Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men đồ án tốt nghiệp

Tên đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men” 2... TÓM TẮT ĐỒ Á

NGHI£N CøU THU NHËN ENZYME CHITINASE

TR¦êNG R¾N

Vµ KH¶O S¸T KH¶ N¡NG CHUYÓN HãA CHITIN

TRONG QU¸ TR×NH L£N MEN

Giáo viên hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Sinh viên thực hiện: Lê Thị Phương

NGHỆ AN - 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Lê Thị Phương Số hiệu sinh viên: 0852040456

Khóa: 49

Ngành: Công Nghệ thực phẩm 1 Tên đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men” 2 Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: ………

………

………

………

Ngày tháng năm 2012

Chủ nhiệm bộ môn Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm 2012

Người duyệt

(Ký, ghi rõ họ, tên)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Lê Thị Phương Số hiệu sinh viên: 0852040456

Khóa: 49 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán bộ duyệt: 1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

………

2 Nhận xét của cán bộ hướng dẫn: ………

………

………

………

………

……… ………

Ngày tháng năm 2012

Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Lê Thị Phương Số hiệu sinh viên: 0852040456

Khóa: 49 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán bộ duyệt: 1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

………

2 Nhận xét của cán bộ duyệt: ………

………

………

………

………

……… ………

Ngày tháng năm 2012

Cán bộ duyệt

(Ký, ghi rõ họ, tên)

LỜI CẢM ƠN

Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Hóa thực phẩm, Trường Đại học Vinh Để hoàn thành được đồ án này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ của nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Đào Thị Thanh Xuân,

giảng viên Khoa Hóa học, trường Đại học Vinh đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Xin cùng bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo, người đã đem lại cho tôi những kiến thức bổ trợ, vô cùng có ích trong những năm học vừa qua

Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Hóa thực phẩm, Phòng Hóa vô cơ đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Vinh, tháng 12 năm 2012

Sinh viên

Lê Thị Phương

TÓM TẮT ĐỒ ÁN

Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum

trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men

Nội dung nghiên cứu:

 Nuôi cấy nấm Trichoderma hazianum sinh tổng hợp enzyme chitinase trên

môi trường rắn

 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, độ ẩm, nhiệt độ,tỷ lệ cơ chất, pH tới

quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum

 Nghiên cứu quá trình đồng thời chuyển hóa chitin và lên men để tạo Glucosamin dưới xúc tác enzym chitinase

Đề tài đã đạt được một số kết quả như sau:

1 Thu nhận được enzyme chitinase từ quá trình nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum trên môi trường rắn

2 Nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase trên môi trường rắn thu được enzym có hoạt tính cao tại:

- Thời gian nuôi cấy: 5 ngày

- Tỷ lệ cơ chất: 1,6 % trên tổng khối lượng môi trường

3 Nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đồng thời lên men

và chuyển hóa chitin bằng enzyme chitinase tạo ra hàm lượng đường amin nhiều nhất

tại các điều kiện:

- Thời gian chiết: 24 giờ

- Hàm lượng cơ chất bổ sung vào quá trình trích ly: 3g/ml

- Bổ sung cơ chất trong 4 lần, mỗi lần ¼ tổng lượng cơ chất tối ưu

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ĐỒ ÁN ii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG v

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu, yêu cầu và ý nghĩa của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Chủng nấm sợi Trichoderma hazianum 3

1.1.1 Giới thiệu chủng 3

1.1.2 Nguồn dinh dưỡng cơ bản của chủng Trichoderma hazianum 5

1.2 Enzyme Chitinase 6

1.2.1 Định nghĩa 6

1.2.2 Phân loại 7

1.2.3 Cấu trúc của hệ enzyme Chitinase 9

1.2.4 Các đặc tính cơ bản của enzym chitinase 9

1.2.5 Các loại cơ chất của enzym Chitinase 11

1.2.6 Cơ chế tác dụng 13

1.2.7 Cơ chế cảm ứng 15

1.2.8 Nguồn thu nhận Chitinase 16

1.2.9 Ứng dụng của chitinase 17

1.2.10 Tình hình nghiên cứu thu nhận chitinase từ Trichoderma 20

1.3 Glucosamin 22

1.3.1 Cấu trúc hóa học và tinh chất hóa lý của glucosamin 22

1.3.2 Tác dụng của glucosamin 22

1.3.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất glucosamin trên thế giới và ở Việt Nam 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Vật liệu và hóa chất, môi trường 26

2.1.1 Vật liệu 26

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 26

2.1.3 Các môi trường 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase 28

2.2.2 Phương pháp xác định đường amin theo Elson-Morgan 29

2.2.3 Phương pháp điều chế chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học 30

2.2.4 Phương pháp thu nhận enzym chitinase trên môi trường rắn 32

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đên sự sinh tổng hợp enzyme chitinase 33

2.2.6 Phương pháp nghiên cứu nâng cao hiệu suất thủy phân tạo đường amin của chitinase 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp enzym từ chủng Trichodermar trên môi trường rắn 38

3.1.1 Nghiên cứu Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase trên môi trường rắn 39

3.1.2 Nghiên cứu Ảnh hưởng của độ ẩm đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase trên môi trường rắn 40

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase trên môi trường rắn 42

3.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase trên môi trường rắn 43

3.2 Quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin 45

3.2.1 Nghiên cứu thời gian quá trình đồng thời lên men và chuyển hóa chitin 45

3.2.2 Nghiên cứu hàm lượng cơ chất tối ưu cho quá trình đồng thời chiết enzym và thủy phân chitin 46

3.2.3 Nghiên cứu cách bổ sung cơ chất cho quá trình đồng thời chiết enzym và thủy phân chitin 47

KẾT LUẬN 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG

Trang

Hình:

Hình 1.1 Bào tử và quá thể nấm Trichoderma hazianum 3

Hình 1.2 Bào tử nấm Trichoderma hazianum 4

Hình 1.3 Vị trí thủy giải phân tử chitin bởi enzyme chitinase 7

Hình 1.4 Sơ đồ phân cắt chitin bởi enzyme thuộc nhóm chitinase 7

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc Không gian của enzyme chitinase Serratia marcescens 9

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc không gian của chitinase Hodeum Vulgale 9

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của Allosamidin và dẫn xuất Allosamidin 11

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của chitin 12

Hình 1.9 Các dạng lập thể của chitin 13

Hình 1.10 Cơ chế thủy giải tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase 14

Hình 1.11 Các vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme chitinase tại trung tâm hoạt hóa 14

Hình 1.12 Công thúc cấu tạo của glucosamin 22

Hình 2.1 Trichoderma phát triển trên môi trường PGA 26

Hình 2.2 Chitin 31

Hình 2.3 Chitin huyền phù 1% 32

Hình 3.1 Đường chuẩn Glucosamin nồng độ 300 ÷500 (µg/ml) 38

Hình 3.2 So sánh giữa lên men trên môi trường rắn và môi trường lỏng 38

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase 39

Hình 3.5 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ tới quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase 41

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất tới quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase 43

Hình 3.7 Ảnh hưởng của yếu tố pH tới quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase 44

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin 46

Hình 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất tới quá trình lên men và chuyển

hóa đồng thời chitin 47

Hình 3.10 Ảnh hưởng của cách bổ sung cơ chất tới quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin 48

Bảng: Bảng 2.1 Cách pha nồng độ glucosamin 300 - 500µg/ml 30

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới hoạt độ enzym chitinase 39

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường tới hoạt độ enzym chitinase 40

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ 41

Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ cơ chất tới hoạt độ enzym chitinase 42

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy tới hoạt độ enzym chitinase 44

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin 45

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất tới quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin 47

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của cách bổ sung cơ chất tới quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin 48

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Với vai trò là chất xúc tác sinh học, enzym có bản chất là protein, có cấu trúc phân tử phức tạp và tinh vi Đặc biệt hoạt lực xúc tác cao hơn nhiều so với chất xúc tác thông thường, và có tính đặc hiệu cao Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, nông nghiệp, thức ăn chăn nuôi, y học

Enzym có thể được khai thác từ nhiều nguồn khác nhau Mặc dù vậy, hiện nay người ta khai thác nhiều nhất enzyme từ vi sinh vật Do vi sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong tự nhiên mạnh nhất Hơn thế so với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều

ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo quy mô công nghiệp Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu

và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase, Những năm sau này người ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme thủy phân chitin

Những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase do tiềm năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamin và N-acetyl glucosamin, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm soát nấm ký sinh trên cây trồng

Chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma Harzianum Cả về sự điều hòa hay tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitinase trên

môi trường nuôi cấy chìm hay lên men bề mặt Các nghiên cứu phần lớn tiến hành trong môi trường lỏng Cho tới năm 2003, Ashok Pandy và cộng sự nghiên cứu tối

ưu hóa quá trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ Trichoderma Harzianum nuôi cấy trên môi trường rắn Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được

phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao Đó chính là tiền đề để chúng tôi thực hiện

đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men”

2 Mục tiêu, yêu cầu và ý nghĩa của đề tài

2.1 Mục tiêu

Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum

trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men

tính chưa cao Đề tài mang lại một số ý nghĩa khoa học và thực tiễn cho những

nghiên cứu sâu hơn về enzyme chitinase từ vi nấm Trichoderma hazianum

Kết quả của đề tài sẽ bổ sung cho những nghiên cứu trước đó về vi nấm

Trichoderma hazianum, đồng thời làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về vi nấm Trichoderma hazianum Kết quả nghiên cứu còn là nguồn tham khảo tốt cho

những nghiên cứu về những ứng dụng cụ thể của enzyme chitinase, nhất là glucosamin để đưa vào sản xuất và đời sống nhằm giảm giá thành chế phẩm và nâng cao hiệu quả sử dụng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Giới thiệu chủng

1.1.1.1 Nguồn gốc

Trichoderma hazianum được tìm thấy khắp mọi nơi trừ những vĩ độ Cực Nam

và Cực Bắc Hầu hết các dòng Trichoderma hazianum đều hoại sinh, chúng phổ biến

trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kĩ sinh trên những loại

nấm khác [22] Trichoderma hazianum rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật Mỗi dòng nấm Trichoderma hazianum khác nhau có

nhu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau [21]

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Trichodema hazianum là một nấm đất, phát triển tốt trên các loại đất giàu dinh

dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật Đặc điểm hình thái của nấm này là cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn Bào tử thường có màu xanh, đơn bào, hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy theo từng loài Bào tử đính ở đỉnh của cành [22]

Hình 1.1 Bào tử và quá thể nấm Trichoderma hazianum

1.1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học

Đa số các dòng nấm Trichoderma hazianum phát triển ở trong đất có PH từ 2,5 đến 9,5 và phát triển tốt ở PH = 4,5 - 6,5 Nhiệt độ để Trichoderma hazianum phát

triển tối ưu thường là 25 - 300C, ở một vài dòng phát triển tốt ở 350C, một số ít phát triển được ở 400C [20], [22] hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma hazianum

khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau Ở 350C chúng tạo ra những rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và mép bất thường, Ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

Trichoderma hazianum là loại nấm mốc, sợi nấm có vách ngăn, tế bào hữu tính

ít khi thấy rõ Đính bào tử (conidi) là một tế bào hình cầu, hình trứng hoặc hình trụ ngắn Conidi không có chất nhầy bao bọc Cuống conidi và các nhánh bên của cuống dài và mảnh, không có đoạn sợi vô sinh kéo dài, thể hình chai không cụm lại, có phần mỏng manh [22]

Trichoderma hazianum là loại sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như

chitinolytic (enzyme phân giải chitin) Đây là enzyme chính phân giải thành và màng

tế bào, phá hủy khuẩn ty của nấm đối kháng với Trichoderma Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nảy mầm, tuy nhiên cơ chế của tác động này

chưa được biết [21]

Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma hazianum có thể xẩy ra hiện

tượng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác

và đa dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loại Trichoderma hazianum Vì thế sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý

khác nhau và đây là những dòng rất có ý nghĩa trông nghiên cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật cứu [22]

Hình 1.2 Bào tử nấm Trichoderma hazianum

1.1.2 Nguồn dinh dƣỡng cơ bản của chủng Trichoderma hazianum

1.1.2.1 Nguồn cacbon

Manczinger và Pollner (1985) đã sử dụng nguồn cacbon là phương thức để

phân loại các giống Trichoderma hazianum thành từng nhóm Theo phân tích, những

nguồn cacbon sau được sử dụng bởi tất cả các chủng đã nghiên cứu: glucose, galactose, D-fructose, D-mannose, cellobiose, trehalose, D-xylose, L-arabinose, D-mannitol, D-arabitol, glycerol, salicin, esculin, arbutin, glycerol-1-monoacetat, b-methyl-D-glucosid và N-acetyl-b-D-glucosamin Nói chung nguồn cacbon tốt nhất là glucose, fructose, mannose, galactose, xylose, trehalose và cellobiose [20]

D-Việc sử dụng một vài nguồn cacbon (như inulin, tinh bột, xylan, pectin, lactose, sucrose, maltose, một vài polyol, sugar acid, hầu hết các amino acid và một vài pentoses) thì tùy thuộc vào từng loài, và có thể sử dụng cho mục đích phân loại hóa học[22]

Trichoderma hazianum nổi bật về khả năng tiết ra enzyme phân hủy nhiều loại

polymer liên quan như chitinase Những enzyme này được công nhận có giá trị thương mại [21]

1.1.2.2 Nguồn nitơ

Nguồn nitơ hữu cơ như pepton thường được sử dụng trong môi trường để hạn chế sự tăng trưởng chậm trên cơ chất polymeric như cellulose Tuy nhiên cần chú ý rằng pepton được sử dụng như là cả nguồn nitơ lẫn cacbon, và được ưu tiên sử dụng khi được cung cấp đồng thời với polysaccharid Trong số những amino acid, nguồn

nitơ tốt nhất cho Trichoderma hazianum là alanin, acid aspartic và acid glutamic [22]

Trichoderma hazianum có khả năng sử dụng cả những nguồn nitơ phức tạp hay đơn giản để tăng trưởng Khi Trichoderma hazianum đang tăng trưởng trên nguồn

cacbon là carbohydrat, nguồn nitơ thường được sử dụng là amonium hơn là nitrat, Một

vài chủng như là T.reesei hay T.koningii T-1 cũng không thể sử dụng nitrat Đó là do

sự thiếu enzyme nitrate permease [20] [22]

1.1.2.3 Nguồn dinh dƣỡng khác

Hầu hết các chủng phân lập hoang dại của Trichoderma hazianum không yêu

cầu cao những nhân tố tăng trưởng phức tạp hay vitamin

Thành phần ion kim loại của sợi nấm T hazianum đã được phân tích bởi Gaunt

và cộng sự (1984) và được sử dụng để tính toán nhu cầu về ion kim loại Những ion

kim loại như sắt thì cần thiết cho sự tăng trưởng và có thể được tìm thấy ở một nồng

độ rất thấp trong môi trường [22]

Một số lượng lớn những ion kim loại khác cũng rất quan trọng cho sự tăng trưởng ở những nồng độ thấp, ngược lại nồng độ cao lại ức chế tăng trưởng Sự thêm vào của Cd2+ và Hg2+ ở nồng độ 1-10mM dẫn đến ức chế tăng trưởng T hazianum và

đẫn đến kiểu hình bất thường của nấm Tuy nhiên tương tự nhiều loại nấm khác,

Trichoderma hazianum cũng bắt các ion kim loại trong màng tế bào của chúng, phát

hiện này đã được sử dụng trong việc loại bỏ những ion kim loại nặng ra khỏi nước thải

công nghiệp bằng hệ sợi nấm Trichoderma hazianum [21]

1.2.2.4 Nguồn O 2 và CO 2

Trichoderma hazianum là vi sinh vật, mặc dù những chủng đã phân lập được

đều thu nhận trên những môi trường sống có áp suất từng phần oxi rất thấp Cung cấp oxi và hoạt động của ti thể cũng là những nhân tố điều hòa sự hình thành chitinase của

T hazianum và nồng độ O2 ở mức dưới cực thuận là thích hợp cho sự tổng hợp enzyme [22]

CO2 là sản phẩm cuối cùng của sự oxi hóa cacbon, sẽ được tích lũy ở một mức

độ nào đó trong môi trường tăng trưởng rắn, phụ thuộc PH và nhiệt độ Vì vậy, một số

loại T hazianum bị ức chế bởi CO2 theo phương thức phụ thuộc vào PH, sự ức chế mạnh nhất trong môi trường kiềm nhẹ và trung tính [23] nghiên cứu và cho rằng

T.harzianum tạo ra hiệu ứng ức chế CO2 và ethanol trên sự tăng trưởng và tạo bào tử

của nhiều nấm khác (Aspergillus niger, pestalotia rhododendri), trên cây con của Lactuca sativa Điều này cho thấy một vài chủng Trichoderma hazianum có thể chấp

C1 và C4 của 2 phân tử N- acetyl glucosamine liên kết nhau trong chitin

Hình 1.3 Vị trí thủy giải phân tử chitin bởi enzyme chitinase

1.2.2 Phân loại

a Dựa vào phản ứng phân cắt [22]

Enzyme phân giải chitin bao gồm: Endochitinase, Chitin-1,4-β- chitobiosidase, acetyl-β- D-glucosaminidase (exochitinase)

N-Endochitinase là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngấu nhiên tạo các đoạn oligosaccharid Các enzyme này đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi

trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase M1 = 36kDa,

pI1 = 5,3+/- 0,2 và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8)

Chitin 1,4 -  - chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose

N - acetyl -  - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N - acetyl - D - glucosamin

Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N - acetyl - D - glucosamin

Hình 1.4 Sơ đồ phân cắt chitin bởi enzyme thuộc nhóm chitinase

b Dựa vào cấu trúc phân tử [24]

Enzyme chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase

Họ Glycohydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoẵn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như Chitodextrinase, Chitobiase và N-acetyl glucosaminidase Các enzyme này hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β- polimer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β- anomer

Các Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens

Họ Glycohydrolase 19 họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật

như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum) Ngoài ra, còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ

chế nghịch chuyển

c Dựa vào trình tự amino acid [25]

Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:

- Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptid nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

- Nhóm II là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đạm giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn; chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài

- Nhóm III trình tự amino acid hoàn toàn khác nhau với chitinase nóm I và II

- Nhóm IV là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 - 47

% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I

- Nhóm V dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

1.2.3 Cấu trúc của hệ enzyme Chitinase

1.2.3.1 Cấu trúc enzym chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18

Cấu trúc không gian (cấu trúc bậc 3) của một số enzyme chitinase thuộc họ

Glycohydrolase 18 đã được nghiên cứu, cụ thể là chitinase vi khuẩn (serratia marcascens) và chitinase thực vật Tâm hoạt động của các enzyme này tạo thành từ 8

sợi xoắn / cuộn tròn Sợi số 8 của phiến cuộn vào bên trong cấu trúc hình nhộng với vòng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn hướng ra ngoài

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc Không gian của enzyme chitinase Serratia marcescens

1.2.3.2 Cấu trúc enzym chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19

Chitinase tách chiết từ lúa mạch (Hodeum vulgare) đã được tinh thể hóa và phân

tích cấu trúc bằng tia X Đầu tiên người ta tiến hành quan sát ở độ phân giải 2,8Ao và sau đó quan sát ở đọ phân giải 1,8Ao

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc không gian của chitinase Hodeum Vulgale

1.2.4 Các đặc tính cơ bản của enzym chitinase

1.2.4.1 Trọng lƣợng phân tử

Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30kDa Enzyme chitinase của các loại thân mềm, chân đốt, động vật có xương

(cá, lưỡng cư, thú) có trọng lượng phân tử cao hơn, khoảng 120 kDa Trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ

30 đến 120 kDa [22]

Một số enzyme chitinase có trọng lượng phân tử thấp có thể được tạo ra từ một enzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một phần Protein

1.2.4.2 Điểm đẳng điện - phổ hấp thụ - số Michaelis

Enzyme chitinase có giá trị pI thay đổi rộng 3,0 - 10,0 ở thực vật bậc cao và tảo

pH thay đổi 4,7 - 9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá, pI bằng 3,5 -8,8 ở vi sinh vật [24] Hệ số hấp thụ E280mg/ml = 1,24; phổ hấp thụ chỉ là bước sóng đơn 280 m Hằng số michaelis: 0,01-0,011 (g/100ml) [22]

1.2.4.3 Nhiệt độ

Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là

400C, ngoại trừ enzyme chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là

glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 500C [22]

Tùy thuộc nguồn gốc thu nhận mà enzyme chitinase có thể có những nhiệt độ tối ưu khác nhau

Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và các chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập từ suối nước nóng có khả năng chịu nhiệt độ đến 800C Mặt khác, chitinase từ côn trùng (tằm ) không ổn định ở nhiệt độ 400C, có thể do côn trùng phát triển ở nhiệt độ 250C nên nhiệt độ tối ưu của enzyme chitinase côn trùng không cao

1.2.4.4 pH

Giá trị pH tối ưu của enzyme chitinas thường giao động trong khoảng từ 4 - 9 đối với các chitinase ở thực vật bậc cao và tảo ở động vật là 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là 3,5-8,0 pH tối thích của enzyme chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng

Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối thích khoảng 5,0 khi

cơ chất là chitin, enzyme chitinase của Streptomyces grieus có pH tối thích khoảng

6,3 Tùy mục đích phân tích, những cơ chất hòa tan như glycol chitin và N- acetyl chitooligosacharid được sử dụng thay thế cho chitin thì PH tối ưu nằm trong khoảng giá trị PH kiềm yếu [24]

Hoạt tính của enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH < 4 ngoại trừ chitinase trong dạ dày của động vật có xương sống, vẫn hoạt động ở pH 3,0

1.2.4.5 Chất tăng hoạt - Chất ức chế

Allosamidin: Allosamidin là chất ức chế được nghiên cứu, đặc biệt là với chitinase côn trùng Allosamidin ức chế cạnh tranh với enzyme chitinase, giá trị KI khoảng 0,1m Chất này có cấu tạo tương tự dạng trung gian của cơ chất: một vòng oxazoline; vòng này có thể ở giữa carbonyl oxygen của nhóm N- acetyl và C1 của N - acetyl - D - glucosamin trong quá trình thủy phân [24]

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của Allosamidin và dẫn xuất Allosamidin

Allosamidin: R1 = R2 = CH3

Demethylallosamidin: R1 = CH3, R2 = H

Didemethylallosamidin: R1 = R2 = H

1.2.4.6 Các ion kim loại

Các ion kim loại: Hg2+, Ag+ ;là những chất ức chế, còn ion Cu+ thì tùy theo dạng enzyme chitinase: dạng chitinase bị ức chế hoặc tăng cường hoạt tính (tìm thấy ở một số loại cá và vi sinh vật) Bên cạnh đó albumin cũng có vai trò làm tăng hoạt động của enzyme chitinase, nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ đầu của phản ứng [22]

1.2.4.7 Ổn định hoạt tính

Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng

2 năm Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 370

C trong trường hợp không có mặt cơ chất Chu kỳ bán hủy ở 370C là 40 ngày và ở 50C là 230 ngày

Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ chất là chitin Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 200C là k = 0,145/h [22]

1.2.5 Các loại cơ chất của enzym Chitinase

1.2.5.1 Chitin

Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin Chitin được tìm thấy trong thành

tế bào của nấm sợi và là chất hữu cơ chiếm khối lượng lớn hình thành nên lớp vỏ

ngoài của động vật không xương sống (côn trùng, giáp xác, thân mềm), cụ thể thành phần chitin chiếm từ 25 - 60% trọng lượng khô lớp vỏ ngoài của côn trùng

Chitin là một polymer mạch thẳng có cấu tạo dạng chuỗi, thành phần chủ yếu là các monomer N- acetyl-D- glucosamin nối với nhau bằng liên kết 1,4-  - glucosid Mỗi đoạn chitin được xác định có độ dài là 10,4 Ao Về mặt cấu trúc chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số

2 trên khung các bon của chitin được thay thế bằng nhóm hydroxyl (- OH) ở cellulose Ngoài ra, chitin cũng có cấu trúc liên hệ với murein- cấu trúc polymer hiện diện ở vách

tế bào vi khuẩn [24]

Ở lớp vỏ côn trùng và giáp xác chitin được được gắn kết với các polysaccharid khác (cellulose, mannan, glucan…) hàm lượng chiếm tối đa khoảng 3-5% sinh khối nấm tươi

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của chitin

Đến nay, chitin tinh sạch chỉ được phát hiện ở lớp vỏ ngoại bào của Thalassiosira fluviatilis và Cyclotella cryptica Do đó, chitin với cấu trúc chuỗi -(1-4) - 2 - acetamido - 2 - hydroxyl - D - glucopyranose chỉ tồn tại sau khi đã trải qua một quá trình tinh chế loại bỏ các tạp chất khoáng, các protein và các thành phần khác Trong tự nhiên, chitin là một chất hữu cơ chiếm vị trí thứ hai sau cellulose về số lượng Chitin là chất rắn vô định hình, bền vững, không tan trong nước, hầu hết các acid cũng như kiềm, alcol và các dung môi hữu cơ khác Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan) hoặc bằng enzyme sinh vật

Về mặt cấu trúc lập thể, Chitin có 3 dạng: , ,  ; sự khác nhau này biểu hiện

ở sự sắp xếp các chuỗi Ở - chitin các chuỗi " xuôi" xen kẽ với 2 chuỗi " ngược" Dạng chiếm nhiều nhất là -chitin [21]

Hình 1.9 Các dạng lập thể của chitin

α - chitin có cấu trúc các mạch được xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên

β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β- chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn

Trong tế bào, chitin được hình thành từ uridin-diphosphat-N-acetyl-D-glucosamin nhờ enzyme chitinsynthetase (EC 2.4.1.16) Chitin-N- deacetylase (EC 3.5.1.41) xúc tác phản ứng N - deacetyl hóa chitin thành chitosan

1.2.5.2 Các dẫn xuất của Chitin

Enzyme chitinase có thể tác động lên một số dẫn xuất của chitin như chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4- methylumbellferyl-tri N-acetyl chititrioside (MUC - phát huỳnh quang)

Enzyme chitinase không tác động trên các cơ chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin [22]

1.2.6 Cơ chế tác dụng

Enzyme chitinase xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết 1,4-ß-glucosid trong chitin Nó phân cắt dọc theo mạch cacbon của chitin và sản phẩm tạo thành chủ yếu là chitobiose và chitotriose Những chất này sau đó tiếp tục bị phân cắt thành các monomer là các N-acetyl-D-glucosamin

Quá trình phân giải chitin được tóm tắt như sau:

Chitin - Chitobiose -N - acetyl - D - glucosamin

Sự thủy giải chitin có thể có thể xẩy ra theo 2 cơ chế: Cơ chế giữ lại các cấu tử

- anomer trong sản phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng  sang dạng 

Vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme chitinase được giả định bao gồm tối thiểu 6 tiểu phần đường được ký hiệu từ A đến F (bắt đầu từ đầu không khử) Tại vị trí này, hexasaccharid sẽ được phân cắt thành hai trisaccharid [26]

Hình 1.10 Cơ chế thủy giải tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase

(1) Cơ chế giữ lại các cấu tử  - anomer (Chitinase họ glycohydrolase 18) (2) Cơ chế nghịch chuyển từ dạng  - anomer sang dạng  - anomer (chitinase họ glycohydrolase 19)

(A: Glu 67, B: Glu 89)

Hình 1.11 Các vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme chitinase tại trung tâm hoạt hóa

1.2.7 Cơ chế cảm ứng

Hiện nay, cơ chế cảm ứng hệ enzyme chitinase của Trichoderma hazianum là

chủ đề rất được nhiều nhà khoa học quan tâm Sự cảm ứng enzyme ngoại bào rất hiệu

quả khi nuôi cấy Trichoderma hazianum trong môi trường có nguồn cacbon duy nhất

là chitin tinh sạch, vách tế bào nấm hoặc hệ sợi nấm Không có hoặc rất ít có hiện tượng cảm ứng khi thành phần môi trường có chữa chitosan, cellulose, chitin chưa tinh sạch hoặc laminarin [26]

Các enzyme khác nhau thì có cơ chế cảm ứng khác nhau Ví dụ: N - acetyl - glucosamin chỉ cảm ứng đặc trưng cho việc tạo ra  - N - acetyl - hesoaminidase (N-acetylglucosaminidase) mà không cảm ứng tạo ra endochitinase hoặc chitobiosidase ở

Trichoderma hazianum

Trong quá trình kí sinh của Trichoderma hazianum trên những ký chủ khác

nhau thì mức độ cảm ứng và thành phần các sản phẩm enzyme tạo thành khác nhau, chủ yếu là 1,4 - - N- acetylglucosaminidase 102 kDa và 72 kDa (CHIT 102, CHIT72) và một vài enzyme endochitinase của nhóm II Hơn nữa vách tế bào nấm thu nhận từ những loại nấm đảm Basidiomycetes khác nhau, được sử dụng để cảm ứng

endochitinase từ các chủng Trichoderma hazianum cũng khác nhau [24]

Sự hình thành hệ enzyme chitinase trong ống nghiệm bị ức chế bởi tỉ lệ gia tăng của lượng đường glucose, sucrose và sản phẩm cuối, điều này cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp enzyme được điều chỉnh một cách đặc hiệu bởi sự ức chế dị hóa Điều này đã được nghiên cứu rõ hơn ở endochitinase 42 kDa (CHIT42) và gen mã hóa

ThEn-42 của T.harzianum Nhiều tác giả cho rằng, glucose ức chế sự hình thành

CHIT42 cũng như ở cấp độ mRNA Sự hình thành CHIT72, CHIT42 và CHIT33 được điều hòa ở cấp độ phiên mã [25]

Inbar và Chet đã chứng minh sự tạo thành enzyme chitinase của chủng

T.harzianum ký sinh được bắt nguồn bởi việc tiết ra chất trung gian tương tác với ký

chủ lectin Hiện tượng này xẩy ra khi có sự cảm ứng của chitooligomer Lectin là hệ thống nhận biết ký chủ của vi nấm ký sinh và rất có giá trị trong nghiên cứu pha sớm của quá trình ký sinh nấm Sự thật là trong điều kiện ống nghiệm hệ sợi nấm đã hấp khử trùng có tác dụng cảm ứng CHIT33 và CHIT42 mạnh hơn tác nhân cảm ứng là

chitin tinh sạch Do đó, khi có sự tồn tại của kí chủ nhưng không có chitin cũng đủ để vượt qua được sự ức chế của glucose đối với CHIT42 [26]

Sự cảm ứng cũng bị hạn chế bởi ánh sáng, quá trình tạo bào tử hay sự tiếp xúc vật lý giữa tế bào và cơ chất Sự hoạt động của hệ enzyme chitinase bị ảnh hưởng bởi các hoạt động của những hợp chất cảm ứng khác nhau như các enzyme phá hủy vách khác (protease và glucanase), các liên kết protein trong vách tế bào chất, permease và chất kháng sinh [22]

1.2.8 Nguồn thu nhận Chitinase

Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các giới vi sinh vật Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về enzyme chitinase của các vi sinh vật, thực vật, động vật [27]

1.2.8.2 Chitinase nấm

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loại nấm sợi Các chủng nấm mốc cho

enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, đặc biệt là ở các

loại nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus Các nấm phân hủy chitin cũng được tìm

thấy trong các thủy vực như loại nấm Karlinggiomyces asterocystic thuộc lớp Phycomycetes [24]

Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của cách tế bào nấm Chitinase còn giữa vai trò chính trong hoạt động ký sinh nấm nhằm đối kháng lại các loại nấm gây bệnh thực vật

enzyme chitinase như: cao su (Hevea brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa mạch (Hordeum vulgare), cà rốt, hạt đậu nành và đặc biệt một số loại tảo biển cũng là

nguồn cung cấp enzyme chitinase [21]

1.2.8.4 Chitinase động vật

Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loại động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt (ví

dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận được enzyme

chitinase Đối với động vật có xương sống enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy

và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ; trong dung dịch dạ dày của những loại chim, thú ăn sâu bọ [22]

Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của các loại chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cutincun) trong quá trình biến thái hay lột xác

1.2.9 Ứng dụng của chitinase

1.2.9.1 Trong nông nghiệp

 Sử dụng enzyme chitinase trong kiểm soát nấm gây bệnh thực vật

Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chữa chitin Chitinase và -1,3-glucanase được tạo ra trong mô thực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây bệnh chữa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của bệnh [29]

Sự kích thích hoạt tính enzyme chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải amoniac, phenylalanin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật

Bên cạnh đó các nhà khoa học cũng đã chứng minh quá trình chống lại các mầm bệnh thực vật có liên quan đến việc sản xuất ra enzyme chitinase [22] Thật vậy,

vi khuẩn có khả năng chống lại nấm bệnh bằng cách sản xuất ra chitinase Chitinase

của Streptomyces có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh Chủng Serratia marcescen hoang dại có khả năng kiểm soát sinh học đối với các mầm bệnh thực vật

Ở chủng Serratia marcescens đột biến có mang gen ChiA (gen mã hóa enzyme

chitinase), khi gen bị bất hoạt thì chủng này.mất hiệu lực kiểm soát sinh học Khi tái tổ

hợp gen ChiA từ Serratia marcescens và E.coli có khả năng làm giảm các bệnh gây ra bởi Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani [27], [28]

Những thí nghiệm trong ống nghiệm gần đây cho biết sự nảy mầm của bào tử

và sự kéo dài sợi nấm của các nấm gây bệnh thực vật như: Botrytis cinerea, Fusarium solani, F.graminearum bị ức chế

bởi enzyme phân giải chitin và glucan tách chiết từ Trichoderma harzianum

Một số loại nấm có vách chữa chitin bị ức chế bởi enzyme chitinase bao gồm

Fusarium, Gliocladium, Rhizotonia, Ustilago, Erysiphe, Botrytis, Sclerotium và Alternaria

 Sử dụng enzyme chitinase trong kiểm soát côn trùng [15]

Phần lớn các nấm gây bệnh côn trùng như Metarhizium anisopliae, Nomurae rileyi, Aschersonia aleyrodis, verticillium lecanii và một số nấm thuộc bộ

Entomophtorales xâm nhập vào cơ thể sâu bằng sợi nấm xuyên qua lớp vỏ cutincun (là phức chất protein-chitin) vào bên trong.Các vòi nấm tiết ra enzyme ngoại bào bao gồm chủ yếu là enzyme phân giải chitin và protein, tạo thành những lỗ giúp chúng xâm nhập vào trong và dễ dàng lây nhiễm bệnh cho côn trùng Các nhà khoa học đã chứng minh mỗi liên hệ giữa khả năng tiêu diệt sâu bệnh của vi nấm đối kháng và sự tổng hợp enzyme chitinase ở các loại vi nấm này

1.2.9.2 Trong y dƣợc và các ngành công nghiệp khác

 Sản xuất chitooligosaccharid

Hiện nay hoạt tính sinh học của các chitooligosaccharid ngày càng được nghiên cứu sâu Trong y học người ta sử dụng các oligomer chitohexaose và chitoheptaose

làm tác nhân kháng ung thư Enzyme chitinase của Vibrio alginolyticus phân cắt huyền

phù chitin thành chitopentaose và chitotriose Enzyme N,N - diacetylchtobiase được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu khởi đầu cho sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học Chitinase thu nhận từ S.griseus có khả năng thủy phân chitin huyền phù

thành chitobiose tiếp tục được cải biến hóa học thành một dẫn xuất díaccharid mới acetamido-2-deoxy-D- allopyranose, đây là chất trung gian để tổng hợp nên chất ức chế enzyme Ngược lại, Kobayashi và cộng sự cho biết có thể sử dụng chitinase của

2-Bacillus để tổng hợp chitobiose nhờ sự kết nối N-acetyl-D- glucosamin với dẫn xuất

đường oxazolin [27], [28]

 Chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme chitinase [29] Nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh nấm được đề xuất như ELISA, sự ngưng kết kháng thể, mẫu dò phân tử , để phát hiện đặc hiệu các nấm gây bệnh trong các dịch cơ thể nhưng giá thành quá cao Những bất lợi chung trong hầu hết các phương pháp hiện sử dụng là khó áp dụng đối với các mẫu dịch cơ thể bởi vì khó cố định được các mẫu này Các phương pháp nhuộm như GMS (Grocott methenamine AgNO3staining), calcofluor/cellufour, India ink, lectin label, rylus BSU được dùng nhuộm cố định các tiêu bản nấm nhưng không có tính đặc hiệu cao và cần sử dụng các thiết bị đắt tiền

Chitin hiện diện nhiều trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm hay ở nấm men thì hiện diện trong những vết chồi

Do đó cần một phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả các loại nấm gây bệnh

Hiện nay các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán mới các bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng enzyme chitinase đã được phân lập tạo

dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên là chitinase VP1), nó kết hợp chặt chẽ với

chitin và có thể sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao, để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh

 Chế phẩm thuốc mới: Enzyme chitinase và các dược chất kháng nấm [28] Hiện nay, các nhà khoa học đề nghị sử dụng Chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase

Các tác nhân bao gồm:

- Amphotericin B và những phức chất có cấu trúc tương tự nystatin và pyramycin

- 5-fluorocytosin và các dẫn xuất azol như fluconazol, ketoconazol, itraconazol, miconazol

- Allylamines- thiocarbamastes như tolnaftat, tẻbinafin

- Griseofulvin; acid undecylenic;bezoic

Enzyme chitinase có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lượng không gây tác dụng phụ Ngoài ra việc kết hợp giữa enzyme chitinase và laminarinase được ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm (so với chỉ dùng enzyme chitinase)

Các nhà khoa học đã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của enzyme chitinase tái

tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các loại nấm khác nhau thuộc nhóm

Aspergillus, Candida Hiệu quả của sự điều trị với tác nhân kháng nấm được ước

lượng trên 3 điểm:

 Giảm tỉ lệ chết

 Giảm số lượng tế bào nấm được nuôi cấy từ các cơ quan

 Giảm mức độ lưu thông kháng nguyên nấm

1.2.10.1 Thế giới

So với cac enzyme khác như protease, amylase, pectinase… thì hệ enzyme chitinase được nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn hạn chế Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces (L.R Berger và D.M Renolds, 1958 ; R.Grupta, R.K Saxena, P Chatuvedi và J.S Windi, 1995) Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm Năm 1978, P.A Carroad và R.A.Tom

có công trình nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I.G Cosio, R.A Fisher, P.A (1982) đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin

Về sau trong những năm 1989, việc thu nhận chitinase được tiếp tục nghiên cứu trên các đối tượng khác như Serratia liquefaciens (S.Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P Vyas và M.V Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trọng việc phá vỡ vách tế bào nấm

Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma Năm 1991, C.J Ulhoa, J.F Peberdy nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma Harzianum Năm 1999, P.A.Felse và T

Panda nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitin từ Trichoderma Harzianum Năm 2000, P.A Felse và T Panda nghiên cứu quá trình nuôi cấy chìm thu nhận chitinase từ Trichoderma Harzianum trong bể lắc Năm 2003, Ashok Pandy và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ Trichoderma Harzianum nuôi cấy trên môi trường bán rắn Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật Đối với chi nấm Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của chúng trên môi trường bán rắn (Noakarn Rattanakit và cộng sự, 2002).Những chủng thuộc chi nấm này được

nghiên cứu thu nhận chitinase là Aspergillus carneus (A.A Sherief, 1990) ; A fumigatus (Jin - Ian Xia và Jing Xiong, 2009) A.A Shubakow và P.S Kucheryavykh

(2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nhiều chủng nấm khác nhau trong đó có các chủng

thuộc các chi nấm Aspergillus và Trichoderma…Tuy nhiên, những nghiên cứu về

chitinase từ nấm sợi phần lớn thực hiện trên môi trường nuôi cấy lỏng

1.2.10.2 Trong nước

Nhìn chung những nghiên cứu về enzyme chitinase trong nước còn rất hạn chế cho dù tiềm năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận Năm

2001, tác giả Đình Minh Tiệp có công trình nghiên cứu đặc tính của enzyme chitinase

thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarus và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ

thực vật và y dược

Nguyễn Trường Thọ (2004), Nghiên cứu sử dụng nấm mốc Trichoderma Harzianum phòng bệnh héo rũ cây dưa leo do Pythium sp, Luận văn Thạc Sĩ ngành

Sinh học, Đại Học KHTN TP.HCM Phạm Minh Hiếu (2005), Khảo sát quá trình cảm

ứng tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma harzianum, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh Học, Trường Đại Học KHTN TP HCM Tô Duy Khương (2007), Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp và khả năng

đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật, Luận Văn Thạc Sĩ ngành sinh học, Đại

Học KHTN TP.HCM

Nhìn chung, những nghiên cứu về chitinase trong nước chưa nhiều, chủ yếu

vẫn trên nấm Trichoderma hazianum, ứng dụng chủ yếu mới đề cập đến trong lĩnh

vực bảo vệ thực vật và khởi đầu trong lĩnh vực y dược