Tài liệu Giống Cây Rừng - Chương 7 pptx

Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật là phương pháp sản xuất hàng loạt cây cøn ft các bộ phân của cây mẹ bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiêm ở điều kiên vô

ce

Chuong VII Nhan giống bằng

phương pháp nuôi cấy mô và tế bao

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

1 Khái niệm

Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực

vật là phương pháp sản xuất hàng loạt cây cøn ft các bộ phân

của cây mẹ bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiêm ở điều kiên vô trùng, có môi trường thích hợp và được kiểm soát

- Bộ phận nuôi cấy có thể là cơ quan, mô hay tế bào Song nói chung chúng có kích thước rất nhỏ, hơn nữa lại được nuôi cấy

trong không øian cũng rất nhỏ (ống nghiệm, bình thí nghiệm)

nên phương pháp nhân giống này còn được gọi là vi nhân giống

- Phương pháp nhân giống này được thực hiện ở điều kiện vô

trùng, với môi trường sống nhân tạo và được kiểm soát nên còn được gọi là nhân giống 77 vitro (nhân tạo)

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

2 Cơ sở sinh học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào

c TB bát đâu phâu hoá

| TB chưa phân hoá (TB phỏi sinh) |

| Các TB có nhâu và TBC gioug | Cac TB co nhân giống nhau có nhau (giông bop tir bau dau) TBC dau dau khác nhau (phân hoá

Tổ bình thành các mô khác nhau)

.—

Mô phân sinh: nhiệm Mô chuyên hoá: thực

vụ xây dựng cơ thẻ hiện các chức nâng

(TB phân chúa và tiếp chuyên hoá để cơ thể tôn

tục phân hoá) quá - tại, sinh trưởng, phát

truah này điện ra suốt triển và sinh sản

đờt nhưng sẽ châm

dan

Chuong VII Nhan giống băng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

+ Tính toàn năng: theo sơ đồ trên thì bất cứ một tế bào nào của cơ thể (ở mô

phân sinh hay mô phân hoá) đều có nhân giống hệt nhân tế bào hợp tử ban đầu, tức là đều mang bộ gen giống hệt bộ gen của hợp tử ban đầu (bộ gen

chứa trong bộ NST) Bởi vậy khi được tách ra khỏi cơ thể và gặp điều kiện

sống thích hợp thì bất cứ tế bào nào đều có thể phát triển thành một cơ thể

hoàn chỉnh

+ Hiên tương phản phân hoá và tái phân hoá: Theo sơ đồ trên, mỗi tế bào ở gial

đoạn ổ tế bào (tb phôi sinh) khi được tách rời ra thì đều có thể phát triển

thành 1 cơ thể hoàn chỉnh gần đầy đủ các cơ quan Vì bất cứ tế bào nào cũng đều có nhân và tế bào chất như hợp tử (hay còn gọi là TB trắng/TB chưa phân hoá) Thế còn khi tách tế bào ra khỏi mô chuyên hoá để nuôi cấy thì từ TB

này sẽ hình thành nên các tế bào mới (qua phân hoá) vẫn theo hướng đã được phân hoá Tức là trong trường hợp này chỉ có hiện tượng sinh trưởng (tăng

sinh khôi của cơ quan cũ) chứ không có hiện tượng phát triển (hình thành cơ quan mới) => từ tế bào nuôi cấy sẽ không hình thành 1 cơ thể hoàn chỉnh

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

3 ý nghĩa của nuôi cây mô - tế bào

- Là phương pháp nhân giống sinh dưỡng nên nó mang đầy đủ các ưu điểm của nhân giống sinh dưỡng

- Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô - tế bào có hệ số nhân cao

- Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô - tế bào được tiến hành một cách chủ động trong mọi điều kiện thời tiết và mọi thời điểm trong năm

- Ngoài ra khác với nhân giống bằng hom thì cây trồng được tạo ra bằng

phương pháp này có độ trẻ cao hơn rất nhiều (gần bằng cây hạt), có bộ rễ tốt

hơn nhiều so với cây hom

- Cây trồng được tạo ra từ phương pháp nuôi cấy mô - tế bào có hình thể giống

cây hạt => khắc phục được hiện tượng "bảo lưu cục bộ " thường bắt gap ở cây trồng được tạo ra bằng giâm hom

