Xác định hàm lượng vitamin b2 bằng phương pháp trắc quang

Phơng pháp quang phổ có thể dùng để định tính hay định lợng thiamintrong các chế phẩm dợc, đặc biệt trong thuốc tiêm.. Trong thời gian gần đây, việc dùng phơng pháp sắc kí trên giấy rất

Bộ giáo dục và đào tạo

Trờng đại học vinhkhoa hoá học

Giáo viên hớng dẫn: Thạc sĩ Nguyễn Quang Tuệ

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Thọ - 39A Hoá

Vinh, 5-2002

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với:

 Thầy giáo hớng dẫn Thạc sĩ Nguyễn Quang Tuệ đã giao đề tài và hớng dẫn tận tình, chu đáo, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài

 Để hoàn thành đợc đề tài này em còn đợc sự giúp đỡ và góp ý của các thầy cô giáo : TS Nguyễn Khắc Nghĩa; Ths Võ Thị Hoà; cô Phạm Thị Đức - cán bộ phụ tá phòng thí nghiệm, cùng nhiều thầy cô giáo khác trong khoa.

Nhờ sự cố gắng của nhiều nhà hoá sinh học và nhiều nhà sinh lí học màgần 100 năm này trong nhành vitamin học ngời ta đã chiết xuất và phân lập đợctrên 30 loại vitamin khác nhau Ngời ta cũng đã tổng hợp đợc một số lớn cácvitamin bằng con đờng tổng hợp hoá học trong phòng thí nghiệm.

Căn cứ vào tính hoà tan của vitamin mà ngày nay ngời ta chia vitamin ralàm các nhóm sau:

+ Các vitamin hoà tan trong nớc (B1, B2, B5, B6, B12, C, B3, H )

+ Các vitamin hoà tan trong chất béo (A, D, E, K, Q, )

Việc cung cấp không đầy đủ các vitamin cho cơ thể sẽ có ảnh hởng xấukhông những đối với sự làm việc của hệ thần kinh mà còn đối với một số loại cơquan khác ở bên trong cơ thể Vì thế, trong khẩu phần ăn của con ngời phải cógiá trị hoàn chỉnh không những về phơng diện calo, về phơng diện chất đạm, màcòn về phơng diện vitamin nữa

Đối với vitamin B1, B2 nói riêng cũng có vai trò rất quan trọng Để cungcấp đầy đủ và hợp lí đối với cơ thể thì vấn đề đặt ra là cần phải biết đợc hàm l-ợng của nó trong các mẫu thuốc, các loại thức ăn Do đó, cần phải tìm ra cácphơng pháp xác định hàm lợng của chúng

Vitamin B1, B2 có thể đợc định lợng bằng nhiều phơng pháp nh: phơngpháp sinh vật học, phơng pháp hoá học, phơng pháp lí học, Phơng pháp địnhlợng vitamin B1, B2 hầu hết chỉ tiến hành bằng phơng pháp hoá học

Trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm hiện nay, chúng tôi định ợng vitamin B2 bằng phơng pháp trắc quang Phơng pháp này khá phổ biến vì cótính chính xác cao nếu nh tìm đợc các thuốc thử thích hợp và xác định đọc các

l-điều kiện tối u cho phép phân tích

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi định lợng vitamin B2 theo 2 phơngpháp:

+ Phơng pháp dựa trên thiết bị quang phổ tử ngoại của TT Kiểm nghiệmDợc phẩm

+ Phơng pháp cổ điển: xây dựng quy trình để định lợng hàm lợng vitamin

B2 ở phòng thí nghiệm khoa Hoá học

Từ kết quả của 2 phơng pháp có thể rút ra so sánh nên sử dụng phơng phápnào để định lợng vitamin, từ đó ứng dụng để định lợng vitamin B2 trong một sốthực phẩm và dợc phẩm trên thị trờng hiện nay

Phần ITổng quan tài liệu

1 Phân loại vitamin B - Nguồn gốc và vai trò của chúng.

Vitamin B có nhiều loại, mỗi loại có vai trò riêng, có ý nghĩa rất quantrọng đối với sự sống

C

H2

Thiếu vitamin B1 sẽ ảnh hởng đến sự trao đổi gluxit, viêm dây thần kinh, bịbệnh tê phù (beri - beri) Khi mắc bệnh, hàm lợng axit piruvic và -xetoglutarictrong máu cao hơn mức bình thờng.

