Xác định hàm lượng vitamin c bằng thuốc thử 2,6 diclophenolindophenol

Với cách đặt vấn đề nhvậy nhiệm vụ của đề tài này gồm: - Xác định hàm lợng vitamin C trong nớc cam ép nguyên chất đóng hộpnhập từ Ôxtrâylia bằng phơng pháp chuẩn độ oxy hoá- khử phơng ph

Sinh Viªn: Lª ThÞ Sen

Líp B2 - K41 - Khoa Ho¸ - §¹i Häc Vinh

Vitamin là những chất hữu cơ có bản chất hoá học rât khác nhau, màchỉ cần một lợng nhỏ trong thức ăn của ngời và động vật bậc cao cũng đủ

đảm bảo sự sinh trởng và phát triển bình thờng của cơ thể Nhng với một ợng rất bé nh vậy chúng không phải là những chất cung cấp năng lợng.Ngày nay ngời ta đã rõ vai trò xúc tác của vitamin đối với các quá trìnhbiến đổi trong cơ thể

l-Theo y học, các loại vitamin rất cần thiết cho hoạt động sống của bất

kỳ cơ thể nào, làm xúc tác cho quá trình sinh hoá, gắn liền với việc giảiphóng năng lợng, tham gia các phản ứng của tế bào Việc cung cấp không

đầy đủ vitamin cho cơ thể sẽ ảnh hởng xấu không những đối với sự làm việccủa hệ thần kinh mà còn đối với một loạt các cơ quan khác ở bên trong cơthể Vì thế cho nên điều rất quan trọng là khẩu phần ăn của con ngời phải

có giá trị hoàn chỉnh không những về phơng diện calo, về phơng diện chất

đạm mà con về phơng diện vitamin nữa

Đối với vitamin C nói riêng cũng có vai trò rất quan trọng, nó có vịtrí đặc biệt trong lich sử của học thuyết về vitamin Thiếu vitamin C cơ thể

sẽ bị bệnh hoại huyết, ảnh hởng tiêu cực đến sự tự vệ của cơ thể với cácbệnh nhiễm trùng khác Cơ thể chúng ta hoàn toàn không tự tổng hợp đợcvitamin C mà phải lấy từ những nguồn thức ăn ngoài vào Vì vậy việc phântích vitamin C trong thực phẩm là điều rất cần thiết

Tuy nhiên đây là hợp chất hữu cơ thuộc đối tợng khó phân tích, hơnnữa trong mẫu phân tích tồn tại nhiều chất hữu cơ và vô cơ ở các dạng khácnhau, gây cản trở cho quá trình định lợng Do đó cần phải lựa chọn phơngpháp phân tích hữu hiệu nhất

Có thể phân tích vitamin C bằng các phơng pháp: sắc ký giấy, cựcphổ, trắc quang, hóa học Trong đó phơng pháp cực phổ là một trongnhững phơng pháp đặc trng nhất, đợc dùng nhiều trong thực tế để định lợnghàng loạt Phơng pháp cực phổ đáp ứng đợc yêu cầu phân tích hợp chất vôcơ, hữu cơ với hàm lợng nhỏ, chính xác Tuy nhiên do điều kiện phòng thí

nghiệm hiện nay cha đáp ứng đợc nên chúng tôi không sử dụng đợc phơngpháp này mặc dù nó có những u điểm rõ rệt.

Khi định lợng vitamin C bằng phơng pháp trắc quang ngời ta sử dụngmột số thuốc thử vô cơ nh: axit photphovonframic, muối titan (IV), axitphotphomolipdic các phơng pháp này thờng gặp khó khăn khi phân tíchhàm lợng vitamin C trong hoa quả, vì dịch quả thờng có màu và có chứanhiều thành phần khử khác gây cản trở cho quá trình định lợng Để khắcphục một số nhợc điểm đó, trong đề tài này chúng tôi chọn thuốc thử 2,6 -diclophenolindophenol để định lợng axit ascorbic Với cách đặt vấn đề nhvậy nhiệm vụ của đề tài này gồm:

- Xác định hàm lợng vitamin C trong nớc cam ép nguyên chất đóng hộp(nhập từ Ôxtrâylia) bằng phơng pháp chuẩn độ oxy hoá- khử (phơng phápphân tích thể tích)

- Tìm các điều kiện tối u cho phép định lợng bằng phơng pháp đoquang

- Thử các điều kiện tối u đã chọn vào việc phân tích mẫu tự tạo

- Phân tích hàm lợng vitamin C trong nớc cam ép nguyên chất đóng hộp

và một số hoa quả có bán trên thị trờng thành phố Vinh hiện nay

- Kiểm tra, đánh giá phơng pháp và các điều kiện phân tích với quátrình thực hiện và kết quả thu đợc, chúng tôi hy vọng rằng luận văn sẽ gópphần bổ sung, hoàn thiện các phơng pháp phân tích vitamin C trong nhiều

đối tợng khác nhau nh nớc ép trái cây nguyên chất đóng hộp và một số hoaquả có bán trên thị trờng hiện nay

phần I Tổng quan tài liệu

I - Giới thiệu về Vitamin C

1 - Lợc sử [1].

