Tài liệu Giáo trình sinh sản gia súc - chương 5 pdf

CHƯƠNG V.KỸ THUẬT GÂY RỤNG TRỨNG VÀ CẤY TRUYỀN PHÔI CHO GIA SÚC Mục đích: Giới thiệu các bước cơ bản trong cấy truyền phôi cùng các kỹ thuật như siêu bài noãn và gây động dục nhân tạo

CHƯƠNG V.

KỸ THUẬT GÂY RỤNG TRỨNG VÀ CẤY TRUYỀN PHÔI CHO

GIA SÚC

Mục đích: Giới thiệu các bước cơ bản trong cấy truyền phôi cùng các kỹ thuật

như siêu bài noãn và gây động dục nhân tạo cho gia súc Ngoài ra trong chương này cũng trình bày tóm tắt các kỹ thuật khác đang được ứng dụng trong sinh sản: xác định giới tính tinh trùng và phôi, thụ tinh ống nghiệm

Thời lượng giảng dạy: 9 tiết

I Khái niệm

Cấy truyền phôi là quá trình đưa phôi từ gia súc cái này sang gia súc cái khác (gia súc cái cho phôi sang gia súc cái nhận phôi) Phôi vẫn sống, phát triển bình thường trên cơ sở trạng thái sinh lí sinh dục của gia súc nhận phôi phù hợp với trạng thái sinh lí sinh dục của gia súc cho phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi (sự phù hợp này gọi

là đồng pha)

Cấy truyền phôi là một quá trình điều khiển sinh sản và phát triển của con vật một cách trực tiếp ở giai đoạn tiền phôi và phôi Đây là biện pháp tạo giống hoàn chỉnh nhất tổng hợp một lúc các thành tựu sinh học sinh sản và di truyền hiện đại

Hình 50 Đàn bò được tạo ra từ kỹ thuật CTP

II MỤC ĐÍCH, Ý NGHĨA VÀ LỢI ÍCH CỦA CẤY TRUYỀN PHÔI

- Khai thác triệt để tiềm năng di truyền ở những cá thể cái cao sản thông qua việc lấy phôi của chúng Trên cơ sở đó phổ biến nhanh những gene tốt, quí ra thực tế

- Nâng cao cường độ chọn lọc, làm tăng tiến bộ di truyền hàng năm, do đó thúc đẩy công tác giống nhanh, đạt được mục đích

- Nâng cao hiệu quả chọn lọc, đẩy mạnh công tác giống

- Bảo quản phôi gọn nhẹ, vận chuyển dễ dàng, đồng thời cũng là kho bảo tồn quĩ gen

- Hạn chế được bệnh tật thú y, thông qua việc chọn lọc và nuôi dưỡng gia súc, vô trùng trong quá trình xử lí và cấy truyền phôi

- Mang lại hiệu qủa kinh tế rất cao

III CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA CẤY TRUYỀN PHÔI

1 Cơ sở lí luận

1.1 Cơ chế điều hòa chu kì sinh dục (Xem sơ đồTK-TD điều khiển chu kì động dục ở

gia súc cái)

1.2 Đặc điểm phát triển của phôi ở giai đoạn đầu

Sau khi thụ tinh, sự phân chia của phôi bắt đầu và rất nhanh, nó phân chia theo cấp

số nhân Qua các giai đoạn phôi bào, phôi dâu, phôi nang, phôi vị và các lá phôi

Trong quá trình phân chia của phôi, tế bào phôi không lớn lên và kích thước, các phôi bào thì nhỏ đi Ở bò trong qúa trình vừa phân chia vừa vận động về tử cung Thời gian quá ống dẫn trứng khoảng 3-5 ngày Khi phôi vận động về tử cung thời gian đầu (khoảng 6-10 ngày), nó trôi nổi tự do trong tử cung Dinh dưỡng thời gian này cho quá trình phát triển của phôi là từ trứng và sữa tử cung Lợi dụng giai đoạn này để

người ta thu hoạch phôi Qua ngày thứ 10 trở đi bắt đầu dần dần định cư vào sừng tử cung để phát triển Dinh dưỡng từ đây trở đi phụ thuộc vào cơ thể mẹ Giai đoạn này không lấy được phôi

Tóm lại: Từ các vấn đề đã nêu trên có thể rút ra những nhận xét quan trọng chỉ đạo thực tiễn:

- Có thể tiến hành gây siêu bài noãn để nâng cao sức sinh sản của bò cái cao sản, thông qua xử lí hợp lý kích tố sinh sản

- Có thể thu gom được hợp tử khi chúng chưa làm tổ

- Có thể đưa hợp tử vào tử cung của những con cái khác đồng pha sinh lý với trứng như thế mới phù hợp yêu cầu phát triển của trứng - phôi thai, thông qua sự làm tổ và cầu nối nhau thai

2 Cơ sở thực tiễn

2.1 Hiện nay con người đã chế tạo thành công một loạt hormon sinh dục như: FSH,

LH, Ostrogen, Progesteron, Prostaglanding Với những hormon đó, con người có thể sử dụng nó để điều hòa chu kì sinh dục nhân tạo, các qúa trình sinh lí sinh sản của gia súc

2.2 Các nhà khoa học đã nghiên cứu ra phương pháp sản xuất những dụng cụ thu lượm phôi và xây dựng được cả những qui trình thu lượm, đánh giá và phân loại phôi

2.3 Tạo ra được môi trường nuôi cấy trứng và hợp tử ở ngoài cơ thể gia súc Phương pháp bảo tồn phôi đông lạnh

2.4 Đã có nhiều cơ thể sinh vật ra đời từ phương pháp cấy truyền hợp tử và thụ tinh trong ống nghiệm:

Phương pháp cấy truyền hợp tử và thụ tinh trong ống nghiệm không chỉ thành công trên gia súc mà nó cũng thành công tương đối phổ biến trên người, đặc biệt ở một số

nước tư bản như Mĩ [1, 2]

