Xác định tổng hợp chất phenolic trong cây cỏ ngọt

i TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC --- NGUYỄN THỊ PHƯỢNG XÁC ĐỊNH TỔNG HỢP CHẤT PHENOLIC TRONG CÂY CỎ NGỌT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VINH - 2012... - Hợp ch

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC -

NGUYỄN THỊ PHƯỢNG

XÁC ĐỊNH TỔNG HỢP CHẤT PHENOLIC

TRONG CÂY CỎ NGỌT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

VINH - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

1 Tên đề tài: “Xác định tổng hợp chất phenolic trong cây cỏ ngọt”

- Lý thuyết chung về phenolic trong thực vật

- Xác định tổng phenolic theo Meda et al (2005)

- Xác định tổng flavonoid theo phương pháp nhôm clorua

3 Họ tên cán bộ hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Hoa Du

4 Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2012

5 Ngày hoàn thành đồ án : Ngày tháng năm 2012

Ngày tháng năm 2012

Chủ nhiệm bộ môn Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm

Người duyệt

(Ký, ghi rõ họ, tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

- -

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Phượng Số hiệu sinh viên: 0852045296 Khóa: 49 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hoa Du Cán bộ duyệt: 1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

………

………

………

2 Nhận xét của cán bộ hướng dẫn: ………

………

………

………

………

………

Ngày tháng năm 2012

Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

- -

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Phượng Số hiệu sinh viên: 0852045296 Khóa: 49 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hoa Du Cán bộ duyệt: 3 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

………

………

………

4 Nhận xét của cán bộ duyệt: ………

………

………

………

………

………

Ngày tháng năm 2012

Cán bộ duyệt

(Ký, ghi rõ họ, tên)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ix

TÓM TẮT x

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

Phần I TỔNG QUAN 3

1 1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CỎ NGỌT 3

1.1.1 Định nghĩa và nguồn gốc 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 5

1.1.3 Thành phần trong cỏ ngọt 5

1.1.4 Dược tính của Cỏ ngọt 6

1.1.5 Ý nghĩa kinh tế 7

1.2 Các hợp chất phenolic từ thực vật 8

1.2.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật 8

1.2.2 Phân loại các hợp chất phenolic 9

1.2.3 Một số hợp chất phenolic điển hình 10

1.2.4 Hoạt tính sinh học của phenolic 16

1.3 Giới thiệu về phương pháp trắc quang 18

1.3.1 Giới thiệu chung về phương pháp trắc quang 18

1.3.2 Định lượng tổng phenolic bằng phương pháp trắc quang 19

1.3.2 Định lượng tổng flavonoid bằng phương pháp trắc quang 19

1.4 Phương pháp thống kê xử lý số liệu thực nghệm 20

1.4.1 Phương pháp xử lý các kết quả phân tích 20

1.4.2 Phương pháp thống kê xử lý đường chuẩn 22

Phần II KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 24

2.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 24

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 24

2.1.2 Hóa chất 24

2.1.3 Pha chế dung dịch 25

2.2 Xử lý mẫu 26

2.2.1 Địa điểm lấy mẫu 26

2.2.2 Chuẩn bị mẫu 26

2.2.3 Xử lý mẫu 26

Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Xác định tổng phenolic trong cây cỏ ngọt 29

3.1.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn phụ thuộc mật độ quang vào axit gallic 29

3.1.2 Kết quả xác định hàm lượng phenolic trong mẫu cỏ ngọt bằng phương pháp trắc quang. 31

3.2 Xác định tổng flavonoid trong cây cỏ ngọt. 34

3.2.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn phụ thuộc mật độ quang vào quercetin. 34

3.2.2 Kết quả xác định hàm lượng flavonoid trong cỏ ngọt 37

Phần IV KẾT LUẬN 45

1.Đã tổng quan được một số vấn đề: 45

2.Đã xác định được tổng hàm lượng phenolic, flavonoid trong lá, thân cây cỏ ngọt trồng tại Nghệ An 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH SÁCH HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cây cỏ ngọt 3

Hình 1.2 Cấu trúc stevioside 3

Hình 1.3 Cấu trúc hoá học của các chất chính trong cây cỏ ngọt stevia 3

Hình 1.4 Cấu trúc một số flavonoid 11

Hình 1.5 Cấu trúc một số axit phenolic 12

Hình 1.6 Cấu trúc đơn phân hydroxycinnamyl alcohol 15

Hình 2.1 Mẫu cỏ ngọt 26

Hình 3.1 Phổ UV – Vis các mẫu chuẩn axit Gallic 29

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ của axit Gallic 30

Hình 3.3 Phổ UV – Vis mẫu lá cỏ ngọt 32

Hình 3.4 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ ngọt 33

Hình 3.5 Phổ UV – Vis các mẫu chuẩn quercetin 35

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ của quercetin 35

Hình 3.7 Phổ UV – Vis mẫu lá cỏ ngọt chiết với dung môi methanol 80% 37

Hình 3.8 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ ngọt chiết với dung môi methanol 80% 39

Hình.3.9 Phổ UV – Vis mẫu lá cỏ ngọt chiết với dung môi methanol nguyên chất 40

Hình 3.10 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ ngọt chiết với dung môi methanol nguyên chất 42

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Phân loại các hợp chất phenolic 10