Bệnh Scocbut và chất gây ra bệnh này đã đợc biết từ những thế kỷ XI

- XII Nhng tới khi Holst nghiên cứu kỹ về cơ chế tác dụng và nguyên nhângây bệnh, rồi Zilva tách đợc chất này từ chanh, cam thì sự hiểu biết và sửdụng chất này mới có cơ sở chắc chắn Năm 1920 Đrumlnond đặt tên chấtnày là vitamin C Vài năm sau, Her - Bert Hirst và Karrer tách đợc vitamin

C từ thợng thận Năm 1933 Funk rồi Reichstein, Haworth tổng hợp đợcvitamin C Ngày nay ngời ta biết vitamin C có trong tự nhiên dới dạng: khử(axit L Ascorbic) và dạng oxy hoá (axit dehydroascorbic), dạng sau này íthơn Cả hai dạng đều tan trong nớc, dễ bị phân huỷ khi tiếp xúc với chấtoxy hóa hoặc bazơ So với các vitamin khác thì vitamin C là chất duy nhấtkhông có ở dạng phức hợp với các Nucleotit hoặc Coenzym Hiện nay ngời

ta điều chế vitamin C bằng tổng hợp rẻ hơn nhiều so với phơng pháp điềuchế từ thực vật

2 - Vai trò của Vitamin C trong đời sống con ngời [1, 2, 3].

Vitamin C có vị trí đặc biệt trong lịch sử của học thuyết về vitamin.Vitamin C tham gia vào các quá trình oxy hoá - khử khác nhau ở cơ thể Nóxúc tác cho sự chuyển hóa nhiều hợp chất thơm thành các dạng Phenol tơngứng Ví dụ: Quá trình hydroxyl hoá triptophan thành hydroxytriptophan, hoặcphenylalanin chuyển thành tirozin Phản ứng chuyển amin hoá giữa tirozin vàaxit  - xetoglutaric tạo nên sản phẩm là axit para oxyphenylpiruvic cũngthực hiện với sự tham gia của vitamin C Ngoài ra vitamin C còn tham gia

điều hoà sự tạo ADN từ ARN hoặc chuyển procolagen thành colagen Nhờquá trình hyđroxyl hoá prolin tạo nên chất oxyprolin cần thiết cho sự tổnghợp colagen Chính vì vậy nó có tác dụng làm cho vết thơng chóng liền sẹo.vitamin C còn liên quan với sự hình thành các hormon của tuyến giáp tràng

và tuyến trên thận Nó rất cần thiết cho cơ thể để tăng sức đề kháng và chốnglại các hiện tợng choáng hoặc ngộ độc bởi các hoá chất cũng nh các độc tốcủa vi trùng Ngời ta cũng chứng minh rằng vitamin C có liên quan tới sựtrao đổi gluxit ở cơ thể Vì khi bị bệnh hoại huyết trao đổi gluxit ở cơ tim bịrối loạn sự phân giải glicogen và glucoza tăng lên mạnh, đồng thời tăng tích

luỹ axit lactic Hiện tợng này sẽ biến đi nhanh chóng nếu thêm vitamin C vàocác chất dinh dỡng.

Khi thiếu vitamin C trong thực phẩm thì ngời ta sẽ bị bệnh hoạihuyết Vì bệnh hoại huyết phát triển từ từ nên việc chuẩn đoán trạng tháithiếu vitamin C rất khó khăn Bệnh thiếu vitamin C đợc đặc trng bởi sựgiảm tính chịu đựng của cơ thể đối với các bệnh nhiễm trùng khác nhau.Bệnh nhân rất chóng mệt hay đau đầu và luôn luôn ở trạng thái mộng mị,

ăn kém ngon Sau đó nhịp đập của tim bị rối loạn, thành các mao quản trởnên mỏng manh và dễ bị đứt, do đó có thể xảy ra các trờng hợp chảy máu tựphát Khi bị bệnh thiếu vitamin C, ngay cả trong những trờng hợp có nhữngtác động rất nhẹ về cơ học cũng có thể gây ra hiện tợng chảy máu ở các cơquan bên trong Trong bệnh thiếu vitamin C cũng kèm theo những thay đổirất đặc trng về xơng và răng: Răng tự phân hủy và rụng rất nhanh Bệnhthiếu vitamin C còn đợc gọi là bệnh scobut

Những rối loạn trong việc tổng hợp chất colagen là cơ sở của nhữnghiện tợng trên Điều đó cũng gây nên những thay đổi bệnh lý của các thànhmao quản và của các mô chống đỡ Hàng ngay cơ thể cần một lợng vitamin

C nhiều hơn các loại vitamin khác Nhu cầu vitamin C thay đổi theo tuổi,khí hậu và lao động Ngời lớn mỗi ngày cần khoảng 50 - 100mg Đối vớiphụ nữ có thai hoặc trẻ con mỗi ngày cần 100 - 200mg

Tóm lại vitamin C rất cần thiết đối với cơ thể con ngời Tuy nhiên trong cơthể chúng ta hoàn toàn không thể tự tổng hợp đợc vitamin C, mà phải lấy từnguồn thức ăn bên ngoài Vậy vitamin C trong thiên nhiên tồn tại ở đâu?