IV KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ CẤY TRUYỀN PHÔI TRÊN BÒ

Tổng quát kĩ thuật của công nghệ cấy truyền phôi như sau :

1 Chọn cái cho phôi

Cái cho phôi phải đạt yêu cầu sau:

+ Phải đặc cấp hoặc cấp kỉ lục (tùy theo mục đích sản xuất mà chọn cho phù hợp) + Chú ý khi chọn cần quan tâm đến các tính trạng có hệ số di truyền cao

+ Các biểu hiện về mặt sinh lí sinh sản phải bình thường (chu kì sinh dục phải bình thường, biểu hiện động dục phải điển hình, khả năng sinh đẻ phải tốt)

+ Lí lịch phải rõ ràng

+ Trước khi siêu b ài noãn phải theo dõi được hai chu kì

2 Chọn cái nhận phôi

+ Không cần nái cao sản

+ Các biểu hiện sinh lí, sinh sản phải bình thường

+ Khả năng sinh đẻ tốt

+ Có thể cùng giống hoặc khác giống

3 Kỹ thuật tạo chu kì động dục, gây siêu bài noãn ở gia súc cái cho phôi, gây động dục cùng pha ở cái nhận và các nhân tố ảnh hưởng

3.1 Kỹ thuật tạo chu kì

động dục

Nếu trong chương trình cấy

phôi có nhiều bò cho phôi,

thì cần phải gây động dục

đồng pha những con bò

này Những bò cho phôi

đang ở ngày 8-14 của chu

Phải nhận biết được động

dục của tất cả bò cho phôi

và lựa chọn những con ở

giữa ngày 8-14 của chu kỳ

để đưa vào chương trình

cấy phôi

Tiêm một liều

prostaglandin:

Phải nhận biết được động

dục của tất cả bò cho phôi,

loại bỏ những con ở ngày

3-4 của của kỳ và tiêm cho

tất cả những con còn lại bằng một liều prostaglandin (PG) để gây động dục đồng pha

Tiêm 2 liều prostaglandin:

Tiêm tất cả bò cho bằng một liều PG ở ngày 1 Sau đó 11 ngày tiêm PG lần 2 Quan sát động dục trong 4-5 ngày Bắt đầu gây rụng nhiều trứng 10 ngày sau khi động dục của đa

số bò cho phôi

Synchromate-B:

Đặt SMB ở ngày 1, prostaglandin vào sáng ngày 9 và rút SMB vào chiều cùng ngày Quan sát động dục trong 3 ngày Đưa tất cả bò động dục vào chương trình cấy phôi

3.2 Kĩ thuật gây siêu bài noãn (rụng trứng nhiều)

Nguyên tắc của siêu bài noãn khá đơn giản, đó là làm cho nhiều noãn xuất hơn bình thường bằng cách dùng kích dục tố ở thời điểm quan trọng của nang noãn đang phát triển Sau đó, kiểm soát sự thoái hóa thể vàng, gây xuất noãn đồng loạt, thụ tinh nhiều noãn và phát triển phôi giai đoạn sớm phần lớn bò đáp ứng tốt nếu xử lý trong ngày 8-

14 của chu kỳ sinh dục

Điều quan trọng là phải sờ khám buồng trứng của bò cho phôi một ngày trước khi bắt đầu tiến hành gây rụng nhiều trứng để đảm bảo chắc chắn sự có mặt của thể vàng vì

một số gia súc, mặc dầu có biểu hiện tất cả các triệu chứng động dục, nhưng không

rụng trứng Hiện tượng này phổ biến ở bò Bos indicus hơn so với ở bò Bos taurus Gây

rụng nhiều trứng ở những gia súc kém như thế sẽ dẫn đến không rụng trứng, tỷ lệ thu phôi kém và chất lượng phôi kém

Những sản phẩm để gây siêu bài noãn bao gồm:

- Huyết thanh ngựa chửa (PMSG)

Thông thường người ta dùng một liều PMSG 1.500 – 3.000 UI vào giữa thời kỳ thể vàng của chu kỳ (ngày thứ 10 – 12) Một liều PGF2α được gây thoái hóa thể vàng được tiêm vào 2-3 ngày sau Bò có thể động dục sau khi tiêm PGF2α 2 ngày Như thế, bò động dục

tử lúc tiêm PMSG khoảng 4 ngày

- FSH

Có chứng cứ cho thấy tiêm FSH làm tăng đáp ứng của thú so với PMSG Qui trình thông dụng nhất hiện nay là tiêm FSH mỗi ngày 2 mũi (cách nhau 12 giờ) trong thời gian 4 ngày (thường giảm liều dần) Thời gian bán rã của FSH ước tính khoảng 5 giờ Trong nhiều năm qua, liều FSH là 5, 5, 4, 4, 3, 3, 2 mg và sau đó là 2 mg PGF2α (có thể tiêm vào lân tiêm FSH thứ 5 hoặc 6) để làm thoái hóa thể vàng

- hMG, human menopausal gonadotropin (kích tố từ phụ nữ mãn kinh)

hMG có tác dụng như FSH lẫn LH Gần đây người ta khẳng định rằng một liều tiêm

450-600 UI hMG trong polyvinylpyrrolidone đủ để gây siêu bài noãn [3]

4 Phối giống cho cái cho phôi

Sau khi tiêm FSH và

thường bò sẽ động dục vào ngày thứ 5, 6 (kể từ lúc bắt đầu tiêm) Ta sẽ phối giống bằng phương pháp thụ tinh nhân tạo bào thời điểm 9-24 giờ kể từ lúc bắt đầu có biểu hiện động dục