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

4 Các hình thức nhân øiống ỉn vitro

4.1 Nuôi cấy mô phân sinh:

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:

+ Nuôi cấy đỉnh thân, đỉnh cành: thường là cho cây là kim

+ Nuôi cấy chổi nách: thường dùng cho những cây lá rộng (vd:

Keo, Bạch đàn rất phổ biến)

+ Nuôi cấychồi bất định: Chồi bất định là chổi được hình thành

từ bất cứ bộ phận nào của cây khi được kích thích (cơ giới hay

hoá học)

- Từ mô phân sinh phát triển trực tiếp thành cây

Chương VII Nhân giống bằng phương

háp nuôi cấy mô và tế bào

4.2 Nuôi cấy mô chuyên hoá: nuôi cấy bất cứ bộ phận nào của

cây (mảnh thân, lá, rễ, đoạn cành, cánh hoa, )

phần phân hoá tát si thành cây

Tu mo phan hoa > 10 Seo: © lao phot soma => thaub

cay

tao plot soma dé tao bat

[tân tạo => thành cây

Chương VII Nhân giống bằng phương

2háp nuôi cấy mô và tế bào

5 qui trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô - tế bào

Huân luyện cầy mồ ———> Cay cay vao bau dat va cham

SỐC ngoài vườn ươm

Chuong VII Nhan gidng băng phương

ohap nudi cay mo va té bao

5.1 Giai doan chuan bi

- Đưa cây tốt (cây ưu việt) về vườn sưu tập, vườn giống

+ Để giảm bớt nguồn cạnh (lai tạp xung quanh)

+ Để có điều kiện chăm sóc cho cây sinh trưởng và phát triển

tot

+ Để chủ động lấy mẫu nhân giống

Việc đưa các cây tốt về vườn sưu tập có thể bằng phương pháp chép hoặc giam hom

- Trẻ hoá cây giống gốc: Để tạo mẫu cấy còn non (trẻ hoá: dựa

trên quá trình tuổi quyết định của các tế bào)

Chương ø VỊI Nhân VII Nhan giống giống băng bằng phương phươn

⁄ A ° " rN aN "` aN

ohap nudi cay mo va té bao

5.2 Giai đoạn cấy khởi động (tạo mâu sạch trong ống nghiệm)

- Muc đích: tạo được mẫu cây sống trong ống nghiệm sạch hoá học cũng như sinh học Tạo được nguồn mẫu sạch (sạch về hoá học và sinh học) sống được trong điều kiện in vitro

+ Sạch hoá học: không làm ảnh hướng đến môi trường hoá học phù hợp với loài cây

+ Sach sinh học: (sạch nấm va vius) vi mau cay chỉ là 1 bộ phận rất nhỏ của cây nên sau khi

tách khỏi cây mẹ cấy vào bình thì nó cần một thời gian để hồi phục sau đó mới sinh trưởng và phát triển Trong khi nấm và vi khuẩn là những sinh vật đơn bào hay đa bào, chúng vào theo

mẫu cấy là vào cả cơ thể nên chúng sinh trưởng và phát triển ngay => sử dụng hết môi trường nuôi cấy => khi mẫu cấy hồi phục thì môi trường đã hỏng

- Phương pháp:

+ Lầm sạch hoá học bằng rửa: đầu tiên tiến hành rửa bằng nước máy, tiếp theo là rửa bằng xà

phòng và cuối cùng là rửa bằng nước cất

+ Lam sach sinh học bằng khử trùng: khử trùng bằng dung dịch canxi hypoclorit 1% hoặc bằng

HgCl, 0,1% trong 5 phút, tuỳ mẫu gia hay non

+ Sau khi rửa và khử trùng thì tiến hành cấy mẫu sạch vào bình chứa trong môi trường hoá học cũng đã được khử trùng (bằng nồi hấp) Việc cấy mẫu được tiến hành trong tủ cấy mô trùng