3 - Các nguồn Vitamin C trong thiên nhiên [1, 2, 3, 4]

Vitamin C tồn tại trong thiên nhiên dới 3 dạng phổ biến là axitascorbic (dạng khử); axit dehydroascorbic (dạng oxy hoá) và ascorbigen(dạng kết hợp)

Vitamin C có nhiều trong các loại rau quả nh: Cam, chanh, dâu, ớt,rau cải, cà chua Còn trong các loại hạt ngũ cốc hoặc trong trứng, thịt hầu

nh không có vitamin C

Hàm lợng vitamin C biến đổi nhiều phụ thuộc vào loài, vị trí trồng trọt

và các yếu tố nh độ chiếu sáng, khí hậu Bình thờng lợng vitamin C giảm dần

từ phía vỏ ngoài vào bên trong ruột của quả vitamin C xuất hiện ở hầu hếtcác bộ phận của cây mầm gặp nhiều ở họ: đơn, thông, cải, ít gặp ở họ: cúc,trạch, tả

.4 - Công thức hoá học:

4.1 - Axit L - Ascorbic

- C«ng thøc ph©n tö: C6H8O6

- C«ng thøc cÊu t¹o

O

C

C OH

O

C OH

dụng của vi khuẩn Acetobacter suboxydans tạo ra L - sorbose (3) Ngng tụ(3) với axeton với xúc tác axit sunfuric tạo diaxeton sorbose (4) Oxy hoá(4) bằng kalipermanganat tạo (5); thuỷ phân (5) tạo axit 2 ceto L - gulonic(6) Este hoá (6) bằng methanol, sau đó cho tác dụng với natri methoxydtạo (7) Thuỷ phân (7) trong dung dịch axit hydrocloric trong nớc loại nhómmethyl và natri, lacton hoá tạo axit ascorbic (8):

CHO CH2OH CH2OH

CHOH CHOH C = O

H2 A Suboxydans HOCH HOCH HOCH

CHOH CHOH CHOH

CHOH CHOH HOCH

CH2OH CH2OH CH2OH

.6.2 - Hoá tính.

Về hoá tính, đó là hoá tính của chức lacton, của các nhóm hydroxyl.Song quan trọng nhất là hoá tính của nhóm endiol Nhóm này gây ra tínhaxit và tính khử của axit ascorbic

.6.2.1 - Tính axit.

Do hiệu ứng liên hợp với nhóm cacbonyl nên nguyên tử hydro củanhóm hydroxyl ở vị trí số 3 trở nên rất linh động làm cho vitamin C có tínhaxit mạnh Vì vậy vitamin C có tên là axit ascorbic

Tác dụng với muối kim loại cho muối mới Nhiều dợc điển dùngthuốc thử là sắt (II) sunfat hoặc sắt (III) clorua để định tính ascorbic

Phơng trình phản ứng:

CH2OH CH2OH

HOCH HOCH

O O

+ NaHCO3 Fe²+

Sau đó + FeSO4

HO OH O OH 2

6.2.2 - Tính khử là đặc tính cơ bản của Axit ascorbic.

Axit ascorbic cũng nh tất cả các endiol có tính chất khử mạnh và bịoxy hoá trong một phản ứng thuận nghịch thành axit dehydroascorbic Cóthể dùng các thuốc thử sau đây để oxi hoá: oxy, dung dịch iôt; 2,6 -diclophenolindophenol; xanh metylen; kaliferixianua Tốc độ của sự oxyhoá trong các môi trờng phụ thuộc vào pH, pH cực đại là 5,0; với phản ứng

có bazơ, pH cực đại là 11,5 Trong môi trờng kiềm phản ứng oxi hoá xảy ranhanh hơn trong môi trờng axit

Các tác nhân xúc tác sự oxy hoá là: ánh sáng, nhiệt độ, chất kiềm, cácenzym và vết đồng hay sắt

Sự oxy hoá khử thuận nghịch axit ascorbic thành axit dehydroascorbic

Axit ascorbic Axit dehidroascorbic

Tính chất này vô cùng quan trọng đối với tác dụng sinh học của axitnày Trong cơ thể, axit ascorbic có thể cho hai nguyên tử hydro (là chấtcho) để tạo thành axit dehydroascobic; ở dạng này, nó có thể nhận hainguyên tử hydro (là chất nhận) để trở lại axit ascorbic Nh vậy axit ascorbictham gia vận chuyển hydro tức là tham gia vào các hệ enzym xúc tác cácquá trình oxy hoá khử xảy ra trong cơ thể

Axit dehydroascorbic vững bền trong môi trờng axit PH dới 4,0 Dễ bịphân huỷ trong môi trờng trung tính và kiềm để thành axit 2,3 -dixetogulonic không có tác dụng sinh học.

+ Phơng pháp hoá lý

+ Phơng pháp hoá học

Trong những phơng pháp hoá lý thì phơng pháp cực phổ có một ýnghĩa thực tế Trong những năm gần đây phơng pháp này rất đợc phát triển

và đã đợc dùng để nghiên cứu vitamin C về mặt lý thuyết Phơng pháp sắc

ký giấy với nhiều kiến thức mới quý giá đã đợc sử dụng để nghiên cứu axitascorbic ở dạng kết hợp Trong các phơng pháp đo màu, nhiều phơng pháp

có ý nghĩa nhất đều dựa trên phản ứng của axit ascorbic dạng oxy hoá với2,6 - dinitrophenylhydrazin Sau đây là tóm tắt về các phơng pháp hoá học

Vị trí của dải hấp thụ chủ yếu phụ thuộc vào tính chất của dung môi, thí dụ

O + H

2O

trong nớc cực đại ở 265nm, trong etanol ở 245nm Vị trí cực đại phụ thuộcvào pH và khi pH giảm đi thì sẽ dịch về những bớc sóng ngắn hơn Sự thay