5 Thu hoạch phôi

5.1 Thời gian thu hoạch phôi trong khoảng 5-9 ngày sau khi phối (tốt nhất là vào ngày thứ 7 - 8)

5.2 Kỹ thuật thu hoạch phôi

A Phương pháp thu hoạch phôi bằng phẫu thuật (Rowson và Newcomb, 1975)

B Phương pháp thu hoạch phôi không phẫu thuật

- Nguyên tắc: đưa dụng cụ và dung dịch gội rửavào tử cung Đưa dụng

cụ bào vị trí lấy phôi sau đó bơm dung dịch gội rửa vào và hút dung dịch gội rửa ra Phôi sẽ ra ngoài theo dung dịch gội rửa và ta sẽ thu lượm được

- Phương pháp:

a Cho gia súc nhịn ăn 24 giờ trước khi gội rửa

b Chuẩn bị dụng cụ: thuốc vô trùng, dung dịch gội rửa, catheter, các dụng cụ xử lí và bảo quản phôi sau khi lấy ra khỏi cơ thể gia súc

c Cố đinh gia súc và gây tê lõm khum đuôi bằng dung dịch Novacain 3%

d Đưa Catheter qua âm hộ vào bị trí lấy phôi (gội rửa từng sừng một)

đ Dùng dung dịch gội rửa đưa vào với dung lượng cho một sừng tử cung từ 200-500

ml (có thể dùng box hoặc xanh bơm vào và lấy ra)

e Bơm không khí vào Catheter (lượng không khí tùy theo to nhỏ của tử cung)

+ Ưu điểm: tiện lợi, dễ làm, đảm bảo an toàn cho gia súc

+ Nhược điểm: không biết số lượng chính xác của phôi, lượng phôi lấy ra được ít

6 Kỹ thuật cấy truyền phôi

+ Cố đinh gia súc

+ Vệ sinh phía sau bộ phận sinh dục của gia súc

+ Chuẩn bị dụng cụ cấy truyền phôi và phôi

1.6.1 Kỹ thuật cấy truyền phôi bằng phương pháp phẫu thuật

Kỹ thuật này giống thụ tinh nhân tạo (tiện lợi, dễ làm, an toàn)

* Chú ý: nếu cấy một phôi nên cấy ở sừng tử cung bên phải, còn nếu cấy hai phôi thì cấy ở cả hai sừng

2.6.2 Kỹ thuật cấy truyền phôi bằng phương pháp phẫu thuật

+ Vị trí phẫu tthuật (tại vị trí phẫu thuật để thu hoạch phôi)

+ Tiến hành phẫu thuật, đưa

tử cung ra ngoài

+ Tiến hành cấy phôi

* Chú ý: cũng như cấy truyền không phẫu thuật nếu cấy ở sừng tử cung bên phải, còn nếu cấy hai phôi thì cấy ở cả hai sừng

+ Đưa tử cung lại vị trí ban đầu

+ Khâu vết mổ lại (khâu giống như sau khi phẫu thuật thu hoạch phôi)

+ Công tác hậu phẫu và chăm sóc nuôi dưỡng

* Chú ý: dù cấy truyền bằng phương pháp nào thì trước khi cấy cũng phải xác định trạng thái sinh lí của cái nhận phôi và tuổi của phôi (trạng thái sinh lí sinh sản của cái nhận phải tương đương với trạng thái sinh sí của phôi) + Kiểm tra chất lượng phôi trước khi cấy

7 Khám thai sau cấy truyền phôi

Sau khi cấy truyền phôi ta theo dõi chu kì động dục của gia súc

- Nếu gia súc động dục trở lại thì không có kết quả

- Nếu gia súc không động dục trở lại ta tiến hành khám thai

a Dùng phương pháp siêu âm

b Dùng phương pháp khám thai qua trực tràng

c Chẩn đoán bằng phương pháp hóa nghiệm

V Cấy truyền phôi cho dê cừu

Tóm tắt

Những lợi ích đáng quan tâm đã đạt được trong 25 năm qua trong việc tạo phôi cừu-dê

và kỹ thuật cấy truyền phôi Bài này đề cập đến các kỹ thuật được sử dụng để vượt qua

sự dao động của phản ứng buồng trứng sau khi sử lý bằng gonadotrophin ngoại lai, sự không đồng pha của rụng trứng, không thụ tinh ở con cái có phản ứng rụng trứng cao,

và ảnh hưởng phụ khi sử lý lặp lại (vết thương phẫu thuật, gonadotrophin và kháng thể)

ở cừu, sử lý trước kháng gonadotrophin đã cho tỷ lệ rụng trứng cao do loại bỏ không phản ứng và tăng sản lượng phôi gấp đôi Có thể hiểu rõ hơn mối quan hệ giữa chất lượng tế bào trứng và đặc tính nang trứng sau khi gây rụng trứng nhiều bằng các kỹ thuật in-vitro Những hiểu biết này sẽ được sử dụng tiếp theo để đạt được sự tối ưu về sản lượng phôi cần thiết cho cải tiến di truyền gia súc và phát triển các kỹ thuật sinh học mới

1 Giới thiệu

Khả năng cấy truyền phôi được báo cáo lần đầu tiên vào giữa những năm 1950 bởi Rowson và đồng nghiệp của ông trường đại học tổng hợp Cambridge Kỹ thuật này đã cung cấp phương tiện để kiểm tra ở cừu, trong điều kiện có kiểm soát, về tầm quan trọng của các yếu tố di truyền và môi trường lên sự phát triển của phôi Các thí nghiệm cấy truyền phôi đã chứng minh điều quan trọng của tình trạng môi trường tử cung đối với sự sống của phôi và nơi mà phôi phải có mặt trong tử cung ở ngày thứ 12,5 sau động dục ở cừu để ngăn cản sự thoái hoá của thể vàng Nghiên cứu ở cừu cắt buồng trứng ở thời điểm cấy phôi 3-4 ngày sau khi phối với cừu đực vô sinh đã chứng minh rõ ràng sự cần thiết của phân tiết progestrerone sau rụng trứng, nhưng vai trò đối với estradiol trong sự di chuyển của phôi hay sự sống sót của chúng không thể chứng minh được Cấy phôi giữa các giống có thời gian mang thai khác nhau đã chứng minh rằng kiểu gen xác định thời gian mang thai Nghiên cứu liên quan đến sử lý phôi hai tế bào đã chứng minh rằng mỗi phôi bào có thể phát triển độc lập Khía cạnh quan trọng khác của cấy phôi là khả năng ngăn cản sự lây truyền bệnh tật từ con cho phôi bị truyền nhiễm cho đời con của chúng từ phôi của chúng và tạo ra con cừu-dê thông qua tiêm tế bào

