Đề xuất biện pháp kỹ thuật chuyển giao quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh trichoderma atroviride phòng trừ nấm mốc hại lạc ở quy mô nông hộ

Chính vì vậy, việc tìm hiểu và nghiên cứu chế phẩm trichoderma atroviride nhằm phòng trừ nấm mốc Aspergillius flavus trên cây lạc là một giải pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng tích cực,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

-*** -

ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP KỸ THUẬT CHUYỂN GIAO QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI

SINH Trichoderma atroviride PHÒNG TRỪ NẤM

MỐC HẠI LẠC Ở QUY MÔ NÔNG HỘ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NGÀNH: KHUYẾN NÔNG VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

Người thực hiện: Lê Thị Thanh Bình Lớp: 49K3 - KN&PTNT Người hướng dẫn: ThS Trần Hậu Thìn

KS Hồ Thị Nhung

VINH, 5.2012

LỜI CAM ĐOAN

Tên tôi là Lê Thị Thanh Bình, với đề tài nghiên cứu: “Đề xuất biện pháp kỹ

thuật chuyển giao quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh Trichoderma atroviride phòng trừ nấm mốc hại lạc ở quy mô nông hộ” Tôi xin cam đoan luận văn này là

do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của giảng viên Ths.Trần Hậu Thìn và giảng viên Hồ Thị Nhung, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này hoàn toàn trung thực và chưa sự dụng để bảo vệ một công trình khoa học nào, các thông tin, tài liệu trích dẫn trong đoạn văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Vinh, ngày 14 tháng 5 năm 2012

Tác giả

Lê Thị Thanh Bình

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ tận tình của các cá nhân, tập thể Nhân đây tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: Thầy giáo Ths Trần Hậu Thìn - người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận

Giảng viên Hồ Thị Nhung – người đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Các thầy cô giáo khoa Nông – Lâm – Ngư trường Đại học Vinh đã dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập và cho tôi nhiều lời khuyên để hoàn thành nghiên cứu Các thầy cô và các cán bộ Trung tâm thực hành thí nghiệm khoa Nông – Lâm – Ngư trường Đại học Vinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu của đề tài

Các cán bộ Phòng Nông nghiệp huyện Nam Đàn, UBND Xã Khánh Sơn, UBND

Xã Nam Trung, UBND Xã Nam Cường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu tại cơ sở

Bà con và khuyến nông viên các xã được chọn làm địa điểm nghiên cứu, đã giúp

đỡ tôi trong quá trình thu thập thông tin nghiên cứu để hoàn thành luận văn này Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu của các tập thể

và cá nhân đã dành cho tôi

Vinh, ngày 14 tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Lê Thị Thanh Bình

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN 0

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ HÌNH VẼ viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

Chương 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 5

1.1 Cơ sở lý luận 5

1.1.1 Vai trò của nấm Trichoderma sp 5

1.1.1.1 Vai trò của quần thể nấm Trichoderma sp trong đất 5

1.1.1.2 Vai trò của nấm Trichoderma sp trong việc xử lý hạt giống 6

1.1.1.3 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng và làm phân bón 6

1.1.2 Tính năng của Trichoderma trong phòng trừ sinh học 7

1.1.3 Nghiên cứu về nấm Trichoderma atroviride 8

1.2 Cơ sở thực tiễn 10

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 10

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 11

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu 11

1.2.2.2 Tình hình sản xuất và sử dụng 13

1.2.3 Mô tả chủng Trichoderma atroviride Tri.020(2).NC 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 15

2.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 15

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Tìm hiểu khả năng chuyển giao và ứng dụng chế phẩm Trichoderma

atroviride trong việc phòng trừ bệnh hại cây trồng 15

2.2.2 Tìm hiểu phương pháp sản xuất chế phẩm áp dụng cho quy mô nông hộ 15

2.2.3 Đề xuất một số giải pháp chuyển giao và ứng dụng chế phẩm 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp điều tra hộ sản xuất lạc 16

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 16

2.3.2.1 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sản xuất giống 16

2.3.2.2 Hoàn thiện công thức môi trường rắn sản xuất 17

2.3.2.3 Xác định nhiệt độ và thời gian sấy chế phẩm 18

2.3.3 Môi trường PDA và phương pháp cấy nấm từ PDA sang PDA 19

2.3.4 Phương pháp thu chỉ tiêu môi trường rắn 21

2.3.4.1 Chỉ tiêu theo dõi môi trường rắn 21

2.3.4.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 21

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 23

2.4 Điều kiện cơ bản của khu vực nghiên cứu 23

2.4.1 Điều kiện tự nhiên của huyện Nam Đàn 23

2.4.1.1 Vị trí địa lý 23

2.4.1.2 Đặc điểm khí hậu 23

2.4.1.3 Tài nguyên đất 24

2.4.2 Điều kiện kinh tế, xã hội của huyện Nam Đàn 25

2.4.2.1 Điều kiện xã hội 25

2.4.2.2 Điều kiện kinh tế 26

2.4.2.3 Hoạt động sản xuất trồng trọt và chăn nuôi 26

Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Kết quả đi điều tra tình hình sản xuất lạc 28

3.1.1 Tình hình sản xuất lạc tại các xã Khánh Sơn, Nam Trung, Nam Cường 28

3.1.2 Khả năng chuyển giao và ứng dụng chế phẩm Trichoderma atroviride trên địa bàn 35 3.2 Kết quả các thí nghiệm biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm vi sinh

Trichoderma atroviride phòng trừ nấm mốc hại lạc trong phòng thí nghiệm 39

3.2.1 Lựa chọn được phương pháp sản xuất giống phù hợp nhất 39

3.2.2 Lựa chọn loại dụng cụ nhân nuôi thích hợp nhất 41

3.2.3 Lựa chọn thời gian thu sinh khối của T atroviride Tri.020.NC 43

3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến chất lượng chế phẩm 44

3.3 Những thuận lợi và khó khăn trong sản xuất và chuyển giao chế phẩm Trichoderma atroviride ở địa bàn nghiên cứu 46

3.3.1 Thuận lợi và khó khăn khi sản xuất và chuyển giao kỹ thuật sản xuất chế phẩm quy mô nông hộ 46

3.3.1.1.Thuận lợi 46

3.3.1.2 Khó khăn 46

3.3.2 Hướng khắc phục những tồn tại và khó khăn trong việc chuyển giao và ứng dụng 47

3.4 Đề xuất biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm và phương thức chuyển giao cho nông dân 48