đổi phổ hấp thụ của axit ascorbic đối với pH phụ thuộc vào trạng thái cânbằng trong dung dịch giữa dạng endiol và dạng xeton Về mặt quang phổ,axit ascorbic có tính chất tơng tự nh các endiol khác, các axit khử, các chấtkhử phổ hấp thụ tử ngoại của dinitrophenylhydrazon, axitdehydroascorbic và các sản phẩm endiol oxy hoá khác đợc dùng để địnhtính các chất này Phổ hấp thụ của axit ascorbic có thể dùng nh một hằng sốvật lý đặc trng và để thử định tính khi đánh giá các chất dùng làm mẫuchuẩn hoặc dùng để định lợng axit ascorbic trong dung dịch tiêm

Zprochazka đã đo phổ hấp thụ ascorbigen trong vùng tử ngoại khinghiên cứu cấu tạo của chất này So sánh các phổ của ascorbigen, indol vàaxit ascorbic thì phổ của ascorbigen không giống phổ axit ascorbic từ đó cóthể suy ra là axit ascorbic không kết hợp dạng endiol Phổ tử ngoại củaascorbigen thực tế trùng với phổ của indol, từ đó có thể suy ra là trong phân

tử ascorbigen có vòng đó hoặc có các nhóm có cấu trúc tơng tự

2.2 - Phơng pháp cực phổ [4].

Cực phổ nghiệm là một trong những phơng pháp đặc trng nhất đợcdùng nhiều trong thực tế để định lợng hàng loạt Axit ascorbic có tính chấtcực phổ giống nh các endiol khác về cho sóng anốt đôi điện tử không thuậnnghịch Tuy rằng sóng cực phổ của axit dehydroascorbic có tính khử, nhng

nó nhiều lần thấp hơn sóng anốt tơng ứng của axit ascorbic Cơ chế khử nàythực ra cha rõ ràng Tính chất của axit ascorbic khi định lợng bằng phơngpháp oxy hoá và sự thay đổi thế năng chuẩn của nó đối với pH cho phép giảthiết rằng dạng endiol có khẳ năng trao đổi thuận nghịch đôi điện tử với

điện cực Kwiesner đã theo dõi quá trình oxy hoá thuận nghịch ở điện cựckhi nghiên cứu axit dehydroxyfumaric bằng cực phổ giao động Tác giả chorằng chất này có chứa nhóm endiol, đầu tiên cho sản phẩm oxy hóa thuậnnghịch không bền vững, sau đó sản phẩm này hydrat hoá thành sản phẩmkhông thuận nghịch không bền vững

Sự chứng minh tơng tự đối với ascorbic không có kết quả có thể do

đời sống ngắn ngủi của sản phẩm thuận nghịch

Sự oxy hoá axit ascorbic bằng phơng pháp cực phổ trên điện cựcthuỷ ngân nhỏ giọt khác biệt với phơng pháp điện thế ở chỗ thế năng oxyhoá cực phổ ở khoảng 200mv dơng hơn giá trị thu đợc với phơng pháp đo

điện thế Theo J.Heyrovsky và Z Vavrina thì trong sự di chuyển này códạng sóng tơng tự nh trong quá trình thuận ngịch; bằng cách ứng dụng ph-

DA* = Sản phẩm oxy hóa thuận ngịch đầu tiên.

DA = Sản phẩm oxy hóa thứ hai sau khi đã hydrat hóa

K = Hằng số tốc độ hydrat hoá

Giả thiết cho rằng sự biến đổi axit ascorbic thành axitdehydroascorbic không hydrat hóa là thuận ngịch và sự hydrat hoá của sảnphẩm oxy hoá thứ nhất trên điện cực bị chậm do quá trình riêng của điệncực, đợc giải thích bằng sự tơng quan giữa sự di chuyển thế bán sóng vớithời gian nhỏ giọt, điều này phù hợp với các kết quả thực nghiệm Năm

1933 E Kodicek và K Wenig đã sử dụng phơng pháp cực phổ để thăm dò

định lợng axit ascorbic tự do Họ đã nghiên cứu trong môi trờng photphat

có đệm pH = 7,0 và định lợng trong dịch quả chanh, quả cam bằng cáchtrộn đơn giản dịch đó với đệm theo tỉ lệ 1 : 1 Ghi đờng cong sau khi đã loạioxy hoà tan bằng cách sục khí trơ Phơng pháp và dung dịch đệm ở trên đã

đợc I.okada dùng để định lợng axit ascorbic trong dịch hoa quả đồ hộp.K.Schwars đề nghị thay đệm photphat bằng đệm axetat pH = 4,7 với lý do

là axit ascorbic trong môi trờng axit thì vững bền hơn trong môi trờng trungtính, và đã tiến hành định lợng bằng cách trộn dịch đó với dung dịch đệmtheo tỉ lệ 1 : 5 Để định lợng axit ascorbic trong dợc phẩm, O Mata đề nghịdùng đệm phtalat có axit oxalic pH khoảng 4,0 Với cách làm nh trên thìviệc xác định không bị trở ngại khi có mặt aspirin; histidin; vitamin K3;pyridoxin

P Zuman đã lu ý tới nhiều chi tiết trong việc định lợng bằng cực phổaxit ascorbic bên cạnh các chất sunfhydryl thờng có trong các mô thực vậtdới dạng glutathion; cystein; ergothionein và cho sóng anốt dễ nhầm lẫnvới sóng của axit ascorbic Các chất này có ảnh hởng không tốt đến việc