Bảng 1.2 Giá trị phân bố t tương ứng với xác suất p và k bậc tự do 20

Bảng1.3 Dùng để tính 2 S và S X 21

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ của axit Gallic 29

Bảng 3.2 Xử lý thống kê đường chuẩn 30

Bảng 3.3 Kết quả đo mật độ quang của mẫu lá cỏ ngọt 32

Bảng 3.4 Kết quả đo mật độ quang của mẫu thân cỏ ngọt 33

Bảng 3.5 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ của quercetin 35

Bảng 3.6 Xử lý thống kê đường chuẩn 36

Bảng 3.7 Kết quả đo mật độ quang mẫu lá cỏ ngọt chiết với dung môi methanol 80% 37

Bảng 3.8 Kết quả đo mật độ quang mẫu thân cỏ ngọt chiết với dung môi methanol 80% 39

Bảng 3.9 Kết quả đo mật độ quang mẫu lá cỏ ngọt chiết với dung môi methanol nguyên chất 40

Bảng 3.10 Kết quả đo mật độ quang mẫu thân cỏ ngọt chiết với dung môi methanol nguyên chất 42

Bảng 4.1 Tổng hàm lượng phenolic trong cây cỏ ngọt 45

Bảng 4.2 Tổng hàm lượng phenolic trong các bộ phận của cây cỏ ngọt 45

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đồ án này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Hoa Du đã giao đề tài, hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình hoàn thành đồ án

Em xin chân thành cảm ơn cô giáo Ngô Thị Thủy Hà, Chu Thị Thanh Lâm thuộc Trung tâm phân tích và chuyển giao công nghệ thực phẩm – môi trường, đại học Vinh, đã hết lòng tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đồ án này

Em xin tỏ lòng biết ơn các thầy, cô giáo trong Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Hóa học - Trường Đại học Vinh đã tận tình dạy bảo và có những ý kiến quý giá trong quá trình em học tập và làm đồ án tốt nghiệp

Tuy nhiên, trong bản đồ án chắc chắn vẫn còn nhiều thiếu sót nên rất mong quý thầy

cô và các bạn góp ý để em hoàn thiện bản đồ án của mình và học hỏi, rút kinh nghiệm cho công tác nghiên cứu sau này

Cuối cùng, một lần nữa em xin gửi đến tất cả những người đã quan tâm, giúp đỡ em hoàn thành đồ án lời cảm ơn chân thành nhất !

Vinh, tháng 12 năm 2012 Sinh viên 49K -CNTP

Nguyễn Thị Phượng

TÓM TẮT Phần I Tổng quan

- Tổng quan về cây cỏ ngọt và những tác dụng của nó

- Hợp chất phenolic trong thực vật và hoạt tính sinh học của nó

- Xác định tổng hợp chất phenolic, flavonoid bằng phương pháp trắc quang

- Phương pháp thống kê xử lý số liệu thực nghiệm

Phần II Kỹ thuật thực nghiệm

- Pha chế thuốc thử Folin – Ciocalteu

- Xử lý mẫu để xác định tổng hợp chất phenolic, flavonoid

Phần III Kết quả và thảo luận

- Đã xác định được tổng hàm lượng phenolic, flavonoid trong lá, thân cây cỏ ngọt trồng tại Nghệ An

- Kết quả gần với các kết quả được công bố trong những năm gần đây

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Stress oxi hóa được đặc trưng bởi sự mất cân bằng giữa sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxy hóa trong cơ thể được coi là nguyên nhân của rất nhiều bệnh trong đó có ung thư, tim mạch, suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hóa sớm (Pincemail và Defraigne, 2004; Edeas, 2006) Kết quả nhiều nghiên cứu cho thấy

có một mối liên hệ nghịch giữa khả năng xuất hiện các căn bệnh trên và chế độ ăn giàu rau quả Giải thích hợp lý cho mối liên hệ nghịch này là do sự có mặt của chất chống oxy hóa tự nhiên có trong rau quả Các chất chống oxy hóa tự nhiên có trong rau quả sẽ vô hoạt các gốc

tự do khiến chúng không còn khả năng phá hủy các đại phân tử sinh học (AND, protein, lipid) và gây bệnh cho cơ thể

Trong số các chất chống oxy hóa tự nhiên có trong thực vật, polyphenol là nhóm chất rất được quan tâm bởi lẽ polyphenol thể hiện những đặc tính sinh học quý đặc biệt là khả năng chống oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng và khả năng kháng khuẩn (Tapiero và cs., 2002; Alberto và cs., 2006) Các polypenol có tính khử giống vitaminC, khử gốc tự do và vô hoạt chúng Ngoài ra, polyphenol làm tăng hiệu quả chống oxy hóa của nhiều chất chống oxy hóa khác như vitamin C, E và các carotenoid Nhiều kết quả thử nghiệm cho thấy chế

độ ăn giàu polyphenol (quả, rau, ngũ cốc nguyên dạng, rượu vang đỏ, trà) cho phép hạn chế

sự xuất hiện stress oxy hóa và các bệnh lên quan (Hung và cs., 2004; Haliwell, 1994)