3.4.1 Biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm Trichoderma atroviride quy mô nông hộ 48

3.4.2 Đề xuất phương thức chuyển giao quy trình sản xuất chế phẩm Trichoderma atroviride cho nông dân 49

3.4.2.1 Xây dựng mô hình sử dụng chế phẩm Trichoderma atroviride phòng trừ nấm mốc hại lạc 49

3.4.2.2 Chuyển giao biện pháp kỹ thuật sản xuất chể phẩm vi sinh Trichoderma atroviride quy mô nông hộ 50

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 51

1 Kết luận 51

2 Khuyến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

I TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 53

II TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 54

PHỤ LỤC

T viride Trichoderma viride

T atroviride Trichoderma atroviride

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số nấm bệnh mà T atroviride kiểm soát được 9

Bảng 2.1 Diện tích và Năng suất cây trồng năm 2010 của huyện Nam Đàn 26 Bảng 3.1 Cơ cấu diện tích, năng suất, sản lượng lạc của 3 xã nghiên cứu qua phỏng vấn hộ nông dân 31 Bảng 3.2 Chi phí đầu tư cho 1 sào lạc qua phỏng vấn hộ nông dân 32 Bảng 3.3 Những dịch hại chính và cách phòng trừ trên cây lạc qua phỏng vấn 33 Bảng 3.4 Nhu cầu thực tiễn được chuyển giao kỹ thuật sản xuất chế phẩm của các

hộ nông dân 38 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của môi trường nhân giống đến khả năng sinh trưởng của nấm

T atroviride Tri.020.NC 39

Bảng 3.6 Khả năng phát sinh bào tử sau thời gian nhân nuôi 40

Bảng 3.7 Khả năng phát triển sợi nấm T atroviride Tri.020.NC trên môi trường cơ

chất trong các dụng cụ nuôi 41

Bảng 3.8 Khả năng phát sinh bào tử nấm T atroviride Tri.020.NC trên môi trường

cơ chất trong các dụng cụ nuôi 42

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phát sinh bào tử của T.atroviride44 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến chất lượng chế phẩm nấm T atroviride

Tri.020.NC 44

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng của chế phẩm nấm T

atroviride Tri.020.NC 45

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Cơ chế đối kháng của Trichoderma đối với nấm bệnh 7

Hình 1.2 T atrovirider 020(2).NC sau 5 và 7 ngày cấy 14

Hình 1.3 Bào tử và cành phát sinh bào tử của nấm T atroviride Tri.020(2).NC 14

Hình 2.1 Mô tả cấu tạo buồng đếm hồng cầu 21

Hình 3.1 Khả năng sinh trưởng của T atroviride Tri.020.NC 39

Hình 3.2 Khả năng phát sinh bào tử trên các môi trường giống 40

Hình 3.3 Nhân sinh khối nấm T atroviride Tri.020.NC trong các dụng cụ nuôi 41

Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng của nấm T atroviride Tri.020.NC trong các dụng cụ nuôi sau 3 ngày 42

Hình 3.5 Khả năng phát sinh bào tử trên môi trường rắn ở các dụng cụ nuôi 43

Hình 3.6 Mối tương quan giữa nồng độ bào tử và thời gian nhân nuôi 44

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ sấy đến chất lượng chế phẩm 45

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Một trong những tồn tại lớn của sản xuất nông nghiệp đang được quan tâm hiện nay là việc sử dụng quá nhiều thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học Tình trạng này nếu cứ tiếp diễn sẽ đi ngược lại mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững và an toàn mà chúng ta đang nỗ lực tiến tới Theo kết quả điều tra của Tổng cục Môi trường, Việt Nam đang còn khoảng 1.153 điểm với 864 khu vực

bị ô nhiễm do POP (hợp chất hữu cơ khó phân hủy ), trong đó có 185 khu vực được đánh giá bị ô nhiễm nghiêm trọng và đặc biệt nghiêm trọng Cuộc khảo sát còn cho thấy, có tới 96,6% nông dân sử dụng hóa chất BVTV quá mức cho phép trong hướng dẫn sử dụng trên nhãn, gần 95% nông dân đổ các bình phun hóa chất còn thừa vào các rãnh, mương, phun vào các loại cây trồng khác hoặc tiếp tục sử dụng đến hết Chỉ có 4,8% nông dân biết tiêu huỷ đúng cách hóa chất bỏ đi, 38,1% chôn bao bì hóa chất BVTV sau sử dụng, nhiều người khác vùi bao bì tại các cánh đồng, vào các kênh, rãnh, mương, ao hoặc bán cho người thu gom phế liệu hoặc sử dụng vào mục đích khác (theo khảo sát của Tổng cục Môi trường – Bộ tài nguyên môi trường 2009) Thực tế sản xuất cho thấy, do người dân quá lạm dụng việc sử dụng thuốc hoá học để phòng trừ sâu bệnh trong sản xuất nông nghiệp đã ngày càng làm bộc lộ mặt trái của nó Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật làm ảnh hưởng xấu đến môi trường, ảnh hưởng tới sức khoẻ con người và gây thiệt hại kinh tế trong sản xuất nông nghiệp Một số thuốc trừ nấm dùng nhiều đã gây ra sự huỷ diệt côn trùng trong đất, tạo nên tính kháng thuốc ở một số nấm bệnh hại cây trồng Để giảm bớt những tác động xấu lên môi trường mà vẫn bảo đảm lương thực cho con người, các nhà khoa học đã khuyến cáo phát triển nền nông nghiệp hữu cơ và tạo ra các sinh

vật hữu ích Vai trò của chế phẩm sinh học, trong đó có vi sinh vật trong sản xuất

nông nghiệp được thừa nhận có các ưu điểm sau:

 Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng Không gây ô nhiễm môi trường sinh thái

 Có tác dụng cân bằng hệ sinh thái ( vi sinh vật, dinh dưỡng ) trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

 Ứng dụng các chế phẩm sinh học không làm hại kết cấu đất, không làm chai đất, thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

 Có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông sản phẩm

 Có tác dụng tiêu diệt công trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc BVTV có nguồn gốc hóa học khác

 Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu cơ bền vững, các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