ICM vào xoang bào Các kỹ thuật áp dụng trong thời gian đó đã chứng minh có thể có giá trị và đã được sử dụng trong nhiều năm làm công cụ nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm, nhưng áp dụng của chúng đối với chăn nuôi tiểu gia súc nhai lại đòi hỏi phải cải tiến Cấy phôi rất có lợi đối với việc nhập khẩu gia súc ở dạng phôi đông lạnh và số lượng tương đối lớn phôi cừu và dê được cấy đã được báo cáo ở úc và Nam Phi Smith (1986) đã gợi ý rằng MOET (gây rụng trứng nhiều và cấy phôi có thể có lợi cho việc thúc đâỷ tiến bộ di truyền cao hơn cho mỗi tính trạng có liên quan Tuy nhiên, sự chấp nhận của kỹ thuật này trong chăn nuôi cừu và dê vẫn còn chậm, chủ yếu do sự dao động của phản ứng buồng trứng đối với xử lý gây rụng trứng nhiều

2 Tăng hiệu quả của kỹ thuật gây rụng trứng nhiều

Do thực tế rằng cừu dê là những gia súc sinh sản theo mùa nên chúng không phải lúc nào cũng biểu hiện động dục Vì lý do đó nên sử lý trước bằng progestagen sau đó bằng gonadotrophin đối với con cho phôi Không có sự khác biệt giữa những con cừu được gây rụng trứng nhiều bằng hai CIDR và những con cưù được sử lý bằng xốp có tẩm progestagen, nhưng sản lượng phôi thấp hơn sau khi gây động dục đồng pha bằng một CIDR hay xốp có tẩm progestagen ở liều thấp

Các chế phẩm gonadotrophin được dùng cho gây rụng trứng nhiều

Gonadotrophin đầu tiên được dùng rộng rãi cho gây rụng trứng nhiều là PMSG (bây giờ được gọi là gonadotrophin nhau thai ngựa, eCG) Gonadotrophin nhau thai ngựa được tiêm (liều ở giữa 1000 và 2000 IU) 1 hay 2 ngày trước khi rút progestagen bằng một liều tiêm cơ do thời gian bán sinh trong cơ thể của chúng dài Tác động kéo dài của hocmôn này có thể làm cho nguy cơ các nang trứng không rụng cao cùng với làm tăng mức estradiol của các nang trứng này Estrogen này được coi là làm thay đổi sự di chuyển của giao tử trong đường sinh dục và vì vậy làm giảm tỷ lệ phôi thu được ảnh hưởng phụ như thế được giảm bằng trung hoà eCG bằng kháng thể monoclon sau khi bắt đầu kích thích nang trứng Tiêm GnRH lúc động dục có thể là một cách thay thế cho việc tiêm kháng eCG Thay đổi các sự kiện nội tiết và làm chín các tế bào trước lúc trưởng thành

có thể giải thích cho hiệu quả kém của eCG

Từ khi chế phẩm FSH có sãn, nhiều nghiên cứu so sánh hiệu quả với eCG đã được thực hiện ở những nghiên cứu này và những nghiên cứu được tiến hành ở các loài khác, FSH được coi là gonadotrophin ưu việt hơn so với eCG về sự rụng trứng và tỷ lệ thụ thai và lượng phôi có chất lượng tốt Mối quan hệ giữa phương pháp gây rụng trứng nhiều và liều hocmôn đối với các chế phẩm thương mại khác nhau FSH tuyến yên cừu

và lợn đã sãn có 6 dến 8 lần tiêm với khoảng cách 12 giờ bắt đầu 2 hay 3 ngày trước khi rút progestagen được yêu cầu do thời gian bán sinh của chúng ngắn (5 giờ đối với pFSH) Nhiều cố gắng đã được thực hiện để làm đơn giản hóa kỹ thuật này bằng một lần tiêm gonadotrophin để tiết kiệm thời gian và sức lực, pFSH được hoà tan hay không hoà tan trong PVP (polyvinylpyrrolidone), một dẫn suất tác động lâu Không may rằng những số liệu này không được khẳng định bởi các tác giả khác Tiêm một liều FSH kết hợp với liều eCG vừa phải (400-800IU) có thể vượt qua những bất lợi của mỗi gonadotrophin và được sử dụng rộng rãi một cách thương mại ở Australia

Trong giữa những năm 1980, người ta đã chứng minh rằng các chế phẩm pFSH có thể biểu hiện mức giao động lớn về tỷ lệ hoạt lực của FSH và LH và một lượng LH cao đã ảnh hưởng ngược lên phản ứng của buồng trứng, tỷ lệ thụ thai và chất lượng phôi ở cừu

và bò Ngày nay, oFSH và pFSH tinh khiết đã có sãn Tuy nhiên, một lượng LH tối thiểu

là cần thiết sau khi rút progestagen (FSH/LH :0,3-0,4 ở hai lần tiêm cuối cùng, tương ứng, đặc biệt là trong mùa không sinh sản ở cừu và dê, để tăng phản ứng rụng trứng nhiều và số phôi có khả năng cấy thu được