định lợng axit ascorbic bằng phơng pháp oxyhoá, bởi vì cũng bị oxyhoá vớiaxit ascorbic và làm tăng lợng thuốc thử oxyhoá P Zuman đã tìm thấy các

điều kiện thích hợp để có thể tiến hành định lợng đồng thời axit ascorbic vàcác chất Sunfhydrin Cách làm đơn giản và thực tế tác giả đề nghị dùng

đệm axetat pH = 4,7 làm môi trờng thích hợp nhất

←→

Một số tác giả đã chú ý đến việc định lợng vitamin C trong nhữngnguyên liệu rất giàu axit ascorbic Họ đã lu ý đến vitamin C có kèm theocác chất khác có tính khử mạnh, gây cản trở cho định lợng M Pyke, R.Melville và H Sarson rồi C Daglish và F Wokes đã xác minh bằng đoquang phổ là chất khử này là este của hydrojuglon mà trông có vẻ nh axitascorbic

2.3 - Phơng pháp sắc ký [4].

Phơng pháp sắc ký giấy đã mang lại nhiều kết quả quý cho việc địnhlợng axit ascorbic khi có mặt các chất cản trở Nó cho phép phát hiện nhanhchóng các thành phần cản trở khác nhau và định tính đợc chúng Do đó cóthể lựa chọn tơng đối dễ cánh định lợng thuận lợi, sự cải tiến thích hợp L

M Mapson và S Partridge đã nghiên cứu phơng pháp này có kết quả Họ đãdùng hệ dung môi: phenol bảo hoà nớc, colidin bão hoà nớc vàhệ: n- butanol - axit axetic - nớc (4 : 1 : 5) phát hiện bằng dung dịch 2,6 -diclophenolindophenol Z Prochazka dùng giấy whatman số 1, hệ dungmôi metanol - nớc và phát hiện bằng dung dịch bạc nitrat amoniacat hoặcdung dịch hồ tinh bột có iodua V.Sanda đã khảo sát nhiều cách khác nhau

để xác định hàm lợng axit ascorbic trong chất liệu thực vật bằng phơngpháp sắc ký giấy và đã nghiên cứu cải tiến tốt việc định lợng trong thựcphẩm Các hệ dung môi đợc dùng là: metanol trong nớc 50%, hệ butanol -axit axetic - nớc (50ml nớc, 40ml n- butanol và 14,5ml axit axetic băng cho

đến khi mất hẳn giới hạn ngăn cách của hai pha) Tiếp đó hệ dung môi do

Mapson đề nghị đã có kết quả tốt: n - butanol - axit axetic - nớc (4 : 1 : 5)phát hiện bằng dung dịch 2,6 - diclophenolindophenol.

Chạy sắc ký theo hớng từ dới lên trên trong khí quyển dioxit cacbon

định lợng bằng phơng pháp cho thêm chất chuẩn Kết quả thu đợc trong

ph-ơng pháp sắc ký đợc kiểm tra lại bằng phph-ơng pháp oxyhoá

H.V Euler và cộng sự đã dùng phơng pháp sắc ký giấy để theo dõi

sự bền vững của axit ascorbic trong những môi trờng khác nhau Phơngpháp sắc ký giấy đã đợc dùng để định lợng axit ascorbic trong nớc tiểu vàcác tổ chức, để theo dõi sự tạo ra các chất khử trong đờng Phơng pháp sửdụng rất tốt để định lợng axit ascorbic kết hợp trong cây xanh

Z.Prochazka đã thăm dò 26 hệ dung môi khác nhau để định lợngascorbigen trong rau xanh và đề nghị dùng các hệ: etylaxetat - nớc; butylaxetat - nớc, n - butanol - nớc Hỗn hợp gồm focmaldehyt và axit clohydric

đề nghị làm thuốc thử phát hiện ascorbigen, nó cho với ascorbigen một vếtmàu da cam có màu huỳnh quang sẫm trong ánh sáng tử ngoại Sau khithuỷ phân ascorbigen dùng thuốc thử hồ tinh bột có iodua để phát hiện axitascorbic tự do Sắc ký trên giấy whatman theo chiều từ dới lên

F Samraj đã chọn một cách sắc ký giấy khác để định lợngascorbigen, làm trong khí quyển hydro và dùng hỗn hợp gồm 50ml nớc,40ml n - butanol làm hệ dung môi và thêm 100ml axit axetic băng cho tớikhi hỗn hợp nhuyễn đều Phát hiện bằng một dung dịch bạc nitrat 1% trongaxit axetic 2% Tác giả đã ứng dụng vào quả kim anh, bắp cải và ớt ngọt.Trong tất cả các mẫu thử đã thấy ascorbigen bên cạnh axit ascorbic Có thểphân biệt đợc chúng không chỉ theo giá tri Rf, mà còn theo hình dạng vếtsau khi phát hiện Trong thực tế đã theo dõi hàm lợng của hai chất trongmẫu thử trớc và sau khi thuỷ phân trong môi trờng axit axetic 10% Các kếtquả này đã đợc các tác giả kiểm tra lại bằng phơng pháp oxy hoá và cựcphổ Việc xác định lợng axit ascorbic trong chất liệu sinh vật đã đợc Yu -Tuan - Chen và các cộng sự lu ý; bằng phơng pháp đã mô tả, họ có thể táchaxit L - ascorbic ra khỏi axit D - araboascorbic Sau khi triển khai sắc ký

đồ, đem cắt theo từng vết và chiết từng vết rồi xác định giá trị bằng phơngpháp so màu sau khi cho tác dụng với diclophenolindophenol Việc xác

định axit dehydroascorbic bên cạnh axit ascorbic bằng phơng pháp sắc kýgiấy đã đợc H Smidt và H Staudinger nghiên cứu

Để tách ascorbigen từ dịch đậm đặc thu đợc từ bắp cải, Z Prochazka

đã dùng sắc ký phân chia trên cột xenluloza và đã thu đợc dịch đậm đặc

ascorbigen rất tinh khiết có chứa 31% axit ascorbic Để triển khai sắc ký đồdùng hệ ete - nớc.

