả năngkháng oxy hóa (DPPH) cao nhất

Khảo sát xử lí nguyên liệu gồm nhiệt độ sấy (50oC, 60oC, 70oC, 80oC), thời giansấy (2h, 3h, 4h, 5h) và kích thước nguyên liệu (<0.3mm, 0.3 ÷ 0.5mm, 0.5 ÷ 1mm,

>1mm) Kết quả là nguyên liệu được sấy ở 60oC trong 4h còn giữ được hàm lượngpolyphenol tổng cao nhất (615.709 ± 34.296 mg GAE/100g (p<0.05), mẫu sấy đượcnghiền và rây đạt kích thước 0.3 ÷ 0.5mm cho TPC cao nhất 630.244 ± 15.327

mg GAE/100g (p<0.05)

Khảo sát quá trình trích ly lá đắng (Vernonia amygdalina) bằng dung môi nước

gồm nhiệt độ, thời gian và tỉ lệ nguyên liệu: dung môi Mẫu lá đắng được trích ly ởnhiệt độ (50oC, 60oC, 70oC, 80oC, 90oC), thời gian (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 phút) và

tỉ lệ nguyên liệu: dung môi (1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50) Nghiên cứu chỉ ra rằng, điều

kiện trích ly lá đắng (Vernonia amygdalina) ở 70oC trong 40 phút với tỉ lệ 1:30 sẽ chokhả năng trích ly cao nhất về 3 hàm mục tiêu TPC, TFC và DPPH (lần lượt là 451.784

± 1.995 mg GAE/100g, 41.735 ± 0.791 mg QE/100g, 96.536 ± 2.920 ppm VitC).Cuối cùng, dịch trích lá đắng được đem đi xây dựng công thức phối chế để tạosản phẩm nước giải khát Tỉ lệ nước (1:2, 1:3, 1:4, 1:5) và hàm lượng đường (7oBx,

8oBx, 9oBx, 10oBx) lần lượt được khảo sát và đánh giá cảm quan sau mỗi thí nghiệm.Kết quả dịch trích lá đắng phối trộn với tỉ lệ nước là 1:3 và 8oBx là cho chất lượng cảmquan tốt nhất

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp là một mốc son quan trọng, đánh dấu sự trưởng thành củasinh viên về mặt kiến thức Để hoàn thành tốt đề tài khóa luận này, ngoài sự nổ lực củabản thân, chúng em được sự hỗ trợ từ phía gia đình, sự giúp đỡ của thầy cô và bạn bè.Với lòng kính trọng và biết ơn chân thành, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến toànthể các thầy cô giáo trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm Thành phố Hồ ChíMinh, các thầy, các cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm đã tạo điều kiện cho chúng emđược học tập và nghiên cứu, cung cấp những kiến thức và kinh nghiệm thực tiễn đểchúng em có vốn tri thức vững vàng trước khi rời khỏi ngôi trường đại học Chúng emxin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô phụ trách trung tâm thí nghiệm thực hành đãtạo điều kiện cho chúng em thực hành và hoàn thành tốt khóa luận

Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Mai Nguyên Phương,

Cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho chúng em gần ba tháng thực hiện, để có thểhoàn thiện được bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp này

Trong quá trình tìm hiểu tài liệu, tổng hợp có những điểm còn thiếu sót, em kínhxin Thầy, Cô góp ý để bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp được hoàn thiện hơn, đồngthời cũng giúp chúng em có thêm những kinh nghiệm bổ ích để có thể thực hiện tốtnhững bài báo cáo, đồ án sau này Do kiến thức của em vẫn còn bị giới hạn và thờigian làm bài ngắn nên không tránh khỏi những sai sót Mong Thầy, Cô chấp nhận và

bỏ qua

Em xin cảm ơn gia đình- những người thân đã luôn bên em, ủng hộ về mặt tàichính và động viên tinh thần em trong những lúc khó khăn để hoàn thành tốt khóaluận

Em xin chúc quý thầy cô và các bạn sinh viên dồi dào sức khỏe và thành công

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2017

Sinh viên thực hiện

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về cây lá đắng 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 3

1.1.3 Thành phần hóa học trong cây Lá đắng 5

1.1.4 Thành phần một số hoạt chất trong cây lá đắng 6

1.1.5 Công dụng của lá đắng 7

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây lá đắng (Vernonia mygdalina) 8

1.2.1 Nghiên cứu trong nước 8

1.2.2 Nghiên cứu ngoài nước 8

1.3 Tổng quan về gốc tự do 9

1.3.1 Khái niệm về gốc tự do 9

1.3.2 Đặc điểm gốc tự do 10

1.3.3 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể 11

1.3.4 Tác hại của gốc tự do 13

1.4 Tổng quan về chất chống oxy hóa 14

1.4.1 Chất chống oxy hóa và cơ chế của nó 14

1.4.2 Phân loại chất chống oxy hóa 15

1.4.3 Chất chống oxy hóa có bản chất là enzyme 16

1.4.4 Chất chống oxy hóa có bản chất phi enzyme 17

1.5 Tổng quan về quá trình trích ly 23

1.5.1 Bản chất của quá trình trích ly 23

1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình trích ly 24

1.5.3 Các phương pháp trích ly 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.2 Nguyên liệu – Hóa chất – Thiết bị 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 29

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tiền xử lý nguyên liệu bằng phương pháp sấy đối lưu 30 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu trích ly hợp chất polyphenol bằng phương pháp ngâm

dầm 30

2.3.4 Phương pháp đánh giá cảm quan 30

2.3.5 Phương pháp phân tích 30

2.3.6 Phương pháp xử lý thống kê 30

2.4 Nội dung nghiên cứu 30

2.4.1 Lựa chọn nguyên liệu lá đắng 31

2.4.2 Khảo sát nguyên liệu 32

2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sấy: 33

2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly 36

2.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly: 37

2.4.6 Khảo sát xây dựng công thức phối trộn cho sản phẩm 43

2.4.7 Đề xuất quy trình tạo sản phẩm nước giải khát từ lá đắng 47

2.4.8 Phân tích thành phần hóa lý, cảm quan, vi sinh cho sản phẩm 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50

3.1 Lựa chọn nguyên liệu 50

3.2 Khảo sát nguyên liệu 51

3.2.1 Khảo sát độ ẩm 51

3.2.2 Khảo sát độ tro 52

3.2.3 Xác định hàm lượng chất chống oxy hóa trong lá đắng 52

3.3 Sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sấy 54

3.3.1 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sấy 54

3.3.2 Sự ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sấy 56

3.4 Sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly 57

3.5 Sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly 58

3.5.1 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly 58

3.5.2 Sự ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly 59

3.5.3 Sự ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu: dung môi đến quá trình trích ly 61

3.6 Xây dựng công thức phối trộn cho sản phẩm 63

3.6.1 Khảo sát tỉ lệ dịch trích: nước phối trộn 63

3.6.2 Khảo sát hàm lượng đường bổ sung 65

3.7 Quy trình công nghệ sản xuất nước giải khát từ lá đắng 66

3.8 Phân tích thành phần hóa lý, cảm quan, vi sinh cho sản phẩm 72

3.8.1 Phân tích thành phần hóa lý của sản phẩm 72

3.8.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm cuối 72

3.8.3 Kiểm tra vi sinh sản phẩm 74

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾM NGHỊ 75

4.1 Kết luận 75

4.2 Kiến nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

PHỤ LỤC 83

PHỤ LỤC 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU (PHƯƠNG PHÁP FOLIN – CIOCALTEAU) 83

