THUYẾT MINH DỰ THẢO TIÊU CHUẨN QUỐC GIA Tên tiêu chuẩn Thực phẩm nguyên liệu – Xác định hàm lượng protein sữa – Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (ESI HPLC-MS/MS)

Tên tiêu chuẩn Thực phẩm và nguyên liệu – Xác định hàm lượng protein sữa – Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ESI HPLC-MS/MS Foodstuffs and Raw Materials – Identification of Milk Proteins

THUYẾT MINH DỰ THẢO TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

1 Tên tiêu chuẩn

Thực phẩm và nguyên liệu – Xác định hàm lượng protein sữa – Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (ESI HPLC-MS/MS)

Foodstuffs and Raw Materials – Identification of Milk Proteins – Liquid chromatographic tandem mass spectrometry (ESI HPLC-MS/MS)

2 Tổ chức biên soạn

Cục Chăn nuôi - Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn

3 Khái quát chung

3.1 Protein sữa

Protein sữa là một loại protein có nguồn gốc từ sữa và được hình thành từ whey và protein casein Protein sữa thường được xử lý sao cho các protein gần với trạng thái tự nhiên của chúng, nhưng trong một hình thức thanh lọc hơn Quá trình làm sạch nhẹ nhàng protein sữa đảm bảo sự thay đổi của các protein được giảm thiểu và các amino acid vẫn nguyên trạng Các protein sữa mang lại nguồn tuyệt vời của canxi, amino acid mạnh nhánh và ít chất béo

Protein sữa được hình thành từ casein chủ yếu và một số protein Carbohydrate và chất béo được loại bỏ trong quá trình này và protein sữa được phân tách và làm giầu Rất nhiều người có xu hướng coi trọng whey protein Whey protein là một nguồn protein rất tốt và nó nhanh chóng tiêu hóa Trong thực

tế, các hàm lượng casein cao trong protein sữa làm cho nó một nguồn protein tuyệt vời, với một trình tự amino acid phong phú Trình tự này rất giàu các amino acid chuỗi chi nhánh và cung cấp một gian hàng kéo dài nhiều hơn nữa để tổng hợp nên các sợi cơ

Khi các protein trong sữa là protein ở trạng thái tự nhiên của chúng, cơ thể phải mất thời gian dài hơn để tiêu hóa Điều này làm cho protein sữa lý tưởng cho phù hợp như một nguồn protein duy trì và một sự lựa chọn tuyệt vời như là một protein bổ sung khi đi ngủ hoặc cho ở giữa các bữa ăn Khi protein sữa đang dần

tiêu hóa, nó tạo thành một gel trong ruột được hấp thu dần trong một khoảng thời gian Điều này cung cấp một nguồn kéo dài của các amino acid liên tục được sử dụng bởi cơ thể

4 Sự cần thiết của việc xây dựng tiêu chuẩn

Hiện nay vấn đề kiểm soát chất lượng của sản phẩm đang được quan tâm, việc xây dựng phương pháp chuẩn làm công cụ giúp các cơ quan chức năng kiểm soát và đánh giá được chất lượng của sản phẩm là rất cần thiết Hơn nữa, tại Việt Nam chưa có một phương pháp chuẩn để ứng dụng phân tích giữa các phòng thí nghiệm Vì vậy phương pháp được xây dựng phù hợp với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm với độ nhạy, độ chính xác cao, ban hành thành tiêu chuẩn quốc gia áp dụng rộng rãi trong cả nước

5 Phương thức xây dựng và tài liệu làm căn cứ xây dựng tiêu chuẩn

* Phương thức xây dựng:

+ Xây dựng mới + Sửa đổi, bổ sung + Chấp nhận tiêu chuẩn quốc tế + Thay thế

* Tài liệu chính làm căn cứ xây dựng TCVN: AOAC 2017.12 Identification of Milk Proteins in Raw Materials and Finished Goods ESI HPLC-MS/MS

Phương pháp xác định gluten được tiến hành thẩm định nội bộ tại phòng thí nghiệm của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia

(Báo cáo xác nhận giá trị sử dụng được gửi kèm theo)

6 Nội dung tiêu chuẩn

Bố cục, nội dung của TCVN gồm các phần sau:

1 Phạm vi áp dụng

2 Tài liệu viện dẫn

3 Nguyên tắc

4 Thuốc thử

5 Thiết bị, dụng cụ

6 Lấy mẫu

7 Cách tiến hành

8 Tính toán kết quả

9 Báo cáo thử nghiệm

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính xác định protein sữa trong các mẫu nguyên liệu và thành phẩm thực phẩm

2 Tài liệu viện dẫn

- AOAC 2017.12 Identification of Milk Proteins in Raw Materials and Finished Goods ESI HPLC-MS/MS

3 Nguyên tắc

Mẫu rắn được chiết xuất bằng urê 5,0 M trong dung dịch đệm Tris 50 mM, sau đó khử bằng dithiothreitol (DTT) 1 M trong 30 phút và kiềm hóa trong iodoacetamide 0,5M trong 30 phút Dịch chiết được thủy phân thêm bằng dung dịch trypsin ở 37°C qua đêm, và sau đó được làm nguội bằng axit formic Sau khi lọc bằng ống tiêm dùng một lần và bộ lọc ống tiêm nylon 0,22 µm, dịch chiết được pha loãng (1:10) với axit formic 0,1% và chất chuẩn nội 200 ng/mL và được phân tích LC-MS/MS Phương pháp sử dụng peptide -4-casomorphin 1-4 làm chất nội chuẩn (IS) Nhận dạng protein sữa dựa trên so sánh với các mẫu giới hạn báo cáo của phương pháp (MRL), được làm từ nguyên liệu thô và được xác định bằng PCR

4 Thuốc thử

Tất cả các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, nước được sử dụng là nước cất hai lần hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác

4.1 Nước siêu tinh khiết (H2O), ≥ 16 MΩ/cm

4.2 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho HPLC (CAS No 75-05-8)

4.3 Axit formic (HCOOH), độ tinh khiết ≥98.5% purity (CAS No 64-18-6)

4.4 Iodoacetamid (NaCl), loại thủy phân protein (CAS No 144-48-9)

4.5 DTT, loại dùng cho sinh học phân tử (CAS No 3483-12-3)

4.6 Urea, loại dùng cho sinh học phân tử (CAS No 57-13-6)

4.7 Ammonium bicarbonat, độ tinh khiết ≥ 99.5% pure (CAS No.1066-33-7) 4.8 Trypsin, loại thủy phân protein (CAS No 9002-07-7)

4.9 Trizma base, loại dùng cho sinh học phân tử (CAS No 77-86-1)

4.10 Phosphate buffered salin (PBS), loại dùng cho sinh học phân tử

4.11 Dimethyl sulfoxide (DMSO), loại dùng cho HPLC (CAS No 67-68-5)

4.12 Peptide tham chiếu β-Casomorphin 1-4 (bovine) (YPFP)

4.13 Mẫu kiểm soát (LCS), Sử dụng để kiểm soát tín hiệu các peptide

4.13 Dung dịch đệm Tris 1 M (PB), 0,1 M

Chuyển 60,57 g Trizma base (MW =121,14) vào ống đong 500 ml và thêm ~ 350

ml nước cất siêu tinh khiết Sau khi Trizma base đã được hòa tan, dùng nước cất siêu tinh khiết đổ đầy đến vạch

4.14 Đệm chiết (urê 5 M trong Tris đệm 50 mM)

Chuyển 300,3 g urê (MW = 60,06) vào một ống đong 1 L và thêm ~ 600 ml nước cất siêu tinh khiết Đậy nắp ống đong bằng parafilm và khuấy từ cho đến khi urê tan hết (dung dịch sẽ bị giảm nhiệt độ Đảm bảo dung dịch trở lại nhiệt độ phòng trước khi tiếp tục bước tiếp theo) Thêm 50 ml đệm Tris 1 M và làm đầy đến vạch bằng nước cất siêu tinh khiết

4.15 Dung dịch khử (DTT 1 M)

Chuyển 1,697 g DTT (MW = 154,2) vào một ống 15 ml hình nón và thêm 11 ml nước cất Lắc vortex cho đến khi tan hết, dung dịch trở nên trong suốt Lưu trữ tại – 20°C sử dụng trong vòng 2 lần phân tích

4.16 Đệm thủy phân (amoni bicarbonate100 mM)

Chuyển 3,953 g amoni bicarbonate (MW = 79,06) vào một ống đong 500 ml và thêm 400 ml nước cất Định mức đến vạch bằng nước cất siêu sạch và chuyển vào

lọ đựng

4.17 Dung dịch trypsin gốc (~ 50 mg/ml)

Chuyển 525 mg trypsin vào một ống hình nón 15 ml và thêm 10,5 ml đệm thủy phân Trộn dung dịch trong ống nhẹ nhàng bằng cách đảo ngược cho đến khi

trypsin được tan hết (không Vortex trypsin dung dịch) Lấy 1200 µl phần dung dịch vào ống ly tâm 1,5 ml, dán nhãn TRYP 50 và bảo quản ở – 20°C, dùng hai lần trước khi bỏ đi

4.18 Dung dịch Trypsin làm việc (~ 500 μg/ml)

Lấy một lọ dung dịch trypsin gốc 50 mg/ml từ tủ đông và để tan băng hoàn toàn trước khi sử dụng Chuyển 400 μl đến một ống hình nón 50 ml và pha loãng đến

40 ml bằng dung dịch đệm thủy phân Trộn nhẹ nhàng bằng đảo ống liên tục (không vortex dung dịch trypsin) Lấy 1500 µl phần dung dịch vào ống ly tâm 1,5

ml, dán nhãn TRYP 500 và bảo quản ở – 20°C, dùng hai lần trước khi bỏ đi

4.19 Dung dịch bảo vệ alkyl hóa (iodoacetamid 0,5 M)

Iodoacetamide là hóa chất độc hại nên khi sử dụng cần có thiết bị bảo vệ cá nhân, bao gồm áo thí nghiệm, găng tay và kính an toàn Chuẩn bị dung dịch alkylation ngay trước khi sử dụng Loại bỏ phần không sử dụng hết Mỗi mẫu, hòa tan 185 mg iodoacetamide (MW = 184,96) trong 2 ml nước cất Vortex cho đến khi tan hoàn toàn

4.20 Nội chuẩn (IS; β-casomorphin 1-4, ypfp)

Cân ~ 40 mg β-casomorphin 1-4 peptide vào một bình định mức 25 ml, hòa tan bằng đệm PBS, và trộn đều và định mức đến vạch Pha dung dịch trung gian ~ 100 μg/ml trong 25 mL với PBS Chuẩn bị dung dịch làm việc nồng độ ~ 2000 ng/ml trong 50 ml PBS Ghi nhãn "bcas 2000" và bảo quản ở – 20°C

4.21 Mẫu kiểm soát nội bộ phòng thí nghiệm LCS

Một hỗn hợp các mẫu protein nguyên liệu chuẩn bị bảo đảm rằng mỗi nguồn protein là ở cùng mức hàm lượng trong hỗn hợp mẫu chuẩn cuối cùng Đối với mỗi mẫu protein nguyên liệu được sử dụng trong hỗn hợp mẫu chuẩn, sử dụng phân tích Kjeldahl để tính toán trọng lượng mẫu cần sử dụng trong hỗn hợp mẫu chuẩn Đối với ~ 100 g composite từ nguyên liệu, sử dụng các phương trình sau đây để tính toán trọng lượng của mỗi nguồn protein:

Lượng mẫu X (g) = (100 g của hỗn hợp / tổng số mẫu) × (giá trị protein trung bình của các mẫu theo Kjeldahl / kết quả protein của mẫu X theo Kjeldahl)

4.22 Mẫu MRL - 1000 ppm (0,1%)

Trộn mẫu LCS với mẫu trắng Mức trung bình phần trăm của mỗi thành phần nguyên liệu được sử dụng để tính toán lượng của LCS cần thiết để thêm chuẩn ở mức nồng độ mong muốn Ví dụ, tính toán cho lượng của LCS để tạo ra hỗn hợp 10

g lúc ban đầu 20 000 ppm (2%) là:

Hàm lượng của LCS = (10 g của Mix × 2%)/19.79% = 1,01 g

Các mẫu thêm chuẩn LCS được trộn trên nền mẫu âm tính

4.23 Pha động A (axit formic 0,1% trong nước)

Lấy 500 μl axit formic vào ống đong 500 ml Làm đầy đến vạch bằng nước cất, chuyển sang chai thủy tinh, trộn đều, rung siêu âm khử khí trước khi sử dụng

4.24 Pha động B (acid formic 0,1% trong acetonitril)

Lấy 500 μL axit formic vào ống đong 500 ml Làm đầy đến vạch bằng acetonitril, chuyển sang chai thủy tinh, trộn đều, và rung siêu âm khử khí trước khi sử dụng 4.25 Dung môi rửa kim (95% acetonitril - 5% nước)

Lấy 25 mL nước cất vào ống đong 500 ml Làm đầy đến vạch bằng acetonitril, chuyển sang chai thủy tinh, trộn đều, và rung siêu âm khử khí trước khi sử dụng

5 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) —Shimadzu 20AXL hoặc tương đương

5.2 Detertor khối phổ ba tứ cực — AB Sciex Triple 5500 hoặc tương đương

5.3 Cột HPLC column — C18, 150 × 4.6 mm x 3.5 µm , Waters hoặc tương đương 5.4 Tiền cột C18 HPLC — C18 Waters hoặc tương đương

5.5 Máy ly tâm — tốc độ tối thiểu 4000 r/min

5.6 Cân phân tích — độ chính xác 0,0001 g

5.7 Pipette chính xác — loại điều chỉnh được thể tích từ 10-100 µL và từ 100-1000

µL

5.8 Pipette tip — loại dùng cho pipette (4.7)

5.9 Xy-lanh — 3 ml

5.10 Màng lọc mẫu — 0,22 μm

5.11 Ống ly tâm — 1,5, 15 và 50 ml

5.12 Vial — thể tích 2 ml

5.13 Tủ ấm — Ổn định nhiệt độ ở 37°C

5.14 Tủ lạnh — Ổn định nhiệt độ 2–8°C

5.15 Tủ đông — Ổn định nhiệt độ –20°C

5.16 Bếp điều nhiệt — Ổn định nhiệt độ 55°C

5.17 Bể rung siêu âm

5.18 Máy lắc vortex

6 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi chất lượng trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển

7 Cách tiến hành

(a) Trộn mẫu trước khi cân Chuyển 500 mg vào ống ly tâm 15 ml

(b) Chuẩn bị từng mẫu riêng biệt để tránh vón cục trong ống

(c) Thêm 10 ml đệm chiết, lắc xoáy 10 – 60 s cho đến khi mẫu đồng nhất

(d) Siêu âm trong 60 min (làm nóng bể siêu âm trước khi cho mẫu vào siêu âm) (e) Ly tâm mẫu trong 10 min tại tốc độ 4000 r/min

(f) Chuyển 4 ml của dịch chiết bằng pipet vào ống ly tâm hình nón mới 15 ml và thêm 150 μl dung dịch khử

(g) Lắc xoáy mẫu để trộn Đun nóng 30 min trong bể điều nhiệt ở 55°C

(h) Làm mát ở nhiệt độ phòng (trong khi làm mát, chuẩn bị dung dịch alkyl hóa)

(i) Alkyl hóa các mẫu riêng biệt Thêm 1,2 ml dung dịch alkyl hóa, trộn bằng máy lắc xoáy, và để mẫu tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng trong 30 min

(j) Sau khi alkyl hóa, thêm 4 ml dung dịch đệm thủy phân vào mỗi mẫu

(k) Trộn cẩn thận nhiều lần

(l) Thêm 250 μL của dung dịch trypsin

(m) Trộn cẩn thận ống nhiều lần

(n) Ủ mẫu qua đêm trong tủ ấm ở 37°C (Ghi thời điểm bắt đầu và kết thúc quá trình ủ mẫu)

(o) Thêm 400 μL axit formic để dừng phản ứng

(p) Trộn cẩn thận nhiều lần tránh tạo bọt, việc tạo bọt có thể dẫn đến mất mẫu (q) Ly tâm mẫu trong 10 min tại 4000 r/min

(r) Lọc một phần dịch vào một ống ly tâm 1,5 ml

(s) Rã đông dung dịch IS 2000 ng/ml

(t) Pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1:10 với axit formic 0,1% và IS 200 ng/ml (ví dụ: thêm 100 μl của mẫu, 100 μl là dung dịch IS, và 800 μl của axit formic 0,1%) (u) Tiêm 5 μl mẫu vào máy để phân tích

8 Phân tích sắc ký

8.1 Điều kiện vận hành HPLC

- Cột HPLC Waters 3 μm, 150 × 2 mm C18

- Tốc độ dòng 0,5 ml/min

- Nhiệt độ cột, ổn định 30ºC

- Thể tích tiêm mẫu, 10 μl

- Chương trình gradient

7,3 2 98

Chương trình valco valve

Phút Vị trí Đường đi của dung

môi

Điều kiện khối phổ

Nhiết độ đầu

Mảnh đặc trưng

α-s1-Casein-1 FFVAPFPEVFGK 692,9 920,5 29 α-s1-Casein -2 YLGYLEQLLR 634,4 991,6 33 α-s1-Casein -3 HQGLPQEVLNENLLR 880,5 1324,7 51 β-Lactoglobulin-1 VYVEELKPTPEGDLEILLQK 1157,1 1453 60 β-Lactoglobulin -2 VLVLDTDYK 533,3 853,5 23 β-Lactoglobulin -3 LIVTQTMK 467,3 707,4 21 Glutelin-1 EGSLLLPHYNSR 693,4 773,6 40

Vicilin-1 ALPNDVLANAYR 658,9 566,8 26

Vicilin -3 GDEFGAFTPIQYK 736,9 1024,8 33 Glycinin G1-1 VLIVPQNFVVAAR 713,4 1001,6 33 Glycinin G1-2 VFDGELQEGR 575,3 903,4 29 Glycinin G1-3 LNALKPDNR 520,8 629,3 32 8.2 Phân tích mẫu

Mẫu thử được tiến hành tương tự mẫu chuẩn,

Thứ tự chạy mẫu

Dung môi DMSO

Mẫu blank

Dung môi

Mẫu MRL

DMSO blank

Mẫu thử

8.3 Tính kết quả

(a) MRL 1000 ppm, — Tính tỷ lệ diện tích trung bình của các peptide:

Tỷ lệ diện tích píc = diện tích chất phân tích / diện tích nội chuẩn

(b) Mẫu thử – tính tỷ lệ diện tích píc của mẫu thử

(c) Xác định mẫu thử

(1) so sánh tỷ lệ diện tích píc của mẫu thử và mẫu MRL,

(2) khi tỷ lệ diện tích của các peptide trong mẫu thử nhỏ hơn mẫu MRL, kết quả là

âm tính, Khi tỷ lệ diện tích píc của các peptide trong mẫu thử lớn hơn mẫu MRL, kết quả là dương tính,

(3) khi cả ba peptide của mỗi protein có kết quả dương tính, mẫu thử dương tính với protein đó, Nếu không, mẫu thử âm tính với protein đó

9 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

- phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

TM Ban soạn thảo