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Vitamin B1 có nhiều trong thực vật nh men bia, cám gạo, gạo cha xát, ngô,

đặc biệt nhiều hơn trong đỗ tơng, lạc, ngoài ra còn có trong các loại rau nh bắpcải, rau dền, xà lách Trong động vật, vitamin B1 có nhiều trong gan, sữa, lòngtrắng trứng

Nhu cầu vitamin B1 của ngời lớn là 1,5 - 3mg, đối với trẻ em là 0,5 - 2mg

1.2 Vitamin B 2 (riboflavin, lactoflavin).

+ Công thức cấu tạo: (trang sau)

+ Vai trò, chức năng sinh học:

Vitamin B2 là thành phần cấu tạo nên các coenzym sau:

Flavin mono nucleotit (FMN)Flavin ađenin đinucleotit (FAD)

Đó là các coenzym tham gia vào quá trình oxy hoá - khử Vì vậy, thiếuvitamin B2, sự sinh trởng của cơ thể diễn ra không bình thờng Ngoài ra nó còn

ảnh hởng đến sự phát triển của nhiều mô khác trong cơ thể nh da, màng nhầy,bào thai, máu

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu: Vitamin B2 có nhiều trong nấm men, trong rauquả nh rau dền, da hấu, hành tây, súplơ, đậu, thịt, sữa, gan, lòng đỏ trứng.

Nhu cầu vitamin B2 hàng ngày của ngời là 2 - 2,5mg Đối với động vậtnhai lại, nhờ các vi sinh vật đờng ruột có thể tổng hợp đợc vitamin B2 cung cấpcho cơ thể nên chúng không có nhu cầu hấp thụ B2 từ ngoài

1.3 Vitamin B 3 (axit pantoteric):

Nicotinait ađenin đinucleotit (NAD+)

Nicotinamit ađenin đinucleotit photphat (NADP+)

O C

H

CH3

CH3OH O

H

N

COOH

Đó là những coenzym tham gia vào quá trình oxy hoá - khử, vì vậy thiếuvitamin này thì quá trình oxy hoá - khử trong cơ thể bị vi phạm.

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Vitamin PP có nhiều trong gan, thịt, trứng, hạt đậu đỗ, gạo, bánh mì, nấmmen Nhu cầucủa ngời đối với vitamin PP trong một ngày khá cao: 15 - 25mg.Tuy nhiên, một số loài vi sinh vật có thể tổng hợp đợc vitamin PP từ axit aminkhông thay thế là triptophan

Thiếu vitamin B6 sẽ biểu hiện các triệu chứng nh viêm thần kinh, các bệnhngoài da, nôn mửa, đau cơ, suy nhợc

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Vitamin B6 có nhiều trong thịt, sữa, lòng đỏ trứng, cá, men bia và các hạtngũ cốc Nhu cầu vitamin B6 hàng ngày của ngời lớn là 1,5 - 2,8mg, trẻ em là0,5 - 2mg

OH CH

Vitamin B12 có tác dụng chữa bệnh thiếu máu ác tính, nó giúp cho sự hìnhthành huyết cầu tố và hồng cầu, nó tham gia vào các quá trình sinh tổng hợp cácnucleotit, giúp cho các phản ứng metyl hoá.