PHỤ LỤC 2: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP DPPH (1,1 – DIPHENYL – 2 – PICRYLHYDRAZYL) 86

PHỤ LỤC 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU 89

PHỤ LỤC 4: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRO TỔNG (TCVN 5105-90) 92

PHỤ LỤC 5: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ẨM 93

PHỤ LỤC 6: PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN – CHO ĐIỂM THỊ HIẾU 94

PHỤ LỤC 7: ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN SẢN PHẨM (TCVN 3215 – 79) 96

PHỤ LỤC 8: SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 100

PHỤ LỤC 9: HÌNH ẢNH THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 119

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ TH

Hình 1.1 Hình ảnh của Vernonia amygdalina 4

Hình 1.2 Hình ảnh về gốc tự do 9

Hình 1.3 Quá trình hình thành gốc tự do 11

Hình 1.4 Các tác nhân gây ra gốc tự do 12

Hình 1.5 Gốc tự do tấn công tế bào 13

Hình 1.6 Phân loại chất chống oxy hóa 16

Hình 1.7 Các vùng cấu trúc đảm bảo khả năng chống oxy hóa của polyphenol 18

Hình 1.8 Cấu trúc cơ bản của flavonoids 20

Hình 1.9 Cấu trúc phân lớp của flavonoids 21

Hình 1.10 Cơ chế hoạt động của flavonoids 22

Hình 1.11 Sự giống nhau về cấu trúc của flavonoid và xanthine 22

Hình 2.1 Lá đắng được làm sạch, để ráo 26

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 29

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn nguyên liệu lá đắng 31

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol tổng 33

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sấy 35

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly 36

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly 38

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly 40

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu: dung môi đến quá trình trích ly 42

Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ dịch trích: nước phối trộn thích hợp 44 Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát hàm lượng đường bổ sung 45

Hình 2.12 Sơ đồ quy trình đề xuất tạo sản phẩm nước giải khát lá đắng 47

Hình 3.1 Hàm lượng polyphenol tổng (a), Hàm lượng flavonoid tổng (b) trong các loại lá nguyên liệu 50

Hình 3.2 Hàm lượng polyphenol tổng, hàm lượng flavonoid tổng trong nguyên liệu 53

Hình 3.3 Hàm lương polyphenol tổng của một số loại thực vật ở Việt Nam 53

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol tổng (a) và độ ẩm (b) của V amygdalina 54

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian sấy đến hàm lượng polyphenol tổng (a) và độ ẩm (b) của V amygdalina 56

Hình 3.6 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol tổng của

dịch trích ly V amygdalina 57

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng (a), hàm

lượng flavonoid tổng (b), hoạt tính kháng oxy hóa (c) của dịch trích ly V amygdalina

58Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng (a), hàm

lượng flavonoid tổng (b), hoạt tính kháng oxy hóa (c) của dịch trích ly V amygdalina

60Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu: dung môi trích ly đến hàm lượngpolyphenol tổng (a), hàm lượng flavonoid tổng (b), hoạt tính kháng oxy hóa (c) của

dịch trích ly V amygdalina 62

Hình 3.10 Kết quả thí nghiệm được xử lý theo phương pháp phân tích phương sai(ANOVA) bằng phần mềm Microsoft excel 63Hình 3.11 Kết quả thí nghiệm được xử lý theo phương pháp phân tích phương sai(ANOVA) bằng phần mềm Microsoft excel 65Hình 3.12 Quy trình sản xuất nước giải khát từ Lá đắng 67

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Hàm lượng chất khoáng có trong 100g V amygdalina 5

Bảng 1.2 Bảng hàm lượng vitamin và acid amin trong 100g V amygdalina 6

Bảng 1.3 Các gốc tự do trong cơ thể sinh học 10

Bảng 1.4 Các lớp polyphenol và các đại diện tiêu biểu của nó 19

Bảng 2.1 Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 3.1 Bảng kết quả độ ẩm của lá đắng 51

Bảng 3.2 Bảng độ tro của nguyên liệu 52

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá cảm quan tỉ lệ dịch chiết: nước bổ sung 63

Bảng 3.4 Sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu 64

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá cảm quan hàm lượng đường bổ sung 65

Bảng 3.6 Sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu 66

Bảng 3.7 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm 72

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm cuối 73

Bảng 3.9 Các chỉ tiêu vi sinh 74

MỞ ĐẦU

Trong nhịp sống hiện đại ngày nay, vệ sinh an toàn thực phẩm là mối lo ngại củahầu hết mọi người do đó bên cạnh việc ăn ngon, mặc đẹp thì vấn đề sức khỏe luônđược quan tâm hàng đầu Như chúng ta đã biết, nguyên nhân sâu xa của nhiều cănbệnh nguy hiểm là sự mất cân bằng trong việc hình thành các gốc tự do Ở nồng độcao chúng thúc đẩy oxy hóa, phân hủy đại phân tử DNA, protein, gây ra các bệnh vềtim mạch, huyết áp, là một trong những nguy cơ phát triển ung thư [1] Mặc dù cơ thể

có hệ thống các enzyme bảo vệ khỏi sự oxy hóa nhưng các hệ thống này có thể không

đủ bảo vệ cơ thể trong quá trình oxy hóa nghiêm trọng [2]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất trong thực vật có hoạt tính chốngoxy hóa, chế độ ăn có nguồn gốc thực vật giúp làm giảm nguy cơ của một số bệnhthoái hóa [3] Một số thực phẩm trên thị trường được bổ sung các chất chống oxy hóatổng hợp nhưng việc sử dụng các hợp chất này có nhiều hạn chế do đó chất chống oxyhóa tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật với hoạt tính chống oxy hóa cao càng được quantâm [4]

Cây lá đắng (Vernonia amygdalina) ở Châu Phi được sử dụng như một loại rau

hoặc một loại gia vị súp đắng và được dùng như một loại thuốc [5] Theo một số báo

cáo, Vernonia amygdalina là một phương thuốc dân gian giảm đau, chống khuẩn,

chống giun và viêm (Dahanukar và cộng sự, 2000) Năm 1995, Igile và cộng sự báocáo về sự hiện diện của flavonoid, [6] Năm 2004, Tona và cộng sự cũng xác nhận sự

có mặt của flavonoid trong cây này [7] Có thể thấy, Vernonia amygdalina giàu chất

chống oxy hóa tự nhiên và là một nguyên liệu mới, tiềm năng để khai thác và nghiêncứu