Cây cỏ ngọt “Stevia rebaudiana bertoni” được phát hiện vào năm 1908, nhưng mãi đến năm 1931 Briel và Lavielle mới xác định được stevioside là chất ngọt cơ bản tạo nên độ ngọt Từ lá cỏ ngọt người ta chiết xuất được 11 chất có hàm lượng và độ ngọt khác nhau như: rebaudioside A và B, stevioside v.v…, đặc biệt chất stevioside là loại đường có năng lượng thấp và ngọt gấp 300 lần so với đường sacsro nhưng không độc hại cho người Stevioside được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới như: Paragoay, Braxin, Nhật Bản, Mỹ, Đức, Nam Triều Tiên, Nga, Ucraina, Trung Quốc v.v… Stevioside được sử dụng trong y học để dùng cho người bị bệnh đái đường, phòng chống xơ cứng động mạch ở người già, chống béo phì ở phụ nữ, chống sâu răng, chống ung thư vòm họng v.v… Trong công nghiệp thực phẩm stevioside là chất phụ gia để sản xuất bánh kẹo, rượu màu và nước giải khát v.v…

Tuy nhiên chưa có báo cáo về hoạt tính chống oxy hóa và tổng phenolic của cây cỏ

ngọt trồng tại Nghệ An Vì vậy, chúng tôi đã chọn đề tài “Xác định tổng hợp chất phenolic

trong cây cỏ ngọt” để làm khóa luận tốt nghiệp đại học

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong khóa luận này, chúng tôi có các nhiệm vụ sau:

- Lý thuyết chung về cây cỏ ngọt

- Lý thuyết chung về phenolic trong thực vật

- Xác định tổng phenolic theo Meda et al (2005)

- Xác định tổng flavonoid theo phương pháp nhôm clorua

3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu cây cỏ ngọt được lấy tại Công ty cổ phần đầu tư và phát triển Stevia Á Châu Mẫu dạng khô, đã được cắt nhỏ cỡ 1cm

1899, được Rasenack phát hiện vào năm 1908 nhưng mãi đến năm 1931 hai người Pháp là Bridel và Lavieille mới xác định được stevioside là chất ngọt cơ bản tạo nên độ ngọt của nó

đó nhu cầu về nhập khẩu cỏ ngọt của các nước ngày càng cao, là một triển vọng lớn cho nông nghiệp Việt Nam

Hiện nay trên thế giới, theo kết quả nghiên cứu về tính an toàn của các chất phụ gia thực phẩm, người ta đã kiến nghị cấm dùng một số chất ngọt có hại cho người như cyclamat

và saccharin Mặc dù vậy, các chất này vẫn đang bị sử dụng lén lút trong một số loại thực phẩm, rượu và nước ngọt Ở các nước phát triển và thành thị các nước đang phát triển phải

hạn chế sử dụng các chất ngọt có năng lượng cao như đường mía, đường bắp, mật và bột ngũ cốc…, người ta đã đề nghị sử dụng chất ngọt từ cỏ ngọt với mục đích thay thế cho các thức ăn giàu Calori, đáp ứng nhu cầu cho người bị bệnh đái tháo đường, cao huyết áp, mập phì… Từ năm 1991 ở các nước này dự kiến giảm 30% đường có năng lượng cao bằng các loại chất ngọt thay thế đường có năng lượng thấp, người ta sử dụng stevioside từ cỏ ngọt để làm phụ gia trong công nghiệp thực phẩm Ngoài ra người ta còn dùng nó để chế biến các loại kem đánh răng, kem làm mềm da, sữa làm mượt tóc…

Hàng năm ở Nhật Bản người ta đã sử dụng tới 45 - 53 tấn stevioside trong công nghiệp bánh mứt kẹo, nước hoa quả, rượu màu, các món tráng miệng đông lạnh… Còn ở Paragoay, nơi đã sinh ra cây trồng quý giá này, người ta dùng cỏ ngọt pha với trà làm nước giải khát Hiện nay theo các tài liệu đã công bố, 3 nước dùng cỏ ngọt trong công nghiệp thực phẩm nhiều nhất là Nhật Bản, Brasil và Paragoay Tại châu Âu và Mỹ cũng đang trên

Đà Lạt, Xí nghiệp dược phẩm trung ương 2 Hà Nội, Viện dinh dưỡng quốc gia, Phòng thí nghiệm độc tính của Trường đại học tổng hợp Hà Nội, Phòng nuôi cấy mô của Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam và Viện sinh vật Viện khoa học Việt Nam đã tiến hành các thí nghiệm về nhân giống, trồng trọt, chế biến và thử nghiệm độc tính cũng như công dụng… Kết quả nhận được cho thấy cây cỏ ngọt có những khả năng thích ứng trên những vùng sinh thái khác nhau của nước ta như Long An, Sông Bé, Đồng Nai, Lâm Đồng, Đăk Lăk, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Vĩnh Phú, Yên Bái…

Ở nước ta, cỏ ngọt có thể cho năng suất 2 - 3 tấn lá khô/ha/năm Cỏ ngọt không yêu cầu đất đai khắt khe lắm, rất thuận tiện cho việc phát triển kinh tế vườn, do vậy trồng cỏ ngọt tăng thu nhập cho người sản xuất mà không làm giảm diện tích trồng lương thực Với

độ một vài ngàn hecta đất trồng cỏ ngọt, nước ta có thể đáp ứng nhu cầu cỏ ngọt trong nước

và xuất khẩu cỏ ngọt sang các nước lân cận, là nguồn thu nhập lớn lao cho kinh tế đất nước

1.1.2 Đặc điểm thực vật học [7]

