Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng nấm isaria tenuipes có tiềm năng và xây dựng kỹ thuật nhân sinh khối

Nghiên cứu đầu tiên về nhân nuôi nhân tạo của Nguyễn Mậu Tuấn công bố Hội Nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 7 năm 2011 trên giá thể nhộng tằm qua kết quả phân tích hợp chất hóa học trong

Tr-ờng đại học vinh Khoa NÔNG LÂM NGƯ

NGHIấN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM Isaria

tenuipes Cể TIỀM NĂNG VÀ XÂY DỰNG KỸ THUẬT NHÂN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thân tiến hành và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Phòng thí nghiệm Công nghệ Nấm ký sinh côn trùng, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh, với sự đồng ý và hướng dẫn của Thạc sỹ Nguyễn Thị Thúy là giáo viên hướng dẫn và các kĩ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Vinh , tháng 5 năm 2012

Tác giả

Mai Thị Giang

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành kỹ

sư Nông học, tôi đã luôn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, người thân, bạn bè

Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm

ơn đặc biệt tới Th.s Nguyễn Thị Thúy, KS Trần Văn Cảnh, những người đã dẫn dắt,

định hướng cho tôi từ những bước đầu làm nghiên cứu khoa học, rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài luận văn tốt nghiệp

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo trong tổ bộ môn Bảo

vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như những sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài

Và tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới người thân trong gia đình, bạn bè

đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên

cứu và hoàn thành luận văn này

Vinh , tháng 5 năm 2012

Tác giả

Mai Thị Giang

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 5

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 8

Hình 3.1 Một số mẫu nấm Isaria tenuipes thu được tại VQG Pù Mát 38

Hình 3.2 Sự sinh trưởng theo thời gian trên của I.tenuipes VN2012 và

Hình 3.8 Tăng trưởng của khuẩn lạc tại 5 mức nhiệt độ theo

thời gian của chủng I.tenuipes VN2012

46

Hình 3.9 Tăng trưởng của khuẩn lạc tại 5 mức nhiệt độ theo thời gian

của chủng I.tenuipes VN2013

47

Hình 3.10 So sánh tốc độ tăng trưởng của khuẩn lạc theo thời gian của

hai chủng nấm I.tenuipes VN2012 và I.tenuipes VN2013

47

Hình 3.11 Ảnh hưởng về sự sinh trưởng và phát triển của khuẩn lạc 49 Hình 3.12 Khả năng sinh trưởng của hai chủng nấm trền cùng nhiệt độ 50 Hình 3.13 Khả năng sinh trưởng của hai chủng nấm trên các mức độ pH 50 Hình 3.14 Sự sinh trưởng của hai chủng nấm trên các loại môi trường

Hình 3.17 Khả năng sinh trưởng và hình thành synnema của các chủng

nấm trên môi trường rắn

57 Hình 3.18 Ảnh hưởng của hai chủng nấm đến trong lượng synnema 58

Mở đầu

1 Tính cấp thiết của đề tài

Điểm đặc biệt của rừng nhiệt đới là những cánh rừng nguyên sinh được đặc trưng bởi tài nguyên vi sinh vật phong phú và đa dạng trong đó có nấm ký sinh côn trùng (Evan H.C, 1982) Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic

fungi - EPF) thuộc bộ Hypocreales không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh

học cao mà còn có vai trò quan trọng trong kiểm soát sinh học sâu hại cây trồng

và trong y - dược Nhiều nghiên cứu đã khẳng định giá trị của nấm ký sinh côn trùng nên ngày càng được nhiều nước trên thế giới quan tâm Sự phong phú về nguồn lợi của nấm ký sinh côn trùng đã tạo nên sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học nấm ký sinh côn trùng ở nhiều quốc gia trên thế giới

Hiện nay có hơn 700 loài nấm gây bệnh côn trùng trên thế giới Có trên

131 loài đã được thu thập và định loại tại Vườn Quốc gia Pù Mát – Nghệ An (Trần Ngọc Lân và cs., 2010)

Cùng với Đông trùng Hạ thảo (Cordyceps sinensis), Nhộng Trùng thảo (Cordyceps militaris) với 25 tác dụng sinh lý được biết đến, thì Bông tuyết đông trùng hạ thảo (Isaria tenuipes (Peck.) Samson) có chứa các hợp chất sinh

peroxide, Acetoxyscirpenediol và

dòng tế bào ác tính ở người như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào

1983; Choi J.H và Shin K.H., 1999; Nam K.S et al., 2001; Oh G.S et al., 2001,

2009;…) Hoạt tính của Acetoxyscirpenediol mạnh hơn Cisplatin là hoạt chất đang được dùng điều trị cho các bệnh nhân ung thư hiện nay là từ 4,0 đến 6,6

lần (Nam K.S et al., 2001)

Với những giá trị dược liệu đó, kỹ thuật nhân nuôi nhân tạo của loại nấm này đã được phát triển mạnh ở các nước như Nhật Bản, Trung Quốc và đặc biệt

là Hàn Quốc có quy mô sản xuất I tenuipes lớn nhất thế giới Sản phẩm của I

tenuipes đa dạng từ dạng thực phẩm chức năng đến các dạng thuốc viên nang

từ nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes Nghiên cứu đầu tiên về nhân nuôi

nhân tạo của Nguyễn Mậu Tuấn (công bố Hội Nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 7 năm 2011) trên giá thể nhộng tằm qua kết quả phân tích hợp chất hóa học trong nấm không cho thấy 2 hợp chất sinh học quan trọng kể trên Nghiên cứu này đóng góp một phần quan trọng cho phân tích các hợp chất sinh học từ loài

Isaria tenuipes ở vùng á nhiệt đới, đồng thời là nguồn dẫn liệu khoa học và cơ

sở thực tiễn cho nhân nuôi hàng loạt nguồn dược liệu và thực phẩm chức năng

Vì vậy, hướng nghiên cứu tuyển chọn và xác định điều kiện ảnh hưởng tới quá

trình sinh trưởng của các chủng nấm Isaria tenuipes là thực sự cần thiết, có giá

trị khoa học và thực tiễn cao

Xuất phát từ những điểm nêu trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng nấm Isaria tenuipes có tiềm năng

và xây dựng kỹ thuật nhân sinh khối”

2 Mục đích nghiên cứu

2.1 Mục đích tổng quát

Tuyển chọn và xác định điều kiện ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng

của một số chủng nấm Isaria tenuipes có tiềm năng để xây dựng quy trình

nhân sinh khối

2.2 Mục đích cụ thể

- Đánh giá sự phân bố của các chủng nấm Isaria tenuipes

- Tuyển chọn được 1 – 2 chủng có tiềm năng

- Xây dựng quy trình nhân sinh khối

3 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra sự phân bố theo mùa (tháng) của các chủng nấm

- Thu thập, phân lập một số chủng nấm Isaria tenuipes

- Tuyển chọn được 1 – 2 chủng nấm Isaria tenuipes có tiềm năng

- Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của 1 – 2 chủng nấm

- Xây dựng các biện pháp kỹ thuật cho các giai đoạn nhân sinh khối (giống thạch, giống lỏng, môi trường rắn)

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học quan trọng cho những nghiên

cứu nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng nói chung, loài nấm I tenuipes nói riêng

Ngoài ra, kết quả còn góp phần bổ sung cho những nghiên cứu trước đó về nấm

I tenuipes đồng thời làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về nấm Iaria