Gây rụng trứng nhiều lặp lại và thu phôi

Các kỹ thuật thu phôi bằng phẫu thuật đối với cừu và dê được sử dụng ngày nay tương

tự với các kỹ thuật đã được xuất bản trước đây Lôi đường sinh dục ra ngoài thường dẫn đến viêm dính sau phẫu thuật, làm giảm sản lượng phôi ở lần phẫu thuật lặp lại sau

đó Với sự phát triển của các phương pháp không phẫu thuật liên quan đến việc sử dụng nội soi, bây giờ có thể thu phôi nhiều lần từ một con cái mà không bị viêm dính sau phẫu thuật Tuy nhiên, gây rụng trứng nhiều lặp lại bằng pFSH ở dê thường đi cùng với việc xuất hiện các kháng thể kháng FSH và giảm tỷ lệ rụng trứng sau lần điều trị thứ ba Tuy nhiên, phản ứng gây rụng trứng nhiều được duy trì ở dê bằng điều trị nhiểu lần với một chế phẩm FSH của cừu

Sự dao động trong phản ứng gây rụng trứng nhiều

Phổ biến ở bò là mức độ dao động cao về tỷ lệ rụng trứng và số phôi thu được sau khi gây rụng trứng nhiều đã được chứng minh, dao động này trong phản ứng là yếu tố hạn chế chính trong các chương trình cấy phôi ở tiểu gia súc nhai lại Những con cho phôi không có phản ứng (<5 trứng rụng) (cừu :20%; dê :10%) không có giá trị đối với thu phôi dường như là các yếu tố mùa vụ, di truyền và dinh dưỡng làm cho dao động kết quả gây rụng trứng nhiều không kể đến các kỹ thuật gây rụng trứng nhiều được sử dụng ảnh hưởng của dinh dưỡng không đủ lên sự thoái hoá của thể vàng trước lúc trưởng thành

đã được báo cáo nhưng các cơ chế gây ra điều đó vẫn cần phải nghiên cứu thêm Tuy nhiên, sự đóng góp của dao động sinh lý như tình trạng của quần thể nang trứng ở thời điểm bắt đầu điều trị gonadotrophin cũng không thể loại bỏ Gần đây rBST (recombinant bovine somatotrophin) sãn có và cùng với hocmôn sinh trưởng (GH) trong việc điều hoà sinh trưởng của nang trứng ở bò đã được báo cáo Điều trị bò hậu bị với GH trước các hocmôn gonadotrophin dẫn đến phản ứng gây rụng trứng nhiều tốt hơn và tăng số lượng phôi có thể cấy ở cừu, mặc dầu số lượng cho thấy tăng số lượng nang trứng 2-3mm sau khi điều trị GH, tỷ lệ gây rụng trứng nhiều do gonadotrophin không bị thay đổi

so với không điều trị GH ở dê, điều trị bốn tuần bằng rBST không có ảnh hưởng đến chức năng buồng trứng và không ảnh hưởng đến eCG gây tỷ lệ rụng trứng Mức độ của phản ứng buồng trứng với pFSH ở cừu có liên quan dương với số lượng các nang trứng nhỏ 1-2mm và có liên quan âm đến số lượng các nang trứng lớn hơn, khi quan sát bằng nội soi ngay trước khi tiêm gonadotrophin Vì thế, điều trị trước hai tuần bằng GnRH agonist (Buserelin) có thể tăng số trứng rụng và giảm sự dao động phản ứng với pFSH giữa những gia súc bằng việc ức chế các nang trứng lớn (Bảng 1)

Bảng 15 ảnh hưởng của hai tuần tiêm 50μg/ngày Buserelin lên số trứng nhỏ(1-2mm) và nang trứng lớn (3-5mm) có mặt trước khi điều trị pFSH và lên phản ứng gây rụng trứng

nhiều đối với pFSH

Điều trị

Số lượng cừu

Số lượng các nang trứng nhỏ ?SD/cừu

Số lượng các nang trứng lớn ?SD/cừu

7.3?1.3

0

13.2?5.5 19.2?4.1 P<0.05

Tiêm GnRH antagonist (0,5mg/ngày trong 10 ngày) cũng có thể được sử dụng để thay thế Buserelin với cùng hiệu quả và được sử dụng thường xuyên ở chương trình cấy phôi Lacaune ở Pháp (bảng 2)

Bảng 16 Tỷ lệ rụng trứng, sản lượng phôi và khả năng sống của phôi sau khi cấy phôi

tươi cho con nhận ở cừu Lacaune

Tỷ lệ trứng thụ tinh

Tỷ lệ phôi thoái hoá

Tỷ lệ phôi

có khả năng cấy

Số phôi có khả năng cấy/con cho

Tỷ lệ cừu được sinh ra/số phôi cấy

Số cừu cho phôi :26

Các kết quả này khẳng định những kết quả đã đạt được nhiều năm trước đây của Brebion và cs (1992), những người đã đạt được sản lượng phôi cao hơn và số cừu sinh

ra trên mỗi con cho cao hơn khi sử dụng GnRH antagonist trước khi điều trị (12,5 và 8,2)

so với các kết quả của các kỹ thuật cấy truyền phôi hiện nay (6,8 và 4,5 tương ứng)

Không thụ tinh sau gây rụng trứng nhiều

Thụ tinh thành công của cái cho phôi cũng phụ thuộc vào sự đồng pha giữa thời gian phối giống và rụng trứng Giảm sự dao động của thời gian rụng trứng và tăng tỷ lệ trứng rụng có thể đạt được bằng tiêm GnRH ở một thời gian cố định sau khi rút progestagen Tuy nhiên, sau khi gây rụng trứng bằng GnRH một đợt bùng nổ rụng trứng mới đã quan sát được 12-14 giờ sau đợt bùng nổ thứ nhất ở 60% những cừu được điều trị Một phương pháp thay thế khác là sử dụng GnRH antagonist sau 12 giờ rút mút tẩm progesterone, tiếp theo bằng lần tiêm pLH 24 giờ sau Điều này giống như một đợt dâng lên trước rụng trứng và cho phép phối giống theo chương trình ở dê được gây rụng trứng nhiều