Việc sử dụng phân bón hữu cơ kết hợp với các vi sinh vật có ích như

Trichoderma, Azotobacter, Pseudomonas ,… sẽ giúp cho đất khỏe mạnh hơn, hệ

sinh thái đất được "phục hồi" sẽ làm giảm nguy cơ gây bệnh cho cây trồng

Việt Nam là đất nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm và sản xuất nông nghiệp ở trình độ hạn chế, đây là điệu kiện thuận lợi cho sự phát sinh, phát triển của nấm mốc

gây bệnh cây trồng như Aspergillus flavus và độc tố Aflatoxin Aflatoxin là độc tố

và là tác nhân gây ung thư Có 4 loại Aflatoxin, trong đó độc nhất là Aflatoxin B1 (AFB1), nó có khả năng gây hại chỉ với liều lượng rất nhỏ, 1 kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 miligam cũng đã đủ làm hỏng gan Độc chất này lại bền vững với nhiệt, nếu đem đun sôi 100oC ở nồi bình thường hoặc nhiệt độ cao hơn ở nồi áp suất thì Aflatoxin vẫn không bị phân huỷ

Ở Việt Nam, tiêu chuẩn thực phẩm dùng cho người có hàm lượng aflatoxin không vượt quá 10ppb Theo điều tra của Trung tâm y tế dự phòng TP HCM thấy hàm lượng Aflatoxin trong lạc cao gấp 263 lần ngưỡng cho phép Khảo sát của Viện

NC Dầu Thực vật cũng cho kết quả cứ 11 mẫu thử thì có 5 mẫu nhiễm Aflatoxin với hàm lượng từ 20 – 112 mg/kg (gấp 2 đến 11 lần ngưỡng cho phép) Theo Viện

Vệ sinh Y tế công cộng Thành phố Hồ Chí Minh sau khi tiến hành kiểm nghiệm

115 mẫu thực phẩm lưu hành trên thị trường và mẫu do cơ sở sản xuất mang tới kiểm nghiệm, kết quả cho thấy có 30% mẫu cafe, 43% mẫu nước tương, 67% mẫu

đồ hộp chay, 68% mẫu lạc và sản phẩm từ lạc chứa độc tố aflatoxin B1 Kết quả khảo sát phân tích 243 mẫu ngô, lạc và sản phẩm chế biến thức ăn gia súc tại 3 xã

của huyện Tân Kỳ, Nghệ An tháng 6/2002, đã phát hiện mức độ và nguy cơ nhiễm aflatoxin rất cao, hơn 90% mẫu lạc, ngô lấy từ các hộ gia đình đang được bảo quản

bị nhiễm độc tố này và tỷ lệ vượt giới hạn cho phép quy định giới hạn hàm lượng

AF có trong thực phẩm của Bộ Y tế là trên 23% (56/ 243 mẫu)[6]

Độc tố AF còn là rào cản an toàn lương thực, thực phẩm, nông sản xuất khẩu, Cộng đồng Châu Âu cho phép giới hạn tối đa là 2ppb (aflatoxin B1) và 4ppb (aflatoxin tổng số) Đây là trở ngại lớn cho sự phát triển nông nghiệp hàng hóa như xuất khẩu lạc của Việt Nam, đặc biệt là Nghệ An Từ những thực tế đó có thể nói aflatoxin là nguyên nhân gây nên những tổn thất nặng nề về kinh tế và sức khỏe con người và vật nuôi Nhưng hiện nay ở Việt Nam, đặc biệt ở vùng sản xuất Lạc tiềm năng chưa có một biện pháp phòng trừ nào cụ thể và hiệu quả Hướng nghiên cứu

ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong kiểm soát sinh học nấm mốc

Aspergillus spp là rất cần thiết, không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị

thực tiễn to lớn

Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tuyển chọn được chủng Trichoderma

atroviride có khả năng đối kháng cao với nấm bệnh Aspergillus flavus có tính độc

mạnh Vì vậy, sau những công đoạn như thu thập, phân lập, định loại, tuyển chọn chủng đối kháng, xác định các điều kiện tối ưu thì việc xây dựng các biện pháp kỹ thuật để sản xuất với mục đích chuyển giao cho người dân hay sản xuất ở một trình

độ phù hợp với cơ sở vật chất hiện có của vùng là điều rất quan trọng và thiết thực

Cho nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Đề xuất biện pháp kỹ thuật chuyển

giao quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh Trichoderma atroviride phòng trừ

nấm mốc hại lạc ở quy mô nông hộ”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Đề tài nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm hiểu và nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm từ nấm vi sinh Trichoderma atroviride; lựa chọn ra phương thức tốt nhất, đơn giản, dễ làm và hiệu quả nhất nhằm chuyển giao đến người dân tự sản xuất

2.2 Mục tiêu cụ thể

Đề tài tiến hành với những mục đích cụ thể sau :

Điều tra tình hình sản xuất lạc ; tình hình sử dụng thuốc BVTV và phân bón trong

sản xuất lạc

Tìm hiểu khả năng chuyển giao và ứng dụng chế phẩm vi sinh trong việc phòng trừ

bệnh hại cây trồng

Tìm hiểu và lựa chọn phương pháp sản xuất chế phẩm trichoderma atroviride phòng

trừ nấm mốc hại lạc phù hợp nhất nhằm chuyển giao cho người dân

Đề xuất một số giải pháp chuyển giao và ứng dụng chế phẩm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Trên thế giới, nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để kiểm soát

Aspergillus spp, bằng cách “loại trừ bằng cạnh tranh sinh học” hiện nay là hướng

nghiên cứu ứng dụng đang được quan tâm Chính vì vậy, việc tìm hiểu và nghiên cứu chế phẩm trichoderma atroviride nhằm phòng trừ nấm mốc Aspergillius flavus trên cây lạc là một giải pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng tích cực, tiên tiến mang lại nguồn lợi kinh tế, đảm bảo sức khỏe cho con người và vật nuôi, ngoài ra còn không gây tổn hại đến môi trường Phù hợp với định hướng phát triển một nền nông

nghiệp bền vững của nước ta

Từ kết quả của đề tài sẽ là những cơ sơ ban đầu cho việc chuyển giao quy trình sản xuất chế phẩm ở quy mô nông hộ