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về nấm ký sinh côn trùng

1.1.1 Khái niệm và phân loại

“Nấm ký sinh công trùng - Entomology phathogenic fungi (EPF) hay

nấm côn trùng – Insect fungi” là khái niệm được các nhà khoa học sử dụng như

là một thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật ký sinh gây bệnh cho côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng vừa là một nhóm nấm có tính đa dạng sinh học cao( trên thế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó ở Thái Lan có khoảng 70000- 150000 loài nấm và 2000 loài nấm ký sinh côn trùng) vừa có vai trò quan trọng trong phòng trừ sâu hại cây trồng và trong y dược

Theo Evans (1988), nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm: (1)

Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côn trùng ký chủ; (2) Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể của côn trùng và gây nên bệnh hại cho ký chủ; (3) Nấm mọc trên côn trùng tức

là những nấm đã được trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng (samson và cs., 1988); (4) Cộng sinh có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống

Nấm còn được chia ra thành ký sinh sơ cấp (primery pathogen) và ký sinh thứ cấp (secondery pathogen) (Pu và Li, 1996) Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng yếu hoặc bị thương.Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyên tính, loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng (dẫn theo Trần Ngọc Lân và cs, 2008) [7]

Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượng

niệm này cũng được dùng cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng

là 2 nhóm(lớp) trong một nghành Động vật chân khớp và chúng có cùng kiểu sinh thái ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trên cây (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [7]

1.1.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp

vỏ cuticun của chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơ thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tủ mọc mần và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cuticun Khi nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọc khắp cơ thể của côn trùng, nhiều loại nấm cũng sản xuất các độc tốc trong đó để tăng tốc độ giết chế côn trùng hoặc ngăn chặn sự cạnh tranh của các loài vi sinh vật khác

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Thông thường sau khi côn trùng đã chết, nấm mọc ra bao phủ xung quanh cơ thể côn trùng, chúng bắt đầu xâm nhiễm ở các khu vực mỏng hơn như khớp hoặc nếp da nhăn và bắt đầu sản xuất bào tử Các bào tử của loài nấm tạo

ra các ổ dịch tự nhiên trong nhóm entomophthorales thường chủ động phóng ra ngoài từ côn trùng đã chết, nhóm này lây lan nhanh và mạnh Côn trùng bị giết

bởi nấm thường có vẻ xù ra bên ngoài do sự tăng trưởng của sợi nấm từ bên trong cơ thể để sản xuất các bào tử

Nếu bào tử không gặp một vật chủ nào thì hoặc là chết hoặc vẫn tồn tại trên các bộ phận của cây hay trong đất Mặc dù có một số loài nấm có thể sản xuất bào tử có thể sống nhiều năm trong đất, nhưng hầu hết các bào tử nấm chỉ

có hiệu quả cho một mùa hoặc nhiều nhất là một năm

Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

(i) Giai đoạn xâm nhập Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme này được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trong một loài

Enzyme protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein) Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai trò không kém phần quan trọng Nhưng quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein (protease) và enzyme phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzyme này

có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng

(ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng

chết

Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém

với các tác nhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết

(iii) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bên trong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài của cơ thể côn

trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và Fusarium spp định

cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng Do nấm côn trùng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng các enzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, ở giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật chủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và các bào tử, vì vậy mà rất khó hoặc không thể xác định các vật chủ (Janet Jennifer và cs., 2006) [26 ]

Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiện trên bề mặt, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc mầm xâm nhiễm

vào bên trong cơ thể vật chủ Nơi xâm nhập của nấm Beaueria bassiana thường

có vệt chấm đen hình dạng bất định

Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 - 3 ngày trước thời điểm phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ Nếu bị bệnh do

nấm Beauveria thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày trước khi chết

Những cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùng thường có màu hồng nhạt Một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh

lá cây hoặc nâu Cơ thể sâu bị bệnh trở nên hóa cứng

Cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị thối, lũn mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trong cơ thể sâu chết chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết do nấm côn trùng với sâu chết do virus, vi khuẩn gây bệnh ( Phạm Văn Lầm, 2000) [13]

Thomas M.B., Read A.F (2007) đã đưa ra sơ đồ xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng vào cơ thể vật chủ

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

(Nguồn: Thomas M.B & Read A.F., 2007) Theo Thomas M.B., Read A.F., chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn

trùng, như nấm Beaueria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai

đoạn: Bào tử đính tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ Bào tử nảy mầm và sinh sản hình thành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tác động của enzyme phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trong xoang máu cơ thể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ chết Tầng cuticun của vỏ

cơ thể vật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo vệ chống lại sự

xâm nhiễm của nấm và nó có vai trò quyết định tính chuyên hóa đặc hiệu của nấm Nếu nấm phá vỡ được tầng cuticun thì sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụ thuộc vào khả năng chiến thắng được phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở côn trùng của nấm

Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng cả hai phương thức là tế bào và thể dịch Sự hình thành hoạt động miễn dịch càng sớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâm nhập Các loài nấm nói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phản ứng

tự vệ của vật chủ: Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là sự ngụy trang hữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất ra các chất miễn dịch phân hóa thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thống bảo vệ

Nếu một loại nấm Cordyceps tấn công vật chủ thì thể sợi nấm xâm chiếm và

dần dần thay thế các mô trong cơ thể vật chủ, vào lúc hình thành dạng quả thể thon dài (chất đệm) có thể có hình trụ, phân nhánh hay tập hợp nhiều hình thù khác nhau

Một số loài Cordyceps có thể ảnh hưởng đến hành vi của vật chủ sâu bọ

Cordyceps unilateralis gây bệnh trên kiến và khiến chúng leo lên cây rồi bám ở

đó trước khi chết, đảm bảo phân phối tối đa bào tử từ quả thể mọc ra ngoài cơ thể côn trùng đã chết

1.2 Tổng quan về nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng

1.2.1 Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới

 Nghiên cứu về đa dạng sinh học và nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng

Trên thế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm tính đến năm 2005 theo đánh giá của Hywel-Jones (BIOTEC, Thái Lan) Trong 1,5 triệu loài nấm có khoảng 2.000 loài nấm ký sinh côn trùng (Hywel-Jones, 2005) Mặt khác, theo kết quả công bố mới nhất về nấm ký sinh côn trùng của trang web Index Fungorum

(www.indexfungorum org), trên thế giới có khoảng 2500 loài nấm ký sinh côn trùng, trong đó thứ tự về sự đa dạng của nấm được xếp như sau: Cordyceps với

525 loài, Verticillium với 261 loài, Entomophthora với 152 loài,tiếp đến là

Hypocrella với 112 loài, Aschersonia với 79 loài và Turrubiella với 83 loài,…

Hiện nay trên thế giới nghiên cứu mới chỉ tập trung vào một số ít loài như

Metarhizium anisopliae, Hisutela lecaniicola, Beauveria basiana, B amorpha, Akathomyces aranearum, Cordycep sinclairii,…

Nấm ký sinh côn trùng không chỉ là nhóm có tính đa dạng sinh học cao và

là nguồn lợi có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng mà còn là một nguồn tài nguyên rất quí cung cấp thực phẩm chức năng, dược liệu

Nấm ký sinh côn trùng được đánh giá là một trong những nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao sử dụng trong y - dược trong tương lai để chữa trị các chứng bệnh nan y hiện nay Trong đó, Bộ Clavicipitales được

đánh giá có nhiều đặc tính ưu việt nhất với các giống như Cordyceps,

Mertacordyceps, Elaphocordyceps, Ophiocordyceps, vì phần lớn các loài cho

các chất có hoạt tính sinh học cao

Cordyceps là nhóm nấm ký sinh côn trùng thuộc lớp nấm túi Ascomycetes,

hầu hết các loài này ký sinh chủ yếu trên côn trùng và động vật chân khớp, một số ít

ký sinh trên các loài nấm khác Cho đến nay, mới chỉ nghiên cứu nhiều về 2 loài là

Cordyceps sinensis S (Đông trùng hạ thảo) và C militaris L (Nhộng trùng thảo) Ở

các nước Châu Âu sử dụng nấm này làm thực phẩm chức năng bổ sung dinh dưỡng.,

còn ở nước ta hiện đang sử dụng nấm Cordyceps sinensis làm dược liệu trong Đông y

Trên thế giới một số nước đã thành công trong nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong thực phẩm chức năng, dược liệu, enzyme, như Hoa

Kỳ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Trung Quốc (“Đông trùng Hạ thảo“

Cordyceps sinensis) Cordyceps sinensis, khi ký sinh trên các ấu trùng của các

loài sâu thuộc chi Thiarodes được gọi là đông trùng hạ thảo, một loại dược liệu quý hiếm sử dụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á, chẳng hạn

Phần lớn các loài của giống Cordyceps cho các chất có hoạt tính sinh học cao Trong loài thuộc giống Cordyceps có chất Cordycepin có thể chữa các

bệnh ưng thư thông qua việc tăng khả năng miễn dịch của con người, có thể ngăn chặn được di căn và sự phát triển của tế bào ung thư (Thomadaki H và cs., 2008) Nghiên cứu của Nan J X (2001) đã chứng minh nấm Đông trùng -

Các nghiên cứu của Thomadaki H và cs., (2008) [16] cho thấy trong

loài thuộc giống Cordyceps có chất Cordycepin có thể chữa các bệnh ưng thư

thông qua việc tăng khả năng miễn dịch của con người Cordycepin chính là 3`deoxyadenosine và khi được chèn vào ADN có khả năng kìm hãm sự sao chép của phân tử ADN này Ngoài ra, chất này có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, virut và tế bào ưng thư Điều này được thể hiện rõ ràng qua

khả năng kìm hãm sự phát triển của Clostidium sp.( Ahn Y.J và cs 2000) [12].

Các nghiên cứu của Pegler DN và cs (1994); Mizuno T (1999) và Tang

W., Eisenbrand G., 1992 cho thấy các loài Cordyceps sp thường được sử dụng

như là một loài thuốc kéo dài tuổi thọ và nó được xem như là thuốc cầm máu, thuốc chữa bệnh hen và chứng giảm glucoza trong máu Sở dĩ nó có được những chức năng như thế là vì chúng có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, như cordycepin, ophiocordin và một số hợp chất polisaccharides

Loài C unilateralis có 6 chất dẫn xuất của napthoquinone có hoạt tính

sinh học cao như eythrostominone, deoxyerythrostominone, 4-O-methyl erythrostominone, epierythrostominol, deoxyerythrostominol và đặc biệt là 3,5

được xem như là chất có khả năng chống lại bệnh sốt rét - malaria (Patcharaporn Wongsa và cs., 2005 và Kittakoop P và cs.,1999)

Các nghiên cứu của Sengonca C., Thungrabeab M., Blaeser P., (2007)

cho thấy Cordyceps sp có khả năng trong kiểm soát sinh học phòng trừ sâu non của Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae)

Ở Thái Lan, nấm ký sinh côn trùng mới được nghiên cứu trong những năm gần đây Trong khoảng 15 năm qua, BIOTEC đã phát hiện được ở Thái Lan có hơn 380 loài nấm ký sinh côn trùng BIOTEC đã có nhiều thành công trong nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong sản xuất thuốc sinh học trừ sâu hại cây trồng và sản xuất các chế phẩm dược liệu (Janet Jennifer Luangsa-ard và cs., 2006) [20] Các nhà khoa học BIOTEC đã phân loại nấm

ký sinh côn trùng về hình thái, sinh học (Janet Jennifer Luangsa-ard và cs.,

2006, 2007) [20] Phân loại các loài Cordyceps bằng sinh học phân tử ADN

(Gi-Ho Sung, Nigel L Hywel-Jones và cs., 2007) [18] Nghiên cứu phát hiện

các loài nấm ký sinh côn trùng mới Cordyceps khaoyaiensis, Cordyceps

pseudomilitaris (Hywel-Jones N., L., 1994) [19]; Nghiên cứu ứng dụng các

loài nấm ký sinh côn trùng có giá trị dược liệu, như Cordyceps unilateralis (K

Kocharin, P Wongsa, 2006; Panida Unagul, P Wongsa và cs., 2005;

Patcharaporn Wongsa và cs., 2005; ) [23- 26]; loài Cordyceps nipponica (Isaka M., Tanticharoen M và cs., 2001) [21], loài Cordyceps pseudomilitaris

(Isaka M., Tanticharoen M và cs., 2000; ) [22]

Dịch chiết C sinensis có hoạt tính chống oxi hoá (antioxidation), miễn dịch

(immunomodulatory), hypoglycemic, hạ huyết áp (hypotensive) và vasorelaxant,

và các hoạt tính chống khối u ung thư (antitumor activities) (Chen Y.J và cs., 1997; Bok J.W và cs., 1999; Chiou W.F và cs., 2000; Yamaguchi Y và cs., 2000;

Kuo Y.C và cs., 2001; ) [15 - 14] Nghiên cứu thành phần hoá học của loài C

sinensis chứa các polysaccharit và các sterols (Kiho T và cs., 1986; Bok J.W và

cs., 1999) [21] Ngoài ra còn có 17 acid amin khác nhau, có lipid, có nhiều nguyên

tố vi lượng (Al, Si, K, Na,…) và các loại vitamin Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao đang được phát hiện nhờ sự tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất thiên

nhiên Loài C sinensis đã được sử dụng trong y học cổ truyền của Trung Quốc

cách đây 2000 năm (Zhu J.-S và cs., 1998a, b) [20] Sự quan tâm nghiên cứu được phát triển mạnh trong 15 năm gần đây Ngày nay ở Trung Quốc đã có nhiều

chế phẩm từ C sinensis được bán rộng rãi trên thị trường

Loài Cordyceps unilateralis, được thu mẫu ở Vườn Quốc gia Khao Luang

(Thái Lan) đã phân lập được các dẫn xuất naphthoquinone mới Điều đáng quan tâm là các naphthoquinone này có hoạt tính antimalarial với liều IC50 2.5 -

Loài Cordyceps nipponica có nguồn gốc ở Nhật Bản và cũng được tìm

thấy ở Thái Lan Hai N-hydroxy-2-pyridones, cordypyridon A và B và hai tricyclic N-methoxy-2-pyridon, cordypyridon C và D đã được phân lập từ loài

Cordyceps nipponica BCC (mẫu thu ở vườn Quốc gia Khao Yai, Thái Lan)

Cordypyridon A và B có hoạt tính chống sốt rét với liều IC50, 0,066 và 0,037

Loài Cordyceps pseudomilitaris chỉ phát hiện được ở Thái Lan và cho

đến nay chỉ tìm thấy tại vườn Quốc gia Sam Lan, khi nó ký sinh trên ấu trùng Lepidoptera từ tháng 8 đến tháng 10 (Hywel-Jones N.L., 1994)[19]

Cordyanhydride A và B, hai anhydride đơn, được phân lập từ loài Cordyceps

pseudomilitaris BCC 1620 Quan trọng nhất là cordyanhydride B là lần đầu tiên

tìm thấy trong tự nhiên nonadride chứa 3 đơn vị C-9 Tuy nhiên các anhydride này cho thấy kết quả âm tính về antimalarial, antituberculous và cytotoxicity assays (Isaka M., Tanticharoen M và cs., 2000) [21]

Một phần từ Cordyceps, dịch chiết của sợi nấm và thân quả của nấm ký sinh côn trùng thuộc giống Paecilomyces đã phân lập được các hợp chất có hoạt

tính sinh học Các hợp chất trichothecane mới, paecilomycine A, B và C được

tách ra từ loài Paecilomyces tenuipes (trạng thái vô tính của Cordyceps

takaomontana), là một loại nấm được sử dụng rộng rãi như là một thực phẩm

thuốc ở các nước Bắc Á (Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản) Từ thân quả nuôi cấy của loài nấm này, đã phân lập được các trichothecane, tenuipesine A

và spirotenuipesine A và B Các công trình nghiên cứu hoạt chất sinh học về nấm ký sinh côn trùng đã được tổng kết (Kikuchi H và cs., 2004a, b; Masahiko

I và cs., 2005) [24- 25- 27]

Bên cạnh cho các chất có hoạt tính sinh học cao, nấm ký sinh côn trùng còn có ứng dụng quan trọng về kiểm soát sinh học các dịch hại côn trùng trong

hệ sinh thái nông nghiệp

thuộc giống Aschersonia trong đó có loài A aleyrodis có thể sử dụng để kiểm soát loài Trialeurodes vaporariorum thuộc họ Coccoidea, bộ Homoptera Mặt khác, tác giả này còn nghiên cứu về khả năng sử dụng chế phẩm từ A aleyrodis ở

bí Nghiên cứu của Evans (1982) [17], Evans và Hywel - Jones (1997) đưa ra

triển vọng sử dụng các loài thuộc giống Aschersonia như là thiên địch tự nhiên

của các loài côn trùng thuộc họ Aleyrodiidae và Coccoidea Các nghiên cứu của Wagenaar, Melissa M.,Gibson, Donna M., Clardy, Jon (2002) cho thấy, giống

Ankanthomyces có loài A gracilis được xem như là tác nhân phòng trừ sâu hại

loài Staphylococcus aureus

Các nghiên cứu của Sengonca C., Thungrabeab M., Blaeser P., (2007)

cho thấy Cordyceps sp có khả năng trong kiểm soát sinh học phòng trừ sâu non của Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae)

 Nghiên cứu nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng dược phẩm và làm thực phẩm chức năng

Nhiều công trình đã nghiên cứu nuôi nhân sinh khối loài Cordyceps

sinensis để chiết suất lấy các hoạt chất làm dược liệu (Sun S và cs., 2003; Chen

Y.Q và cs., 2004; Jonh Holliday và cs., 2004; Weiyun Zhang và cs., 2005; Richard Alan Miller, 2005; Cleaver Phillip D., John C., 2006; ) Nghiên cứu

nuôi nhân sinh khối loài Cordyceps militaris để chiết suất lấy các hoạt chất làm

dược liệu (Hiroki Sato và cs., 2002; Kim S.W và cs., 2003; Mina Masuda và cs., 2005; Sung-Hom Yeon và cs., 2006; )

Nấm ký sinh côn trùng thu hái từ thiên nhiên chỉ có hạn, môi trường tự

nhiên thích hợp cho sự phát triển của nấm ký sinh côn trùng Cordyceps lại là ở các vùng núi cao hiểm trở, xa xôi, rất khó bắt gặp (như các loài Cordyceps sp1.,

Cordyceps sp2 ở VQG Pù Mát) Cho nên việc nghiên cứu ứng dụng để có được

các công nghệ nuôi nhân, công nghệ chiết suất các chất có hoạt tính sinh học

cao của nấm ký sinh côn trùng Cordyceps spp rất cần thiết và rất có giá trị cho

các ngành công nghiệp dược liệu, thực phẩm chức năng

Một số nước như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc cũng đã nghiên cứu thành công và triển khai nhân nuôi sản xuất nấm ký sinh côn trùng ở quy mô nông hộ, quy mô thủ công nghiệp và quy mô công nghiệp

Cho đến nay, ở Trung Quốc có ít nhất 25 sản phẩm của Cordyceps sinensis

Nghiên cứu về nhân sinh khối Cordyceps militaris trong điều kiện lên

men chìm của Trung Quốc cho thấy nguồn cacbon và tỷ lệ C/N có ảnh hưởng

nấm phát triển là glactose, tuy nhiên nguồn cacbon thích hợp nhất cho sản xuất Cordycepin trong môi trường lên men lỏng là glucose Nồng độ Cordycepin trong môi trường nuôi cấy đạt cao nhất là 345,4 ± 8,5 mg/l, khả năng sản xuất Cordycepin cao nhất đạt 19,2 ± 0,5 mg/l khi trong môi trường có tỷ lệ C/N là

42,0g glucose/l và 15,8g peptone/l

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nấm Isaria Tenuipes

 Nghiên cứu nhân nuôi nấm Isaria tenuipes

Theo đánh giá của Hywel-Jones( BIOTEC, Thái lan), trên thế giới có khoảng 1.5 triệu loài nấm, trong đó có khoảng 2.000 loài nấm ký sinh côn trùng Mặt khác, theo kết quả công bố mới theo trang web Index Fungorum (www.indexfungorum) , trên thế giới có khoảng 2.500 loài nấm ký sinh côn trùng, trong đó giống có thành phần loài da dạng nhất là Cordyceps với 525 loài, tiếp theo là Verticillium với 261 loài, Entomophthora với 152 loài

Sau 15 năm nghiên cứu các nhà khoa học BIOTEC đã phát hiện hơn 400 loài nấm ký cinh côn trùng thuộc 15 giống được phát hiện ở Thái lan trong đó

có hơn 120 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc giống Cordyceps

Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng của Aung và cs, 2008 tại Chiang mai, Thái Lan trong thời gian từ tháng 6 năm 2005 đến tháng 10 năm

2006 cho thấy, có 34 loài thuộc 15 giống ký sinh côn trùng trong tổng số 301 mẵu thu thập ký sinh trên 10 bộ côn trùng chân khớp

Nghiên cứu của Katsuji Yamana và cs (1998) về đặc điểm nuôi trồng

Isaria Tenuipes trên môi trường lỏng và rắn để sản xuất fruit body (synnema)

trên một quy mô lớn Kết quả nghiên cứu cho thấy: Sợi nấm phát triển tốt nhất

fruit-body của Isaria Tenuipes được gây ra bằng cách hạ thấp nhiệt độ xuống dưới

cho thấy trọng lượng tươi của fruit- body ngày càng tăng với nội dung ngày càng tăng của bột nhộng tằm Sản lượng cao nhất của bộ phận thể quả đã thu được trong môi trường giàu cacbon như hạt lúa mạch có bổ sung lượng bột nhộng tằm

Nghiên cứu của Yi Sang Mong và cs (1998) về sự thay đổi tỷ lệ lây

nhiễm Isaria Tenuipes trên nhộng đã được phân tích trong các giai đoạn phát

triển tương ứng trong tằm Boombyx mori Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tiêm nhiễm vào nhộng 5 ngày tuổi đạt tỷ lệ cao nhất (khoảng 90%) so với các phương pháp khác

Nghiên cứu của Sae yun Cho và cs (1999) về việc nuôi trồng Isaria

Tenuipes bằng cách sử dụng nhộng tằm Nguồn giống được lấy từ PDA môi

ngày Nghiên cứu sử dụng nhộng tằm tuổi 4 hoặc tuổi 5 để lây nhiễm với nồng

Nghiên cứu của He-Duck Lss và cs (1999) được tiến hành nhằm tìm ra

phương pháp sản xuất fruit-body của Isaria Tenuipes đại trà bằng môi trường

nhân tạo Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng nhộng tằm ở ngày đầu tiên của tuổi 5 đạt tỷ lệ nhiễm cao nhất là 72,0% Và công thức môi trường rắn tối

ưu cho sản xuất sinh khối là 80g Brownrice + 20g bột nhộng tằm, cường độ chiếu sáng tối ưu cho sự hình thành thể quả là 200lx, lượng giống (kích thước) truyền độc tối ưu là 5% (w/v)

Nghiên cứu của Yanging (1999) về tỷ lệ lây nhiễm trên thời gian ủ bệnh

là khác nhau Sau khi lây nhiễm trên ấu trùng tằm tuổi 5 đã cho thấy thời gian

so với thời gian ủ bệnh khác (8h và 24h)

Nghiên cứu của H S Kang (2003) về phương pháp nuôi trồng Isaria

Tenuipes bằng cách sử dụng trứng Kết quả nghiên cứu cho thấy sợi nấm phát

quả trứng sau 60 ngày tiêm nhiễm

Nghiên cứu của Pil-Don Kang, Gyoo- Byung Sung(2010) [28] được tiến

hành nhằm tìm ra một loại tằm thích hợp nhất cho sản xuất synnema của Isaria

Tenuipes Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt đáng kể đã được

quan sát trong sự hình thành synnema trong số các giống tằm Các synnema của

Isaria Tenuipes sản xuất trên nhộng tằm tương tự như trong hình dạng và màu

sắc synnema của Isaria Tenuipes thu được trong tự nhiên

 Các hợp chất sinh học và thành phần hóa học có trong Isaria teuipes

Nấm ký sinh côn trùng không chỉ được ứng dụng trong kiểm soát sinh học,

mà chúng còn mang lại những nguốn lợi khác, trong đó có khả năng cho hợp chất có hoạt tính sinh học cao( bioactive compound) là nguồn nguyên liệu cho y- dược

Rachada Haritakun và cs 2007 nghiên cứu về các hợp chất trong loài

Isaria tenuipes BCC 7.831, kết qua phân tích cho thấy Isariotins A-D (1-4), có

một ancaloit sở hữu một đơn chất được cố định với vòng kép [3.3.1] Các cấu trúc của các hợp chất này đã được làm sáng tỏ chủ yếu bởi NMR và phân tích khối lượng bằng kính quan phổ

Theo y học truyền thống của Trung Hoa, thể quả của nấm P tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và sinh học của chúng Những hợp chất có hoạt tính bao gồm cả hoạt tính chống khối u hoặc tác động đến hệ thống miễn dịch tách chiết từ các loài nấm Paecilomyces đã được công

bố (Borchers và cộng sự, 1999; Liu và cộng sự 1996; Lee và cộng sự 1996) như Leucinostatins A, D, Polygalactosamine kháng khối u, Saintopin, Sphingofungins E và F, UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E và F, Ergosterol peroxide, Acetoxyscirpenediol…

Polysaccharides phân lập từ P.tenuipes đã được báo cáo có hoạt động

chống ưng thư trong cơ thể( Ban và cs., 1998) Báo cáo này cho rằng tác dụng chống ưng thư của Polysaccharides có thể do sự kích thích của hệ thống miễn dịch

Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol tách chiết từ

ở người như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột ruột thẳng Hoạt tính của Acetoxyscirpenediol mạnh hơn Cisplatin là hoạt chất đang được dùng điều trị cho các bệnh nhân ung thư hiện nay là 4 đến 6,6 lần

Phân tích hóa sinh cho thấy hợp chất Y dược Adenosine và N6- adenosine trong thể quả của Isaria tenuipes, hai hợp chất này là hợp chất quan trọng trong điều chỉnh sự vận chuyển nơron và chúng được chứng minh có liên quan nhiều đến chức năng sinh lý như điều hòa giấc ngủ, điều hòa sự lo lắng, nhận thức và

Các chiết xuất của methanol từ P tenuipes cho thấy khả năng gây độc

đáng kể so với dòng tế bào ung thư HeLa, HeLa S3 và A-431 ( Shin và cs., 2000)

Park và cs (2000) nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào ung thư của P

tenuipes trên môt số tế bào khối u ở con người

Nghiên cứu của Nilanonta và cs (2000) cho thấy loài P tenuipes có

chứa các chất kháng khuẩn chống ưng thư và trùng rốt rét( plasmodial) do trong loài này có chứa hoạt chất thuộc nhóm cycoldepsipeptides

Theo kết quả nghiên cứu của Haruhisa Kikuchi và cs (2004) cho thấy,

trong sinh khối nấm I tenuipes chứa Paecilomycine A, B và C là các hoạt chất

có hoạt tính sinh học cao[20]

Năm 2009, Akira Sakakura, Kazufumi Shioya và cs [29] đã phát hiện hợp chất mới chống oxy hóa pseudo-di-peptide và tiền chất của nó được chiết

xuất từ Isaria Tenuipes Chất này đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian

có nguồn gốc từ thiên nhiên tại Nhật Bản và có tên là ‘Hanasanagitake’ Cấu trúc pseudo-di-peptide được xác định là (R)-3,4-diguanidinobutanoyl-(S)-DOPA và (R)-3,4-diguanidinobutanoyl-(S)-tyrosine bằng phân tích quang phổ, tổng hợp hóa học và chuyển đổi enzym

T Bunyapaiboonsri và cs (2009), Một Hêmiacêtan mới có vòng kép và đơn, isariotins E (1) và F (2), cùng với TK-57-164A (3) đã được phân lập từ

nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes BCC 12.625 Cấu hình tuyệt đối của 3

được ghi địa chỉ bằng cách áp dụng các phương pháp sửa đổi của Mosher Isariotin F (2) trưng bày các hoạt động chống lại bệnh sốt rét ký sinh trùng Plasmodium falciparum K1 với IC50 là 5,1 μm và các hoạt động độc tế bào chống lại dòng tế bào ung thư (KB, BC, và NCI-H187) và nonmalignant (Vero)

Hiện nay Hàn Quốc là nước có quy mô sản xuất P tenuipes lớn nhất thế giới Sản phẩm của P tenuipes đa dạng từ dạng thực phẩm chức năng đến các

dạng thuốc viên nang

 Khả năng ứng dụng trong phòng trừ sinh học

Trên thế giới chi Isaria cũng được xem như là một tác nhân quan trọng trong phòng trừ sâu hại cậy trồng vì chúng dể dàng phân lập và hình thành bào

tử trong môi trường nuôi cấy (Nigel L., Hywel- Jones, 2005) Trong đó có các

loài như Isaria javanica, Isaria fariosa, Isaria fumosorosea

Ở Thái Lan loại nấm Isaria fariosa đã phòng trừ sâu hại cây trồng rất

thành công

Nấm Isaria javanica đã được sử dụng để phòng trừ nhiều loại cây trồng

Năm 2008 ở Argentina đã phòng trừ sâu hại cây trồng đạt hiệu quả phòng trừ từ

trùng khác

Theo kết quả nghiên cứu của Takeshi Maruyama và cs (2009) sử dụng P

tenuipes để tạo ra sản phẩm làm thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ rệp trắng hại

rau trong nhà kính với hiệu quả cao

Nghiên cứu của Vega-Aquino và cs (2010) cho thấy, nấm Nomuraea

rileyi và Isaria tenuipes (= Paecilomyces tenuipes ) là các tác nhân gây bệnh

phổ biến của lepidopterans Các thử nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt

động của dầu làm chất bám dính cho bào tử của N rileyi và I tenuipes chống

lại ấu trùng của Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa Zea, và

Heliothis virescens Cả hai loại nấm được đánh giá cao tương thích với các loại dầu và tỉ lệ chết gây ra gần 100% trong tất cả các phương pháp kết hợp với dầu,

giá trị LT(50) thấp nhất 4,7 ngày đối với N rileyi và 6,0 ngày đối với I

tenuipes trong dầu đậu nành Tỉ lệ chết với I tenuipes chống lại S exigua dao

động từ 90% đến 100% (giống ARSEF 2488 và 4096), N rileyi gây ra tử vong 95% S frugiperda Kết quả cho thấy một đánh giá toàn diện các nấm ký sinh côn trùng trong nông nghiệp bằng cách sử dụng các công nghệ ứng dụng dầu là khuyến khích, đặc biệt, trong các nền nông nghiệp hữu cơ bền vững

1.2.2 Nghiên cứu và ứng dụng nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam

1.2.2.1 Nghiên cứu sử dụng nấm côn trùng ở Việt Nam

 Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng

Từ thập niên 60 của thế kỷ XX, Việt Nam đã đạt được nhiều thành công

về khoa học và ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực nghiên cứu vi sinh vật, như các công trình của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1969, 1972) [3], Nguyễn Lân Dũng (1981) [4], Trịnh Tam Kiệt (1981) [9]; Và những thành công trong lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng sinh vật dược liệu, như các công trình của Đỗ Tất Lợi (1999) [1], Nguyễn Bá Hoạt và cộng sự (2000) [2], Viện Dược liệu (2001); Các công trình nghiên cứu về nấm dược liệu của Trịnh Tam Kiệt (2003) [10], Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo (2005, 2007) [11]

hai loại EPF làm dược liệu, một loại nhập từ Trung Quốc và một loại của Việt Nam Hàng năm tại Thất Khê (Lạng Sơn), Hoà Bình, Lào Cai nhân dân khai

thác một loại Đông trùng Hạ thảo, loại này có tên khoa học Brihaspa

atrostigmella thuộc bộ cánh vảy (Liepidoptera), nó sống trong thân cây đót

(Thysanoloena maxima O Kuntze) thuộc họ Hòa thảo (Gramineae) Đông trùng

Hạ thảo được người dân Việt Nam sử dụng là loài nấm ký sinh côn trùng

Cordyceps sinensis được nhập từ Trung Quốc

“Đông Trùng Hạ Thảo” (Cordyceps sinensis) là một loại thần dược, các nghiên

cứu y học và dược học đã chứng minh chúng có 25 tác dụng phòng chống bệnh

và tăng cường sức khoẻ con người

Kết quả nghiên cứu của Võ Thị Oanh (2003) về thành phần nấm ký sinh côn trùng, gây hại tại một số quận ngoại thành của thành Phố Hồ Chí Minh cho thấy, có 8 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc các giống Bveauveria, Metarhizium, Normuraea, Entomophthora, Verticillium, Aschersonia, Fusarium

và Hirsuterlla Trong các mẫu thu thập, thì 2 loài nấm Beauveria bassiana và

Metarhizium anisopliea ký sinh trên nhiều loại côn trùng khác nhau [12]

Kết quả hợp tác nghiên cứu giữa Viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh và Trung tâm Quốc gia về Kỹ nghệ gen và Công nghệ sinh học (BIOTEC, Thái Lan) về đa dạng nấm ký sinh côn trùng ở Vườn Quốc gia Cát Tiên cho thấy (Lê Tấn Hưng, 2008), trong thời gian nghiên cứu gần 2 năm có

35 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc 13 giống Giông có thành phần loài đa dạng nhất là giống Aschersonia với 8 loài, tiếp theo là giống Cordyceps và

Torrubiella với 5 loài Các giống còn lại biến động từ 1-3 loài thu thập và mô

tả

Ở Việt Nam, nấm ký sinh côn trùng đang là một lĩnh vực rất mới và chỉ

có một số dẫn liệu ban đầu là ứng dụng chế phẩm nấm trong phòng trừ sâu hại cây trồng Các nghiên cứu của Phạm Thị Thuỳ và nnk., 2005 [6] cho thấy có

thể sử dụng loài Beauveria bassiana (Bals.) Vuill phòng trừ sâu róm hại thông

ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam Ngoài ra, có thể sử dụng loài ký sinh côn trùng này để phòng trừ cho nhiều loài sâu hại cây trồng nguy hiểm khác như châu chấu hại lá (Ouedraogo RM., 1993), rệp hại lúa, rầy nâu hại lúa …

Các nghiên cứu của Nguyễn Thị Lộc và nnk., 2004 cho thấy loài

Metarhizium anisopliae.(Metschnikoff) Sorokin có thể sử dụng để phòng trừ

bộ cánh cứng hại dừa ở các tỉnh miền Nam Việt Nam Mặt khác, các nghiên

cứu của Phạm Thị Thùy và nnk (1995), cho thấy có thể sử dụng M anisopliae

để phòng trừ sâu hại rau và sâu hại hành Thrips tabaci Lindeman (Thys.,

Thripidae) và nhiều loài sâu hại cây trồng nguy hiểm khác

Việt Nam là đất nước nhiệt đới có nguồn tài nguyên sinh học đa dạng cao và phong phú Cho đến nay chúng ta còn biết quá ít về sự đa dạng và nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng, đặc biệt là nhóm nấm ký sinh côn trùng quí hiếm, có

chứa các chất có hoạt tính sinh học cao như Cordyceps

 Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ Corrdyceps

ứng dụng trong y - dược

Các kết quả nghiên cứu và thành tựu đạt được về Cordyceps ở Việt Nam

còn rất ít và mới chỉ là những nghiên cứu ban đầu Tuy nhiên, từ những năm của thập niên 60 của thế kỷ XX, Việt Nam đã đạt được nhiều thành công về khoa học

và ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực nghiên cứu vi sinh vật, như các công trình của Nguyễn Lân Dũng và cs (1969, 1972), [3], Nguyễn Lân Dũng (1981) [4], các công trình nghiên cứu về nấm dược liệu của Trịnh Tam Kiệt (2003) …[10]

Theo Đỗ Tất Lợi (1999) [1], người dân Việt Nam hiện đã và đang sử dụng hai loại EPF làm dược liệu, một loại nhập từ Trung Quốc và một loại của Việt Nam Hàng năm tại Thất Khê (Lạng Sơn), Hoà Bình, Lào Cai nhân dân khai

thác một loại Đông trùng - Hạ thảo, loại này có tên khoa học Brihapa

atrostigmella

Theo Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp, Phạm Thế Hải (2005) “Đông

Trùng Hạ Thảo” (Cordyceps sinensis) là một loại thần dược, các nghiên cứu y

học và dược học đã chứng minh chúng có 25 tác dụng phòng chống bệnh và tăng cường sức khoẻ con người [5]

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và nnk (2008) ở Vườn Quốc Gia

Pù Mát, giống nấm ký sinh côn trùng Cordyceps có 6 loài khác nhau, bao gồm

Cordyceps unilateralis, Cordyceps irrangensis, Cordyceps sp1., Cordyceps

sp2., Cordyceps sp3., Cordyceps sp4 Trong đó loài phổ biến nhất là loài

Cordyceps unilateralis với 88 mẫu thu được (chiếm 92.63%) và 3 loài (C unilateralis (Tull.) Sacc, Cordyceps sp1., Cordyceps sp2.) có khả năng cho các

hoạt chất sinh học làm dược liệu Năm 2009 nhóm nghiên cứu cũng đã thu thập

được nhiều mẫu nấm Cordyceps có nhiều triển vọng Hiện tại, các công trình

nghệ sản xuất các loài Cordyceps sp phục vụ nhu cầu đời sống sức khỏe của

con người

Ở Việt Nam cũng đã có các chương trình hợp tác với nước ngoài về Đông trùng - Hạ thảo như hợp tác giữa Công ty Shanghai Grace Biotech Co Ltd Hàn Quốc và Công ty Cổ phần dược Trung ương Mediplantex về sản xuất Đông trùng hạ thảo phục vụ nhu cầu của thị trường

 Khả năng ứng dụng trong phòng trừ sinh học

Ngành nông nghiệp hiện nay đang phải đối mặt mới các loại dịch hại do côn trùng gây hại, trong đó phải kể đến các loại sâu gây hại trên rau và cây công nghiệp Sử dụng nấm ký sinh côn trùng được xem là một hướng đi thích hợp nhằm tạo ra những sản phẩm an toàn Nấm ký sinh côn trùng là nhóm ít được quan tâm nghiên cứu và là lĩnh vực mới đối với Việt Nam Cho đến nay, mới chỉ nghiên cứu một vài loài nấm ký sinh côn trùng theo hướng nghiên cứu

sử dụng chúng trong kiểm soát sâu hại cây trồng và chỉ tập trung nghiên cứu

ứng dụng hai loài nấm là Beauveria bassiana, Metarhizium anisoplae

Các công trình nghiên cứu chỉ tập trung vào nấm Beauveria, Metarhizium

kiểm soát sâu hại rau để sản xuất rau an toàn ở Hà Nội và vùng phụ cận, sử

dụng nấm Metarhizium anisopliae kiểm soát bọ cánh cứng hại dừa ở các tỉnh

phía Nam (Nguyễn Thị Lộc và cs., 2004) Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ

sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm Beauveria và Metarhizium để kiểm soát sâu hại đậu xanh ở Hà Tĩnh năm 2003; sử dụng chế phẩm Metarhizium anisopliae để kiểm soát bọ cánh cứng hại dừa Brontispa sp (Phạm Thị Thùy và cs., 2005)

Nghiên cứu đặc tính sinh học và hiệu lực diệt côn trùng có hại của nấm

Metarhizium anisopliae Sorokin, sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để kiểm

soát rệp sáp Pseudococcus citri Risso hại rễ cây cà phê tại tỉnh Daklak năm

2002 - 2003 (Phạm Thị Thùy, 2005) ứng dụng chế phẩm nấm Metarhizium

anisopliae để kiểm soát bọ xít hại cây trồng (Đàm Ngọc Hân, Phạm Thị Thùy,

2007) [4]

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2008) [7] cho thấy loài

Paecilomyces sp1 có khả năng kiểm soát sâu xanh (Heliothis armigera F.) hại lạc

và sâu tơ (Plutella xylostella L.) hại rau cải một cách có hiệu quả

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2008) [7] về sử dụng nấm B

bassiana (BbGc), B bassiana (BbPs) và M anisopliae (MaPs) kiểm soát sâu mọt

hại kho, cho thấy ảnh hưởng của các công thức khác nhau của nấm B bassiana lên mọt ngô Sitophilus zeamais Motsch gây hại ở kho ngô Dạng nhũ tương với

B bassiana ở nồng độ 109 bào tử/ml cho thấy hiệu quả kiểm soát đạt cao nhất

đối với ngô Công thức dạng bột của nấm B bassiana đạt hiệu quả kiểm soát mọt

1.2.2.2 Tiềm năng và tình hình nghiên cứu Isaria tenuipes ở Việt Nam

Nấm ký sinh côn trùng và công nghệ nấm – côn trùng là một lĩnh vực mới đối với Việt Nam Cho đến nay, ở Việt Nam chỉ mới nghiên cứu về một vài loai nấm ký sinh côn trùng theo hướng nghiên cứu phòng trừ sâu hại cây

trồng và chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng hai loài nấm Beaueria,

Metarhizium, những hạn chế về đa dạng sinh học các hợp chất có hoạt tính

sinh học cao, khả năng nhân nuôi để thu synnema còn rất hạn chế

Kết quả nghiên cứu của Võ Thị Thu Oanh (2003)[12] về thành phần nấm ký sinh trên côn trùng gây hại tại một số quận ngoại thành của thành phố

Hồ Chí Minh cho thấy, có 8 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc các giống

Beaueria, Metarhizium, Normuraea, Entomophthora, Verticillium, Aschersonia, Fusarium và Hirsutella Trong các mẫu thu thập thì 2 loại nấm Beaueria, Metarhizium ký sinh trên nhiều loài côn trùng khác nhau

Kết quả nghiên cứu giữa Viên sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh và Trung tâm Quốc gia về Kỹ nghệ gen và Công nghệ sinh học (BIOTEC, Thái Lan) về đa dạng nấm ký sinh côn trùng ở Vườn Quốc gia Cát Tiên cho thấy có 35 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc 13 giống Giống có thành

phần loài đa dạng nhất là giống Aschersonia với 8 loài, tiếp theo là giống

Cordyceps và Torrubiella với 5 loài Các giống khác biến động từ 1-3 loài (Lê

Tấn Hưng, 2008)

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2010) [8] về đa dạng

nấm ký sinh côn trùng giống Isaria ở vườn Quốc gia Phù Mát và khu bảo tồn thiên nhiên Phù Huống cho thấy có 13 loài Isaria đã được thu thập và định loại, trong đó Isaria tenuipes là loài phổ biến nhất, tiếp theo là Isaria javanica Các

loài còn lại rất hiếm gặp, số mẫu thu được dao động từ 1 - 5 mẫu

Bảng 1 Thành phần loài Isaria tại VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù Huống

TT Tên loài Số lượng mẫu Tần suất (%)

Vật chủ của I tenuipes chỉ có trên các loài nhộng hoặc sâu non bộ cánh

vảy nhưng chủ yếu là nhộng Kích thước vật chủ biến động rất lớn, với chiều

dài 2,21 - 27,36 mm, chiều rộng 1,13 - 7,78mm Điều này, chứng tỏ I tenuipes

ký sinh trên nhiều loài sâu cánh vảy khác nhau Mức độ chuyên hóa tương đối cao chỉ ký sinh ở pha nhộng của sâu bộ cánh vảy Các loại sâu cánh vảy khi hóa nhộng thường nằm trong lá, cành cây hay trong đất, nếu bị nấm ký sinh thì sau một thời gian các synnemata mọc lên có màu trắng đặc trưng

Đái Huy Ban, Trần Đình Toại, Lưu Tham Mưu (2007) đã công bố nghiên cứu về một loại Đông trùng Hạ Thảo Isaria sp Tiêu bản của Đông trùng Hạ Thảo đã được phát hiện ở Tuyên Quang

Kết quả nghiên cứu về thành phần sinh hóa trong nấm “Đông trùng hạ

thảo tằm dâu” (Isaria tenuipes) của Nguyễn Mậu Tuấn (2010) cho thấy: hàm

lượng protein dao động từ 59.61 đến 70.45%, hàm lượng mannitol dao động từ 1,21 đến 1,78%, tổng acid amin dao động từ 27,75 đến 48,02% với các thành phần vi lượng và vitamin cao Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu không cho thấy sự

thành phần hóa sinh phân tích từ loài này mà [3] đã báo cáo

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Quy trình nghiên cứu

Thu thập

Phân lập và nuôi cấy

pH

Kỹ thuật nhân giống gốc trên môi trường thạch

Đánh giá môi trường

lỏng

Lựa chọn môi trường

Lựa chọn thời gian

Kỹ thuật nhân nuôi giống lỏng

+ VN2012

+ VN2012

+ VN2012

2.2 Vật liệu và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Chủng nấm

- Chủng nấm Isaria tenuipes VN1342 được bảo quản trong tủ lạnh

- Chủng nấm Isaria tenuipes VN2013 lần đầu tiên được thu thập và phân lập từ VQG Pù Mát vào tháng 2 năm 2012