3 - Định lợng axit ascorbic bằng phơng pháp hoá học [4].

3.1 - Định lợng bằng phơng pháp oxy hoá [4].

Cũng nh trong cực phổ nghiệm có sự nhờng điện tử cho điện cực, ở

đây sau khi thêm thuốc thử oxy hoá vào dung dịch axit ascorbic thì sự oxyhoá có thể xảy ra Ngời ta đã dùng iot; kaliferixyanua; 2,6 -diclophenolindophenol, xanh metylen làm thuốc thử oxy hoá Có thể theodõi sự chuẩn độ oxy hoá axit ascorbic bằng mắt, đo quang, đo điện thế và

đo cực phổ Do tính không bền vững của axit ascorbic ngoài khí trời nêncần đặc biệt lu ý khi pha chế dung dịch và chiết từ chất liệu thiên nhiên.Việc định lợng axit ascorbic bằng phơng pháp oxy hoá thông thờng tiếnhành bằng cách nhỏ từ buret dung dịch thuốc thử vào dịch chiết axitascorbic trong môi trờng thích hợp axit metaphotphoric hoặc các axit thíchhợp khác Trong trờng hợp đơn giản nhất, ngời ta quan sát sự mất màu bằngmắt Trong phép chuẩn độ bằng đo điện lợng, ngời ta dùng bạch kim hoặcnhững điện cực khác chế tạo một cách đặc biệt làm điện cực chỉ thị Phép

đo điện lợng tơng đối ít dùng để định lợng axit ascorbic trong chất liệuthiên nhiên vì nó ít đặc trng và thế chậm ổn định Phép đo quang rất hay đ-

ợc dùng để quan sát sự oxy hoá axit ascorbic bằng 2,6 diclophenolindophenol, trong đó sự mất màu dần đợc theo dõi bằng độ tắt

-đo ở bớc sóng 520nm Ngời ta đã nghiên cứu cải tiến phơng pháp này bằngcách theo dõi tốc độ mất màu, từ đó suy ra đợc tính chất của các tạp chấtkhử có mặt Một trong những cải tiến này do F Follkmann nghiên cứu làviệc loại ảnh hởng của tạp chất khử kèm theo

Việc cải tiến dựa trên nguyên tắc chiết 2,6 - diclophenolindophenolcha bị khử trong môi trờng phản ứng axit bằng xylen E Stotz đã dựa trênphơng pháp cơ bản này để nghiên cứu định lợng axit ascorbic trong máu.Theo cách làm ở trên ngời ta có thể ngăn trở sự xúc tiếp của dạng oxy hoáquá thừa của chất màu với các chất tác dụng chậm, trừ axit ascorbic Trongphần trình bày dới đây là những phơng pháp hay dùng nhất để định lợngaxit ascorbic dựa trên phơng pháp oxy hoá và bằng những thí dụ sẽ minhhoạ những cải tiến khác nhau tiến hành trên những chất liệu nhất định

3.1.1 - Phơng pháp chuẩn độ bằng 2,6 - diclophenolindophenol quan sát bằng mắt.

Khi chuẩn độ oxy hoá axit ascorbic bằng 2,6 - diclophenolindophenoltrong môi trờng axit, axit ascorbic bị oxy hoá thành axit dehydroascorbic và

chất màu bị khử thuận nghịch thành dạng không màu Sự kết thúc định lợng

đợc báo hiệu bằng sự xuất hiện màu hồng, chứng tỏ sự có mặt của một lợng

có thừa chất màu không bị khử

Phơng pháp có thể dùng để định lợng trực tiếp axit ascorbic trong cácchế phẩm dợc và với cải tiến thích hợp có thể định lợng trong thực phẩm.Việc cải tiến chủ yếu nhằm loại trừ ảnh hởng của những chất cản trở nh cácchất khử, các chất sunfhydryl Bằng cách cho các chất sunfhydryl ngng tụvới focmandehit ở điều kiện thích hợp

Nh vậy để xác định giá trị dịch chiết cần phải tiến hành 3 lần định lợng

ở điều kiện khác nhau theo sơ đồ sau:

1 - Chuẩn độ không có focmaldehit để xác định axit ascorbic, chấtkhử và các chất sunfhydryl nói chung (A)

2 - Chuẩn độ có focmaldehit trong môi trờng pH = 0,6 để xác địnhaxit ascorbic và các chất khử (B) ở điều kiện này ảnh hởng của các chấtsunfhydryl đợc loại bằng focmaldehit

3 - Chuẩn độ trong môi trờng đệm pH = 3,5 với sự có mặt củafocmaldehit thì chỉ xác định đợc các chất khử (C)

3.1.2 - Định lợng axit ascorbic trong chất liệu thiên nhiên bằng phơng pháp

đo quang [4].