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Có trong thịt, cá, trứng, sữa,

ở ngời, vitamin B12 đợc dự trữ ở gan (vài mg), đợc tổng hợp nhờ hệ vikhuẩn đờng ruột, vi khuẩn này cũng thấy ở ao, hồ, trong nguồn nớc thải nhàmáy

Nhu cầu 10 - 20  /ngày.ngày

2 Tính chất hoá học của thiamin - Khái quát về phơng pháp định lợng.

2.1 Tính chất

+ Điểm nóng chảy: 246 - 2500C cho đến khi phá huỷ

+ Độ hoà tan:: 100g/ngày.100ml nớc

1g/ngày.100ml etanol 960

không tan trong hexan, ete, axeton

+ Trong môi trờng kiềm, thiamin rất dễ bị phá huỷ Phần thiazol trongphân tử rất dễ dàng bị phá huỷ Thiamin trong môi trờng trung tính và đặc biệt

là trong môi trờng axit tơng đối vững bền

Ngoài không khí bình thờng, thiamin trong dung dịch rất dễ bị oxy hoá Sựoxy hoá dần dần phát sinh ra dạng đisunfua, có tác dụng về phơng diện sinh vậthọc Bằng cách dùng các thuốc thử oxy hoá mạnh nhất phát sinh ra thiocrom làmột chất có huỳnh quang xanh lơ rất rõ Phản ứng này coi nh đợc dùng cơ bảncho phơng pháp định lợng thiamin rất nhạy và tơng đối đơn giản

định rằng đôi khi do ảnh hởng của vi sinh vật tạo nên thiamin ở bộ máy tiêu hoácủa chuột

Thực tế khi định lợng thiamin trong các nguyên liệu thiên nhiên hay trongcác chế phẩm dợc, hầu hết ngời ta dùng phơng pháp định lợng hoá học Phơngpháp hoá học để định lợng thiamin dựa trên sự đo huỳnh quang của sản phẩmoxy hoá của thiamin (thiocrom) Sau đó ngời ta dùng phơng pháp so màu để

định lợng Phơng pháp này cho sản phẩm ngng kết của thiamin với những aminthơm D.Melnik và H Field nghiên cứu phơng pháp này dùng sản phẩm ngngkết với p-aminoaxetophenon Màu phát sinh đem lắc với butanol, xylen hayaxeton Nồng độ màu tăng lên khi có mặt etanol hay phenol Phơng pháp này đ-

ợc cải tiến bằng cách dùng axit sunfanilic điazo hoá và kaliferixianua Côngtrình này làm tăng độ nhạy của phản ứng bởi vì sự có mặt của kaliferixianua tácdụng với axit sunfanilic điazo hoá trong nguyên liệu có amin giao thoa vớithiamin Từ nồng độ màu trớc và sau khi cho ferixianua, có thể định lợng mộtcách tơng đối chính xác lợng thiamin

Về các phản ứng màu khác đối với thiamin có thể cho biết một cách đơnsơ Vitamin B1 với p- đimetylamino benzaldehyd tạo nên một kết tủa đỏ gạchkhi cho bốc hơi trong môi trờng axit Với 2,6- đibromquinon clorimit trong môitrờng dung dịch đệm borat pH 9,6 thiamin cho màu da cam

Định lợng vitamin B1 bằng phơng pháp cân có thể tiến hành theo B.Naiman bằng cách tủa dung dịch thiamin với iodo bitmuto kali Tủa màu dacam tạo thành thực tế không tan trong nớc Sau khi lấy đợc, đem sấy khô và cân.Phơng pháp này tuy vậy đôi khi dùng để định lợng thiamin trong các chế phẩmdợc

Định lợng thiamin tự do bên cạnh dạng este hoá dựa trên độ hoà tan khácnhau của sản phẩm oxy hoá cocacboxylaza với thiamin Từ môi trờng kiềmthiocrom có thể lấy đợc hẳn để định lợng bằng cách lắc với izobutanol, trongkhi đó, sản phẩm oxy hoá cocacboxylaza vẫn ở trong pha nớc Định lợngthiamin đã đợc cân sẵn đáp ứng từ một lợng lớn cocacboxylaza đợc tiến hànhtrên cơ sở định lợng thiamin trớc và sau sự thuỷ phân enzym

2.2.1 Phơng pháp lý học để định lợng thiamin

2.2.1.1 Phơng pháp quang phổ

Phơng pháp quang phổ có thể dùng để định tính hay định lợng thiamintrong các chế phẩm dợc, đặc biệt trong thuốc tiêm Quang phổ hấp thụ vùng tửngoại của thiamin rất đặc hiệu và chịu sự thay đổi đáng kể trong môi trờng nớc