Một yếu tố chính ảnh hưởng đến số lượng phôi tốt đạt được sau khi phối giống cho cừu được gây rụng trứng nhiều là tỷ lệ trứng thụ tinh ở con cho có nhiều hơn 10-12 trứng rụng Sau khi phối giống qua tử cung hay âm đạo, tỷ lệ thụ tinh ở con cho phản ứng cao

là thấp, thậm chí sau 2 hay 3 lần phối giống, do sự di chuyển của tinh trùng bị giảm qua

cổ tử cung Vì vậy, tỷ lệ thụ tinh cao có thể đạt được bằng phẫu thuật bằng cách đưa

trực tiếp đưa tinh trùng vào sừng tử cung Gần đây, thụ tinh trong tử cung bằng vi phẫu thuật sau 48 giờ rút xốp có tẩm progesterone và cho kết quả thụ tinh cao và tần xuất thấp phôi bị thoái hoákhông kể đến tỷ lệ rụng trứng, cho thấy khả năng bẩm sinh của tế bào trứng để được thụ thai không bị tổn thương bằng gây rụng trứng nhiều với FSH

3 Tạo phôi trong ống nghiêm

Mới chỉ một thập kỷ trôi qua kể từ khi sinh ra những con cừu và những con dê sau khi thụ tinh ống nghiệm (IVF) Các kỹ thuật nuôi chín ống nghiệm (IVM) các tế bào trứng, sự thụ thai của chúng bằng tinh trùng đã được hoạt hoá trong ống nghiệm và nuôi cấy trong ống nghiệm (IVC) những phôi được tạo ra đã thành công cả ở cừu và dê Mặc dầu các

kỹ thuật sử dụng cho tạo phôi trong ống nghiệm ở gia súc nhỏ nhai lại dao động giữa các phòng thí nghiệm, những phần quan trọng nhất của kỹ thuật được coi là hoạt hoá tinh trùng và nhiệt độ và pH của môi truờng nuôi cấy được thực hiện Hepảin rất quan trọng trong hoạt hoá tinh trùng bò trong ống nghiệm, đã được sử dụng thành công ở dê

và cừu Tuy nhiên, chất lượng phôi tạo ra trong sự có mặt của heparin vẫn là một câu hỏi, vì chỉ có 25% (5/20)phôi nang đã cấy sinh ra dê con sống so với 61% (11/18; P<0.05) của nhóm đối chứng, mà ở đó tinh trùng được hoạt hoá bằng huyết thanh đã được sử lý nhiệt Những khác biệt giữa con đực và nguy cơ đa tinh trùng giữa các thí nghiệm (10-20%) đã được chứng minh Tuy nhiên, sau khi loại bỏ những tế bào trứng có nhiều tinh trùng, trung bình 60-70% các tế bào trứng cừu và dê thụ thai bình thường có thể đạt được trong ống nghiệm Gần đây, có thể đạt được tỷ lệ phân chia trong ống nghiệm tương đương với tỷ lệ phân chia trong cơ thể, mà không có mặt các tế bào soma trong hệ thống môi trường nuôi cấy không có huyết thanh Các nghiêm cứu trước đây đã chỉ ra rằng rào cản sự phát triển ở giai đoạn 8-16 tế bào có thể vượt qua bằng việc cùng nuôi cấy với các tế bào ống dẫn trứng Tỷ lệ có chửa cao đã đạt được sau khi cấy (2 phôi nang trên con nhận) phôi có nguồn gốc nuôi cấy trong môi trường ống dẫn trứng tổng hợp (SOF) có BSA và axit amin hay SOF có bổ xung FCS (bảng 3)

Bảng 17 Ảnh hưởng của bổ xung môi trường SOF với 10% huyết thanh thai bê (FCS) 2

ngày sau thụ tinh (dpi) lên tỷ lệ phát triển và khả năng sống sau khi cấy phôi cừu tạo ra trong ống nghiệm

% phôi nang 8dpi

Số phôi nang được cấy

Có chửa lúc 50 ngày

Có chửa lúc sinh

%bê sinh

ra trên phôi nang cấy

5/8 8/8

44(7/16) 80(11/15)

*Số tế bào trứng IVM/IVF/IVC ở mỗi nhóm =230

Người ta đã báo cáo rằng cấy phôi cừu tạo ra trong SOF bổ xung 20% huyết thanh người làm cho thời gian có chửa dài hơn và trọng lượng so sinh cao hơn so với mong đợi bình thường Những khuyết tật này rõ ràng không quan sát thấy sau khi nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh

Với những tiến bộ gần đây về phương pháp những trứng rụng được thụ tinh và nuôi cấy trong ống nghiệm tạo ra 60-70% phôi nang, tỷ lệ đó gần với tỷ lệ phát triển quan sát được trong cơ thể Khi sử dụng các tế bào nuôi chín trong ống nghiệm tỷ lệ phát triển giảm xuống xấp xỉ một nửa Nguyên nhân chính vẫn là việc lựa chọn những tế bào trứng