Việc sản xuất nước giải khát chứa các hợp chất chống oxy hóa đang là hướng đimới sẽ đáp ứng được nhu cầu sử dụng các loại sản phẩm có hoạt tính sinh học của

người tiêu dùng Với những lí do trên, đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất nước

uống có khả năng chống oxy hóa từ cây lá đắng (Vernonia amygdalina)” được thực

hiện nhằm đưa ra những thông số phù hợp cho quá trình trích ly và thu được hoạt chấtchống oxy hóa.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình sản xuất nước uống có khả năng chống oxy

hóa từ cây lá đắng với những thông số phù hợp

Nội dung nghiên cứu:

Khảo sát nguyên liệu: độ ẩm, độ tro, hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng.Khảo sát điều kiện xử lý nguyên liệu: nhiệt độ sấy, thời gian sấy, kích thước nguyênliệu

Khảo sát điều kiện trích ly

- Khảo sát nhiệt độ trích ly

- Khảo sát thời gian trích ly

- Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

Đánh giá hiệu quả trích ly của dung môi nước

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các mẫu dịch trích

Nghiên cứu công thức phối trộn sản xuất sản phẩm

Đánh giá cảm quan sản phẩm thành phẩm

Phân tích thành phần hóa, lý, cảm quan và vi sinh cho sản phẩm

Mục tiêu kinh tế - xã hội: Xây dựng quy trình sản xuất nước uống giàu hàm

lượng polyphenol, tăng khả năng chống oxy hóa từ nguồn nguyên liệu thiên nhiênnhằm đa dạng hóa nguồn sản phẩm nước giải khát hiện nay là vấn đề có ý nghĩa khoahọc, có giá trị thực tiễn và tính xã hội cao

Mục tiêu khoa học công nghệ: Xây dựng được quy trình sản xuất và khảo sát

khả năng chống oxy hóa của cây lá đắng (Vernonia amygdalina).

Chi (genus): Vernonia Schreb

Loài (Species): Vernonia amygdalina

Tên khác: Cây mật gấu, cây kim thất tai (Việt Nam); bitter leaf (tên tiếngAnh); Ewuro (Ibdan, Nigeria); Etidot (bang Cross River của Nigeria),…

Chi Vernonia Schreb có chừng 1000 loài, trong đó hơn 500 loài phân bố chủ yếu ở

châu Phi và châu Á, xấp xỉ 300 loài ở Mexico, Trung và Nam Mỹ và 16 loài được tìmthấy ở Mỹ

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Đặc điểm thực vật cây lá đắng (Vernonia amygdalina) 2n = 40 [9]:

Dạng cây bụi mọc thẳng đứng, cao từ 1.5÷3m, đường kính thân rất nhỏ khoảng 2÷4

cm, cây thường phân nhánh ở cành gốc, khi còn non thân cây được phủ một lớp lôngtrắng mịn về già lớp lông này rụng dần hết [8]

Lá mọc cách, có hình dáng và kích thước khác nhau, hình mũi mác hoặc hình ovan,kích thước 3÷17 x 1.3÷7 cm, mép lá hình răng cưa, bề mặt lá hơi bóng có lớp lông mịn[8] Cuống lá thường rất ngắn nhưng có thể dàn đến 1÷2 cm [10]

Hoa lưỡng tính, có hình dáng nhỏ, màu trắng kem, dài khoảng 10 mm, gộp thành cụmdày đặc có đường kính khoảng 15 cm nhưng không dễ thấy; có hương thơm, đặc biệtvào buổi tối [10]

Hạt: nhỏ, có lông bao xung quanh hạt và trên đỉnh có một bó lông dài [10] Vernonia

amygdalina thường không sản sinh ra hạt giống trong điều kiện bình thường và thường

được nhân giống bằng cách giâm cành [8]

Hình 1.1 Hình ảnh của Vernonia amygdalina

a Cây Vernonia amygdalina; b,c Hoa Vernonia amygdalina; d Lá Vernonia

amygdalina [8]

V amygdalina mọc tự nhiên dọc theo sông và hồ, ở các ranh giới rừng, trong rừng và

đồng cỏ lên tới độ cao 2800 m, ở các vùng có lượng mưa trung bình hàng năm là

750÷2000 mm V amygdalina đòi hỏi ánh sáng mặt trời đầy đủ và thích môi trường

ẩm ướt Nó phát triển trên tất cả các loại đất nhưng thích đất giàu mùn [10]

1.1.3 Thành phần hóa học trong cây Lá đắng

Vernonia amygdalina chứa 21 đến 23% vật chất khô Trong chất khô, chứa từ 6.5 đến

29.2% chất xơ và 0.137% chlorophyll V amygdalina chứa 17÷33 g/100g chất đạm

thô và 2÷15 g/100g chất béo (trong đó có 24.54% chất béo bão hòa và 65.45% chấtbéo không bão hòa, acid oleic là acid béo không bão hòa chủ yếu trong lá) Do có hàm

lượng cao chất đạm thô, V amygdalina được xem là nguồn cung cấp protein tuyệt vời.

Hàm lượng tro từ 10÷13 g/100g cho thấy hàm lượng khoáng chất hữu ích có trong câynày [8]

Bảng 1.1 Hàm lượng chất khoáng có trong 100g V amygdalina [11]

và giá trị iodine cao (35 mg/100g) [11], chính vì vậy nó như một loại rau phổ biến ởChâu Phi và có tiềm năng trong điều trị bệnh bướu cổ Lá tươi chứa 280 đến 354mg/100g vitamin C Tuy nhiên, nồng độ vitamin C bị ảnh hưởng bởi tính chất của đất(thường xuyên sử dụng phân bón) [8]

Bảng 1.2 Bảng hàm lượng vitamin và acid amin trong 100g V amygdalina [11] [12]

1.1.4 Thành phần một số hoạt chất trong cây lá đắng

Ngoài các chất chuyển hóa thông thường và khoáng chất, một loạt các chất hóa thực

vật cũng được báo cáo có trong V amygdalina, cụ thể như sau:

Nhóm Stigmastane- hợp chất steroid glucoside:

Vernoniosides là một trong những chất chính thuộc nhóm steroid glucoside được tìm

thấy trong V amygdalina bao gồm: vernoniosides A1, A2, A3, B1[13], A4, B2, B3

[14], C, D và E [15] được phát hiện có trong lá Trong đó, nhóm vernoniosides A làmcho lá có vị đắng [13]

Sesquiterpene lactones:

Sesquiterpene lactones là một nhóm hóa thực vật khác được phát hiện có nhiều trong

lá của loài này Các chất sesquiterpene lactones xác định được là vernolide;vernodalol; vernolepin; vernodalin; vernomenin, vernomygdin, vernolic;hydroxyvernolide; 11, 13 - dihydrovernodalin; 11, 13 - dihydrovernorodeline; 4, 15 -dihydrovernodalin; 7, 24 (28) - stigmastadien-3-ol và 1, 2, 4, 15, 11, 13, 2’, 3’ -octahydrovernodalin [16] [17] [18]

Flavonoids:

Theo báo cáo của Igile và cộng sự (1994) [6] có sự hiện diện của flavonoids: luteolin,

luteolin 7-O-β-glucoroniside và luteolin 7-O-β-glucoside trong lá của V amygdalina.