ỏ các pH khác nhau Sự thay đổi sâu xa về quang phổ theo pH rất điển hình vớinhân pyrimidin Trong môi trờng HCl 0,1N thiamin cho một quang phổ hấp thụ

đơn giản với độ cực đại ở bớc sóng 253nm Trong môi trờng đệm axetat pH 3,5

có 2 cực đại ở các bớc sóng 245 nm và 261nm Trong môi trờng đệm photphat

pH 6,6 có 2 cực đại ở cách xa nhau mà ở đó độ tắt của cực đại ở khoảng 265nmthấp xuống đáng kể

2.2.1.2 Phơng pháp cực phổ

K Wiesner là ngời đầu tiên nghiên cứu định lợng thiamin bằng phơngpháp cực phổ đã nhận thấy trong dung dịch thiamin có 2 loại sóng cực phổ:sóng xúc tác trong dung dịch đệm, và sóng anot trong môi trờng kiềm Dungdịch đệm photphat pH 7,3 thích hợp cho việc định lợng Còn về độ nhạy, thì pHnày rất thích hợp bởi vì có thể dùng nồng độ thiamin ở mg/ngày.ml Tuy vậy, việc lựachọn phơng pháp này cũng rất ít vì tất cả chất gây tác nhân phát hiện hiđro trên

điện cực thuỷ ngân nhỏ giọt đều cho làn sóng giống nhau Vì thế chỉ dùng

ph-ơng pháp này cho việc định lợng các chế phẩm dợc, trong khi khả năng định ợng trong các nguyên liệu thiên nhiên bị hạn chế

l-2.2.1.3 Phơng pháp sắc kí định lợng thiamin

Phơng pháp sắc kí là phơng pháp rất căn bản để đạt tới việc định lợngthiamin trong các nguyên liệu thiên nhiên Và nh vậy kể cả phơng pháp sắc kíhấp phụ trên cột đến phơng pháp sắc kí mới nhất trên giấy

Trong sự chọn lọc các phơng pháp định lợng thiamin trong nguyên liệuthiên nhiên, phơng pháp trao đổi ion từ nhóm zeolit do L.R Cevecedo và D.J.Henessy đã dùng chất này để chiết thiamin từ chất dợc liệu

Trong thời gian gần đây, việc dùng phơng pháp sắc kí trên giấy rất thíchhợp và có giá trị đối với việc định lợng thiamin trong nguyên liệu thiên nhiên.Phơng pháp sắc kí giấy có khả năng dễ tách thiamin khỏi các cocacboxylaza.Vấn đề này đợc đặt ra do A Baldantoni, M Spaoloni Dung môi đợc dùng làhỗn hợp izo- butanol, pyridin với nớc, với tỷ lệ 1 : 1 : 1 và 1,1% axit axetic kếttinh đợc, ngời ta tiến hành phát hiện phản ứng thiocrom sau khi oxy hoá thiamin

và cocacboxylaza bằng ferixianua kali Vị trí của vết thiocrom đợc phát hiện do

huỳnh quang phát triển dới ánh sáng tia tử ngoại Việc chuyển dạng thiocromthờng hay đợc dùng để phát hiện thiamin trong sắc kí giấy Nghiên cứu khảnăng mới định lợng các vitamin bằng cách phối hợp các phơng pháp lí học vớisắc kí trên giấy thì cần sử dụng đến khả năng phân chia lớn của phơng pháp sắc

kí trên giấy, và độ nhạy đáng kể của một vài phơng pháp lí học để định lợngmột lợng nhỏ vitamin

2.2.1.4 Định lợng thiamin pyrophotphat bằng phơng pháp manomet.