Cỏ ngọt là cây thân thảo, đa niên, có thân rễ khỏe, mọc cạn từ 0 - 30 cm (tùy thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất) Rễ của cây cỏ ngọt gieo từ hạt ít phát triển hơn rễ từ cành giâm

Cỏ ngọt có dạng thân bụi, chiều cao trung bình khi thu hoạch là 50 - 60 cm, trong điều kiện thâm canh có khi cao tới 80 - 120 cm Phân cành cấp 1 nhiều, chỉ đến khi ra hoa mới phân cành cấp 2, cấp 3 Cành cấp 1 thường xuất hiện ở những nách lá cách mặt đất 10

cm trên thân chính, nhưng khi đốn cành có thể xuất hiện ở trên tất cả các đoạn trên thân

Thân và cành cỏ ngọt tròn, có nhiều lông, đường kính thân chỗ to nhất từ 5 - 8 mm, thân già có màu tím nâu, phần non màu xanh, có khả năng ra rễ bất định (dựa vào các đặc điểm này để đặt ra các quy trình kỹ thuật chăm sóc và thu hái thích hợp)

Lá cỏ ngọt mọc đối theo từng cặp hình thập tự, phiến lá hình trứng ngược, có 12 - 16 răng cưa ở mép Lá già dài từ 5 - 7 cm, rộng từ 1,5 - 2 cm, có 3 gân song song và các gân phụ phân nhánh Trên một thân, số lá có thể đạt tới 70 - 90 lá

Hoa cỏ ngọt thuộc loại hoa đầu phức hợp, nhỏ, mọc ở đầu cành hay kẽ lá, ở cuống chùm hoa có hai lá chét nhỏ Trái nhỏ màu nâu thẫm 5 cạnh, khi chín dài 2 - 2,5 mm, có lông để gió đưa hạt đi xa Cây non gieo từ hạt sinh trưởng yếu và chậm

Diterpen glycosid ở đây là stevioside Hai glycosid chính tạo ra vị ngọt là stevioside

và rebaudioside Stevioside chiếm 5 - 10% trọng lượng cành lá khô với 3 phân tử glucozơ kết hợp với steviol (một diterpen có chức rượu và carboxyl) Những hợp chất tương tự gồm rebaudioside A, B, C, D, E, steviolbioside và dulcoside A Phần lớn đều cho vị ngọt

Hình 1.2 Cấu trúc stevioside

Hình 1.3 Cấu trúc hoá học của các chất chính trong cây cỏ ngọt stevia

Tổng axit phenolic (mg/100g dịch chiết từ mẫu lá hoặc thân khô), trong chiết xuất từ

lá cao hơn từ thân Pyrogallol là các hợp chất chính trong chiết xuất từ lá và từ thân Trong chiết xuất từ lá, pyrogallol là hợp chất nhiều nhất chiếm (951,27 mg/100 g), tiếp theo axit 4-methoxybenzoic (33,80 mg/100g), axit p-coumaric (30,47 mg/100 g), 4-methylcatechol (25,61 mg/100g), axit sinapic (9,03 mg/100 g), và axit cinnamic (2,42 mg/100g) (p <0,01) Trong chiết xuất từ thân, pyrogallol cũng là hợp chất chính (40,72 mg/100g), tiếp theo axit 4-methylcatechol 3,27 mg/100g, rồi axit salicylic (3,22 mg/100g).[14]

1.1.4 Dược tính của Cỏ ngọt [7]

Nghiên cứu tại Brasil trên thú vật đã công nhận các tính chất giảm đường huyết, hạ huyết áp Năm 1996 một nghiên cứu dùng cao thô cỏ ngọt với liều cao hơn làm cho ngọt thức ăn để thử trên chuột nhắt, thấy có tính giãn mạch ở chuột bình thường cũng như chuột cao huyết áp Nghiên cứu này cũng ghi nhận tính hạ huyết áp và lợi tiểu Một nhóm nghiên cứu khác cũng ở Brasil chứng minh cao nước cỏ ngọt làm hạ đường huyết và tăng mức dung nạp glucose trong khi thử nghiệm và sau khi nhịn đói qua đêm Một nghiên cứu khác cho thấy các glycosid khác như steviol, isosteviol và glucosilsteviol của cỏ ngọt ngăn chặn phản ứng sinh glucozơ trong cơ thể Có tính chất làm mạnh tim, điều hòa nhịp tim được báo cáo đầu tiên ở nghiên cứu trên loài chuột năm 1978

Tính hạ huyết áp có thể do hoạt động của prostaglandin tạo ra tính lợi tiểu và giãn

mạch Một giả thuyết khác, có thể do steviol ức chế tái hấp thu natri ở tiểu quản thận, khiến nước và các chất hòa tan được bài tiết nhiều hơn mà không ảnh hưởng lên mức độ lọc ở cầu thận

Một nghiên cứu lâm sàng về sự dung nạp glucozơ trên người tình nguyện Mẫu nghiên cứu gồm 22 người, cho thấy dung nạp tốt và không có phản ứng phụ gì

Theo sách “An toàn cây thuốc” của Hiệp hội dược thảo Hoa Kỳ, cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) được sắp vào nhóm I, có nghĩa là an toàn nếu dùng một cách đúng đắn [12]