có khả năng chín trong ống nghiệm, thụ tinh và phát triển tiếp theo Kích thươcs của nang trứng mà ỏ đó có tế bào trứng cần phải được quan tâm khi thu tế bào trứng cho IVM.Đạt được khả năng phân bào và khả năng phát triển tiếp theo bởi tế bào trứngxuất hiện trong giai đoạn sinh trưởng của nang trứng Tế bào trứng từ nang trứng nhỏ và trung bình cho tỷ lệ phôi nang thấp hơn so với phôi nang từ những nang trứng lớn ở cừu có gen gây chết Booroola, sự phát triển của các tế bào trứng từ một kích thước nang trứng đã cho tốt hơn so với quan sát được đối với các tế bào trứng thu được từ kích thước tượng tự ở con cái có kiểu gen hoang dại Điều này cho thấy một gen có thể điều khiển động thái của sự chín nguyên sinh chất của tế bào trứng bên trong nang trứng phát triển Trong cơ thể, khả năng của tế bào trứng có thể được kiểm soát bởi môi trường nang trứng như đã được dẫm chứng bằng những thí nghiệm của Moor và cs (1993) cho thấy 6 giờ đầu tiên xảy ra bên trong nang trứng cừu được kích thích bằng LH

là quan trọng đối với khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng Khả năng phát triển của tế bào trứng ước lượng sau IVF/IVC cũng có liên quan với tần suất nhịp LH ở cuối pha nang trứng của chu kỳ động dục ở cừu Bản chất chính xác của các yếu tố nang trứng điều khiển sự đạt được của tiềm năng phát triển bằng tế bào trứng chín vẫn chưa được biết mặc dầu một số yếu tố sinh trưởng, hocmôn và các peptides trong buồng trứng được coi là các ứng cử viên

Phương pháp đầu tiên đề cử cho sự nuôi chín tế bào trứng bên ngoài nang trứng là cùng nuôi cấy 24 giờ hỗn hợp cumulus- tế bào trứng (COC) với các tế bào hạt trong môi trường có bổ xung FSH, LH, estradiol và huyết thanh thai bê trong những điều kiện không ổn định Hệ thống này đã được mở rộng đến các tế bào trứng của dê Tuy nhiên, đơn giản hoá môi trường nuôi chín các tế bào trứng cừu và dê là có thể, bổ xung dịch nang trứng cừu và dê (10%) và FSH (100ng/ml) vào M199 Sự thành công của quá trình nuôi chín (24 giờ ở cừu, 27 giờ ở dê) có thể bị ảnh hưởng bởi sự lựa chọn tế bào trứng

và nhiệt độ tối ưu (38,5 -390) thu tế bào trứng từ buồng trứng ở lò mổ bằng cách hút hay cắt cho 1,5-2 COC có thể dùng được trên mỗi buồng trứng cừu hay dê Cắt nhỏ buồng trứng là một phương pháp hiệu quả hơn đối với thu một số lượng lớn COC (6COC/ buồng trứng), nhưng các tế bào trứng thu được thêm từ những nang trứng nhỏ ít có khả năng phát triển sau IVF Trung bình 9COC trên mỗi trứng được cắt (bao gồm 4COC từ những nang trứng lớn hơn 5mm) có thể đạt được với dê được sử lý trước bằng FSH Khi thu tế bào trứng lặp lại được thực hiện bằng phương pháp ovum pick-up bằng hút nội soi sau khi sử lý trước bằng FSH, 3 hay 4 COC đạt được trên mỗi buồng trứng ở cừu và dê tương ứng tới Báo cáo của Ruacura về thu phôi thu phẫu thuật các tế bào trứng cừu cho thấy đến 57% các tế bào trứng có thể phát triển thành phôi nang, sinh ra 1,5 cừu con trên mỗi cừu cái được hút Cũng như ở bò, thu các tế bào trứng lặp lại từ cừu sống và dê sống có thể là quan trọng trong sự phát triển của các chương trình cải tiến giống có hiệu quả Bây giờ có khả năng nuoi chín và thụ tinh các tế bào trứng trước tuổi trưởng thành ở cừu và dê, cho phép giảm khoảng cách thế hệ

4 Kỹ thuật phôi

Cấy truyền phôi

Cấy truyền phôi tạo ra trong cở thể hay trong ống nghiệm vào sừng tử cung của cái nhận có thể đạt được một cách tin tưởng bằng phương pháp nội soi Kỹ thuật này giảm thời gian cho mỗi lần cấy phôi và tỷ lệ có thai tương tự (70-75%) với phương pháp mổ ổ bụng ở đường giữa dưới bụng Trong ngữ cảnh áp dụng các phương pháp không phẫu thuật đôí với lý do bảo vệ sức khoẻ gia súc, cấy phôi qua cổ tử cung đã được cố gắng thực hiện ở cừu và dê Tuy nhiên, tỷ lệ có chửa vẫn còn quá thấp để có thể áp dụng được kỹ thuật này

Đông lạnh phôi

Thành công đầu tiên sau khi cấy phôi đông lạnh-giải đông đã đạt được 23 năm trước đây Phôi đầu tiên được giữ trong môi trường có dimethylsulphoxide (DMSO) như là chất bảo vệ lạnh, nhưng ethylel-glycol đã nổi lên như là một chất bảo vệ lạnh siêu trội với tỷ lệ sống sót cao hơn đạt được khi cấy phôi tươi và nó có khả năng cấy trực tiếp phôi sau khi giải đông Phôi cừu và dê có khả năng sống sót với kỹ thuật tạo pha lê và nghiên cứu thêm về phương pháp naỳ có thể cung cấp một phương pháp thay thế có kinh tế cho các phương pháp đông lạnh hiện nay đòi hỏi làm mất nước của các tế bào phôi một cách từ từ Những kết quả khuyến khích đã đạt được về tỷ lệ sống sót của phôi cừu tạo pha lê-giải đông tạo ra trong cơ thể và phôi dê tạo ra trong ống nghiệm (Bảng 18)

Bảng 18 Tỷ lệ có chửa và sự sống sót của phôi tạo ra trong cơ thể (in vivo) và trong ống

nghiệm (In vitro) và phôi cừu và phôi dê tạo pha lê

Loài Loại phôi Số

phôi cấy

Số con nhận Tỷ lệ có chửa (%)

ngày 40

Tỷ lệ có chửa lúc sinh

Tỷ lệ phôi sống (%) Cừu

Cắt phôi và cloning

Cắt phôi được dùng cả để tăng số lượng phôi từ những con cái cho được lựa chọn và