Năm 1937 - 1938, A S Shultle, L Atkin và các đồng nghiệp đã công bốphơng pháp định lợng thiamin rất nhạy và đặc hiệu dựa trên việc đo thể tích CO2

phát sinh khi có sự lên men của glucoza trong giai đoạn đecacboxyl hoá axitpyrotactrric Nếu ta cho vào men cocacboxylaza (pyrophotphat thiamin) chấtnày sẽ kết hợp với thành phần anbumin của cacboxylaza (men ngoại lai) dựatrên chức năng hoạt động của cacboxylaza gây xúc tác cho sự khử cacboxyaxitpyrotactrric Đo bằng áp kế lợng CO2 phát sinh, và từ lợng đó xác định đợc lợngcocacboxylaza trong mẫu nguyên liệu đem thử G.K Westenbrink và các đồngnghiệp nghiên cứu phơng pháp này để định lợng thiamin pyrophotphat trongmáu, trong các mô và các men Đó là một trong những phơng pháp rất nhậy để

định lợng vitamin

2.2.2 Phơng pháp hoá học định lợng thiamin.

2.2.2.1 Khái quát chung

Trong các phơng pháp hoá học định lợng thiamin, phơng pháp thiocrom

đ-ợc xếp lên hàng đầu Phơng pháp này dựa trên sự đo cờng độ huỳnh quang xanhlơ của sản phẩm oxy hoá của thiamin là thiocrom:

Thiocrom đợc phát sinh do thiamin bị oxy hoá trong môi trờng kiềm Đạt

đợc những điều kiện tốt nhất để đo huỳnh quang khi ta dùng tia tím - tử ngoại ởbớc sóng vào khoảng 365nm B.C.P Jansen là ngời đầu tiên dùng phơng pháphuỳnh quang để định lợng thiamin Jansen đã oxy hoá nớc chiết có chứathiamin bằng dung dịch muối màu đỏ máu Sau đó sản phẩm oxy hoá vừa đợc

N N

CH3

CH3CH

tạo ra đem lắc với izobutanol Nguyên tắc này nói chung là dùng cho phơngpháp huỳnh quang Độ nhạy của phơng pháp đợc nâng lên với thời gian.

D.J Henessyt và các cộng tác viên đã dùng zeolit tổng hợp (pecmutit) đểtách thiamin từ các nguyên liệu thiên nhiên, đã nghiên cứu nâng cao chủ yếu độnhạy của phơng pháp, và loại trừ ảnh hởng của huỳnh quang của các chất phụkhác

Sự hấp phụ thiamin trên nguyên liệu này đợc tiến hành trong môi trờngaxit Henessy và cộng sự tiến hành giải phóng thiamin từ chất trao đổi ion bằngdung dịch amoni nitrat Tiếp theo là sự cải tiến phơng pháp ban đầu của Jansenkhi xác định rằng bên cạnh thiamin tự do còn có cả este của axitpyrophotphoric, ví dụ trong men bánh mì và trong một vài mô tế bào động vật.Tác dụng vi sinh vật của thiamin pyrophotphat tơng đơng với tác dụng củathiamin tự do Khi định lợng bằng phơng pháp thiocrom, cần phải lắc sản phẩmoxy hoá của cocacboxylaza từ môi trờng kiềm với izo - butanol, do lí do trênnên cần phải tiến hành giải phóng thiamin khỏi liên kết của este Muốn vậy,phải dùng một loại enzym khác để thuỷ phân nh: photphataza, takadiastaza vàamylaza cũng cho hiệu quả nh nhau

2.2.2.2 Định lợng vitamin B 1 bằng phơng pháp thiocrom theo "Hội những nhà hoá học về vitamin".

Phơng pháp này tiến hành theo các bớc sau:

+ Chiết: cân một mẫu có chứa khoảng 10 - 40mg thiamin, cho vào bìnhcầu 100ml, thêm 75ml dung dịch HCl 0,1N và đun sôi cách thuỷ 30 phút Mộtmặt trong môi trờng axit thì ít nhất thiamin cũng bị oxy hoá, mặc khác có thểdùng phơng pháp này để chiết toàn bộ thiamin vào dung dịch Đối với nhữngmẫu thử không chứa thiamin liên kết thì có thể không cần thuỷ phân bằngenzym, mà tiến hành ngay sắc kí phân chia

+ Thuỷ phân bằng enzym: nhằm giải phóng thiamin khỏi dây nối este bằngaxit pyrophotphoric Tiến hành thuỷ phân bằng cách dùng sản phẩmtakadiastaza Sau khi thuỷ phân xong, để nguội ở nhiệt độ phòng, pha loãng chovừa đủ 100ml nớc cất, lắng và lọc li tâm để có đợc dung dịch trong

+ Sắc kí: để đẩy nớc trong có lơ lửng chất pecmutit đã chuẩn bị sắc vào cộtsắc kí ở dới đáy có lót bông thuỷ tinh Dùng ống hút nhỏ 25 ml dung dịch lọcaxit hay nớc chiết để cho chảy từ từ Nớc lọc chảy ra bỏ đi Rửa cột 3 lần, mỗi

lần bằng 10ml nớc nóng Trong điều kiện này thiamin đợc giữ trong cột trao đổiion Thiamin giải phóng sau đó đợc tiến hành lấy bằng dung dịch KCl.

Tiến hành chiết thiamin bằng cách rửa cột hai lần với 10ml dung dịch axitkaliclorua cho dung dịch chiết vào bình câù 25ml và đổ đầy dung dịch axit kaliclorua đến ngấn

Hút 5ml dịch chiết axit vào 2 ống nghiệm có kích thớc thích hợp Trongống nghiệm thứ nhất, hút 3 ml dung dịch kiềm kali ferixianua, trộn thêm 15mlizobutanol và lắc mạnh trong 90 giây Bằng phơng pháp oxy hoá này, có thể chooxy hoá toàn bộ thiamin thành thiocrom và đem lắc vào trong lớp izobutanol.Trong ống nghiệm thứ hai, hút 3 ml dung dịch NaOH vào mẫu trắng và sau đó15ml izobutanol Lắc mạnh trong 90 giây; tiến hành những bớc nh vậy với dungdịch thiamin mẫu chuẩn

+ Tách dung dịch thiocrom: tiến hành phân chia izobutanol với lớp nớc; cóthể dễ dàng phân tách 2 lớp ấy bằng ly tâm Rút lớp nớc, thêm vào lớp chiếtizobutanol 23g natri sunfat khan và lắc trong 30 giây

+ Đo huỳnh quang: để tiến hành định lợng, thờng tiến hành xác định kếtquả theo đờng cong đồ thị Để tính đợc nồng độ thiamin trong mẫu cần phải biếtkết quả của 4 lần đo

2.2.3 Định lợng thiamin bằng phơng pháp so màu

Nguyên tắc của phơng pháp này là dựa trên việc đo màu sắc của dẫn xuấtazo của thiamin phát sinh trong quá trình ngng tụ thiamin với các thuốc thử

điazo hoá khác nhau Năm 1934 H Kinersley và R Pekers dùng axit

điazobenzen sunfonic làm các chất điazo hoá Chất azo đợc tạo nên màu đỏ và

đợc đem lắc với butanol và đem so màu Phơng pháp này tiếp tục đợc M.Itvenberg và cộng sự cải tiến tốt hơn, và thực tế họ đã dùng phơng pháp so màunày rất tốt để định lợng thiamin

2.2.4 Định lợng thiamin bằng phơng pháp cân

Thiamin cho những hỗn hợp rất khó tan với axit silicovonframic.D.Adamson và J Handisyde đã dùng phản ứng này để định lợng thiamin bằngphơng pháp cân trong các chế phẩm dợc Thiamin tạo nên một tủa rất khó tanvới reineckat amoni nh một vài chất amin dự phòng và các muối bậc 4 Phảnứng này do B J Bandelin đầu tiên dùng để tách thiamin ra khỏi các chế phẩmdợc Ngời ta cân trọng lợng các kết tủa này để định lợng thiamin

3 Tính chất và phơng pháp định lợng riboflavin (vitamin B 2 )

3.1 Tính chất

+ Độ hoà tan: trong nớc ở 250C: 0,012g trong 100ml

trong cồn etylic tuyệt đối: 0,0045g trong 100ml

trong ete: không tan

trong benzen: không tan

trong hexan: không tan

+ Độ quay cực: []D25 = -1140 (trong NaOH 0,1N)