Hợp chất dồi dào nhất là luteolin 7-O-β-glucoside

Ngoài ra, Tona và cộng sự (2004) [7] xác nhận sự hiện hữu của các hóa thực vật khác

có trong lá V amygdalina là terpenes, coumarin, lignans, phenolic acids, xanthones và

anthraquinones Izevbigie (2003) [19] báo cáo sự hiện diện của chất peptides sinh hoạt

tố gọi là edotides trong lá của cây V amygdalina.

1.1.5 Công dụng của lá đắng

Ở Chây Phi, lá của nó chủ yếu được sử dụng như một loại rau hoặc như một loại gia vịsúp, đặc biệt phổ biến là món súp lá đắng Loài cây này có chứa các thành phần hóahọc hoạt động phức tạp có ý nghĩa dược học, do đó nó được dùng như một loại thuốc

có thể ngăn ngừa một số bệnh nhất định Theo một số báo cáo, Vernonia amygdalina

là một phương thuốc dân gian chữa bệnh sốt rét, nhuận trường, thuốc bổ đường tiêuhoá, thuốc giảm đau [20] Rễ và lá được sử dụng trong y học dân gian để sơ cứu vếtthương, nấc, các vấn đề về thận và khó chịu dạ dày [21] Ngoài ra, tính chống chảy mồhôi, chống nấm, hạ đường huyết và hạ lipid máu của cây này cũng đã được báo cáo[21]

Theo báo cáo của Dahanukar và cộng sự (2000) chiết xuất từ lá đắng đã được báo cáo

là có khả năng kháng khuẩn cao và có hoạt tính chống oxy hóa, chống ung thư, khángvirut, chống giun và viêm [22]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây lá đắng (Vernonia

mygdalina)

1.2.1 Nghiên cứu trong nước

Ở nước ta mặc dù lá đắng được biết đến và sử dụng rộng rãi trong dân gian như mộtbài thuốc nhưng vẫn chưa có một nghiên cứu lâm sàng nào cũng như chưa có một sảnphẩm từ loại cây này

1.2.2 Nghiên cứu ngoài nước

Cây lá đắng (Vernonia mygdalina) được sử dụng để ăn, sau khi nghiền và rửa sạch có

thể loại bỏ hoàn toàn vị đắng (Mayhew và Penny, 1998) [23, 24] Nhiều hoạt tính sinhhọc được báo cáo hiện diện trong dịch chiết (Fafunso và Basir, 1977; Akah và Okafor,1992) [25] như flavonoids, alkaloids, terpenoids, saponin, tannins và cardiacglycosides, và tất cả các bộ phận của cây đều có tác dụng dược lý Cả rễ và lá đềuđược sử dụng như hóa chất thực vật để điều trị sốt thương hàn, nấc, bệnh về thận, bộithực dạ dày, những loại bệnh khác (Gill, 1992; Hamoiona và Saffaf, 1994) Tính chấtchống giun sán và ký sinh trùng (Abosi và Raserika, 2003) cũng như khả năng chốngung thư (Izevbigie và cộng sự, 2004) từ chiết xuất của loại cây này Ngoài ra còn tácđộng hạ đường huyết và giảm lipid máu nghiên cứu trên các con vật (Akah và Okafor,1993; Nwanjo, 2005) Thêm vào đó là khả năng ức chế của dịch chiết nước lá lên sự

phát triển của vi khuẩn gram (+) Staphylococcus aureus và vi khuẩn gram (-)

Escherichia coli (Fred O.J Oboh và Honeybell I.Masodje, 2009) [23] Flavonoids được

báo cáo là chất chống oxy hóa, chống dị ứng, chống viêm, kháng khuẩn và khả năngchống ung thư Tính chất oxy hóa cao của flavonoids kết hợp với các chấtphytochemical khác vốn có trong lá đắng đã tạo ra nhiều lợi ích chữa bệnh như trên

V.amygdalina có vị đắng là do các chất chống oxy hóa như alkaloids, saponins, tanin

và glycoside đã được xác định trong nhiều nghiên cứu [26]

Bên cạnh nhiều nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng, các hợp chất có trong cây lá

đắng Vernonia mygdalina cũng như tác dụng dược lý thì các quá trình tiền xử lý và

phương pháp trích ly các hợp chất từ loại cây này là một mối quan tâm lớn Ảnh

hưởng của quá trình xử lý lên hàm lượng dinh dưỡng của lá V.mygdalina theo nghiên

cứu của Yakubu, Amuzat và Hamza (2012) tiến hành ở Nigeria cho thấy mẫu tươi cókhả năng kháng oxy hóa cao hơn các mẫu xử lý [24] Theo nghiên cứu của Obeta,Nwamaka Alexandra 2015 cho thấy rằng tất cả chất hóa học thực vật phytochemical bịgiảm bởi việc chần ở 100oC nhưng với sấy khô chỉ làm giảm alkaloids và flavonoidsnhưng lại tăng hàm lượng tannins, saponin, phytate và steroid [27] Các loại dung môichiết xuất khác nhau cũng ảnh hưởng đến đặc tính chống oxy hóa và khả năng bắt gốc

tự do của V.mygdalina và theo như nghiên cứu của Ekaluo, Ikpeme, Ekerette và

Chukwu (2015) thì với dung môi cồn tuyệt đối cho hàm lượng flavonoid tổng cao nhất(352.22 µgRE/mg) [28]

đó, gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học nhưDNA, protein, lipid (Proctor, 1989; Favier, 2003; Pincemail và cộng sự, 1998; Minn,2005; Fouad, 2006) [1]

Chu kỳ bán hủy

2 Hydroxyl oOH giây10-9

Hình thành thông qua phản ứng Fentonhoặc Haber-Weiss Đây là gốc tự do cóhoạt động mạnh nhất và gây nhiều tổnthương cho tế bào

3 Hydrogenperoxide H2O2 Vài

phút Được hình thành chủ yếu do sự mất 1electron của phân tử nước

có mặt oxy

6 Hydroperoxide ROOH địnhổn Phản ứng với các kim loại chuyển tiếpđể hình thành các dạng oxy phản ứng.

7 Nitric oxide NOo Vài

giây

Được tạo ra liên tục bởi các tế bào biểu

mô của mạch máu từ acid argininedưới tác dụng của enzyme Nitric oxidesynthaza

Gốc tự do có một số đặc điểm:

Tính bất ổn: do gốc tự do có electron độc thân mang năng lượng cao, kém bền nên nó

dễ dàng phản ứng với các phân tử quanh nó và tham gia vào nhiều phản ứng hóa họckhác nhau

Được sinh ra thường xuyên trong cơ thể thông qua chuỗi hô hấp tế bào

Xu hướng đạt tới sự ổn định: vì có điện tử lớp ngoài cùng không ghép cặp nên gốc tự

do rất không ổn định và luôn có xu hướng đạt tới sự ổn định, các gốc tự do có thờigian tồn tại rất ngắn và hoạt tính rất mạnh Gốc tự do tồn tại càng ngắn càng có độctính lớn, hoạt tính của gốc tự do tương quan nghịch với thời gian tồn tại của chúng.Gốc tự do có thời gian tồn tại < 10 -6 giây là gốc tự do không bền và có độc tính cao,gốc tự do tồn tại > 10-6 giây là gốc tự do bền, ít độc tính hơn[31]

1.3.3 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể

Gốc tự do liên tục được sản sinh trong chuỗi phản ứng trong cơ thể như một phần củachức năng tế bào bình thường [2] và từ các tác động bên ngoài Các gốc tự do hìnhthành khi có sự đứt nối đồng ly các liên kết cộng hóa trị Quá trình này cần nănglượng

Hình 1.3 Quá trình hình thành gốc tự doCác gốc tự do trong cơ thể sinh vật hình thành từ hai nguồn gốc đó là nội sinh và ngoạisinh Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh do chính cơ thể sinh ra được coi là cần thiết chocác phản ứng hóa học trong chu trình chuyển hóa tế bào Gốc tự do có nguồn gốcngoại sinh hình thành do tác động từ môi trường sống như tia tử ngoại (UV), khóithuốc lá, thuốc trừ sâu, hội chứng viêm, thiếu máu cục bộ…

1.4.4.1 Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh

Hô hấp tế bào là quá trình chuyển đổi năng lượng diễn ra ở ti thể Nó là một hệ thốngcác phản ứng oxy hóa khử, trong đó hydro được tách ra từ các chất hữu cơ chuyển đếnoxy tạo thành nước và giải phóng năng lượng dưới dạng ATP Trong quá trình chuyểnđiện tử, các điện tử được di chuyển theo từng cặp Tuy nhiên, có một số điện tử bì rò rỉdẫn đến hậu quả là chúng tương tác với phân tử oxy để tạo superoxide và các ion nàyqua phản ứng dị ly sẽ sinh ra H2O2 Khoảng 2 ÷ 5% oxy sử dụng cho trao đổi hiếu khítrong ty thể chuyển hóa thành các gốc tự do có nhóm oxy hoạt động [32]

1.4.4.2 Gốc tự do có nguồn gốc ngoại sinh

Hình 1.4 Các tác nhân gây ra gốc tự do

Sự bức xạ: Bức xạ điện từ (tia X, tia gamma) và những bức xạ hạt (electron, proton,

alpha,…) tạo ra những gốc tự do nguyên thủy bằng việc chuyển năng lượng của chúngcho thành phần của tế bào như nước Những gốc này có thể phản ứng với oxy hòa tantrong dịch tế bào để hình thành ROS [32] Trong thành phần các tia cực tím, bức xạmặt trời cũng có thể tạo nên gốc tự do với cường độ rất nhỏ nhưng có thể tích lũy theothời gian góp phần gây nên sự lão hóa

Tác nhân xenobiotic và vấn đề ô nhiễm môi trường: Xenobiotic là các chất sinh học

như thuốc, hóa chất trong nông nghiệp (thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, thuốc kích thíchsinh trưởng,…), hóa chất công nghiệp (chất tẩy rửa, thuốc nhuộm,…) Các chấtxenobiotic chuyển hóa trong cơ thể tạo ra ROS như superoxide, oxy đơn có độc tínhrất cao, gây đột biến gen và hoại tử Nhiều bằng chứng đã chỉ ra rằng các hợp chấtnitro hữu cơ là các tác nhân gây đột biến, ung thư khi xâm nhập vào cơ thể tạo ra gốcsuperoxide, các hợp chất halogen hữu cơ điển hình là CCL4 gây hoại tử gan, tác nhângây ung thư paraquat bị enzyme flavin khử thành các gốc bền nhường điện tử cho oxytạo ra superoxide[31]

Hội chứng viêm và quá trình thực bào: Hiện tượng này kích thích các bạch cầu đa

nhân trung tính, làm gia tăng tiêu thụ oxy và kích thích enzyme của màng tế bào là

NADP-oxidase, gây phản ứng xúc tác bởi enzyme này và tạo ra superoxide (Almagor,1984) [31].

Một số tác nhân khác: các gốc tự do cũng sinh ra trong các phản ứng khử độc của cơ

thể bằng phản ứng oxy hóa Các oxidase chứa trong peroxisome là tác nhân sinh rasuperoxide, hydrogenperoxide Ngoài ra, các cytochrome P450 trong quá trìnhmonooxygen hóa chất độc cũng sinh ra gốc tự do

1.3.4 Tác hại của gốc tự do

Hình 1.5 Gốc tự do tấn công tế bàoCác gốc tự do luôn tồn tại trong cơ thể Các electron tự do luôn có xu hướng kết đôivới các electron khác để tạo ra liên kết hóa học và biến các phân tử ban đầu ở trạngthái trung hòa về điện trở thành gốc tự do Tác động này gây ra các phản ứng dâychuyền trong cơ thể gây ảnh hưởng đến phospholipid, lipoprotein màng Các peroxide

là sản phẩm của quá trình oxy hóa do các gốc tự do tham gia gọi là phản ứng thoái hóasinh học Gốc tự do và sản phẩm của chúng gây tổn thương màng tế bào, phá hủy lipidmàng, tăng nhanh quá trình lão hóa cơ thể, gây ra các bệnh về tim mạch, tiểu đường vànhiều bệnh khác[28] Các gốc tự do cũng tham gia vào quá trình gây suy giảm hệ thầnkinh như Alzheimer, Parkinson , trong đó hiện tượng chết của các tế bào thần kinh gắnliền với hiện tượng phân ly tế bào gây nên bởi ROS và RNS (Gardes-Albert, 2003) [1].Các gốc tự do ở nồng độ cao sẽ gây ra đột biến ở DNA, biến tính protein, oxy hóalipid Sự phá hủy các đại phân tử sinh học bởi các gốc tự do là nguyên nhân của nhiềubệnh nguy hiểm Sự oxy hóa các Low Density Lipoprotein (LDL) dẫn đến sự hìnhthành các vạch lipid trên thành mạch máu, giai đoạn đầu tiên của bệnh huyết áp cao

Sự oxy hóa các DNA bởi các gốc tự do gây nên biến dị di truyền là một trong nhữngnguy cơ phát triển ung thư [1]

Bên cạnh những tác hại đó thì gốc tự do cũng đóng vai trò hết sức quan trọng cho cácquá trình trong cơ thể ở mức độ vi mô Hệ thống miễn dịch là rất cần thiết để bảo vệ cơthể khỏi những xâm nhập lạ, đóng vai trò chính trong nhiệm vụ này là các tế bàolympho T và các gốc tự do, phần lớn là các ROS được tạo ra bởi các đại thực bào.Ngoài ra, ở nồng độ thấp, các ROS và RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ điều hòa phân

ly tế bào, kích thích các yếu tố phiên mã, điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho cácenzyme chống oxy hóa [1]

1.4 Tổng quan về chất chống oxy hóa

1.4.1 Chất chống oxy hóa và cơ chế của nó

Theo Jovanovic và Simic, 2000 [33]; Lachman và cộng sự, 2000 [34], chất chống oxyhóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxyhóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể Theo Lobo [35], chất chống oxy hóa lànhững phân tử ổn định đủ để nhận hoặc nhường electron cho các gốc tự do và trunghòa chúng, làm giảm hoặc mất khả năng gây hại tới tế bào của gốc tự do

Các chất chống oxy hóa bảo vệ cơ thể khỏi tác hại của gốc tự do theo cơ chế [36]:

- Phản ứng với các ROS

- Ức chế các enzyme tạo ra các ROS như NADPH oxidase và xanthine oxidase (XO)

- Tăng cường hoạt động của các enzyme chống oxi hóa như superoxide

dismutase, catalase, trong tế bào

1.4.2 Phân loại chất chống oxy hóa

Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được chia thành hai loại: cácchất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai Các chất chống oxyhóa bậc một khử hoặc kết hợp với với các gốc tự do, kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻgãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc hai kìmhãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím, tạo phức với các kim loại kíchhoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe, vô hoạt oxy [1],[37]

Chất chống oxy hóa có bản chất phi enzyme

Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme

Nhóm Polyphenol

tử sắt và đồng

FlavonoidsAcid phenolic

Tannins

Lignans

Stilbenes

Curcuminoids

Dựa vào bản chất, người ta chia chất chống oxy hóa thành hai loại: chất chống oxy hóa

có bản chất là enzyme và chất chống oxy hóa có bản chất phi enzyme Sơ đồ tổng quátđược trình bày bên dưới

Hình 1.6 Phân loại chất chống oxy hóa

1.4.3 Chất chống oxy hóa có bản chất là enzyme

Gốc tự do luôn luôn tồn tại trong cơ thể sống nhưng thường xuyên được thu dọn nhờenzyme có sẵn trong tế bào của các tổ chức [2], trong đó chất chống oxy hóa có bảnchất là enzyme hiệu quả nhất bao gồm các enzyme: glutathione peroxidase, catalase vàsuperoxide dismuatase[1]

Superoxid dismutase (SOD)

2 O2o- + 2 H+  2 H2O + O2

Superoxid dismutase (SOD) là enzyme chống oxy hóa có chứa kim loại thuộc lớpoxidoreductase có vai trò chuyển gốc superoxide, chức năng của enzyme này là xúctác cho phản ứng dị ly xảy ra nhanh SOD có hoạt tính càng cao thì gốc superoxide cóhoạt tính càng giảm SOD là chất chống oxy hóa rất cơ bản, làm hạ thấp nồng độ tiềnchất superoxide từ đó giảm sản sinh ra các dạng oxy hoạt động khác SOD hiện diệntrong ti thể có cofactor là mangan, SOD hiện diện trong bào tương có cofactor là đồng

và kẽm, SOD có nồng độ cao nhất ở gan, thận và hồng cầu

Catalase

2 H2O2  2 H2O + O2

Catalase có mặt trong hầu hết các tế bào và các mô động vật nhưng hoạt tính mạnhnhất là ở gan và thận, ít nhất là ở mô liên kết Trong các mô, catalase có chủ yếu ở tythể và peroxisome Catalase là enzyme xúc tác phản ứng phân hủy Hydrogenperoxide(H2O2) thành nước và oxy, enzyme này chỉ hoạt động khi H2O2 ở nồng độ cao

Gutathione peroxidase

2 H2O2 + 2 GSH  2 H2O + GSSG (1)LOOH + 2 GSH  LOH + H2O + GSSG (2)Gutathione peroxidase là một nhóm các enzyme có hoạt tính chống oxy hóa có trong

tế bào Các chức năng sinh hóa của glutathione peroxidase là biến đổi hydrogenperoxide tự do thành nước (1) và giảm hydroperoxide lipid (2)

1.4.4 Chất chống oxy hóa có bản chất phi enzyme

1.4.4.1Nhóm các polyphenol

Polyphenol là các hợp chất tự nhiên, đại diện cho một nhóm lớn ít nhất 10000 hợp chấtkhác nhau Trong cấu trúc phân tử polyphenol có một hoặc nhiều nhóm chức phenolgắn với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl Chúng có nhiều trong trái cây và hoa quả, phổbiến nhất của nhóm polyphenol là flavonoid và acid phenolic [38]

Ngày nay, nhiều nghiên cứu cho rằng các polyphenol có khả năng kháng viêm và ngănngừa các bệnh lý khác nhau như tim mạch, ung thư Nó còn làm chậm sự tiến triển vàthậm chí góp phần vào quá trình chữa bệnh [39]

Với cấu trúc có nhiều nhóm phenol, chúng có khả năng ngăn chặn các chuỗi phản ứngdây chuyền gây ra bởi các gốc tự do bằng cách phản ứng trực tiếp với gốc tự do đó tạothành một gốc tự do mới bền hơn, hoặc cũng có thể tạo phức với các ion kim loạichuyển tiếp vốn là xúc tác cho quá trình tạo gốc tự do Đặc điểm cấu tạo của các hợpchất polyphenol liên quan chặt chẽ đến khả năng chống oxy hóa của chúng Đó là:

- Các nhóm hydroxyl ở dạng ortho của vòng B

- Liên kết đôi giữa C2 và C3 và nhóm ceton ở C4

- Nhóm hydroxyl ở C3 và C5 cùng với nhóm ceton ở C4

Hình 1.7 Các vùng cấu trúc đảm bảo khả năng chống oxy hóa của polyphenol [1]Hầu hết các nhà khoa học chấp nhận sự phân chia polyphenol thành các lớp theo cấutrúc hóa học của chúng Các lớp polyphenol chính là flavonoid, axit phenolic,

stilbenes, lignin, tannin, curcuminoids Mỗi lớp lại gồm nhiều phân lớp, bảng dưới đâythể hiện các lớp và phân lớp của polyphenol cũng như các đại diện của nó.

Bảng 1.4 Các lớp polyphenol và các đại diện tiêu biểu của nó [38]

4 Anthocyanidins Delphinidin,Pelargonidin

7 Chalcones Isoliquiritigenin,Xanthohumol

8

Acid phenolic

Acidhydroxybenzoic Acid ellagic, acid gallic

9 hydroxycinnamicAcid Acid caffeic, acidchlorgenic

10

Tannins

Condensed tannins Procyanidin B1,Procyanidin B4

11 Hydrolyzabletannins Theogallin, Punicalagin

Flavonoids và acid phenolics là những nhóm quan trọng nhất của chất chuyển hóa thứsinh và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thực vật - nguồn chứa chất chống oxyhoá tự nhiên cho con người Đặc biệt, flavonoids là chất chống oxy hóa chủ yếu trong

cây lá đắng Vernonia amygdalina Vì thế, báo cáo này tìm hiểu chủ yếu về flavonoids.

Cấu trúc và phân lớp của flavonoids:

Flavonoids là một họ rất phổ biến trong thực vật, có bản chất hóa học là nhữngpolyphenol Các flavonoids được khám phá bởi một trong những nhà sinh hóa nổitiếng nhất của thế kỉ 20 đó là Albert Szent- Gyorgyi Các nghiên cứu gần đây đã chứngminh rằng flavonoids được tìm thấy trong trái cây và rau quả hoạt động như chấtchống oxy hoá Những flavonoid có hoạt tính sinh học được gọi là bioflavonoid có khảnăng chống oxy hóa cao Các flavonoids như luteolin và cathechin là chất chống oxyhoá tốt hơn vitamin C, vitamin E và β carotene [40]

Do chúng có các nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl, vòng thơm benzene nênchúng có khả năng phản ứng rất lớn, chúng triệt tiêu các gốc tự do sinh ra trong quátrình bệnh lý của cơ thể và tạo nên những gốc tự do bền vững hơn mà không tham giavào dây chuyền phản ứng gốc (Lê Thị Lan Oanh và cộng sự, 2004)

Về cấu trúc hóa học, flavonoids có khung cơ bản là 2 vòng benzene (A và B) nối vớinhau qua một mạch 3 carbon (C) và được chia làm nhiều nhóm khác nhau (C6-C3-C6) Một trong những cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để flavonoids thể hiện được hoạttính sinh học của chúng là khả năng kìm hãm quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởicác gốc tự do

Hình 1.8 Cấu trúc cơ bản của flavonoids [40]

Flavonoid được chia thành nhiều phân lớp khác nhau:

Hình 1.9 Cấu trúc phân lớp của flavonoids

Cơ chế hoạt động của flavonoids [1]:

Chalcones

Các hợp chất flavonoids có thế oxy hóa khử thấp nên có thể khử các gốc tự do bằngcách nhường điện tử hydro Gốc flavonoids tự do hình thành sau phản ứng được kếthợp với một gốc tự do khác để tạo thành hợp chất bền Cơ chế này được minh họa nhưsau:

Hình 1.10 Cơ chế hoạt động của flavonoidsNgoài cơ chế trên, flavonoids còn kìm hãm sự phát sinh các gốc tự do hoạt động dokhả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp như Fe++, Cu++… để chúng khôngthể xúc tác cho phản ứng Fenton, phản ứng Haber-Weiss sinh ra các gốc hoạt độngnhư hydroxyl, oxy đơn

Do đó, ngăn ngừa sự tạo ion superoxide

Xanthine + 2O2 + H2O  Acid uric + 2O2-+ 2H+

Hình 1.11 Sự giống nhau về cấu trúc của flavonoid và xanthine

1.4.4.2Nhóm các thiol

Nhóm thiol có cấu trúc RSH (R là gốc hydrocarbon) gồm glutathione,mercaptopropionyl glyxin, N-acetyl cysteine Glutathion là một tripeptide, có mặt ởhầu hết các loại động vật, thực vật và vi sinh vật, cơ chế hoạt động của glutathioneđược giả thiết liên quan đến phản ứng vận chuyển một nguyên tử H tới các gốc tự do.Nồng độ glutathione trong tế bào được giữ ổn định nhờ tác dụng của glutathionereductase phụ thuộc NADPH khử glutathione dạng oxi hóa Glutathion của tế bàođóng vai trò như hệ đệm chống lại quá trình oxi hóa của những phân tử proteinsylhydryl (PSH)

1.4.4.3Nhóm các phối tử sắt và đồng

Ion sắt và đồng xúc tác phản ứng Fenton tạo nên hai dạng oxy hoạt động rất độc hạicho cơ thể là gốc hydroxyl và oxy đơn Ion sắt nếu tạo được phức qua đủ 6 liên kếtphối trí như trong hemoglobin, myoglobin thì không có khả năng xúc tác phản ứngtrên nữa Trong cơ thể của chúng ta có nhiều protein tạo phức chelat với sắt với đủ 6liên kết phối trí như transferrin, lactoferin, ceruloplasmin

1.4.4.4Nhóm selen

Selen là một nguyên tố vi lượng, nó có thể loại bỏ gốc tự do đặc biệt là phá hủy H2O2 .Tác dụng phối hợp với selen làm tăng khả năng miễn dịch của cơ thể lên nhiều lần,selen còn xúc tác cho sự tạo thành các gốc tự do bền (gốc vitamin E), coenzyme Q,flavin chống lại các gốc tự do độc hại

Hiện nay, chất chống oxi hóa tự nhiên trong thực vật là hướng đi mới đang rất đượcquan tâm Vì thế nhiều chất chống oxi hóa tự nhiên đã được nghiên cứu và chiết xuất,ứng dụng trong công nghệ thực phẩm nói chung và lĩnh vực nước giải khát nói riêng

1.5 Tổng quan về quá trình trích ly

1.5.1 Bản chất của quá trình trích ly

Trích ly là sự chiết rút chất hòa tan trong chất lỏng hoặc rắn bằng một chất hòa tankhác (còn gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán giữa các chất có nồng độ khácnhau

1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình trích ly

Loại dung môi: Mỗi dung môi có độ phân cực khác nhau sẽ ảnh hưởng đến độ hòa tancủa các hợp chất chống oxy hóa khác nhau Có nghĩa là mỗi lớp trong nhómpolyphenol thích hợp với những dung môi khác nhau Chất phân cực tan tốt trongdung môi phân cực và ngược lại Acetone và methanol là dung môi thích hợp để chiếtflavan-3-ol, methanol thì chiết tốt đối với catechin, anthocyanidins cho hiệu quả chiếttốt trong methanol, etanol…Nhiều báo cáo cho rằng dung môi thích hợp nhất cho quátrình trích ly polyphenol là methanol, etanol, nước hoặc hỗn hợp các dung môi này vớinước [38]

Nhiệt độ: Không những ảnh hưởng tới hiệu quả trích ly mà nhiệt độ còn ảnh hưởngđến chi phí và chất lượng của dịch chiết Nhiệt độ tăng làm giảm độ nhớt, tăng tốc độthẩm thấu của dung môi vào tế bào giúp tăng tỉ lệ khai thác Tuy nhiên, nhiệt độ là mộtyếu tố có giới hạn cần phải chú ý trong quá trình trích ly [38]

Thời gian: thời gian trích ly kéo dài khi đã đạt mức độ trích ly cao nhất sẽ không manglại hiệu quả kinh tế Vì vậy, cần xác định thời gian trích ly phù hợp để trích ly đượcnhiều polyphenol mà vẫn kinh tế [41]

Kích thước nguyên liệu: kích thước ảnh hưởng đến diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu

và dung môi Diện tích tiếp xúc càng lớn hiệu quả trích ly càng cao Tuy nhiên, kíchthước quá nhỏ làm chúng lắng đọng và gây cản trở việc tiếp xúc của nguyên liệu vớidung môi [42]

Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi: điều này liên quan tới sự chênh lệch nồng độ giữa nguyênliệu và dung môi Khi chênh lệch nồng độ càng lớn thì quá trình trích ly càng dễ dàng,rút ngắn thời gian trích ly Nhưng dung môi quá nhiều sẽ gây lãng phí [43, 44]

1.5.3 Các phương pháp trích ly [38]

1.5.3.1Phương pháp truyền thống

Phương pháp trích ly ngâm dầm: Được xem là kĩ thuật thông dụng nhất, không cầnthiết bị phức tạp, thao tác tiến hành đơn giản Chỉ cần cho mẫu nguyên liệu đã xử lícùng với dung môi vào bình chứa (thường là thủy tinh) có nắp đậy Trích ly được tiến

hành ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ cao (bằng cách sử dụng bể ổn nhiệt) Tuy nhiênnhiệt độ cao hơn 70oC không được khuyến khích Sau thời gian trích ly nhất định thuđược dịch trích, đuổi dung môi để thu cao chiết (nếu cần).

Phương pháp trích ly bằng thiết bị Soxhlet: kỹ thuật này sử dụng nhiệt đun sôi bìnhcầu chứa mẫu nguyên liệu và dung môi Quá trình trích ly được tiến hành tự động, liêntục Tuy nhiên việc sử dụng nhiệt độ cao làm cho các hợp chất kém bền nhiệt bị hưhại

1.5.3.2Phương pháp hiện đại

Do các vấn đề liên quan đến nhiệt độ xử lý cao và thời gian xử lý lâu dài trong cácphương pháp trích ly truyền thống Các phương pháp hiện đại như: trích ly bằng sóngsiêu âm, trích ly bằng lò vi sóng, trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn,… được sự quantâm cao do sự đơn giản của chúng, thời gian chiết ngắn hơn và giảm lượng dung môihữu cơ

Phương pháp siêu âm: Ngày nay người ta dùng sóng siêu âm hỗ trợ quá trình trích lytheo phương pháp truyền thống làm tăng khả năng trích ly Dựa vào nguyên tắc xâmkhí thực và hiện tượng vi xoáy, sóng siêu âm làm giảm ranh giới giữa các pha, tăngcường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuếch tán làm tăng hiệu quả tríchly

Phương pháp chất lỏng siêu tới hạn: Đây là phương pháp được lựa chọn trong nhiềungành công nghiệp chế biến thực phẩm Nó đã được chấp nhận rộng rãi như là một kỹthuật "xanh" thân thiện với môi trường Dung môi CO2 siêu tới hạn phổ biến nhất bởivì sự thâm nhập dễ dàng trong nguyên liệu thực vật Gần đây, bên cạnh CO2, một sốchất lỏng siêu tới hạn được đề xuất như: propan, argon và SF6 Nước là một dung môiđang gây nhiều tranh cãi, nhưng tính chất ăn mòn cao của H2O ở trạng thái siêu tới hạnđã hạn chế ứng dụng thực tế của nó Ưu điểm chính của phương pháp này so vớiphương pháp thông thường là chất lượng trích xuất cao, thời gian trích ly thấp và tínhthân thiện với môi trường

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm thí nghiệm thực hành trường Đại học Công NghiệpThực Phẩm Tp Hồ Chí Minh

Thời gian nghiên cứu: từ 10/04/2017 đến 25/06/2017

2.2 Nguyên liệu – Hóa chất – Thiết bị

2.2.2 Hóa chất

Bảng 2.5 Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

khiết Hãng sản xuất Ghi chú

1 Thuốc thử Folin – Ciocalteu Merck KgaA, Đức

7 Giấy lọc Whatman No.1 GE HealthcareLife Sciences

(Anh)

TFC

1 Tủ sấy venticell MMM Group Nhiệt độ: 0÷200oC

2 Máy quang phổ Model Photolab® 6100

3 Cân sấy ẩm MB45/Ohaus – Mỹ Khoảng cân: 45g, bước nhảy:0.001g, kiểu gia nhiệt: đèn halogen

4 Bể ổn nhiệt Memmert Nhiệt độ tối đa 125oC

5 Máy lắc ốngnghiệm Vortex ZX3 (Ý)

Đường kính khay lắc: 5mmTốc độ lắc: 50÷2400 vòng/phút

Công suất: 45W

6 Máy ghép míchân không Vacuum Sealer V-300/Fuji Impulse (Nhật) Lực hút bơm: 10 l/p, nhiệt độ:230oC, thời gian hút: 1-20 giây

7 Cân 2 số TE412/Satorius (Đức) Tải trọng: 0.01g

10 Máy lắc Gerhard (Đức) Tốc độ lắc: dưới 100 vòng/phút

11 Brix kế Atago (Nhật) Độ brix: 0÷50; 50÷100 Bx

13 Nồi hấp Tomy-ES 315 (Nhật) Nhiệt độ: 105÷132oC

B2: Khảo sát nguyên liệu

Khảo sát quá trình sấy

Khảo sát kích thước nguyên liệu

Khảo sát quá trình trích ly

Xây dựng công thức phối trộn

cho sản phẩmLựa chọn nguồn nguyên liệu

Đề xuất quy trình tạo sản phẩm nước giải khát từ lá đắng

Phân tích thành phần hóa lý, cảm quan, vi sinh cho sản phẩm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Hình 2.13 Sơ đồ nghiên cứu tổng quátKết quả dự kiến xác định được:

- Điều kiện tiền xử lý nguyên liệu (nhiệt độ, thời gian) tốt nhất bằng phương pháp sấy

- Điều kiện trích ly hợp chất polyphenol (nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung môi)

Nhiệt độ trích lyThời gian trích ly

Tỉ lệ nguyên liệu: dungmôi

Đánh giá hiệu quả củaquá trình trích ly

Tỉ lệ nước/dịch chiết, đường

Độ ẩm, độ tro,…

Nhiệt độ, thời gian