Phơng pháp đo quang dựa trên sự theo dõi quá trình làm mất màu của2,6 - diclophenolindophenol bằng dung dịch axit ascorbic chuẩn và bằngdịch chiết Sự mất màu do axit ascorbic thực tế xảy ra tức thời, còn sự mấtmàu do các chất tạp có tính khử phần nhiều chậm hơn Do đó có thể tiếnhành điều chỉnh bằng cách theo dõi thời gian quá trình xác định hàm lợngthực của axit ascorbic

Phơng pháp này thích hợp cho những trờng hợp dung dịch trong vàhàm lợng axit ascorbic thấp Không thể ứng dụng cho dung dịch có màuhoặc dịch chiết đục nhiều Trong trờng hợp này nên dùng phơng phápindophenol cải tiến dùng xylen

3.1.3 - Định lợng bằng đo quang axit ascorbic theo phơng pháp chiết indophenol - xylen [4]

Sau khi xử lý chất liệu cần thử, tác giả xem chất liệu có chứa chấtmàu chiết đợc bằng xylen không Thí nghiệm bằng cách trộn 5ml dịch chiếtaxit, 5ml đệm và chiết với 10ml xylen Nếu độ tắt của dung dịch lớn hơn0,01 thì cần phải dùng giá trị của mẫu trắng sau khi thêm hydroquinol

Tiến hành khử chất màu bằng axit ascorbic, chiết lợng thừa của chấtmàu bằng xylen Sau đó đem đo màu, trên cơ sở đó chúng ta định lợng đợcaxit ascorbic

3.1.4 - Chuẩn độ axit ascorbic bằng phơng pháp đo điện [4].

Chuẩn độ bằng phơng pháp đo điện có u điểm rõ rệt khi định lợng axitascorbic trong dung dịch đục hay có màu đệm, ở đây không thể dùng phơngpháp nhìn bằng mắt hoặc so màu đợc E Becker và J Gleria dùng bạch kimnhẵn làm điện cực chỉ thị, điện cực calomen làm điện cực so sánh Họ tiếnhành định lợng trong dung dịch nhôm sunfat M Kirk và D Tessler dùng

điện cực lỡng kim (bạch kim và antimon) Việc chuẩn độ tiến hành trongmôi trờng axit axetic 8% L Harris và L Mapson đã khảo sát tỉ mĩ việcchuẩn độ điện thế axit ascorbic và đề nghị dùng những điện cực bạch kim

có bao thuỷ ngân Khi ứng dụng phơng pháp này vào việc đinh lợng cácchất thiên nhiên có mặt của những chất cản trở làm cho thế chậm ổn định

và điểm cuối không rõ ràng, do đó độ chính xác bị giảm đi Ngời ta có thểdùng phơng pháp điện thế để định lợng axit ascorbic trong chế phẩm dợc Chuẩn độ đo điện axit ascorbic với 2,6 - diclophenolindophenol theo

L Mapson, L Harris và Y Wang: tác giả dùng điện cực bạch kim bọc thuỷngân làm catốt và bạch kim bóng làm anốt Chuẩn độ trong môi trờng axitmetaphotphoric 5% bằng dung dịch 2,6 - diclophenolindophenol

3.2 - Định lợng axit ascorbic bằng phơng pháp đo quang [4].

Axit ascorbic cho một loạt phản ứng màu có thể dùng để nghiên cứu

định lợng chất đó bằng phơng pháp so màu M.Bachstez và G.Gavallini đãmô tả axit ascorbic cho màu nâu khi có mặt uranylaxetat trong môi trờngkiềm nhẹ N Bezssonoff đã dùng phơng pháp so màu để định lợng axitascorbic nhờ màu xanh lơ mà axit này tạo nên với axit photphovonframictrong những điều kiện thực nghiệm nhất định E Sehulec và J Floderer đãmô tả một phản ứng màu rất nhạy Việc định lợng tocoferol theo Emmre vàengel cũng dựa trên một phản ứng tơng tự Việc định lợng dựa trên cách đomàu đỏ thẩm xuất hiện khi có tác dụng của , , - dipyridyl trên ion sắt hoátrị II, ion này sinh ra do axit ascorbic khử sắt III clorua Xét về bản chất củaphơng pháp thì rõ ràng là phản ứng rất không đặc trng J H Roe và C H.Kuther đã giới thiệu nhiều lần phơng pháp so màu, trong đó axit ascorbic bịoxy hoá bởi brom hoặc iot thành axit dehydroascorbic, chất này tác dụngvới dinitrophenylhydrazin thành osazon có màu tơng ứng Năm 1953M.Schmall, CH Pifer và E Wollisch đã nghiên cứu một phơng pháp mớidựa trên cách đo màu xanh lơ sinh ra khi cho tác dụng diazo - 4 - metoxy -

2 - nitroanilin trên axit ascorbic Phơng pháp đợc coi là khá đặc trng nên nó

đã đợc dùng để định lợng axit ascorbic trong polyvitamin và trong quả và sẽ

đợc trình bày đầy đủ ở dới

3.2.1 - Định lợng axit ascorbic,dehydroascorbic và dixeto - gulonic bằng phơng pháp với 2,4 - dinitrophenyldrazin.

Theo J H Roe và M.B.Mills thì phơng pháp này có thể dùng để địnhlợng các axit ascorbic, dehydroascorbic, dixetogulonic trong chất liệu thiênnhiên, nó sinh ra bằng cách thuỷ phân axit dehydroascorbic Axitdixetogulonic không có tác dụng sinh lý và ngời ta đã xác định rằng hàm l-ợng của nó tăng lên trong quả hay rau xanh lu kho Phơng pháp dựa trênviệc định lợng bằng cách đo màu sinh ra do tác dụng của 2,4 -dinitrophenyldrazin trên axit dehydroascorbic và dixetogulonic Bằng cách

bố trí thực nghiệm thích hợp, phơng pháp này có thể định lợng đợc cả bathành phần bên cạnh nhau Kết quả phụ thuộc vào tốc độ thí nghiệm, bởi vìaxit dehydroascorbic dễ chuyển thành dixetogulonic Thioure đợc cho thêmvào với mục đích làm ổn định dạng khử của axit ascorbic

3.2.2 - Định lợng axit ascorbic bằng so màu theo M.Schmall, Chpifer và E.G Wollisch.

Dựa vào đo sản phẩm màu của phản ứng giữa axit ascorbic với 4 metoxy - 2 - nitroanilin đã diazo hoá Trong môi trờng kiềm, chất này hoàtan và cho một màu xanh thẩm, phơng pháp này khá đặc hiệu và có thể chophép định lợng axit ascorbic bên cạnh các sản phẩm oxy hoá, nghĩa là bêncạnh axit dehydroascorbic và 2,3 - dixetogulonic Có thể dùng phơng phápnày để định lợng trong thực phẩm và hoa quả

-III đặc điểm của thuốc thử hữu cơ 2,6 - diclophenolindophenol

2,6 - diclophenolindophenolat natri C12H6O2NCl2Na

Tính chất: là bột màu xanh lá cây thẫm, tan trong nớc và rợu etylic.Dung dịch etylic của thuốc thử có màu xanh, khi axit hoá trở thành đỏ, pH = 5,7.Phản ứng: Khi thêm thuốc thử vào dung dịch KI trong môi trờng axitthì có iôt thoát ra Với tác dụng của các chất khử mạnh nh axit ascorbic thìmàu xanh của thuốc thử chuyển thành màu vàng nhạt gần nh không màu.ứng dụng: Để xác định axit ascorbic, dùng làm chỉ thị oxy hoá khử

E0 = + 0,217 V ở pH = 7 (dạng oxy hoá có màu xanh)

E0 = + 0,67 V ở pH = 0 (dạng khử không màu, dạng oxy hoá màu đỏ)

IV - Kết luận

Qua nghiên cứu các tính chất của vitamin, qua phần tổng quan về các

chúng tôi chọn thuốc thử 2,6 – diclophenolindophenol để định lợng axit

ascorbic theo hai phơng pháp:

+ Định lợng axit ascorbic bằng phơng pháp chuẩn độ oxy hoá-khử

(ph-ơng pháp phân tích thể tích)

+ Định lợng axit ascorbic bằng phơng pháp đo quang

• Nguyên tắc chung của hai phơng pháp:

Phơng pháp dựa trên nguyên tắc là axit ascorbic có khẳ năng oxy hoá khửthuận nghịch nhờ trong phân tử của nó có chứa nhóm endiol

C C

OH OH

Vì vậy axit ascorbic khử chất chỉ thị đặc trng màu xanh dùng để địnhlợng nó là 2,6 - diclophenolindophenol trong môi trờng axit đến dạngkhông màu Trong khi đó axit ascorbic lại bị oxy hoá thành axitdehydroascorbic

2,6 - diclophenolindophenol là hợp chất có khẳ năng đổi màu kép mộtmặt khi PH của môi trờng thay đổi từ kiềm qua axit thì màu của chất chỉ thịchuyển từ xanh sang hồng Mặt khác dạng oxy hoá của 2,6 -diclophenolindophenol có màu, còn dạng khử không màu Chính vì vậy sự

có mặt của một lợng thừa chất màu không bị khử trong môi trờng axit sẽlàm cho dung dịch có màu hồng

Sơ đồ phản ứng giữa axit ascorbic và 2,6 - diclophenolindophenol

O C

Trong một phép đo có hạn (n << ) ta nhận đợc các giá trị : X1, X2,

X3 Xn Sau khi loại trừ sai số thô bằng chuẩn Đixan (Q) ta tính đợc giá trịtrung bình X nh sau:

- Chọn trong số các giá trị thực nghiệm đã có một giá trị nào đó và

tP,k : Hàm lợng Studenst với xác xuất p, bậc tự do k (tra bảng)

Vậy khoảng xác định của kết quả là:

2 - So sánh kết quả phân tích với mẫu đã biết hàm lợng

Để kiểm tra một phép phân tích mới có dùng đợc hay không thì chúng

ta tiến hành làm thí nghiệm và nhận đợc giá trị X Sau đó đem so sánh X

với giá trị chuẩn a theo năm bớc sau:

b1: Giả thiết rằng X  a là do nguyên nhân ngẫu nhiên với xác xuất

a

X 

b4: Tìm tlt = tP,k (tra bảng)

b5: So sánh tlt và tTN:

Nếu –tP,k < tTN < tP,k thì X a là do nguyên nhân ngẫu nhiên

Nếu tTN>tP,k hoặc tTN<-tP.k thì X a không phải là ngẫu nhiên

3 Xử lý thống kê các đờng chuẩn.

Để xác định đợc hàm lợng chất phân tích cần phải dựa vào đờngchuẩn biểu thị mối liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ của dung dịch