+ Riboflavin tơng đối vững bền trong môi trờng axit, trong môi trờng kiềm

nó rất dễ bị phá huỷ nhanh Thuốc thử oxy hoá mạnh nh KMnO4, lại càng làmphá huỷ nhanh Các chất khử nh H hoạt động, NaHSO3, TiCl2 khử nó một cáchthuận nghịch thành hợp chất leuco(II) theo công thức dới Riboflavin dới ảnh h-ởng của ánh sáng bị phân huỷ

R

+2e + 2H +

II

3.2 Các phơng pháp định lợng riboflavin

Phơng pháp định lợng riboflavin hầu hết chỉ tiến hành bằng phơng pháphoá học, vì phơng pháp sinh vật học phụ thuộc một cách đáng kể vào tính chấtcủa động vật và tơng đối ít chính xác

+ Phơng pháp sinh vật: ngời ta hay dùng nhất là thí nghiệm sự lớn trênchuột ốm Phơng pháp vi sinh vật học trong những năm gần đây thờng đợc dùng

dể định lợng riboflavin trong những nguyên liệu hiếm về yếu tố đó E E Snell

và F.M Strong và các đồng nghiệp đã viết về phơng pháp dựa trên việc theo dõi

sự phát triển của việc nuôi cấy lactobacillus casei M F Clark và đồng nghiệp

đã nghiên cứu một trong những cải tiến sau này của phơng pháp đó

+ Về phơng pháp lí học, dùng quang phổ tử ngoại và cực phổ để định lợngriboflavin ý nghĩa của phơng pháp này đến nay cũng cha đợc đánh giá đầy đủ + Phơng pháp so màu dựa trên sự đo màu của dung dịch riboflavin cũng làphơng pháp phổ biến, tuy nhiên độ nhạy thực tế rất ít

+ Phơng pháp định lợng riboflavin bằng huỳnh quang dựa trên sự đo huỳnhquang màu của chất đó Nh vậy, cần phải loại trừ ảnh hởng do các chất huỳnhquang mang lại, có thể tiến hành bằng phân tách và sắc kí hoặc định lợng riêngbiệt từng phần huỳnh quang trớc và sau khi khử riboflavin Phơng pháp huỳnhquang rất nhạy và tơng đối đặc biệt rõ rệt Vì vậy, ngời ta dùng để định lợngriboflavin trong một nguyên liệu thiên nhiên Phơng pháp định lợng lumiflavindựa trên sự chuyển riboflavin trong môi trờng kiềm bằng những nguồn chiếusáng mạnh thành những sản phẩm quang học có huỳnh quang màu vàng rất dễtan trong clorofoc, khác với riboflavin không tan trong dung môi này Phơngpháp này rất đặc hiệu, nhng cũng có phần thiếu sót rất cơ bản là sự phân tíchbằng ánh sáng không xảy ra hoàn toàn đợc và hơn thế nữa sản phẩm phân tích

do ánh sáng lumichrom và lumiflavin sẽ bị phân huỷ tiếp ở ánh sáng nh phơngpháp sắc kí giấy đã chứng minh

3

IV III

Sau đây là các phơng pháp lí học và hoá học để định lợng riboflavin.

Để chuẩn bị cho dung dịch riboflavin đo quang phổ, cần phải đảm bảo

điều kiện mẫu phải sấy thật khô (sấy khô trên P2O5 hay ở 1000C trong tối), đemcân và đem hoà tan trong 1ml axit axetic kết tinh, thêm 100ml nớc nóng, thêmnớc vừa đủ 1000ml Pha loãng dung dịch để đo quang phổ bằng HCl 0,01N làmsao để có pH khoảng 3,0 Nồng độ thích hợp để ghi quang phổ là khoảng 4mg

% Để xác định trị số về định lợng, tốt nhất là đo ở bớc sóng cực đại 267nm.Quang phổ hấp thụ vùng tím tử ngoại là tiêu chuẩn cần thiết của dung dịchriboflavin tinh khiết, đợc dùng khi định lợng bằng phơng pháp sinh vật học vàphơng pháp hoá học Sau này phơng pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại đợcdùng coi nh một phơng pháp thử đặc hiệu để xác định các nguyên liệuriboflavin cũng nh các dợc phẩm