để tạo ra những gia súc giống hệt nhau để sử dụng như là mô hình của thí nghiệm Các phương pháp đã thay đổi đáng kể trong những năm gân đây và đặc biệt từ khi những nghiên cứu của Willadsen với mục đích tạo ra sinh đôi đồng hợp tử từ phôi giai đoạn 2

tế bào sau khi tách phôi bào, đưa vào agar và cấy vào một con chủ trung gian Giảm số lượng tế bào phôi một nửa từ giai đoạn phôi dâu chặt và phôi nang thoát màng không ảnh huưởng đến sự sống của phôi Thực tế, sự phân chia tế bào ở giai đoạn muộn hơn không ảnh hưởng nghiêm trọng lên sự phát triển tiếp theo của nửa phôi thu được, khi

phôi được chia đôi cân sứng Chỉ có những phôi có chất lượng rất tốt mà những phôi đó đạt ít nhất đến giai đoạn phôi dâu chặt ở tuổi tương ứng với sự phát triển bình thường được lựa chọn để cắt phôi Các cặp phôi một nửa được cấy càng nhanh càng tốt băng

kỹ thuật nội soi cho những con nhận đã gây đồng pha ở điều kiện này, tỷ lệ có chửa tương đương với tỷ lệ có chửa đạt được khi cấy phôi nguyên vẹn, hơn một nửa số có chửa sinh đôi, và hiệu quả chung ở trường hợp con sinh ra trên phôi được cắt gần 100% (bảng 5)

Bảng 19 Cắt phôi và cấy phôi cừu

Phôi cắt sau khi thu ở ngày 8-ngày 10

Cừu nhận (2 x nửa phôi/con nhận)

Con nhận có chửa ở ngày 18

5 Kết luận

Nhiều tiến bộ gần đây trong công nghệ cấy truyền phôi như đã áp dụng đối với gia súc nhỏ nhai lại cũng như thiết lập các phương pháp hiệu quả đối với gây rụng trứng nhiều ở con cho và sử dụng các kỹ thuật nội soi để rửa và cấy phôi đã tăngkhả năng ứng dụng

kỹ thuật này ở cừu, Sự dao động của phản ứng rụng trứng có thể giảm tôi thiểu bằng kiểm soát sinh trưởng của nang trứng bằng điều trị trước kháng gonadotrophin trước khi gây rụng trứng nhiều Tăng 2 lần số cừu trung bình sinh ra trên mỗi con cho đạt được với điều trị trước này đã thúc đâỷ sử dụng hiệu quả hơn cấy truyền phôi trong chương trình sinh sản ở cừu Các kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, mà kỹ thuật đó tạo phôi ở các giai đoạn đặc biệt với giá tối thiểu, là cần thiết cho sự phát triển của các kỹ thuật mới như cloning và chuyển nhân Có chứng cứ cho thấy nuôi chín tế bào trứng trong ống nghiệm của những tế bào trứng chưa chín là một hạn chế chính trong việc sử dụng phôi tạo ra trong ống nghiệm trong các động vật nuôi Hiểu biết hơn về cơ chế tương tác của

tế bào soma-tế bào trứng là cần thiết để giải quyết vấn đề này

VI Cấy truyền phôi cho lợn

Trong chương này chúng tôi sẽ mô tả quá trình chuẩn bị lợn cho phôi (con cho), bao gồm lập kế hoạch thu phôi, chọn lợn nái, chăm sóc trước khi thu phôi, và nuôi dưỡng lợn nái sau khi thu phôi phẫu thuật Để đảm bảo chắc chắn phôi được thu đúng giai đoạn phát triển đáp ứng mục đích dự định, và để đảm bảo tất cả các tính trạng di truyền cần thiết có thể đạt được dưới các điều kiện kiểm soát bệnh tật, chúng tôi sẽ chú ý đến thời điểm thu phôi, giống của con cho, các biện pháp kiểm soát dịch bệnh, phương pháp gây động dục, đàn đực giống di truyền được sử dụng để phối giống hay thụ tinh nhân tạo, tình trạng kiểm soát bệnh tật của đực giống

Trang bị và hoá chất

Sản phẩm Mục đích và phương pháp sử

dụng

eCG: Gonadotropin nhau thai ngựa (trước

đây gọi là gonadotropin huyết thanh ngựa

chửa - PMSG)

Gây động dục ở con cho phôi

hCG: Gonadotropin nhau thai người Gây động dục ở con cho phôi

1 Các bước tiến hành trước khi thu phôi (hình 1)

2 Chuẩn bị kế hoạch thu phôi

Khi chuẩn bị thu phôi, cần quan tâm đến nhiều yếu tố, bao gồm giai đoạn phát triển của phôi, phương pháp thu phôi, giống và chất lượng con cho phôi, tình trạng kiểm soát bệnh tật con cho phôi, phương pháp gây động dục, giá trị di truyền của đực giống được

sử dụng để phối giống hay dẫn tinh, các biện pháp kiểm soát bệnh tật của đực giống v.v Bảng 1 liệt kê thời gian thích hợp để thu phôi, phụ thuộc vào việc sử dụng phôi

Bảng 19 Thời gian tối ưu và các giai đoạn phát triển để thu phôi lợn

Thời điểm thu phôi Phôi được sử dụng

như thế nào

Sau khi tiêm hCG

Sau động dục tự nhiên

Giai đoạn phát triển của phôi thu được

Vị trí dội rửa

Tạo lợn chuyển

gen thông qua vi

tiêm ADN vào tiền

nhân

48-56 giờ Ngày 1 - 2 Giai đoạn tiền

nhân Giai đoạn 1 tế bào

Ống dẫn trứng

Đưa các gen mới

vào đàn lợn