2.2.2 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

2.2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2011 đến tháng 5/2012

- Địa điểm: Nghiên cứu nhân nuôi được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật và Công nghệ sinh học nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu thập, phân lập mẫu nấm Isaria tenuipes

* Phương pháp thu thập

Thu thập mẫu vật côn trùng bị nấm ký sinh được tiến hành trong 2 năm

(từ tháng 5/2010 – 5/2012) số lượng mẫu Isaria tenuipes thu mỗi lần/tháng, tiến

hành thu thập tự do theo phương châm càng nhiều điểm điều tra càng tăng thêm

cơ hội bắt gặp

Một vài kiểu vi sinh cảnh được tiến hành khảo sát bao gồm: (i) mặt dưới của lá cây và thân cây, (ii) tàn dư thực vật, (iii) trong đất Khi các mẫu được phát hiện, chúng được thu thập và lưu giữ trong trong hộp nhựa

* Phương pháp phân lập và nuôi cấy

Các mẫu vật thu thập được phân loại và đánh giá dưới kính hiển vi điện

tử theo phương pháp Lacey and Brooks (1997) Phân lập sử dụng theo phương pháp của Goettel và Inglis (1997) Phân lập các bào tử đơn dựa theo phương pháp của Choi et al (1997)

Cấy chuyển sang môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) theo phương pháp của Brown and Smith (1957) và Samson (1974) Đặc điểm hình thái của bào tử, sợi, cấu trúc quả thể và một số đặc điểm sinh học khác được đánh giá, nhận dạng các loài ký sinh côn trùng theo phương pháp của Samson et al (1988) ; Kobayasi và Shimizu (1983); Luangsa - ard et al (2007) [39] và Sung

et al (2007)

 Phân loại sơ bộ mẫu nấm ngay sau khi thu thập

Mẫu EPF sau khi thu thập phải tiến hành phận loại ngay trên thực địa và phải chú ý quan sát hình thái bên ngoài, màu sắc, hình dạng, dạng sinh sản hữu tính hay vô tính để xác định cách phân loại (có thể dựa vào vật chủ để phân loại nếu chưa xác định mẫu rõ ràng)

Đánh ký hiệu số thứ tự cho các mẫu EPF và định loại chúng theo giống

(genus); vẽ và ghi thông tin về mẫu vào sổ (chiều dài và chiều rộng quả thể, số

quả thể, màu sắc quả thể, chiều dài và chiều rộng synnema, số synnema và màu sắc); ký chủ (chiều dài và chiều rộng vật chủ…), cây cỏ, nơi thu thập, người

thu thập, địa điểm thu thập, tọa độ địa lý (GIS)

Đối với những mẫu bẩn, dùng cồn 75% vệ sinh sơ bộ để tránh nhiễm khuẩn trong quá trình phân lập Đặc biệt là những mẫu sinh sản hữu tính như

Hypocrella, Moelleriella, Samuelsia, Torrubiella, Cordyceps,…

 Chuẩn bị môi trường PDA

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bao gồm các thành phần sau:

 Phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trường PDA

Bước 1 Chuẩn bị môi trường (PDA có thêm chất kháng sinh), các dụng cụ để

phân lập và nuôi cấy

Bước 2 Mẫu đã hình thành bào tử phải phân lập ngay, mẫu non có thể để sau

vài ngày và quan sát sự hình thành bào tử

Bước 3 Dùng dụng cụ phân lập đã vô trùng để lấy bào tử rồi rải đều trên đĩa

môi trường hoặc đặt nghiêng trên đĩa Petri để cho phóng bào tử và đánh dấu vị trí đó

hoặc trong hộp nhựa có lót lớp giấy ẩm

Hàng ngày quan sát sự nảy mầm của bào tử dưới kính hiển vi soi nổi

 Cấy chuyển bảo tử nấm nảy mầm sang PDA trên đĩa Petri

Sau khi phân lập trên PDA, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi soi nổi

để tìm ra bào tử nảy mầm Dùng dụng cụ nuôi cấy đã vô trùng cắt nhanh phần môi trường có chứa bào tử và chuyển sang đĩa PDA sạch khác (cấy chuyển tiếp sang đĩa khác nếu đĩa vẫn bị tạp nhiễm)

2.3.2 Bố trí thí nghiệm

* Thí nghiệm 1 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của hai chủng

nấm trên môi trường thạch

- Thí nghiệm 1.1 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của hai chủng nấm VN1342

Bước 1 Khoai tây được rửa sạch và gọt vỏ, để ráo nước

Bước 2 Cân 200g và cắt nhỏ theo kích thước 1,0 x 1,0 cm rồi cho vào nồi

cùng 1000ml nước cất, nấu mềm trong khoảng 45 phút đến 1 giờ

sao cho đủ 1000ml, cho lên bếp từ, vừa đun nóng vừa cho con khuấy

Chọn ra môi trường nấm phát triển tốt nhất

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại

- Thí nghiệm 1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của các chủng nấm trên môi trường thạch được chọn

Chọn ra mức nhiệt độ nấm phát triển tốt nhất

- Thí nghiệm 1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của hai chủng nấm

pH

LẦN LẶP

Chọn ra mức độ

pH nấm phát triển tốt nhất

* Thí nghiệm 2 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của hai chủng

nấm trên môi trường lỏng lắc (làm giống)

Thí nghiệm nghiên cứu các chỉ số lựa chọn môi trường lỏng làm giống

- Thí nghiệm 2.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng hình thành bào tử (cfu/ml) của hai chủng nấm

Trường

LẦN LẶP

Chủng nấm I tenuipes

trường nấm phát triển tốt nhất

trường nấm phát triển tốt nhất

LL Thời gian thí nghiệm (ngày)

trưởng tốt nhất

* Thí nghiệm 3 Thử khả năng giao phối và hình thành synnema của hai chủng

nấm

Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Bhushan Shrestha (2004)

- Thí nghiệm 3.1 Khả năng hình thành synnema của VN13_F1 trên môi trường thạch

2.3.3 Phương pháp chuẩn bị môi trường và nuôi cấy

2.3.3.1 Chuẩn bị môi trường thạch và nuôi cấy

Bước 1: Cân các nguyên liệu cần dùng rồi tiến hành nấu cùng với 1000ml nước cất Đối với môi trường PDA thì nấu khoai tây lọc lấy dịch chiết trước sau đó mới cho các nguyên liệu khác vào

Bước 2: Cho vào một cái chai loại 1000ml có nắp kín, đem hấp tiệt trùng ở

Bước 3: Lấy ra làm nguội và đổ vào đĩa Petri ở điều kiện vô trùng trong buồng cấy

Bước 4: Tiến hành cấy nấm lên đĩa petri

2.3.3.2 Chuẩn bị môi trường lỏng và nuôi cấy

Bước 1: Tiến hành cân đong các thành phần cần thiết (trường hợp sử dụng khoai tây thì phải gọt vỏ, rửa sạch nấu lấy dịch chiết)

Bước 3: Phân chia môi trường vào các bình tam giác

Bước 4: Dùng nút bông và giấy thiếc bịt kín

Bước 6: Lấy môi trường ra và làm nguội

Bước 7 : Lấy giống nấm từ môi trường thạch rồi tiến hành cấy nấm vào môi trường lỏng

Bước 8: Phân chia ra các vật dụng nuôi dưỡng

2.3.3.3 Chuẩn bị môi trường rắn và nuôi cấy