3.2.1.2 Cực phổ

Việc nghiên cứu định lợng vitamin B2 bằng cực phổ đã bổ sung rất tốt tínhchất đặc hiệu về hoá học của nó R.Brolica và E Knobloch là ngời đầu tiênnghiên cứu phơng pháp cực phổ để định lợng riboflavin và đã nghiên cứu sự phụthuộc của việc khử riboflavin vào pH Trong phơng pháp cực phổ các tác giả đãnghiên cứu theo dõi sự khử của riboflavin thành dạng leuco trong môi trờngkiềm có dùng NaHSO3 Trong môi trờng axit dùng chất TiCl2

Công tác nghiên cứu cực phổ xác nhận rằng riboflavin là một chất khử oxyhoá thuận nghịch Khi khử riboflavin thành một chất leucolactoflavin cũngkhông làm thay đổi thế oxy hoá khử cực, do vậy nên các đờng cong cực phổ đều

là những đờng cong điện thế tơng đối hoàn chỉnh

Trên đờng cong cực phổ của riboflavin, ngời ta theo dõi những bớc đầu đặcbiệt mà không thấy có ở phơng pháp điện thế Phơng pháp cực phổ đợc coi nh

để nghiên cứu sự phân tích do ánh sáng của riboflavin Lumiflavin đợc khử ở

điện thế giống nh riboflavin, do vậy, hai chất này không thể định lợng cạnhnhau đợc bằng phơng pháp cực phổ Lumicrom bị khử trên điện cực thuỷ ngânnhỏ giọt ở thế âm hơn riboflavin và cũng vì vậy có thể định lợng nó bằng phơngpháp cực phổ cạnh riboflavin

Phơng pháp cực phổ đợc dùng có hiệu quả để định lợng riboflavin trongcác dợc phẩm Phơng pháp này không phù hợp để định lợng riboflavin trong cácnguyên liệu sinh vật học, một mặt là vì riboflavin có trong các nguyên liệu thiênnhiên với nồng độ rất nhỏ, một mặt khác riboflavin ở đó dới dạng kết hợp, nênphơng pháp cực phổ không có tác dụng

Khi dùng phơng pháp cực phổ để định lợng các chế phẩm dợc, vìriboflavin ít hoà tan trong nớc, nên cần cho thêm một chất làm tăng sự hoà tancủa nó Chẳng hạn dung dịch natri salixilat 10% làm tăng sự hoà tan củariboflavin, sự có mặt của chất này không làm ảnh hởng đến việc định lợngriboflavin bằng phơng pháp cực phổ

Việc dùng phơng pháp cực phổ rất thích hợp để kiểm tra hàm lợngriboflavin có trong chế phẩm polivitamin, trong đó có thể tiến hành định lợngthẳng hỗn hợp vitamin nhóm B còn lại Để dịnh lợng riboflavin bằng phơngpháp cực phổ, việc chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh là rất cần thiết Trong thínghiệm dùng phơng pháp cực phổ để định lợng riboflavin một cách chính xác

và đặc hiệu nhất trong công nghiệp dợc thì dùng 100% mẫu chuẩn

3.2.1.3 Sắc ký

Phơng pháp sắc ký có một giá trị để định lợng riboflavin trong các nguyênliệu thiên nhiên, gồm cả phơng pháp pháp sắc ký hấp phụ, và sắc ký phân chia.Trong đó phơng pháp sắc ký trên giấy có giá trị đặc biệt nhất F Weygemel và

K Wacker dùng frankonit làm chất hấp phụ để định lợng riboflavin trong nớctiểu W Neuweiler dùng đất sét nung để định lợng trong sữa Trong những chấthấp phụ khác nhau còn dùng sunfua chì, floridin và một vài loại đất sét hấp phụkhác dùng trong kỹ nghệ (đất sét dùng trong kĩ nghệ chất béo) Để định lợngriboflavin cạnh thiamin R.T Conner và G.J Straub dùng sự phân chia thành 2

hệ hấp phụ, pecmutit (thiamin) và floridin (riboflavin) Huỳnh quang màu vàng