Stevioside không gây độc tính cấp tính ở chuột, thỏ, chuột lang và các loài chim thí nghiệm Hóa chất trong cỏ ngọt được bài tiết không bị thay đổi cấu trúc, nên không gây đột biến, không có nguy cơ gây ung thư và không ảnh hưởng lên thai nhi Trong một nghiên cứu

ở chuột đồng với liều cao 2,5 g stevioside/kg chuột mỗi ngày không thấy phản ứng phụ hay độc tính và không tác dụng lên hệ sinh sản Stevioside không thấy gây đột biến ở vi khuẩn thí nghiệm Cho chuột đồng dùng stevioside trong 6 tháng và chuột nhắt dùng trong 2 năm không thấy ngộ độc hoặc sinh ung thư nào Liều dùng để tạo vị ngọt cho người dùng rất thấp: 1 - 10 viên stevioside (tương đương 60 - 600 mg stevioside hay 1,5 - 15 g lá cỏ ngọt khô) nhưng đủ cho độ ngọt của 18 - 180 g đường mía mà chỉ cung cấp có 2,4 calo, coi như năng lượng không đáng kể và không độc hại nào cả

1.1.5 Ý nghĩa kinh tế [7], [16], [12]

Chất ngọt chính là các stevioside chiếm từ 5-10% chất khô, có thể sử dụng ở dạng thô hoặc trộn với chè xanh hoặc chè đen để uống Có thể chế biến thành si rô, bột hoặc tinh thể, dùng bao bọc các loại thuốc hoặc dùng trong công nghiệp thực phẩm làm bánh kẹo, nước hoa quả

Cỏ ngọt có thể làm nguyên liệu và các thành phẩm sau:

- Lá khô (làm trà đơn hoặc phối hợp với atisô…); làm xi rô, bột, hoặc chiết xuất steviosid để tẩm vào trà Nhân sâm - Đương quy - Nhân trần…

- Tinh thể hay bột stevioside (để cho vào cà phê, nước giải khát, chè ngọt, bánh mứt kẹo…)

- Với trà cỏ ngọt bán trên thị trường là những gói cành lá cỏ ngọt khô, có thể dùng để sắc uống với liều 3 - 9 g/ngày Có thể sắc lấy nước đặc hơn để cho vô chè, cháo, cà phê… thay đường

Ưu điểm:

Đặc tính quan trọng của các glucozit này là có thể làm ngọt các loại thức ăn và đồ uống mà không gây độc hại cho người, không đòi hỏi kỹ thuật sản xuất phức tạp, năng suất

cao, công nghệ thu hái chế biến đơn giản Cần lưu ý khối lượng thân, lá và chất lượng cỏ ngọt đạt cao nhất ở thời kỳ trước khi nở hoa, tức là nên thu hoạch ở giai đoạn hình thành nụ, chú ý không để cây ra hoa mới thu hái

Có tính bảo đảm cao, không mốc, đảm bảo tính an toàn của chất phụ gia thực phẩm Chất ngọt từ cây cỏ ngọt rất có giá trị dùng để thay thế cho các thức ăn nghèo calo đáp ứng nhu cầu cho người bị bệnh đái tháo đường, cao huyết áp, béo phì đây là loại đường có năng lượng thấp đang được thế giới ưa dùng trong công nghiệp thực phẩm để thay thế các loại đường có năng lượng cao Ngoài ra còn dùng để chế biến các loại kem làm mềm da, sữa làm mượt tóc

Stevioside hơn các chất đường hóa học khác là đường thiên nhiên từ cây cỏ và không độc, bền ở nhiệt độ cao, không bị thủy phân ở môi trường acid (độ chua của thức ăn) và không bị lên men trong thực phẩm, hay trong quá trình bảo quản

1.2.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật [8]

Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm với một hoặc nhiều nhóm hydroxy gắn với vòng thơm Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật

và là các sản phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã

được tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như các axit phenolic đến các chất polyme như tannin

Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và vì vậy, chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người

1.2.2 Phân loại các hợp chất phenolic [1]

Các hợp chất phenolic bao gồm flavonoid, acid phenolic, tannin, lignin và một số hợp chất khác

Những thí nghiệm đầu tiên về việc tách riêng các chất hoạt động khỏi dung dịch chiết bằng nước từ các loại thực vật và từ gỗ cây được tiến hành vào cuối thế kỷ XVIII Người ta

đã xác định được bản chất phenol của những hợp chất này Tuy nhiên do sự đa dạng của chúng và do sự khác nhau về cấu trúc của chúng, nên có nhiều ý kiến khác nhau về sự phân loại các hợp chất phenol thực vật

Phenolic bao gồm một nhóm rất lớn và đa dạng của các hợp chất hóa học Các hợp chất này có thể được phân loại theo một số cách

Người ta có thể phân loại các hợp chất này theo nguồn gốc của chúng với quan điểm thực vật học, theo một số tính chất chung đã quy định trước (ví dụ như tính chất giống nhau thể hiện đối với các chất protein), theo tác dụng sinh lý học của chúng, theo phản ứng màu định tính, theo sản phẩm của sự phân giải của chúng khi đun nóng ở nhiệt độ cao (180 –

Hiện nay, nhờ sự hoàn thiện các phương pháp tách chiết, làm sạch, các phương pháp đồng nhất hóa và sự nghiên cứu cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ; nhờ sự kiện toàn các tiêu chuẩn nguyên chất và sự ứng dụng các thiết bị, dụng cụ hiện đại để nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và các tính chất của những hợp chất này, người ta đã tiến hành phân loại các hợp chất phenol thực vật trên cơ sở cấu tạo hóa học của chúng