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

5.3 Tai sinh choi

- Muc đích: kích thích mẫu cấy hình thành chối

để làm vật liệu nhân nhanh

- Phương pháp: Cấy chuyển mẫu cấy sang bình

có chứa môi trường hoá học mới với thành

phần chất điều hoà sinh trưởng kích thích tạo

chổi

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

5.4 Nhân nhanh

- Muc đích: tăng số lượng chổi trong giai đoạn nuôi

cấy (từ I thành vạn chổi, triệu chổi) Đây là giai

đoạn quan trọng nhất trong nhân giống 1n vItro

- Phương pháp: cấy chuyển chồi sang các bình có

chứa môi trường hoá học với thành phần chất điều

hoà sinh trưởng kích thích tạo chồi nhiều lần (từ

chồi thành nhiều chồi/1 bình); 1 bình thành nhiều

bình

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

5.5 Tao ré cho cây (tạo cây hoàn chỉnh)

- Mục đích: từ mỗi chổi tạo thành 1 cây con hoàn

chỉnh gồm đầy đủ thân, rê và lá

- Phương pháp: cấy chuyển các chổi sau giai đoạn

nhân nhanh sang các bình có chứa môi trường hoá

học có thành phần chất điều hoà sinh trưởng kích

thích tạo rễ Tất cả các lần cấy chuyển để tái sinh

chồi, nhân nhanh và tạo rễ đều phải được thực hiện trong buồng cấy vô trùng

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

5.6 Huấn luyện cây mô

- Muc đích: làm cho cây mô quên dần với điều kiện tu nhiên (nhiệt độ, ánh sáng và tình trạng nhiễm bệnh)

- Phương pháp:

+ Đưa dần các bình cấy cây hoàn chỉnh từ trong phòng nuôi (có điều kiện vật lý thích hợp) ra khu huấn luyện (có điều kiện vật lý hoàn toàn tự nhiên)

+ Mở dần nắp bình để cho cây thích nghi dẫn với

điều kiện tự nhiên

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

5.7 Cay cay vao bau dat va cham sóc cây ở vườn ươm

- Mục đích: tạo cây con dé đưa vào sản xuất

- Phương pháp:

+ Lấy cây ra khói bình nuôi cấy, rửa sạch môi trường

hoá học bám vào rễ cây

+ Cấy cây vào bầu đất giống như cấy cây con từ hạt

hoặc giam hom

+ Chăm sóc cây: giống chăm sóc cây hom

Cay me > Lay mau > GD chuẩn bị (Tạo chồi)

\ GÐ nhân nhanh chồi >| GD tao ré cho choi

Cay mam Huấn luyện trong nhà kính

Cây con ở vườn ươm rừng

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

Những vấn đề nảy sinh trong nhân gidng in vitro

5.1 Sự nhiễm mẫu

- Trong quá trình nhân giống mẫu có thể bị nhiễm nấm hoặc virus

=> do đó phá huy môi trường (ăn hết môi trường dinh dưỡng) => khi mẫu cấy phục hồi thì môi trường dinh dưỡng đã bị phá =>

mẫu cấy không sinh trưởng và phát triển được

- Khắc phục:

+ Thay đối chế độ khử trùng (dung dịch khử trùng và thời gian khử trùng)

+ Sử dụng mô phân sinh để làm mẫu cấy (vì mô phân sinh là

phần cơ thể mới hình thành nên chưa bị nhiễm nẫm hay virus)

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

6.2 Sản sinh chất độc từ mâu cấy

- Mẫu cấy có thể bị hoá nâu, hoá đen rồi chết Do

trong mẫu cấy chứa nhiều tanin (chất chat)

- Khắc phục: dùng mẫu cấy còn non để cấy, bổ

sung vào môi trường hoá học than hoạt tính

(hút các chất độc ra khỏi mẫu cấy)

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

0.3 Hiện tượng thuỷ tỉnh hóa

- Trong trường hợp cây mô trở nên mọng nước, có thân và lá

trong suốt => không quang hợp được => cây chết

- Khác phục:

+ Tăng nồng độ đường trong môi trường hoá học (do có hiệ

tượng thầm thấu nồn độ đường cao sẽ hút nước ra khỏi tế

bào)

+ Tăng cường độ ánh sáng, giam nhiệt độ trong phòng nuôi + Giảm nồng độ chất chứa nitơ trong môi trường hoá học

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

6.4 Tính bất định về di truyền

- Nếu tiến hành cấy chuyển mẫu (chỉ trong trường hợp

mô sẹo) qua nhiều thế hệ thì càng ở những thế hệ sau

ở mẫu cấy càng xuất hiện đột biến soma với tần số

cao Nguyên nhân là do tế bào mô seo có trạng thái

gidng té bào phôi sinh nên rất trẻ => khi được chuyền

qua nhiều thế hệ thì bộ gen của chúng dễ dàng thay

đổi

- Khắc phục: không cấy chuyển mẫu qua nhiều thể hệ

(không nhân mô sẹo qua nhiều thể hệ)

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

7 Môi trường nuôi cấy

7.1 Môi trường hóa học (môi trường chứa trong ống nghiệm bình tam giác)

7.I.I Chức năng của loại môi trường này

- Là môi trường dinh dưỡng cho mẫu cấy và cây mô (thay cho đất ngoài tự nhiên)

- Là giá thể đề cấy mẫu

- Để điều tiết quá trình sinh trưởng và phát triển của mẫu

theo ý muốn của con người

7.].2 Thành phần của môi trường

.!.2.I Chất đính dưỡng: bao gồm O5 yếu tố

Chuong VII Nhan gidng băng phương

ohap nudi cay mo va té bao

* Đường:

- Chức năng:

+ Cung cấp cacbon để cho mẫu cấy tổng hợp các chất hữu cơ

tạo nên chất nguyên sinh của tế bào => tế bào sinh trưởng => tế bào sinh sản (phân hoá) => mô hay mẫu cấy sinh trưởng (trong

tự nhiên cây tự tổng hợp được đường bằng quá trình quang hợp) + Nguồn nguyên liệu cho quá trình hô hấp để sản sinh năng

lượng cho mẫu cấy thực hiện các phản ứng trao đổi

- Chủng loại và liều lượng: có thể dùng đường sacarose hay

ølucose với nồng độ 20 — 30s/lít dung dịch môi trường

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

* Các nguyên tố đa lương

- Chức năng: Tham gia cấu tạo nên các chất hữu cơ trong tế bào

=> tạo chất nguyên sinh => sinh trưởng và phát triển

- Chung loại và liều lượng: đó là các chất hữu cơ như N, P, K, Ca,

Mg, S với liều lượng > 30mg/lít dung dịch môi trường

* Các nguyên tố vỉ lương

- Chức năng: tham gia vào cấu tạo của enzym phức (đóng vai trò

nhóm ngoại của enzym) => xúc tác các phản ứng trao đổi chất

trong tế bào => tế bào sinh trưởng và phát triển

- Chủng loại và liều lượng: đó là các nguyên tố Fe, Cu, Mn, Zn,

Bo, I, Co với liều lượng < 30mg/lít

Chương VII Nhân giống bằng phương

0háp nuôi cấy mô và tế bào

* Cac vitamin

- Chức năng: là tiền chất để tạo nên các coenzym, mà coemzyn là loại

nhóm ngoại điển hình của enzym phức => vitamin tham gia vào hoạt

động xúc tác các phản ứng trao đổi chất của emzym phức

- Các loại và hàm lượng sử dụng trong nhân giống In vItro:

+ Nhóm B (BI, B2, Bó): được sử dụng với hàm lượng 0,01 —

0,lmg/lít môi trường

+ Myo-inositol (chat này bền với nhiệt độ cao): được sử dụng với

hàm lượng 50 — 500mg/lít môi trường

+ Vitamin C: được sử dụng với hàm lượng Ï - 10mg/lit môi trường

Lưu ý: Các loại vitamin cần phải được bảo quản lạnh trước khi sử dụng