Chương 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Cơ sở lý luận

1.1.1 Vai trò của nấm Trichoderma sp

1.1.1.1 Vai trò của quần thể nấm Trichoderma sp trong đất

Trichoderma sp có khả năng tái tạo lại quần thể, đây là một hiện tượng phòng

trừ sinh học vẫn còn là câu hỏi Theo Bliss (1959), công bố Trichoderma sp có khả

năng thiết lập quần thể và tái hoạt động rất nhanh trên đất đã được xử lý khử trùng

xông hơi bằng carbon disulfid để diệt nấm Armillaria mellea trên cây cam, quít, nhưng không công bố bằng chứng quần thể nấm Trichoderma sp phòng chống

bệnh Ohr và cộng tác viên (1973),[13] cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất quần

thể Trichoderma trong đất có khả năng phòng trừ nấm Armillaria mellea trên đất đã được xử lý xông hơi bằng methyl bromide Trichoderma kháng methyl bromide hơn

A mellea, vì A mellea sản xuất ra ít chất kháng

Thêm vào những bằng chứng về vai trò quần thể Trichoderma trong đất trong

vấn đề phòng trừ sinh học là thêm sulfur vào đất để duy trì độ pH dưới 3,9 nhằm phòng trừ bệnh thối rễ và thối ngọn dứa ở Úc Cách phòng trừ này đã làm giảm túi

bào tử của nấm Phytophthora và làm tăng tính ưa acid của T viride Trichoderma

có khả năng khuyếch tán chất độc của các nấm trong phòng thí nghiệm kể cả các chất hữu cơ trong đất cũng như khả năng kéo dài phòng trừ sinh học của

Trichoderma sp Ngoài ra, khả năng thứ hai của nấm Trichoderma sp là kháng

nấm Loài T hamatum có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm ở Colombia có khả năng ngăn chặn nấm R solani, còn T harzianum có nhiều khi phân lập từ đất

tại Mexico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất.[14]

Dưới nhiệt độ và tia phóng xạ gamma không thể diệt được nấm R solani, ngược lại trên môi trường T harzianum diệt được nấm này (Nelson và cộng tác viên, 1983),[14] đây là vai trò chính của Trichoderma trong việc phòng trừ sinh

học Khả năng ngăn cản của đất đến những loại nấm bệnh cây trong đất, đặc biệt là

R.solani, Pythium spp., có liên quan đến nấm Trichoderma, đã được công bố rộng

rãi và là vấn đề được nghiên cứu trong nhiều năm nay

1.1.1.2 Vai trò của nấm Trichoderma sp trong việc xử lý hạt giống

Mặc dù có nhiều loài nấm Trichoderma sp có khả năng dùng vào phòng trừ

sinh học (PTSH) nhưng chưa có một sản phẩm thương mại nào được đăng ký tại

Mỹ Có nhiều lý do, một trong những lý do này là cần một số lượng lớn nguyên liệu PTSH trên một diện tích đất thí nghiệm lớn (Hadar và cộng tác viên, 1984: Harman

và cộng tác viên, 1980).[13] Sử dụng Trichoderma vào việc xử lý hạt giống có liên quan đến khả năng xâm nhập của Trichoderma sp vào trong đất, phương pháp này

đòi hỏi một số lượng bào tử lớn để áp dụng Tuy nhiên, đây là một phương pháp rất

có ý nghĩa trong việc phòng trừ nấm gây bệnh ở giai đoạn hạt đến giai đoạn cây

con Khả năng PTSH của nấm T hamatum sp với bệnh chết rạp cây con do nấm R.solani và Pythium spp có hiệu quả trên hạt giống đậu Hòa Lan và củ cải đường Dòng nấm T.harzianum xử lý qua tia tử ngoại và T viride có hiệu quả trong

PTSH

Hạt đậu nành được xử lý T pseudokoningii và hạt giống bắp được xử lý T

hazianum có hiệu quả làm ngăn chặn nguồn bệnh và làm tăng năng suất trong việc

phòng trừ nấm Rhizoctonia trên cánh đồng nhiễm nấm này Khi dùng nấm T

harzianum xử lý hạt bông phòng trừ nấm R.solani tại Israel cũng đem lại hiệu quả

cao Hiệu quả trong việc dùng Trichoderma xử lý hạt giống ảnh hưởng từ nhiều yếu

tố phân lập , tuổi của hạt giống gieo trồng, nhiệt độ của đất và tái hoạt động của đất , loại đất và vi sinh vật hiện diện trong đất, dinh dưỡng trong quá trình cấy nấm, mật

độ nấm khi cấy vào đất, tiềm năng bệnh gây hại cây trong đất, và tuổi của cây trồng

Trichoderma có hiệu quả nhất trong việc phòng trừ bệnh chết rạp cây con, khả năng

tạo sinh khối trong đất và hệ rễ ngăn cản bệnh gây hại cây bằng cách cạnh tranh, ký sinh trên nấm hoặc kháng sinh học

1.1.1.3 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng và làm phân bón

Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng

hơn trong thời gian gần đây Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát

hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của

nấm Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với

những cây không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ

Ngoài ra, Trichoderma có khả năng phân hủy Celulose,… nên chúng được

ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm để ủ phân làm phân sinh học

1.1.2 Tính năng của Trichoderma trong phòng trừ sinh học

Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma sp

Hình 1.1 Cơ chế đối kháng của Trichoderma đối với nấm bệnh

Sự đối kháng của nấm Trichoderma sp thông qua nhiều cơ chế Vào năm

1932 Weiding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt

tên cho hiện tượng đó là ”Giao thoa sợi nấm” (Cnyder, 1976).[11] Hiện tượng giao

thoa gồm ba giai đoạn như sau: (1) Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh; (2) Sau sự vây quanh, sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh cây; (3) Cuối cùng là sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng lớp tế bào

của nấm gây bệnh, dẫn đến sự gây bệnh làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bị phân hủy và dẫn đến nấm bệnh chết Sau này quan sát dưới kính hiển vi,

hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma được mô tả như sau: tại những điểm nấm

Trichoderma tiếp xúc với nấm gây bệnh đã làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết

(Dubey, 1995; Rousscu et al., 1996).[12] Ngược lại ở những điểm không có sự tiếp

xúc của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây

bệnh (Agrowcal et al., 1979; Michrina et al., 1996).[12]

1.1.3 Nghiên cứu về nấm Trichoderma atroviride

Trichoderma atroviride là một loại nấm sợi quốc tế, thường tìm thấy trong

đất và được phân lập từ cả hai vùng khí hậu nhiệt đới và ôn đới

T atroviride đã được lựa chọn để đánh giá hiệu quả chống lại bệnh thối gốc

Các nghiên cứu khác nhau đã thông báo rằng T atroviride hoạt động như một đại

lý kiểm soát các tác nhân gây bệnh thực vật trên không và trong đất (Brunner et al,