Các hợp chất phenol thực vật có thể được chia ra thành các nhóm sau đây:

- Các hợp chất phenol thực vật đơn giản, gồm monome của các hợp chất monohydroxyl và polyhydroxyl (trừ các chất thuộc nhóm tropolon)

- Tanin thực vật gồm các hợp chất phenol hòa tan trong nước và có mức độ trùng hợp hóa không cao, có tính thuộc da

- Lignin, gồm các hợp chất phenol có mức độ trùng hợp cao, không tan trong nước,

có chứa nhiều nhóm metoxyl

Harborne và Simmonds (1964) phân loại các hợp chất này thành các nhóm dựa trên

số lƣợng nguyên tử cacbon trong phân tử (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Phân loại các hợp chất phenolic

Tại các vòng có đính một hay nhiều nhóm hydroxyl tự do hoặc đã thay thế một phần,

vì vậy bản chất của chúng là các polyphenol có tính axit

Những hợp chất đó là flavonol, flavon, flavanone, flavanol isoflavones, và anthocyanidins

Hình 1.4 Cấu trúc một số flavonoid

Các hợp chất flavonoid và hợp chất liên quan cumarin thường có ở trong các cây dưới dạng glycosit, trong đó một hay nhiều nhóm hydroxyl phenolic được hóa hợp với gốc đường

 Tính chất

Trong thực vật flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng:

- Dạng tự do (aglycol): thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, axeton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước

- Dạng liên kết với gluxit (glycosid): tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như axeton, benzen, cloroform

1.2.3.2 Acid phenolic [22]

Dựa vào cấu trúc axit phenolic được phân thành hai nhóm: hydroxybenzoic và các axit hydroxycinnamic Axit hydroxybenzoic được tìm thấy nhiều nhất bao gồm axit galic, phydroxybenzoic, protocatechuic, vanillic và syringic, trong khi axit hydroxycinnamic gồm axit caffeic, ferulic, p-coumaric và axit sinapic (Bravo, 1998)

Hình 1.5 Cấu trúc một số axit phenolic

1.2.3.3 Tanin [1]

 Định nghĩa

Theo quan điểm hóa sinh hiện đại, tanin thực vật là một hỗn hợp phức tạp của các hợp chất phenol thực vật bao gồm từ các chất phenol đơn giản – polyhydroxylphenol monome cho đến các sản phẩm oxy hóa ngưng tụ còn tính phenol của chúng

 Phân loại

Tanin được phân loại một cách chi tiết như sau:

- Galotanin là este của axit galic và các đường

- Ellagotanin là este của axit ellagic và các đường

- Este phi sacarit của các axit phenol cacboxylic

- Các dẫn xuất của flavanol – 3

- Các dẫn xuất của flavandiol – 3,4

- Các dẫn xuất của hydroxy stiben

 Tính chất

Các loại tanin thực vật thu được từ các nguồn thực vật khác nhau luôn có thành phần

là tổ hợp các cấu tử khác nhau Tuy nhiên ngoài những đặc tính riêng vốn có của mỗi loại tanin, chúng vẫn có chung một số tính chất cơ bản giống nhau vì bản chất của chúng, như đã nêu ở trên, là một hỗn hợp các chất phenol thực vật

Ở dạng tinh khiết, tanin là chất kết tinh hoặc vô định hình, có vị chát đắng ở mức độ khác nhau, trong y học tanin của một số loài thực vật được dùng làm thuốc chữa bệnh, trong công nghiệp tanin được dùng để thuộc da

Nói chung tanin thực vật đều tan trong nước (trừ tanin kết hợp có thể tan trong dung dịch kiềm) Tanin còn hòa tan trong các dung môi hữu cơ như rượu, etylacetat, aceton, phần lớn không tan trong benzen, ete dầu hỏa và clorofom Các nhóm chất trong hỗn hợp tanin thực vật cũng có tính tan khác nhau Do đó lợi dụng tính chất này người ta có thể tách riêng từng nhóm chất phenol ra khỏi hỗn hợp tanin Ví dụ, có thể dùng etylacetat để tách riêng nhóm chất catechin ra khỏi dung dịch tanin chè chiết bằng nước, trong khi đó nhóm chất đặc biệt vẫn nằm lại trong nước chè

xanh thẫm phụ thuộc vào số lượng các nhóm hydroxylphenol có trong phân tử Tính chất được dùng để định tính tanin và phân biệt hai loại tanin pirogalic và taninpyrocatechin

Khi tác dụng với kalibicromat hoặc axit cromic, tanin sẽ tạo thành kết tủa màu xanh nhạt Tính chất này được dùng để xác định độ dập tế bào của nguyên liệu thực vật dưới tác dụng cơ học, ví dụ xác định độ dập của lá chè sau mỗi lần vò để kết thúc giai đoạn vò chè

Tác dụng với dung dịch amon ferixianua, tanin tạo thành chất có màu thẫm đỏ

Tanin tác dụng với gelatin, protein, alcaloit và một số hợp chất hữu cơ khác có tính kiềm tạo thành hợp chất kết tủa tương ứng Tính chất này của tanin có ý nghĩa quan trọng ở chỗ, chúng được dùng để kết tủa protein trong công nghệ thuộc da, khử độc khi bị nhiễm độc alcaloit và khi cần thiết có thể kết tủa và loại bỏ tanin ra khỏi dung dịch

Tanin tạo thành kết tủa màu vàng tro với dung dịch chì acetat Tính chất này được dùng để tách tanin ra khỏi dịch chiết thực vật hoặc nhằm mục đích thu hồi tanin, và nhiều khi được dùng để loại bỏ tanin không tham gia vào phản ứng khi cần xác định một loại hợp

trong KI

Tanin là nhóm chất có tính khử mạnh, trong không khí chúng dễ bị oxy hóa, nhất là trong môi trường kiềm tính Các sản phẩm oxy hóa của tanin là những chất có màu đỏ hoặc nâu gọi là flobaphen tanin cũng có thể khử được dung dịch feling khi đun nóng

Tanin bị oxy hóa hoàn toàn dưới tác dụng của dung dịch kalifermangant trong môi trường axit, tính chất này được dùng để định lượng tanin với chỉ thị màu indigocarmin,

1.2.3.4 Lignin [3],[15]

 Định nghĩa

Lignin được tìm thấy trong hầu hết những cây có mạch, chúng nằm xen kẽ giữa các

tế bào, bên trong tế bào và trong thành tế bào Nó có chức năng điều khiển sự vận chuyển các chất trong thực vật (một phần tham gia vào việc giữ vững cho thành tế bào, mặt khác tham gia điều chỉnh sự vận chuyển của chất lỏng), cho phép cây lớn lên và cạnh tranh để giành ánh sáng mặt trời

Trong thiên nhiên, lignin có khả năng chống chịu lại sự thoái hóa và được gắn kết với nhau một cách phức tạp nhờ những liên kết hóa học bền vững Nó thực sự không chỉ

là một hợp chất mà bao gồm rất nhiều hợp chất Đó là những polymer ba chiều, phức tạp và

vô định hình Chúng có một cấu trúc chung là một vòng benzen với một đuôi gồm 3 cacbon Cấu trúc tự nhiên của lignin quá phức tạp đến nỗi không một cấu trúc nào có thể được mô tả một cách đầy đủ và ước tính trọng lượng phân tử của chúng khoảng 15.000 kDa hoặc nhiều hơn [15]

Lignin có cấu trúc phức tạp, là một polyphenol có mạng không gian mở Thành phần thay đổi theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu trúc gỗ Lignin là các phức hợp dị polymer thơm và hiếm, được tổng hợp từ ba loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol

Ba loại đơn phân này phân biệt với nhau tuỳ thuộc vào mức độ methoxyl hóa, với tên hóa học là: p-coumaryl M1H, coniferyl M1G và sinapyl M1S alcohol [16], [18] (Hình 1.6)

Hình 1.6 Cấu trúc đơn phân hydroxycinnamyl alcohol

Từ ba loại đơn phân này, các chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và syringyl (S) phenylpropanoid được tạo ra Các chất này sau đó sẽ kết hợp lại để tạo ra phân tử lignin

Mặc quá trình sinh tổng hợp các monolignol (đơn phân tạo ra lignin) đã được xây dựng lại nhiều lần nhưng đến nay nó vẫn còn là vấn đề bàn cãi trong các nhà khoa học Tương tự như vậy, thì các quá trình khử và polymer hóa các monolignol trong thành tế bào cũng vẫn là những chủ đề đang được nghiên cứu và thảo luận

Lignin là hợp chất raxemic với khối lượng phân tử lớn, có đặc tính thơm và kị nước Nghiên cứu xác định độ trùng hợp của lignin, người ta thấy có sự phân đoạn trong quá trình

chiết và phân tử có chứa nhiều loại tiền chất xuất hiện lặp đi lặp lại một cách ngẫu nhiên trong đó chủ yếu là các mắt xích là dẫn xuất của phenylpropan [3]

 Phân bố

Lignin là một trong những thành phần của tế bào thực vật bao bọc xung quanh các sợi xenluloza và có hàm lượng lớn thứ 2 sau xenluloza Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi không những phụ thuộc vào loại cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý Thông thường hàm lượng lignin khoảng 25 - 40% Trong các cây lá nhọn chứa 20 – 30%, trong cây lá rộng 20 – 25%, trong các cây cỏ 5 – 9% [3]

 Các ứng dụng của lignin

Lignin được ứng dụng rộng rãi như là một chất phân tán, chất ổn định và chất phụ gia trong công nghiệp sản xuất cao su, sản xuất bê tông, phụ gia đồ gốm, chất kết dính, chất dẻo trong công nghiệp,…

Lignin còn có thể được sử dụng làm nguyên liệu tổng hợp dimetyl sulfoxyt (DMSO) khi đun nóng lignin với sulfo dioxit hoặc lưu huỳnh [18]

Vanilin là sản phẩm hữu cơ quan trọng thu được bằng cách oxi hóa lignin gỗ mềm trong môi trường kiềm, còn lignin gỗ cứng cho hỗn hợp Vanilin và Sirigandehit Ngoài ra, Sirigandehit có thể sử dụng trong công nghiệp dược phẩm để điều chế thuốc ngủ [18]