2005) Jakubikova và cs (2006)[10] đã báo cáo rằng T atroviride đã được tìm thấy

có hiệu quả chống lại Polymyxa betae Theo Vinale và cs (2006)[11] khả năng của

T harzianum và T atroviride để cải thiện sự tăng trưởng của rau diếp, cà chua và

hạt tiêu trong điều kiện hiện trường đã được điều tra Những phát hiện này rõ ràng

cho thấy các hoạt động của T atroviride chống lại tác nhân gây bệnh khác nhau

Trong 78 mẫu thu thập và phân lập trên đất trồng chè tại các vùng rễ cây bị bệnh đã được lựa chọn dựa trên sự sinh trưởng nhanh, và hoạt động đối kháng cao

sau đó định loại là loài T atroviride

Bảng 1.1 Một số nấm bệnh mà T atroviride kiểm soát được

Armillaria mellea Thối rễ cây ăn quả, cây

rụng lá

Loài cây lá kim

Botrytis cinerea Màu xám mốc dưa chuột,

nho

Dâu tây, dưa chuột

Caprinus

psychromobidus

Lúa mạch đen, lúa mì

Phytophthora capcisi Bệnh bạc lá, thối rễ Ớt, cà tím

Sclerotinia sclerotiorum Thối gốc

trái cây

Trong các nghiên cứu hiệu lực phòng trừ được thực hiện trong nhà kính cho

thấy T atroviride phát triển mạnh trong đất bị nhiễm bệnh P capsici, tạo điều kiện

cho hạt giống hạt tiêu phát triển từ 83% lên đến 100% khi điều trị với nồng độ bào

tử nấm T atroviride là 105 bào tử/ml Khả năng sống sót của cây hạt tiêu cũng tăng

từ 50 % (không điều trị T atroviride) đến 100% (điều trị T atroviride với nồng độ

105 bào tử/ml) Khi xử lý bằng T atroviride lá mầm lớn hơn và những lá thật xuất

hiện sớm hơn và mở rộng nhanh hơn Những phản ứng của thực vật khác nhau trong mỗi tương quan trực tiếp với các liều lượng Lá trong cây con được điều trị

1.2 Cơ sở thực tiễn

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong các nhóm vi sinh vật được ứng dụng trong phòng trừ sinh học thì nhóm

có triển vọng nhất để kiểm soát nấm gây bệnh là các loài thuộc chi Trichoderma,

bởi nhiều yếu tố, bao gồm cả việc giảm hàm lượng độc tố mycotoxin khi nấm gây

bệnh phát triển chung với các loài Trichoderma [11],[12]

Khả năng đối kháng của các loài Trichoderma đã được phát hiện từ cách đây

70 năm Bây giờ Trichoderma spp là tác nhân kiểm soát sinh học được nghiên cứu

và triển khai rộng rãi trên toàn thế giới Cơ chế chính của sự đối kháng trong

Trichoderma là mycoparasitism (hiện tượng ký sinh nấm) Hoạt động Lytic là tính

năng chịu trách nhiệm về sự biểu hiện của mycoparasitism đối kháng một số nấm

gây bệnh Trichoderma spp cũng là đối thủ cạnh tranh tốt trong đất và sản sinh ra

chất kháng sinh không bay hơi và dễ bay hơi để ngăn chặn mục đích gây bệnh Do hiệu quả cao và dễ sản xuất cho mục đích thương mại, ít nhất là chín chế phẩm sinh

học dùng cho thương mại dựa trên các loài Trichoderma đã được sản xuất và buôn

bán ở Bỉ, Thụy Điển, Israel, Mỹ, Đan Mạch, Ấn Độ và New Zealand để sử dụng cho nhiều cây trồng khác nhau

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu và thực nghiệm cố gắng sử dụng

Trichoderma spp để kiểm soát sinh học., nhưng các nhà nghiên cứu ít để ý đến tác

dụng của nấm Trichoderma spp đối với các loài Aspergillus [11],[12] Báo cáo rằng hai chủng của T harzianum và hai chủng của T viride có khả năng ức chế sự tăng trưởng của A flavus Quan sát dưới kinh hiển vi về sự tương tác của

A flavus và Trichoderma spp tuy không chứng minh được sự xâm nhập sợi nấm của Trichoderma spp vào Aspergillus, nhưng đã có sự thay đổi về hình thái sợi nấm của

Aspergillus Trong nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng phần nước lọc thu từ môi

trường nuôi T viride và T harzianum đã ức chế A flavus Một chủng của T viride

đã được tìm thấy có khả năng ức chế sự sản sinh aflatoxin B1 (73,5%) và aflatoxin

G1 (100%) khi nuôi cấy chung với các loài và chủng A flavus khác nhau [13]

Một nghiên cứu của Trung tâm NRCG (National Research Centre for Groundnut) và Viện ICRISAT (International Crops Research institute for the

Semi-Arid Tropics) đánh giá sự đối kháng của 26 chủng Trichoderma spp từ 5 loài

T viride,T hamatum, T harzianum, T auroviride, và T longibrachiatum cho thấy

tiềm năng ứng dụng nấm Trichoderma để kiểm soát sự tích lũy sinh khối A flavus

và sản sinh độc tố aflatoxin trong lạc (S Desai et al., 2000) [10]

Nghiên cứu mới đây của Luisa Elena Mejía Agüero và cộng sự về sự ức chế sản

sinh aflatoxin B1 và tích lũy sinh khối A flavus trong ngô bởi các hợp chất dễ bay hơi (VCs) từ nấm T harzianum khi sử dụng chiếu xạ Gamma (3Kgrey) và nuôi

trong 15 ngày trên môi trường MEA (Malt Extract Agar) hoặc môi trường DCGRH (Defatted Corn Germ - Rice Husk) cho thấy sự tích lũy sinh khối A flavus và sản sinh độc tố aflatoxin B1 được giảm đến mức tương ứng là 31.7% và 51.87% môi

trường, khi T harzianum đã được nuôi trên MEA Trong khi đó, VCs của T

harzianum được sản xuất trên DCGRH vừa được 24 phút đã làm tăng sự ức chế

đáng kể (90%) đối với A flavus Những kết quả này một lần nữa chứng minh tính

hữu ích của T harzianum như là một tác nhân kiểm soát sinh học cho nấm gây độc

trong bảo quản hạt và vai trò của nó trong việc giảm độc tố mycotoxin [14]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu

Việt Nam, hướng nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong phòng trừ nấm mốc

Aspergillus spp sinh độc tố aflatoxin bằng nấm mốc Aspergillus flavus không sinh độc

tố đã có một số kết quả bước đầu Nguyễn Thùy Châu, nghiên cứu phòng chống

Aspergillus sp sản sinh aflatoxin và ochratoxin A trên cà phê ở giai đoạn ngoài

đồng và trong quá trình bảo quản bằng chủng không sản sinh aflatoxin, nghiên cứu

tác dụng của chủng Aspergillus flavus DA2 không sinh và phòng chống aflatoxin

trên ngô ở giai đoạn ngoài đồng và trong quá trình bảo quản; Lê Thiên Minh,

Nguyễn Tiến Minh, Nguyễn Thùy Châu (2010), nghiên cứu đánh giá hiệu quả của

chế phẩm Aspergillus flavus (AF) không sinh aflatoxin để phòng chống aflatoxin

trên lạc (ở Vĩnh Phúc) [6],[7]

Đánh giá về khả năng kiểm soát bệnh thì rất nhiều giống Trichoderma có khả

năng cạnh tranh, loại trừ nhiều loài nấm gây bệnh khác Tuy nhiên một số giống thường có hiệu quả hơn những giống khác trên một số bệnh nhất định

Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma đối kháng nhiều loại nấm gây thối rễ Pythium, Rhizoctonia và Fusarium Quá trình đó được gọi là: kí sinh nấm (mycoparasitism) Trichoderma tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của

các loài nấm khác Sau đó nó có thể tấn công vào bên trong loài nấm gây hại đó và tiêu thụ chúng Chủng sử dụng trong T-22 tiết ra nhiều enzym chính yếu, endochitinase, hơn các chủng hoang dại, do đó, T-22 sinh trưởng tốt hơn và tiết ra nhiều enzym hơn các chủng hoang dại Sự kết hợp này cho phép nó bảo vệ vùng rễ của cây trồng chống lại các loại nấm gây thối rễ trên đồng ruộng

Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số giống có khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những giống này cũng có khả năng kiểm

soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm Các chế phẩm nấm Trichoderma

được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây [3]

Ở tỉnh Nghệ An, kết quả điều tra thu thập nấm đối kháng Trichoderma trên

đồng ruộng trồng lạc ở huyện Nghi Lộc tỉnh Nghệ An (năm 2010) cho thấy, có 5

loài nấm đối kháng Trichoderma, chúng sinh trưởng nhanh trên môi trường PDA và

môi trường cám gạo, mùn cưa, trấu Bước đầu đánh giá tính kháng trên đĩa petri cho

thấy, Trichoderma sp3 có tính kháng mạnh với Aspergillus flavus [4]

Một số kết quả nghiên cứu ban đầu ở Việt Nam về phòng trừ Aspergillus spp

sinh độc tố aflatoxin chưa thể đáp ứng được yêu cầu cấp thiết để có thể kiểm soát độc tố aflatoxin trong cây trồng, nông sản và thực phẩm Vì vậy cần có một chiến lược, giải pháp thực sự có hiệu quả trong việc giảm thiệu độc tố aflatoxin Có nhiều

cách tiếp cận nhưng cho đến nay ứng dụng công nghệ sinh học và công nghệ vi sinh với kiểm soát sinh học hiện nay là hướng triển vọng, đặc biệt là sử dụng các chủng

nấm Trichoderma spp đối kháng phòng trừ sinh học các chủng Aspergillus spp

sinh độc tố aflatoxin trong nông sản như lạc được đánh giá là giải pháp tối ưu

1.2.2.2 Tình hình sản xuất và sử dụng

Hiện nay (năm 2012), Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã nghiên cứu và sản

xuất thành công chế phẩm sinh học Trichoderma dạng bột hòa tan, phun xịt trực tiếp vào bề mặt rơm rạ, giúp xử lý rơm rạ nhanh, rẻ tiền, hiệu quả cao trong điều kiện sản xuất ở Đồng bằng sông Cửu Long, chế phẩm này có nguồn gốc sinh học, là sản phẩm thân thiện với môi trường, an toàn cho người sử dụng, góp phần bảo vệ sinh thái cũng như bầu khí quyển của chúng ta.[2]

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho

thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu long và Đông Nam Bộ Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani ( gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng

lá chết chậm trên tiêu ) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii,

Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma

là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan Lợi dụng đặc tính này

người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc

đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt ( Thành Phố Hồ Chí Minh ) phân VK của Công ty Viễn Khang ( Đồng Nai ) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả.[2]

Sản phẩm Tricô-ĐHCT được sản xuất tại Khoa Sinh Học Ứng Dụng, Đại học Cần Thơ là hỗn hợp nhiều dòng Trichoderma, nên có thể phòng trừ được nhiều loại bệnh gây hại trong đất như vàng lá thúi rễ trên cây có múi, chết cây con trên bầu bí dưa, đậu phộng và điều bằng cách tưới vào đất hoặc phun lên cây Ngoài ra, có thể dùng để ủ phân hữu cơ, sau đó bón vào đất, để cung cấp hữu cơ cho cây và tăng

cường hệ VSV đất trong đó có Trichoderma sẽ tích cực ngăn ngừa và kiểm soát hiệu quả các bệnh phát sinh trong đất.[2]

1.2.3 Mô tả chủng Trichoderma atroviride Tri.020(2).NC

5 ngày

7 ngày

Hình 1.2 T atrovirider 020(2).NC sau 5 và 7 ngày cấy

Trichoderma atroviride Tri.020(2).NC là chủng có khả năng đối kháng mạnh

với Aspergillus flavus Asp.006.VAD, loài này phát triển mạnh trên cả các đĩa phân

lập và đĩa nuôi cấy thuần, sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA nấm đã phát triển chiếm gần hết diện tích của đĩa 9cm, sau 7 ngày nuôi cấy thì nấm đã hoàn toàn phát sinh, phát triển chiếm toàn bộ diện tích của đĩa Khuẩn lạc có những vòng tròn

có bào tử màu xanh đậm xen lẫn với những vòng tròn có bào tử màu nhạt hơn, không tạo ra các sắc tố làm thay đổi môi trường PDA.[1]

Hình 1.3 Bào tử và cành phát sinh bào tử của nấm T atroviride

Tri.020(2).NC

Các bào tử của nấm T atroviride Tri.020(2).NC có mụn mủ dày đặc, hình

trong hoặc hình bầu dục, cành bào tử phân nhánh, đối xứng qua thân chính, sắp xếp theo chiều dọc với các cấp độ khác nhau, chi nhánh thường phát sinh tạo 1 góc 900

với trục chính hoặc ít hơn đối với trên nhánh của điểm phân cành

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu : nấm Trichoderma atroviride lấy từ tổ BVTV khoa Nông Lâm Ngư Trường Đại Học Vinh

Vật liệu nghiên cứu :

+ Môi trường PDA : khoai tây, đường gluco, agar

+ Môi trường lỏng : khoai tây, đường gluco

+ Môi trường rắn : cám gạo, cám vỏ lạc, vỏ trấu

Dụng cụ phục vụ nghiên cứu : tủ cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng, tủ sấy, bếp từ, máy lắc, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, máy ảnh và các thiết bị khác trong phòng thí nghiệm

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Các xã Khánh Sơn, Nam Trung, Nam Cường - huyện Nam Đàn - tỉnh Nghệ An Trung tâm thực hành thí nghiệm khoa Nông Lâm Ngư – Trường Đại Học Vinh Thời gian nghiên cứu : Từ tháng 11/2011 đến tháng 4/2012

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tìm hiểu khả năng chuyển giao và ứng dụng chế phẩm Trichoderma atroviride trong việc phòng trừ bệnh hại cây trồng

Điều tra tình hình sản xuất lạc trên 3 xã Khánh Sơn, Nam Trung, Nam Cường của huyện Nam Đàn

Tình hình sử dụng chế phẩm (phân vi sinh) phòng trừ bệnh hại cây trồng

Tìm hiểu khả năng chuyển giao và ứng dụng chế phẩm Trichoderma atroviride trên địa bàn

2.2.2 Tìm hiểu phương pháp sản xuất chế phẩm áp dụng cho quy mô nông hộ

+ Biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm vi sinh Trichoderma atroviride phòng trừ nấm mốc hại lạc

+ Tìm hiểu và lựa chọn biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm phù hợp nhất áp dụng cho người dân tự sản xuất

+ Tìm hiểu thuận lợi và khó khăn khi chuyển giao

2.2.3 Đề xuất một số giải pháp chuyển giao và ứng dụng chế phẩm

+ Hướng khắc phục những tồn tại và khó khăn trong việc chuyển giao và ứng dụng + Đề xuất biện pháp kỹ thuật

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp điều tra hộ sản xuất lạc

 Tiến hành điều tra khảo sát tình hình sản xuất, đánh giá thực trạng sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu trong sản xuất lạc : điều tra khảo sát tại vùng sản xuất lạc, tập trung phỏng vấn trực tiếp bằng phiếu điều tra nhanh tại 90 hộ dân đại diện trên 3

xã Khánh Sơn, Nam Trung, Nam Cường

 Thu thập số liệu sơ cấp từ nguồn số liệu thống kê cây trồng hằng năm của 3 xã nêu trên : thông qua cán bộ trưởng ban nông nghiệp xã xin số liệu tại phòng thống kê số liệu của Ủy Ban nhân dân xã Khánh Sơn, Nam Trung, Nam Cường

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.3.2.1 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sản xuất giống

Lựa chọn hình thức nhân giống

Thí nghiệm tiến hành đánh giá các dụng cụ chứa giống để có thể tiến hành cấy, cũng như nhân nuôi dễ dàng Giống được cấy trên đĩa thạch PDA, trên bình tam giác chứa PDA và bình tam giác chứa môi trường lỏng PDB

Công

Thời gian nuôi

Số lượng

=> Chỉ tiêu đánh giá:

* Khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường rắn

- Thời gian thu hồi sinh khối

- Nồng độ bào tử

- Sinh khối nấm

* Hiệu quả kinh tế (giá cả cho mỗi hình thức sản xuất)

2.3.2.2 Hoàn thiện công thức môi trường rắn sản xuất

Xác định hình thức sản xuất sinh khối

* Nhân sinh khối trong túi bóng hay trong hộp nhựa

Thí nghiệm tiến hành với 3 loại dụng cụ (vật liệu chứa) là túi nilon có ống nút, lọ thủy tinh và hộp nhựa Khi nhân sinh khối trong túi nilon, không những độ co giãn của túi khi hấp khử trùng làm cho cơ chất có độ xốp cao và trong quá trình phát triển của nấm cũng có thể trộn đều, tuy nhiên nó chỉ sử dụng được một lần và rất khó cấy nấm Trong hộp nhựa thì có độ co giãn, tạo độ xốp hơn lọ thủy tinh nhưng thời gian và số lần sử dụng lại ngắn hơn Để đánh giá và xây dựng hệ thống sản xuất sinh khối nấm trên môi trường rắn, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 3

nghiệm thức như sau:

Công

Số lần lặp lại

- Hiệu quả kinh tế

* Khối lượng sinh khối trong một dụng cụ chứa

Công

thức

Khối lượng g/dụng cụ Số túi/lần lặp

Số lần lặp lại

- Sinh khối nấm (g/100g)

Thí nghiệm một nhân tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại

* Lựa chọn thời gian thu sinh khối

Mỗi loài có một thời gian sinh trưởng và phát triển định cao, cần tiến hành xác định ngưỡng phát triển đó để có thể thu hồi sinh khối có hiệu quả tốt nhất Trichoderma sinh trưởng rất nhanh, có thể hoàn thành chu kỳ trong vòng 10 đến 15 ngày Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các mốc thời gian sau:

2.3.2.3 Xác định nhiệt độ và thời gian sấy chế phẩm

Chất lượng của chế phẩm phụ thuộc vào số lượng bào tử hay đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu), sau quá trình nhân nuôi tạo sinh khối, các chế phẩm cần đảm bảo

độ ẩm thích hợp để nấm tồn trữ ở dạng tiềm sinh, vì vậy cần xác định mức nhiệt độ

và độ ẩm thích hợp Thí nghiệm được tiến hành với các mức sau:

Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy tới chất lượng chế phẩm

2.3.3 Môi trường PDA và phương pháp cấy nấm từ PDA sang PDA

 Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)

Bao gồm các thành phần sau:

- Khoai tây (Potato) 200gam

- Dextrose (hoặc Glucozơ) 20 gam

Bước 3: Lọc lấy dịch chiết và thêm vào 20 gam agar, 20 gam Dextrose (hoặc glucozơ), thêm nước cất vào để được 1000 ml dịch chiết, cho lên bếp từ, vừa đun nóng vừa cho con khuấy từ vào đánh tan đều

Bước 4: Lọc lại 1 lần nữa để có dung dịch trong hơn

Bước 5: Cho hỗn hợp vào chai có nắp đậy, hoặc bình tam giác đậy bằng nút bông và thiếc

Bước 6: Đem hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 15 psi trong vòng 15 phút

Bước 7: Để nguội và đổ môi trường vào các dụng cụ nuôi cấy

 Phương pháp cấy thuần từ đĩa gốc sang môi trường PDA

Cấy thuần từ đĩa gốc sang PDA: Chuẩn bị môi trường PDA trong đĩa Petri

Dùng que có cán nhựa hoặc dùi nhọn lấy 1 lượng nấm rất nhỏ từ đĩa gốc (sợi nấm hoặc bào tử) cấy thuần sang đía Petri có môi trường PDA

Dũng nhãn ghi các thông tin: Ký hiệu mẫu, tên nấm (nếu đã định loại), ngày, tháng năm cấy

Dùng giấy bọc đĩa quấn quanh miệng đĩa

Sắp xếp các đĩa ở nơi thoáng, không cần bảo quản ở tủ định ôn

 Phương pháp cấy từ môi trường PDA sang môi trường lỏng, môi trường rắn

Môi trường lỏng là môi trường sử dụng để cấy nấm làm giống trong nhân sinh khối, được chuẩn bị trong các bình tam giác 500 ml

Môi trường lỏng bao gồm: - 200 gam khoai tây

- 20 gam glucozơ

- 1000 ml nước

Thể tích dung dịch sử dụng cho 1 bình là 150 ml

 Cấy truyền từ môi trường PDA sang môi trường lỏng

Mẫu nấm cấy truyền cần được lấy cẩn thận để tránh nhiễm khuẩn và các loài nấm khác, sử dụng sau 4 – 7 ngày cấy thuần, nếu để lâu quá thì do đặc tính loài nấm náy phát triển nhanh trong khoảng nhiệt độ từ 300C nên mẫu nấm sẽ quá già, làm ảnh hưởng tới chất lượng của giống

Sử dụng que cấy, lấy 1 lượng khuẩn lạc 5mm2 trên PDA cấy vào trong môi

trường lỏng đã chuẩn bị, mẫu cấy vào các bình tam giác với khối lượng tương đương với nhau, để đảm bảo độ đồng đều khi phát triển và làm giống Đem nuôi ở nhiệt độ phòng, có chế độ sáng tối xen kẽ

 Cấy truyền từ môi trường làm giống (PDA và môi trường lỏng) sang môi trường rắn

Môi trường rắn được chuẩn bị trong các túi bóng loại 500g, có nút bông, tiến hành hấp tiệt trùng ở 1210 C trong 40 phút, để nguội, sử dụng lượng giống bằng 10% khối lượng cơ chất sử dụng nhân sinh khối

Nuôi ở nhiệt độ phòng và có chế độ sáng tối xen kẽ

2.3.4 Phương pháp thu chỉ tiêu môi trường rắn

2.3.4.1 Chỉ tiêu theo dõi môi trường rắn

+ Nồng độ bào tử (cfu/g): Theo định kỳ 2 ngày/lần mỗi túi lấy ra 10 g rồi thực hiện theo phương pháp pha loãng để tính nồng độ bào tử trên buồng đếm hồng cầu + Độ bao phủ cơ chất (%): ước lượng

2.3.4.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu

 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu

Hình 2.1 Mô tả cấu tạo buồng đếm hồng cầu

 Cách đếm bào tử trên buồng đếm hồng cầu:

+ Nếu số lượng bào tử sau khi pha loãng lớn hơn hoặc bằng 30 trên một tổng 25 ô thì ta đếm theo cách sau:

+ Nếu số lượng bào tử trong 25 ô vuông ít hơn 30 bào tử thì đếm toàn bộ 25 ô vuông đó

 Cách lựa chọn số bào tử để đếm trong khi quan sát:

Cách sử dụng buồng đếm: dùng đũa thủy tinh hoặc bình hút dịch bào tử loại mini để hút 1 giọt dịch bào tử đã pha cho lên trường đếm của buồng đếm hồng cầu, đặt buồng đếm lên khay kính hiển vi, điều chính kính hiển vi sao cho thấy rõ ràng các bào tử và các ô vuông trên buồng đếm rồi tiến hành đếm

 Cách pha dịch nấm để đếm:

+ Đối với môi trường PDA: Cho toàn bộ môi trường và khuẩn lạc trên đĩa petri vào một cái cốc thủy tinh có chứa 10 ml nước cất 2 lần, lấy đũa thủy tinh khuấy tan rồi cho con khuấy từ vào cốc, đặt cốc lên bếp từ cho khuấy đều chừng 5 phút Dùng lưới lọc hoặc màn gấp 3 lần đem lọc lấy bào tử trong hỗn hợp đó

+ Đối với môi trường lỏng: Nếu nấm cấy trên các lọ môi trường được nuôi ở máy lắc thì không cần đánh tan sợi nấm, nếu nấm nuôi trên các lọ môi trường lỏng dạng tĩnh thì cho trực tiếp 1 – 2 con khuấy từ vào đặt lên bếp từ bật khuấy từ để đánh tan váng nấm và sợi nấm có trong đó Sau đó tiến hành lọc lấy dịch bào tử

+ Đối với môi trường rắn: Lấy 10 g rắn cho vào bình tam giác loại 200 ml (hoặc 250 ml) có chứa 100 ml nước cho 2 con khuấy từ vào đặt lên bếp từ để khuấy

và đánh tan khối rắn sau đó lọc lấy bào tử để đếm

+ Từ các hỗn hợp dịch bào tử được lọc ở các môi trường ta cho 1 – 2 giọt Tween 80 và cồn 90o theo tỷ lệ 1 : 1 vào rồi khuấy đều để dễ dàng quan sát bào tử