Trong các ứng dụng khác, lignin được sử dụng như một chất diệt cỏ, chất ức chế quá trình lưu hóa và khử bọt với một tỉ lệ nhỏ trong quá trình lưu hóa cao su Nó còn được sử dụng như là chất khử sắt trong nước sản xuất, làm mềm nước trong các thiết bị lọc dạng

axit vô cơ nào

Lignin và các dẫn xuất của lignin được biết đến rộng rãi như các vật liệu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như làm phân bón vi lượng, thuốc kích thích tăng trưởng thực vật, phụ gia bê tông, trong thời gian gần đây một số nghiên cứu cho thấy lignin có khả năng trao đổi ion với một số kim loại, đặc biệt là khi được gắn thêm nhóm sulfuanat

1.2.4 Hoạt tính sinh học của phenolic [9], [10]

Polyphenol là nhóm các hợp chất tự nhiên có nhiều nhóm chức phenol trong cấu trúc phân tử Nhóm này gồm có các hợp chất phenol đơn giản, tannin và các hợp chất flavonoid Với cấu trúc có nhiều nhóm phenol, chúng có khả năng ngăn chặn các chuỗi phản ứng dây chuyền gây ra bởi các gốc tự do bằng cách phản ứng trực tiếp với gốc tự do đó tạo thành một gốc tự do mới bền hơn, hoặc cũng có thể tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp vốn

là xúc tác cho quá trình tạo gốc tự do

Flavonoid là nhóm hợp chất polyphenol rất phổ biến trong giới thực vật Do có bản chất là polyphenol các flavonoid thường có tính chống oxy hóa mạnh giúp cơ thể chống lại các tổn thương do gốc tự do một cách hữu hiệu Nhờ vậy, flavonoid còn có tác dụng bảo vệ

hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, nhồi máu

cơ tim, xơ vữa động mạch…

Do có cấu trúc gần giống với α- tocopherol nên chúng có thể thay thế cho nhau trong một số hệ thống Bên cạnh tính chống oxy hóa, chúng còn có khả năng ức chế một số enzym Nhiều loại enzym trong số này là các enzym oxy hóa khử như cyclooxygenase, lipoxygenase, và NADPH oxydase Flavonoid còn có khả năng chống ung thư một cách hiệu quả mặc dù cơ chế chính xác của tác động này vẫn chưa được hiểu rõ Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh ảnh hưởng của flavonoid trong sự ngăn ngừa phát sinh ung thư Điều này thúc đẩy nhiều nghiên cứu về sự ức chế phát sinh ung thư phụ thuộc flavonoid do việc loại các gốc tự do

Mỗi flavonoid đều có những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ trợ nhau Quercetin là một flavonoid phổ biến nhất, nó là genin cho nhiều loại flavonoid khác như rutin, quercitrin Những dẫn xuất này khác nhau bởi phần đường gắn vào khung quercetin

Quercetin đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong hoạt động kháng viêm của cơ thể do nó có thể ngăn chặn trực tiếp nhiều tiến trình khởi phát sự viêm: Ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị ứng Ngoài ra quercetin còn có khả năng chống oxy hóa và tiết kiệm lượng vitamin C sử dụng Khi phản ứng với gốc tự do, quercetin tạo một gốc tự do mới bền hơn do hiệu ứng liên hợp trong cấu trúc quercetin nói riêng và các hợp chất phenol nói chung, giúp giải tỏa các điện

tử tự do

Các chất như flavon, flavonol, flavanon có tác dụng kích thích tiết mật Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm này thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt, Scoparosid trong Saronthamnus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capitata đều có

tác dụng thông tiểu Ngoài ra, flavanon còn có tác dụng chữa đau dạ dày do nó có khả năng chống loét, flavonol, flavon còn có tác dụng chống viêm do các chất này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin [10]

Như vậy, khả năng chống oxy hóa của flavonoid là do:

- Trung hòa các gốc tự do và làm chậm đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxid hóa lipid

- Tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp do đó ngăn chặn sự peroxid hóa lipid

- Ức chế việc tạo ra các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzym như xanthin oxidase, cyclooxygenase, lipoxygenase…

Ở cấp độ tế bào, một trong những đặc tính hữu ích nhất của flavonoid – trung hòa các gốc tự

do – là nhờ vào cấu trúc hóa học cũng như sự liên kết chặt chẽ của nó với màng tế bào; flavonoid bảo vệ LDL chống lại sự ôxy hóa ở giai đoạn khởi đầu của sự peroxyd hóa lipid Flavonoid gắn vào bề mặt của phân tử LDL hình thành liên kết ether làm giới hạn sự tấn công mạnh mẽ của các tác nhân ôxy hóa và các gốc tự do Nhờ vậy mà flavonoid có thể bảo

vệ tế bào chống lại các tổn thương do các gốc tự do một cách rất hiệu quả

1.3 Giới thiệu về phương pháp trắc quang

1.3.1 Giới thiệu chung về phương pháp trắc quang [4]

Phương pháp này dựa vào việc đo cường độ dòng sáng còn lại sau khi đi qua dung dịch bị chất phân tích hấp thụ một phần

Phân tích trắc quang hợp chất màu gồm có ba nhóm phương pháp:

A 

Các phức màu dùng trong phân tích trắc quang thường thỏa mãn các điều kiện:

- Có độ bền phức cao

- Phức có thành phần không đổi, có mật độ quang ổn định theo thời gian

- Có vùng pH tối ưu tương đối rộng

- Có hệ số hấp thụ phân tử gam lớn thỏa mãn các điều kiện: