Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan khối lượng phân tử thấp, chitosan hòa tan trong nước và thử nghiệm ứng dụng trong bảo quản hỗn hợp caroten protein chiết rút từ phế liệu tôm

Sản xuất LMWC Chitosan có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như xử lý nước, nông nghiệp, nuôi trồng thuỷ sản, sản xuất giấy, thực phẩm…[55, 146, 192] nhờ khả năng tạo màng, tạo sợi, khả năn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN CÔNG MINH

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP, CHITOSAN HOÀ TAN TRONG NƯỚC VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN CHIẾT RÚT TỪ PHẾ

LIỆU TÔM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

KHÁNH HOÀ - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN CÔNG MINH

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP, CHITOSAN HOÀ TAN TRONG NƯỚC VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN CHIẾT

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Giáo viên hướng dẫn:

1 PGS.TS Trang Sĩ Trung

Trường Đại Học Nha Trang

2 TS Simona Schwarz

Viện Polymer Leibniz, Dresden, CHLB Đức

Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Thị Hiền

Phản biện 2: PGS.TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo

Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án Trường Đại học Nha Trang vào lúc 8h00, ngày 25 tháng 7 năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Trường Đại học Nha Trang

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình do tôi thực hiện Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình

Tác giả luận án

Nguyễn Công Minh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này tôi xin gửi lời tri ân đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện CNSH&MT, Phòng đào tạo sau đại học đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bộ KH&CN đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu thông qua đề tài Nghị định thư ―04/2014/HĐ-NĐT‖; Viện Polymer Lebniz – Dresden; Viện Plant Biology and Biotechnology - Đại học Münster đã giúp đỡ tôi trong việc thực hiện các phân tích cấp cao cho luận án Tôi xin cảm ơn dự án Vlir Network đã tạo điều kiện cho tôi tham gia các lớp tập huấn và một phần kinh phí hoá chất cho việc thực hiện thí nghiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Trang Sĩ Trung và TS Simona Schwarz đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Văn Hòa, GS Willem F Stevens đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, động viên khích lệ và dành nhiều thời gian trao đổi về chuyên môn với tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Hoàng Ngọc Cương, ThS Phạm Thị Đan Phượng, ThS Phạm Viết Nam, PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, TS Khổng Trung Thắng,

GS Bruno Moerschbacher, TS Jasper Wattjes, TS Anna Niehues, các cán bộ kỹ thuật của Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, các em học viên cao học khóa 2015 – 2017,

2016 – 2018, các em sinh viên khóa K54, K55, K56, K57 Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện CNSH&MT đã đồng hành giúp đỡ, động viên, khích lệ và chia sẽ cho tôi nhiều kinh nghiệm trong quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ, chia sẻ mọi khó khăn để luận án được hoàn thành

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hoà, ngày …… tháng 8 năm 2020

Tác giả luận án

Nguyễn Công Minh

MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC BẢNG IX TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN X

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Chitosan khối lượng phân tử thấp (LMWC) 3

1.1.1 Khái niệm về LMWC 3

1.1.2 Sản xuất LMWC 3

1.1.3 Tính chất của LMWC 16

1.1.4 Ứng dụng của LMWC 22

1.2 Chitosan hòa tan trong nước (WSC) 23

1.2.1 Khái niệm về WSC 23

1.2.2 Sản xuất WSC 23

1.2.3 Tính chất của chitosan hòa tan trong nước 27

1.2.4 Ứng dụng của chitosan hòa tan trong nước 28

1.3 Hỗn hợp caroten-protein 29

1.3.1 Khái niệm về caroten-protein 29

1.3.2 Sản xuất caroten-protein 30

1.3.3 Ứng dụng của caroten-protein 32

1.3.4 Biến đổi của caroten-protein trong quá trình bảo quản 33

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Phương pháp tiếp cận 39

2.2.2 Nghiên cứu sản xuất LMWC bằng phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 40

2.2.3 Nghiên cứu quy trình sản xuất WSC ở trạng thái rắn với tác nhân khí HCl 49

2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống oxy hoá của LMWC, WSC 56

2.2.5 Nghiên cứu ứng dụng LMWC, WSC trong bảo quản hỗn hợp carotene-protein 59

2.3 Phương pháp phân tích 61

2.4 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 63

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64

3.1 Nghiên cứu sản xuất LMWC bằng phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn với tác nhân H 2 O 2 64

3.1.1 Đánh giá tính chất của nguyên liệu chitosan 64

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình trương nở đến Mw chitosan sau cắt mạch bằng H2O2 67

3.1.3 Nghiên cứu quá trình cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 77

3.1.4 Phân tích tương quan, hồi quy giữa khối lượng phân tử, độ deacetyl chitosan đầu vào với khối lượng phân tử, độ tan của sản phẩm cắt mạch 81

3.1.5 Đề xuất quy trình thu nhận LMWC bằng phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 85

3.1.6 Đánh giá hiệu suất và chất lượng LMWC 87

3.2 Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa tan trong nước ở trạng thái rắn với tác nhân khí HCl 98

3.2.1 Thành phần hóa học của chitosan ban đầu 98

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và nhiệt độ phản ứng đến độ tan, Mw WSC 99

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ tan, Mw WSC 100

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ chitosan đến độ tan và Mw WSC 101

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan đến độ tan, Mw WSC 102

3.2.6 Đề xuất quy trình sản xuất WSC 104

3.2.7 Đánh giá tính chất của WSC 105

3.2.8 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hoá của LMWC, WSC 109

3.3 Nghiên cứu ứng dụng LMWC, WSC trong quản caroten-protein (C-P) 116

3.3.1 Thành phần hóa học của LMWC, WSC và C-P 116

3.3.2 Biến đổi hàm lượng carotenoid, protein hoà tan của C-P trong 24 tuần bảo quản bằng LMWC và WSC 120

3.3.3 Biến đổi TVB – N của C-P trong 24 tuần bảo quản với LMWC, WSC 122

3.3.4 Biến đổi hàm lượng lipid; phospholipid; peroxide; vi sinh vật hiếu khí C-P trong 24 tuần bảo quản bằng LMWC và WSC 123

3.3.5 Đánh giá chất lượng của C-P trước và sau bảo quản 126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 131

TÀI LIỆU THAM KHẢO 132

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AAS Atomic absorption

Spectrophotometric

Phổ hấp thu nguyên tử

AOAC Association of Official

Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà hoá phân tích

FTIR Fourier Transform Infrared Quang phổ hấp thụ hồng ngoại LMWC Low molecular weight chitosan Chitosan khối lượng phân tử thấp WSC Water soluble chitosan Chitosan hoà tan trong nước

GlcNAc N-acetyl glucosamine N-acetyl glucosamine

HMWC High molecular weight chitosan Chitosan khối lượng phân tử cao

Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét

SEC-MALLS Size-exclusion chromatography-

Multi-angle static light scattering

Sắc ký loại trừ kết hợp với phân tán ánh sáng tĩnh đa góc

TVB-N Total Volatile Basic Nitrogen Nitơ bazơ bay hơi

XRD X-ray powder diffraction Phổ nhiễu xạ tia X

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của (a) chitin/chitosan, (b) cellulose 3

Hình 1.2 Các phương pháp sản xuất LMWC 4

Hình 1.3 Phản ứng hình thành WSC ở dạng muối chitosan 24

Hình 1.4 Quy trình thu nhận caroten-protein từ phế liệu tôm 31

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp tiếp cận các vấn đề nghiên cứu của Luận án 39

Hình 2.2 Nghiên cứu cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 41

Hình 2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi trương nở đến Mw chitosan 42

Hình 2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH trương nở đến Mw chitosan 43

Hình 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trương nở đến Mw chitosan 44

Hình 2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trương nở đến Mw chitosan 45

Hình 2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến Mw chitosan 46

Hình 2.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý H2O2 đến Mw chitosan 47

Hình 2.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ H2O2/CTS đến Mw chitosan 48

Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu quy trình sản xuất WSC 49

Hình 2.11 Mô hình thiết bị phản ứng sản xuất WSC 51

Hình 2.12 Thiết bị phản ứng sản xuất WSC 51

Hình 2.13 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan, Mw WSC 52

Hình 2.14 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ tan và Mw WSC 53

Hình 2.15 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ chitosan đến độ tan, Mw WSC 54

Hình 2.16 Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan đến độ tan, Mw WSC 55

Hình 2.17 Nghiên cứu ứng dụng LMWC, WSC trong bảo quản hỗn hợp C-P 60

Hình 3.1 Chitosan nguyên liệu (HMWC) dạng vảy (a) và dạng bột (b) 65

Hình 3.2 Mw và độ nhớt của chitosan cắt mạch bằng H2O2 sau khi được trương nở trong các dung môi khác nhau 69

Hình 3.3 Phân bố kích thước của chitosan thu nhận trong trường hợp mẫu cắt mạch trương nở trong NaOH 0,1% (a); NaOH 10% (b); H2O (c), NaCl 0,9% (d) 70

Hình 3.4 Mw của chitosan cắt mạch bằng H2O2 sau khi trương nở trong NaOH có nồng độ khác nhau 71

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH trương nở đến tỷ lệ trương nở chitosan nguyên liệu (đường a) và Mw của sản phẩm cắt mạch (đường b) 72

Hình 3.6 Chitosan ban đầu, trương nở với H2O, NaOH 0,2% (a) và chitosan chưa

trương nở (b) trương nở với NaOH 0,2% (c) quan sát dưới kính hiển vi (x40) 72

Hình 3.7 Phân bố kích thước của chitosan thu nhận trong trường hợp mẫu cắt mạch không trương nở (a); trương trong nước (b), trương trong NaOH 0,2% (c) 73

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ trương nở chitosan nguyên liệu và Mw của sản phẩm cắt mạch bằng H2O2 75

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian trương nở đến tỷ lệ trương nở chitosan nguyên liệu (a) và Mw của sản phẩm cắt mạch (b) 76

Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ H2O2 đến tốc độ phản ứng (a) và Mw, độ tan (b) của sản phẩm cắt mạch 77

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian đến tốc độ phản ứng (a) và Mw (b) của sản phẩm cắt mạch 79

Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ H2O2/CTS đến tốc độ phản ứng (a) và Mw (b) của sản phẩm cắt mạch 80

Hình 3.13 Tương quan, hồi quy giữa Mw chitosan đầu vào (Mw-Input) với khối lượng phân tử chitossan đầu ra (Mw-Output) 82

Hình 3.14 Tương quan, hồi quy giữa Mw chitosan đầu vào (Mw-Input) với số lần cắt mạch (a) và độ phân tán Mw -Output (b) 83

Hình 3.15 Tương quan, hồi quy giữa độ deacetyl với số lần cắt mạch(a) và độ tan (b) của sản phẩm cắt mạch 85

Hình 3.16 Quy trình sản xuất LMWC ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 86

Hình 3.17 Phổ XRD (a); FTIR (b) của HMWC và LMWC 90

Hình 3.18 Phổ 1H NMR của LMWC 92

Hình 3.19 Phổ 1H NMR của chitosan chuẩn theo Lavertu và cộng sự (2003) [106] 93

Hình 3.20 Phân bố Mw của LMWC xác định bằng HP-GPC-RID/MALS 95

Hình 3 21 Độ nhớt của dung dịch LMWC, HMWC khi được bảo quản ở trạng thái rắn và trạng thái dung dịch 97

Hình 3.22 Ảnh hưởng của chitosan và nhiệt độ phản ứng đến độ tan, Mw WSC 99

Hình 3.23 Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến độ tan, Mw WSC 101

Hình 3.24 Ảnh hưởng của mật độ chitosan đến độ tan, Mw WSC 102

Hình 3.25 Ảnh hưởng kích thước chitosan đến độ tan, Mw WSC 103

Hình 3.26 Sơ đồ đề xuất quy trình sản xuất WSC 104

Hình 3.27 Phổ FTIR (a); XRD (b) của LMWC và WSC 106

Hình 3.28 Hình SEM của LMWC và WSC 107

Hình 3.29 Phổ 1H NMR của WSC 108

Hình 3.30 Phổ SEC-MALL của LMWC và WSC 109

Hình 3.31 Điện thế Zeta của LMWC, WSC trong nước, acid acetic 109

Hình 3.32 Mật độ vi khuẩn (a) B cereus; (b) V parahaemolyticus trong các mẫu bổ sung LMWC sau 96h nuôi cấy 110

Hình 3.33 Mật độ vi khuẩn (a) B cereus; (b) V parahaemolyticus trong các mẫu bổ sung WSC sau 96h nuôi cấy 111

Hình 3.34 Khả năng ức chế vi sinh vật của WSC đến Bacillus cereus và Vibrio parahaemolyticus sau 72 h nuôi cấy 111

Hình 3.35 Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của LMWC, WSC, HMWC 112

Hình 3.36 Tổng năng lực khử của LMWC, WSC, HMWC 115

Hình 3.37 Hàm lượng carotenoid của C-P khi được bổ sung LMWC (a), WSC (b) trong 24 tuần bảo quản 120

Hình 3.38 Hàm lượng protein hoà tan của C-P khi được bổ sung LMWC (a), WSC (b) trong 24 tuần bảo quản 121

Hình 3.39 Hàm lượng TVB-N của C-P khi được bổ sung LMWC (a), WSC (b) trong 24 tuần bảo quản 122

Hình 3.40 Biến đổi lipid, phospholipid của C-P trong 24 tuần bảo quản 123

Hình 3.41 Biến đổi hàm lượng peroxide của C-P trong 24 tuần bảo quản 124

Hình 3.42 Biến đổi mật độ vi sinh vật hiếu khí của C-P trong 24 tuần bảo quản 125

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Ưu, nhược điểm của các phương pháp cắt mạch chitosan 5

Bảng 1.2 Một số công bố sử dụng enzyme cắt mạch chitosan 6

Bảng 1.3 Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan 17

Bảng 1.4 Một số ứng dụng của LMWC 22

Bảng 1.5 Các loại chitosan tan trong nước 25

Bảng 1.6 Một số ứng dụng của caroten-protein 33

Bảng 3.1 Chất lượng chitosan sản xuất theo quy trình Trung và cộng sự (2012) 64

Bảng 3.2 Thành phần khoáng còn lại trong các loại chitosan 65

Bảng 3.3 Thành phần acid amin của chitosan 66

Bảng 3.4 Hệ số trương nở của chitosan trong các dung môi 68

Bảng 3.5 Mw chitosan đầu vào (Mw-Input (MwI)), Mw chitosan đầu ra (Mw Output (MwO)) và số lần cắt mạch chitosan (MwI/MwO) 81

Bảng 3.6 Độ deacetyl, Mw chitosan đầu vào (Mw-Input), Mw chitosan đầu ra (Mw Output, số lần cắt mạch và độ tan của sản phẩm cắt mạch 84

Bảng 3.7 Thông số chất lượng của sản phẩm LMWC 87

Bảng 3.8 Hiệu suất cắt mạch, hiệu suất thu hồi sản phẩm 88

Bảng 3.9 Thành phần khoáng và kim loại nặng trong chitosan 89

Bảng 3.10 Thành phần acid amin còn lại trong HMWC và LMWC 90

Bảng 3.11: Số sóng hấp phụ cực đại của các nhóm chức chitosan [137] 92

Bảng 3.12 Độ dịch chuyển hóa học của proton LMWC và chitosan 94

Bảng 3.13 Độ acetyl, độ deacetyl LMWC xác định bằng 1H NMR, FTIR và UV-Vis94 Bảng 3.14 Khối lượng phân tử (Mw), độ polymer hóa (DP), Độ đa phân tán (PDI) của LMWC xác định bằng phổ SEC-MALLS 95

Bảng 3.15 Thành phần hóa học của chitosan 98

Bảng 3.16 Tính chất của LMWC và WSC 105

Bảng 3.17 Độ acetyl, độ deacetyl của LMWC và WSC xác định bằng 1H NMR 107

Bảng 3.18 Khối lượng phân tử (Mw), độ polymer hóa (DP), Độ đa phân tán (PDI) của LMWC và WSC xác định bằng SEC-MALLS 108

Bảng 3.19 Thành phần hóa học và tính chất của LMWC, WSC và C-P 116

Bảng 3.20 Thành phần acid amin của C-P 118

Bảng 3.21 Thành phần acid béo của C-P 119

Bảng 3.22 Thành phần hóa học của C-P sau 10 tuần bảo quản 127

Bảng 3.23 Thành phần acid amin C-P sau 10 tuần bảo quản 128

Bảng 3.24 Thành phần acid béo của C-P sau 10 tuần bảo quản 129

TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Tên luận án: Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan khối lượng phân tử thấp,

chitosan hoà tan trong nước và thử nghiệm ứng dụng trong bảo quản hổn hợp protein chiết rút từ phế liệu tôm

caroten-Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 9540105 Khóa: 2014 - 2018 Nghiên cứu sinh: Nguyễn Công Minh

Người hướng dẫn: 1 PGS.TS Trang Sĩ Trung

2 TS Simona Schwarz

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Những đóng góp mới của luận án:

1 Luận án đã xây dựng được quy trình cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn sử dụng tác nhân H2O2 với 3 bước thực hiện là (i) trương nở, (ii) cắt mạch và (iii) thu hồi sản phẩm Sản phẩm cắt mạch có đồng đều về khối lượng phân tử (PDI = 2,2), độ deacetyl cao (93,5%), khối lượng phân tử thấp (137 kDa), độ tan > 98% Bên cạnh

đó, LMWC vẫn giữ được khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, khả năng khử gốc DPPH và tổng năng lực trong điều kiện in vitro

2 Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất chitosan hoà tan trong nước ở trạng thái rắn với tác nhân khí HCl từ LMWC Sản phẩm tạo ra có độ tan đạt > 98%, khối lượng thấp phân tử thấp (97kDa, giảm khoảng 20% so với LMWC), độ đa phân tán của khối lượng phân tử đạt 2,1 Bên cạnh đó, WSC vẫn giữ được khả

năng kháng Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, khả năng khử gốc DPPH và tổng năng lực trong điều kiện in vitro

3 Kết quả thử nghiệm cho thấy, hỗn hợp caroten – protein được bổ sung 100ppm chitosan khối lượng phân tử thấp hoặc 100ppm chitosan hoà tan trong nước có thể hạn chế được sự thất thoát các thành phần dinh dưỡng như carotenoid, protein hoà tan, lipid, phospholipid và sự gia tăng TVB-N, peroxide, vi sinh vật hiếu khí trong thời gian 10 tuần đầu của quá trình bảo quản

PHẦN MỞ ĐẦU

Chitosan là polymer sinh học có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, thực phẩm,

mỹ phẩm, môi trường … Các tính chất ứng dụng của chitosan phụ thuộc chủ yếu vào

độ deacetyl (DD), khối lượng phân tử (Mw) và dung môi hòa tan chitosan Chitosan khối lượng phân tử cao thường được ứng dụng để tạo màng, tạo sợi, chất kết tủa, tạo bông trong xử lý môi trường Chitosan khối lượng phân tử thấp (LMWC) có tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hoá mạnh nên được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp, thực phẩm, công nghệ sinh học… [98] Tuy nhiên, chitosan chỉ hòa tan trong một số dung dịch acid loãng như acid acetic, acid lactic, acid hydrochloride do vậy đã hạn chế khả năng ứng dụng khi triển khai trong thực tế Nhằm tăng cường hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hoá và cải thiện tính tan, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu sản xuất LMWC và chitosan hoà tan trong nước (WSC) để mở rộng phạm vi ứng dụng của chitosan

Caroten-protein (C – P) là sản phẩm thu nhận từ quá trình sản xuất chitin C-P chứa nhiều acid amin, acid béo và carotenoid (đặc biệt là astaxanthin) nên có nhiều ứng dụng trong thức ăn thuỷ sản và thực phẩm Tuy nhiên, C-P dễ bị hư hỏng trong quá trình bảo quản do các tác nhân vật lý, sinh học và hoá học Do đó, trong thực tế, người ta thường sử dụng các hoá chất bảo quản nhằm hạn chế quá trình biến đổi chất lượng C-P Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về ứng dụng LMWC, WSC trong bảo quản thực phẩm giàu protein, lipid trong cá Trích [88], cá Hồi [96], cá Tuyết [155], Hàu [38], chả cá [100], súp cá [113] … do đó việc nghiên cứu ứng dụng hai loại chitosan trên để bảo quản hỗn hợp caroten-protein là hướng đi cần được quan tâm nghiên cứu

Từ những lý do trên đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan khối lượng phân tử thấp, chitosan hòa tan trong nước và thử nghiệm ứng dụng trong bảo quản hỗn hợp caroten-protein chiết rút từ phế liệu tôm” được đề xuất thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Xây dựng quy trình sản xuất LMWC (Mw < 150 kDa) ở trạng thái rắn

2 Xây dựng quy trình sản xuất WSC có độ tan đạt trên 98% ở trạng thái rắn

3 Xác định nồng độ LMWC, WSC thích hợp để bảo quản hỗn hợp caroten-protein chiết rút từ phế liệu tôm

Nội dung nghiên cứu:

Để đạt được 3 mục tiêu nghiên cứu, luận án tập trung nghiên cứu 3 nội dung:

1 Nghiên cứu quy trình sản xuất LMWC bằng phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2.

2 Nghiên cứu quy trình sản xuất WSC ở trạng thái rắn với tác nhân khí HCl

3 Nghiên cứu ứng dụng LMWC, WSC để bảo quản hỗn hợp caroten-protein chiết rút

từ phế liệu tôm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Luận án:

1 Luận án đã xác định được điều kiện cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 để thu nhận LMWC Sản phẩm chitosan sau cắt mạch có khối lượng phân tử < 150 kDa và tính ổn định cao trong quá trình bảo quản Kết quả luận

án sẽ là cơ sở khoa học để triển khai các nghiên cứu tiếp theo nhằm đưa ra quy trình sản xuất LMWC vào ứng dụng trong thực tế

2 Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất WSC ở trạng thái rắn sử dụng tác nhân khí HCl với độ hoà tan trong nước trên 98% Kết quả luận án sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu về đa dạng hoá sản phẩm từ chitosan

3 Luận án đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, khả năng khử gốc DPPH, tổng năng lực khử của LMWC, WSC trong điều kiện in vitro Kết quả luận án sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu

chuyên sâu về hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hoá của LMWC, WSC

4 Luận án đã bước đầu đánh giá khả năng bảo quản hỗn hợp caroten-protein của LMWC, WSC Kết quả luận án sẽ là cơ sở bước đầu để triển khai các nghiên cứu chuyên sâu về ứng dụng chitosan trong bảo quản các loại thực phẩm giàu protein, carotenoid, lipid

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chitosan khối lượng phân tử thấp (LMWC)

1.1.1 Khái niệm về LMWC

LMWC là dẫn xuất của chitin thường có khối lượng phân tử thấp hơn 150 kDa

và độ nhớt biểu kiến 20 – 200 cP [117] LMWC mang đầy đủ tính chất của chitosan và

có cấu tạo gồm nhiều đơn phân N-Acetyl-Glucosamine (GlcNAc - tiểu phần A), Glucosamine (GlcN - tiểu phần D) liên kết với nhau bằng liên kết  - 1,4 glycoside Công thức cấu tạo của LMWC, chitin và cellulose tương tự nhau và chỉ khác nhau ở nhóm chức ở vị trí cacbon thứ 2 (Hình 1.1)

D-Hình 1.1 Công thức cấu tạo của (a) chitin/chitosan, (b) cellulose

LMWC tan tốt trong các acid loãng như acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic, acid hydrochloric tạo thành dung dịch keo tích điện dương Khả năng tích điện dương của LMWC có mối liên hệ đến độ deacetyl, dung môi hòa tan và thường thể hiện qua thông số điện thế zeta [42] LMWC có khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa…

1.1.2 Sản xuất LMWC

Chitosan có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như xử lý nước, nông nghiệp, nuôi trồng thuỷ sản, sản xuất giấy, thực phẩm…[55, 146, 192] nhờ khả năng tạo màng, tạo sợi, khả năng kháng khuẩn và chống oxy hoá [192] nhưng các tính chất vật lý, hoá học

và sinh học của chitosan phụ thuộc chủ yếu vào độ deacetyl và khối lượng phân tử trung bình của chitosan [55] Chitosan thương mại thường có DD trong khoảng 70 –

90% và Mw trong khoảng 50-2000 kDa [117] Dựa trên khối lượng phân tử trung bình

có thể chia chitosan thành 3 nhóm như sau: (i) Chitosan khối lượng phân tử cao (HMWC) Mw > 700 kDa, độ nhớt > 800 cP; (ii) Chitosan khối lượng phân tử trung bình (MMWC) Mw: 150-700 kDa, độ nhớt: 200-800 cP và (iii) Chitosan khối lượng phân tử thấp (LMWC) Mw < 150 kDa, độ nhớt: 20-200 cP [117]

HMWC và MMWC có nhiều ứng dụng trong keo tụ, tạo bông, tạo màng và tạo sợi sinh học [146] Nhiều báo cáo khẳng định HMWC có thể được sử dụng trong việc chế tạo cột phân tách pha [147, 153] Tuy nhiên, độ tan kém ở pH trung tính và độ nhớt cao của HMWC đã làm hạn chế khả năng ứng dụng của chúng Trong khi đó, LMWC

có độ nhớt thấp thường có hoạt tính sinh học cao và được sử dụng như chất kháng khuẩn, chống oxy hóa [49, 135, 175], kháng nấm [125] Nguyên nhân có thể do LMWC

dễ dàng xâm nhập vào bên trong màng tế bào vi sinh vật nên làm tăng khả năng tiêu diệt

vi sinh vật [49, 111]

LMWC có khả năng hòa tan tốt hơn chitosan thương mại (có cùng độ deacetyl),

có tính kháng khuẩn, kháng nấm [102], có khả năng kích thích sinh học và chống oxy hoá [49, 111, 125, 135, 175] nên được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học và nông nghiệp [98] Vì vậy, sản xuất LMWC đã và đang được nghiên cứu rộng rãi LMWC có thể tạo thành từ quá trình deacetyl chitin khối lượng phân tử thấp [19] hoặc cắt mạch từ chitosan có khối lượng phân tử cao Thông thường, LMWC có thể được tạo thành từ quá trình cắt mạch HMWC với các phương pháp như vật lý, hóa học, sinh học hoặc kết hợp các phương pháp trên [109, 187], quá trình cắt mạch HMWC để tạo LMWC có thể được tóm tắt trong Hình 1.2

Hình 1.2 Các phương pháp sản xuất LMWC

Mỗi phương pháp cắt mạch đều có các ưu và nhược điểm riêng, Bảng 1.1 mô tả các ưu và nhược điểm của mỗi phương pháp ví dụ quá trình cắt mạch bằng các tác nhân hóa học thường được ưu tiên sử dụng trong công nghiệp nhưng có thể tạo ra các vấn đề ô nhiễm cho môi trường, ngược lại quá trình cắt mạch bằng tác nhân vật lý như tia X, tia Gamma có khả năng áp dụng ở quy mô lớn nhưng đòi hỏi thiết bị đặc biệt

Bảng 1.1 Ưu, nhược điểm của các phương pháp cắt mạch chitosan

Phương

pháp

Vật lý Tia gamma (60Co), vi

Hóa học Acid mạnh (HCl,

HNO2, HF, H3PO4,…) hoặc tác nhân oxy hóa (H2O2, K2S2O4,…)

Chi phí thấp, dễ

áp dụng quy mô lớn

Khó điều khiển quá trình Chất lượng sản phẩm khó ổn định

ô nhiễm môi trường Sinh học Enzyme (cellulase,

chitinase, chitosanase,…)

An toàn và dễ điều chỉnh trong sản xuất, sản phẩm có độ tinh sạch cao

Giá thành sản xuất cao, hiệu suất cắt mạch thấp do tính đặc hiệu của enzyme

a, Cắt mạch chitosan bằng phương pháp sinh học

Cắt mạch chitosan bằng enzyme để sản xuất LMWC có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp vật lý và hóa học do khả năng giảm thiểu các biến đổi cấu trúc không

có lợi của sản phẩm cắt mạch Mặt khác, sản phẩm cắt mạch có độ tinh sạch cao, an toàn và dễ điều chỉnh trong quá trình phản ứng [169] Vì vậy, sử dụng các enzyme có tính đặc hiệu cao (chitinase, chitosanase) hoặc không có tính đặc hiệu (cellulase, pectinase) để sản xuất LMWC đã được các nhà khoa học quan tâm từ những năm

1980 Tuy nhiên, sự khan hiếm của các enzyme và giá enzyme khá cao đã hạn chế việc ứng dụng phương pháp này ở quy mô sản xuất lớn Hiện nay, nhiều enzyme đã được nghiên cứu ứng dụng để thử nghiệm cắt mạch chitosan như chitinase, chitosanase,

cellulase… Tuy nhiên, chitinase và chitosanase được nghiên cứu ứng dụng phổ biến nhất Nguồn chitosanase được sử dụng chủ yếu được chiết xuất từ vi khuẩn [69] hoặc

vi nấm [193] Ngoài ra các đặc tính hóa sinh của một số chitosanase từ các vi sinh vật cũng được tóm lược bởi Somashekar và cộng sự (1996) [161] Các enzyme có tính đặc hiệu cao thường có giá thành cao, không có sẵn trên thị trường tuy nhiên quá trình cắt mạch khi sử dụng các enzyme này cho hiệu quả cao Ngược lại, các enzyme không đặc hiệu thường có giá thành thấp, có dạng thương mại nhưng hiệu suất cắt mạch thấp [181, 183] Bảng 1.2 cho thấy việc sử dụng enzyme để cắt mạch chitosan đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

Bảng 1.2 Một số công bố sử dụng enzyme cắt mạch chitosan

N-chitosan, hỗn hợp các enzyme như chitinase, chitonase và cellulase đã được nghiên cứu sử dụng [109, 184]

Tại Việt Nam, nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong cắt mạch chitosan cũng đã được nhiều nhà khoa học triển khai [9, 10, 13] Theo Bùi Văn Hoài và cộng sự (2017), quá trình cắt mạch chitosan bằng cellulase để thu nhận chitooligosaccharide có thể bị tác động của các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất (chitosan), nồng độ enzyme

và thời gian phản ứng Tuy nhiên, điều kiện thích hợp nhất để thu nhận chitooligoasaccharide là xử lý chitosan với cellulase ở 50oC, pH 5,5 với nồng độ cơ chất 0,8%, hoạt tính enzyme 7 UI/g trong thời gian 150 phút Chitooligosaccharide có khối lượng phân tử giảm khoảng 5 lần so với chitosan ban đầu [10]

Hoài và cộng sự (2017) cho rằng, điều kiện tối ưu cho quá trình cắt mạch chitosan bằng enzyme cellulase là: nhiệt độ 49oC; pH là 5,9; nồng độ cơ chất 0,76%; hoạt tính enzyme 8,97 UI/g; thời gian thủy phân 180 phút COS có trọng lượng phân

tử nhỏ hơn 10 kDa chiếm hơn 90% Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho tạo bột chitooligosaccharide tan trong nước với các phân đoạn khác nhau, để hướng tới tạo bột thực phẩm chức năng chitooligosaccharide hoặc các sản phẩm thực phẩm có chứa bột chitooligosaccharide nhằm đem lại lợi ích sức khỏe cho con người [9]

Lê Thanh Long và cộng sự (2011) đã nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng cellulase ở trạng thái tự do và cố định trên gel polymer tự nhiên Khi tiến hành cố định cellulase để thủy phân chitosan cho thấy, hoạt độ của cellulase giảm 11,3% khi cellulase cố định trên chất mang agar và 37,9% khi cố định trên chất mang chitosan so với cellulase tự do Điều này cho thấy khả năng cố định cellulase trên gel agar tốt hơn

so với gel chitosan trong điều kiện nghiên cứu Mặt khác, phương pháp cố định cellulase cho phép tái sử dụng cellulase nhiều lần và giảm chi phí enzyme trong quá

trình thủy phân chitosan để sản xuất oligochitosan [13]

b, Cắt mạch chitosan bằng phương pháp vật lý

Cắt mạch bằng phương pháp vật lý được xem là phương pháp thân thiện với môi trường do năng lượng phá vỡ liên kết β – 1,4 glycoside trong cấu trúc chitosan được thu nhận từ các nguồn bức xạ tia Gamma [72], tia X, tia cực tím [180], bức xạ vi sóng [151], sóng siêu âm [51, 91, 110] Ngoài ra, cắt mạch bằng phương pháp vật lý cũng có thể thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao [33, 73] Ngoài ra, quá trình cắt mạch

có thể được thúc đẩy bằng cách kết hợp các tác nhân vật lý với tác nhân hóa học như

H2O2 [4, 8, 119], HCl, CH3COOH [151] Tuy nhiên, cắt mạch bằng phương pháp vật

lý cũng có một số hạn chế khi áp dụng cho sản xuất công nghiệp, như: (i) tốc độ phản ứng nhanh; (ii) Sản phẩm cắt mạch có phân bố rộng về Mw và (iii) phương pháp này thường đòi hỏi thiết bị đặc biệt

Taşkin và cộng sự (2014) [168] đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl đến khả năng cắt mạch chitosan có khối lượng phân tử 330 kDa bằng bức xạ γCo60

ở trạng thái rắn với liều bức xạ từ 5 – 35 kGy Kết quả cho thấy chitosan có độ deacetyl càng cao thì càng dễ bị cắt mạch bằng bức xạ Nguyên nhân được Taşkin và cộng sự cho là

do sự thay đổi trong cấu trúc tinh thể của chitosan Theo đó, chitosan có độ deacetyl càng cao thì độ kết tinh càng bé do đó càng dễ bị cắt mạch Nghiên cứu của nhóm Taşkin đã cung cấp những thông tin khá quan trọng cho việc kiểm soát khối lượng của chitosan bằng cắt mạch bức xạ khi biết độ deacetyl ban đầu của chitosan

Gryczka và cộng sự (2009) [72] đã nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng tia gamma trong điều kiện chân không và điều kiện khí quyển cho thấy, với cường độ tia gamma từ 300 kGy khối lượng phân từ chitosan giảm từ 690 kDa còn 20 kDa và đi kèm là sự giảm về độ phân bố khối lượng phân tử Nghiên cứu trên cũng chỉ ra rằng có

sự thay đổi một phần cấu trúc mạch vòng trong do đó cần có các khảo sát kỹ hơn để xác định mức độ ảnh hưởng của tia bức xạ đến khả năng thay đổi cấu trúc chitosan

Theo Czechowska và cộng sự (2005) [51], hiệu suất của quá trình cắt mạch chitosan bằng sóng siêu âm với cường độ 360 kHz đạt 76 – 82%, ngoài ra, thời gian càng dài và năng lượng càng lớn sẽ tăng hiệu quả quá trình cắt mạch Tuy nhiên, nghiên cứu của Czechowska chỉ dừng lại ở mức thử nghiệm cắt mạch chitosan khi được hoà tan ở trạng thái dung dịch do đó sản phẩm cắt mạch thu nhận ở trạng thái dung dịch và cần có các nghiên cứu tiếp theo cho quá trình kết tủa, tinh sạch và phân đoạn sản phẩm cắt mạch [51]

Wang và cộng sự (2005) đã sử dụng hiệu ứng đồng vận của tia tử ngoại + H2O2

để cắt mạch chitosan Kết quả cho thấy độ nhớt nội của dung dịch chitosan 2% giảm 84,3% sau 30 phút chiếu tia UV (254 nm) + 2% H2O2; giảm 20,6% dưới tác dụng của

H2O2 2% (không có tia UV) và giảm 17,2% chiếu tia UV (không có mặt H2O2) Kết quả trên cho thấy việc áp dụng hiệu ứng đồng vận của tử ngoại và H2O2 có hiệu quả cao trong việc làm làm giảm độ nhớt của dung dịch chitosan [180]

Năm 2011, Duy và cộng sự đã kết hợp phương pháp vật lý và phương pháp hóa học để thủy phân chitosan bằng tia gamma trong môi trường có bổ sung H2O2 và thu được olygochitosan có khối lượng phân tử thấp (5 – 10 kDa) [61] Nghiên cứu trên chỉ

ra rằng, việc hoà tan chitosan trước quá trình tác động của tia gamma là cần thiết tuy nhiên nồng độ H2O2 sử dụng bổ sung trong quá trình cắt mạch là khá cao (1,5 – 5%)

do đó sản phẩm thu nhận thường bị biến màu và độ bền sản phẩm cắt mạch chưa được tác giả đề cập đến

Tại Việt Nam, nghiên cứu về cắt mạch chitin/chitosan bằng phương pháp vật lý được bắt đầu từ những năm 1980 và chủ yếu được tiến hành ở Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt trên cơ sở sử dụng lò phản ứng hạt nhân và nguồn chiếu xạ gamma 60

Theo Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự (2016), có thể thu nhận oligochitosan (Mw

<10 kDa) bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma 60Co hỗn hợp dung dịch chitosan 5%

và H2O2 1% trong khoảng liều xạ 10 - 20 kGy/s Oligochitosan thu nhận được có hoạt tính chống oxi hóa tăng theo sự giảm Mw Tại nồng độ 0,2% (w/v) hoạt tính chống oxi hóa xác định được là 69,9; 84,5; 89,2 và 99,3% tương ứng với Mw chitosan và oligochitosan là 44,4; 17,4; 10,2 và 4,1 kDa Kết quả nhận được chứng tỏ rằng oligochitosan Mw < 10 kDa rất có tiềm năng ứng dụng làm chất chống oxi hóa do đó oligochitosan có hoạt tính chống oxi hóa hiệu quả và an toàn [7]

Theo Đặng xuân Dự (2015), oligochitosan có thể được chế tạo bằng kết hợp đồng vận của tia γ60

Co và H2O2 5% ở liều xạ thấp dưới 20 kGy/s Tuy nhiên, hiệu ứng đồng vận giảm khi tăng liều xạ Liều xạ cần để chế tạo oligochitosan từ chitosan ban đầu có độ deacetyl là 91, 80 và 72% tương ứng là 7, 9 và 17 kGy/s Hiệu suất cắt mạch bức xạ được gia tăng đáng kể khi có mặt H2O2 Chitosan có DD càng cao thì hiệu suất cắt mạch bức xạ và hằng số tốc độ cắt mạch càng cao [4]

Nghiên cứu của Vũ Thị Hoan (2018) cho thấy, có thể sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng cách sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng

với cường độ 166kGy Oligochitosan thu được sau khi chiếu xạ có 3 phân đoạn và có

khả năng kháng 5 loại vi khuẩn: E coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S aureus,

B subtilis và Listeria monocytogenes Các thử nghiệm độc tính của oligochitosan trên

chuột thí nghiệm cho thấy tính an toàn của oligochitosan đối với hệ tiêu hoá của chuột Ngoài ra, việc ứng dụng chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% trong thời gian 1 phút để bảo quản tôm bạc nguyên liệu cho thấy có thể bảo quản 6 ngày trong điều kiện mát mà vẫn đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng làm nguyên liệu chế biến [11]

c, Cắt mạch chitosan bằng phương pháp hóa học

Cắt mạch chitosan bằng tác nhân hóa học đang được sử dụng chủ yếu để sản xuất LMWC và oligochitosan ở quy mô lớn vì chi phí sản xuất thấp và dễ thực hiện, các tác nhân thường sử dụng như HCl [63], HNO2 [172], H3PO4 [74], H2SO4 [191], acid acetic [151], acid ascorbic [195], acid lactic [81] hoặc H2O2 [79, 170]

Cắt mạch chitosan bằng tác nhân acid

Các tác nhân acid thường có ưu điểm là phản ứng diễn ra nhanh và dễ triển khai

ở quy mô lớn Tuy nhiên, tác nhân acid có thể tác động đến cấu trúc của chitosan vì acid đậm đặc không chỉ thủy phân liên kết β-1,4 glycoside mà còn cắt gốc acetyl và phản ứng liên kết tạo muối với gốc -NH2 ở một mức độ nhất định phụ thuộc vào thời gian, nhiệt độ phản ứng và nồng độ acid sử dụng Bên cạnh đó dưới tác động của acid

có tính oxy hoá mạnh, cấu trúc vòng piranose trong công thức phân tử chitosan dễ bị phá vỡ, sản phẩm tạo ra thường chứa một lượng acid dư nên cần phải qua bước tinh sạch Ngoài ra, việc sử dụng acid vô cơ là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Do vậy, cắt mạch bằng tác acid học đòi hỏi phải kiểm soát tốt các yếu môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, thời gian, lượng acid/chitosan

Cơ chế cắt mạch chitosan bằng tác nhân acid [63, 81, 172, 178]

Cấu trúc mạch chitosan

Phản ứng cắt mạch chitosan bằng tác nhân acid

 Phản ứng tiếp nhận H+ của nguyên từ oxy trong liên kết β-1,4 glycoside

 Phản ứng cắt liên kết β-1,4 glycoside khi có mặt H2O

Liên kết β-1,4 glycoside là liên kết nhị dương do đó khi tiếp xúc với H+ phân tử oxy được nhận điện tử và tích điện dương, tiếp theo sau là phân ly tại vị trí O5 và C1

để hình thành hợp chất trung gian mang điện tích + xung quanh có 6e; H3O+ có hình dạng nữa chiếc ghế với C2, C1, O5 và C5 cùng nằm trên một mặt phẳng Sau đó sản phẩm trung gian phản ứng với H2O để tạo ra đường khử, quá trình này làm đứt liên kết β-1,4 glycoside Trong quá trình phân cắt, bước tạo phức trung gian diễn ra tốc độ chậm và hầu hết quá trình cắt mạch polisaccharides bằng các tác nhân acid được giải thích trên cơ chế này

Cắt mạch chitosan bằng tác nhân hydrogen peroxide

Ngoài các tác nhân acid, hydrogen peroxide (H2O2) là một tác nhân oxy hóa

có khả năng cắt đứt liên kết β-1,4 glycoside trong cấu trúc chitosan được sự quan tâm đáng kể của nhiều tác giả [79, 119, 170, 171] H2O2 dễ bị phân hủy tạo oxy và nước nên tác nhân này không ảnh hưởng đến môi trường H2O2 vừa có khả năng cắt liên kết β-1,4 glycoside trong cấu trúc chitosan vừa có khả năng loại bỏ gốc amin (-

NH2) của chitosan [141, 170] Quá trình cắt liên kết β-1,4 glycoside bằng H2O2 diễn ra nhanh trong thời gian đầu và sau đó chậm dần tùy thuộc vào điều kiện phản ứng như nồng độ H2O2 và nhiệt độ Trong trường hợp nồng độ H2O2 và nhiệt độ cao có thể làm thay đổi cấu trúc chitosan (tạo nhóm carboxyl, mất gốc NH2) dẫn đến giảm độ hòa tan của chitosan [141]

Cơ chế cắt mạch chitosan của H 2 O 2

Chitosan là polysaccharide được cấu tạo từ các đơn phân D-Glucosamine (GlcN) và N-Acetyl-Glucosamine (GlcNAc) thông qua liên kết β -1,4 glycoside và

trong cấu trúc phân tử có sự hiện diện của nhóm amin ở cacbon số 2 Trong quá trình cắt mạch chitosan bằng H2O2, các phản ứng được diễn ra lần lượt như sau:

Trước hết là sự phân ly của H2O2:

HO●, O● và nhóm -OH- Như vậy, có thể hiểu là H2O2 liên tục bị thủy phân

H2O2 + HOO- HO● + O●2- + H2O (5) Gốc hydroxyl (HO●), là một gốc oxy hóa rất mạnh, hiệu suất hình thành gốc tự

do (HO●) và thời gian sống của nó phụ thuộc vào môi trường [68] Trong môi trường kiềm (pH: 11 - 12), khả năng phân ly và thời gian sống của HO● là cao nhất và đây cũng là lý do để ứng dụng H2O2 cho quá trình tẩy trắng cellulose trong môi trường kiềm [162] Trong phản ứng với liên kết β-1,4 glycoside trong mạch chitosan, HO● lấy một hydro nguyên tử của mạch phân tử chitosan để tạo thành gốc tự do mới, phản ứng cắt liên kết β-1,4 glycoside được trình bày trong phương trình 6, 6’, 7, 7’

(GlcN)m − (GlcN)n + HO●→ (GlcN●)m − (GlcN)n + H2O (6) (GlcN)m − (GlcNAc)n + HO●→ (GlcN●)m − (GlcNAc)n + H2O (6’)

do vậy nhiệt độ thường và pH cao tỏ ra hiệu quả đối với quá trình cắt mạch chitosan ở trạng thái dung dịch Kết quả trên chỉ ra rằng, Khối lượng phân tử của sản phẩm cắt mạch bằng H2O2 giao động trong khoảng 1,2 – 50 kDa Tuy nhiên quá trình cắt mạch trên được thực hiện khi hoà tan chitosan ở trạng thái dung dịch và tác giả chưa đề cập đến hiệu suất thu hồi sản phẩm cũng như việc xác định các tính chất sinh học của sản phẩm cắt mạch Cũng theo Qin và cộng sự thì cắt mạch bằng H2O2 luôn đi kèm với phản ứng loại nhóm NH2, phản ứng oxy hóa mở vòng piranose hình thành nên gốc -COOH làm thay đổi cấu trúc chitosan đặc biệt khi điều kiện cắt mạch khắc nghiệt Trong trường hợp sản phẩm cắt mạch có Mw ~ 5 kDa, có cấu trúc chitosan gần như không đổi so với chitosan ban đầu trong khi đó nếu sản phẩm cắt mạch có Mw ~ 1,2 kDa, 40% nhóm amin sẽ bị mất và có sự hình thành lượng lớn nhóm-COOH trong cấu trúc phân tử chitosan [141] Kabal’nova và cộng sự (2000) [87] đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan Kết quả cho thấy có 7% nhóm amin bị mất sau 6h cắt mạch với H2O2 0,6M ở 30°C, pH = 7 Trong trường hợp cắt mạch với H2O2 0,3M ở 70oC, số lượng nhóm amin bị mất khoảng 9%

và thành phần nhóm carboxyl hình thành sau quá trình cắt mạch khoảng 1,5 gốc COOH/100 đơn vị glucosamin [87] Nghiên cứu của Kabal’nova và cộng sự một lần nữa khẳng định nồng độ H2O2 cao có tác động đến cấu trúc phân tử chitosan do đó cần

-có các khảo sát chuyên sâu để hạn chế quá trình làm biến đổi cấu trúc khi cho chitosan phản ứng với hydroperoxyde

d, Trạng thái chitosan trong quá trình cắt mạch

Quá trình phân cắt liên kết β -1,4 glycoside trong cấu trúc phân tử chitosan có thể được thực hiện ở trạng thái rắn (solid-state) hoặc trạng thái lỏng (liquid-state) [131] tuy nhiên mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng

Quá trình cắt mạch ở trạng thái lỏng thường được tiến hành với các dung môi acid loãng (CH3COOH, HCl, H2SO4, H3PO4) hoặc H2O2 hoặc bằng tác nhân sinh học [32] bên cạnh đó việc kết hợp các tác nhân như H2O2/vi sóng [42], H2O2/tia gamma [4,

7, 119] có khả năng làm tăng hiệu suất quá trình cắt mạch Quá trình cắt mạch ở trạng thái lỏng thường được tiến hành qua 3 bước (i) hòa tan chitosan trong dung môi tương ứng; (ii) bổ sung tác nhân cắt mạch để tiến hành cắt mạch; (iii) kết tủa để thu nhận sản phẩm Quá trình cắt mạch ở trạng thái lỏng thường cho hiệu suất cắt mạch cao (70 – 80%), sản phẩm của quá trình phân cắt thường có độ đồng đều về chuỗi mạch tuy

nhiên việc thu hồi sản phẩm sau quá trình phân cắt thường gặp nhiều khó khăn, tốn chi phí và hiệu suất thu hồi thấp (30 – 50%) [131] Phương pháp cắt mạch ở trạng thái lỏng khá phức tạp do có nhiều bước tiến hành và khó triển khai khi áp dụng ở quy mô công nghiệp, bên cạnh đó phương pháp cắt mạch ở trạng thái lỏng phải cần một lượng nước, hóa chất (tác nhân oxy hóa, acid, kiềm) khá lớn và đây được xem là nguyên nhân gây nên các vấn đề về môi trường

Gần đây, phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn đã được quan tâm nghiên cứu phát triển [32] vì phương pháp này khá đơn giản, hiệu quả cao và dễ dàng ứng dụng ở quy mô công nghiệp Theo phương pháp này, chitosan không cần hòa tan trong dung môi mà chỉ cần nghiền nhỏ đến một kích thước thích hợp sau đó cho tiếp xúc với tác nhân cắt mạch, kết thúc quá trình cắt mạch chitosan được rửa sạch bằng nước hoặc các dung môi thích hợp để thu hồi sản phẩm như vậy việc ứng dụng phương pháp cắt mạch ở trạng thái rắn sẽ tránh được bước hòa tan chitosan và bước kết tủa thu hồi sản phẩm do đó tránh được việc sử dụng lượng lớn hóa chất và đơn giản hóa các bước trong quy trình công nghệ

Tác nhân cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn cũng tương tự như trường hợp cắt mạch ở trạng thái lỏng, các tác nhân hay sử dụng như vật lý (tia gamma, tia X) [166]; hóa học (HCl) Tuy nhiên, các nghiên cắt mạch bằng tác nhân sinh học khi chitosan ở trạng thái rắn vẫn đang còn khá hạn chế Theo Belamie và cộng sự (1997), việc sử dụng HCl trong cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn vừa có tác dụng cắt đứt liên kết β -1,4 glycoside đồng thời nhóm amin ở vị trí C2 trong vòng pyranose của các đơn phân sẽ bị chuyển hóa tạo thành gốc mới có công thức –NH3+Cl- Như vậy dưới tác dụng của HCl, phân tử chitosan vừa bị cắt mạch tạo thành các đoạn mạch ngắn vừa bị chuyển hóa thành dạng muối chloride nên tăng khả năng hòa tan trong nước của sản phẩm sau cắt mạch [32] Theo Osorio và cộng sự (2010), cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn thường đơn giản, dễ thực hiện với quy mô lớn nhưng phải khống chế các điều kiện phân cắt để sản phẩm sau có sự đồng nhất về chuỗi mạch và ít bị biến đổi về mặt cấu trúc [131]

Cấu trúc chitosan thường có độ rắn cao do đó các tác nhân cắt mạch thường khó xâm nhập vào sâu bên trong cấu trúc khi chitosan ở trạng thái rắn Việc không xâm nhập vào sâu bên trong cấu trúc dẫn đến quá trình cắt mạch xảy ra không đều (phía ngoài có mức độ cắt mạch sâu hơn phía trong cấu trúc) do đó sự phân bố khối lượng phân tử của sản phẩm sau cắt mạch thường rộng hơn nữa việc tiếp xúc trong thời gian

dài với tác nhân cắt mạch dễ ảnh hưởng đến cấu trúc của mạch chitosan do đó sản phẩm tạo thành sẽ có hiên tượng ngã sang vàng Chính vì lý do trên việc làm trương

nở cấu trúc của chitosan (không làm tan chitosan) trước quá trình cắt mạch là một yếu

tố quan trọng nhằm hỗ trợ cho sự xâm nhập và cắt đúng vị trí của tác nhân cắt mạch

Tahtat và cộng sự (2012) [166] đã nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân

tử ban đầu ban đầu đến hiệu suất và tốc độ cắt mạch bức xạ đối với chitosan ở dạng rắn và dạng dung dịch Kết quả cho thấy quá trình cắt mạch chitosan ở trạng thái dung dịch có hiệu suất cắt mạch cao hơn ở trạng thái rắn bên cạnh đó chitosan có khối lượng phân tử ban đầu cao dễ cắt mạch bức xạ hơn so với chitosan có khối lượng phân tử thấp [114 Nghiên cứu của Tahtat và cộng sự tuy có đề cập đến quá trình cắt mạch ở trạng thái rắn nhưng chưa đề cập đến vấn đề tiền xử lý chitosan trước khi chiếu xạ do

đó sản phẩm cắt mạch có khả năng bị biến đổi tính chất do tác động của tia γ

Các nghiên cứu về cắt mạch chitosan ở Việt Nam bằng phương pháp hoá học chủ yếu tập trung vào việc cắt mạch chitosan ở trạng thái lỏng với tác nhân H2SO4 [1],

H2O2 [15], H2O2/tia Gamma[4]

Theo Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2008), sản phẩm tạo ra từ quá trình cắt mạch chitosan trong môi trường H2SO4 có hoạt tính chống oxy hoá cao Mặt khác, quá trình cắt mạch chitosan chịu tác động của nồng độ acid, thời gian thuỷ phân và độ deacetyl của chitosan đầu vào [1] Nghiên cứu của Bảo và cộng sự tuy có đề cập đến khả năng cắt mạch chitosan bằng H2SO4 và hoạt tính chống oxy hoá của sản phẩm cắt mạch nhưng quá trình cắt mạch được tiến hành ở trạng thái dung dịch do đó quá trình thu hồi sản phẩm cắt mạch đạt hiệu suất thấp hơn nữa hoạt tính kháng khuẩn của chitosan cắt mạch chưa được tác giả đề cập đến trong nghiên cứu này do đó chưa thể đánh giá được tính ưu việt của quá trình cắt mạch chitosan bằng H2SO4

Bùi Phước Phúc và cộng sự (2014) đã nghiên cứu quá trình cắt mạch chitosan

có độ deacetyl khác nhau bằng H2O2 trong môi trường dị thể kết quả cho thấy độ deacetyl càng cao thì hằng số tốc độ phản ứng càng mạnh, cụ thể hằng số tốc độ phản ứng cắt mạch của chitosan có DD 70; 84; 94% lần lượt là 0,33*10-4

; 1,33*10-4; 4,94*10-4 Nghiên cứu của Phúc và cộng sự tuy đã có đề cập đến quá trình cắt mạch ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 nhưng tác giả đã không nghiên cứu đến quá trình tiền

xử lý để làm giãn nở cấu trúc chitosan trước cắt mạch hơn nữa nồng độ H2O2 sử dụng trong nghiên cứu này là 1,5% do đó có khả năng sẽ làm biến đổi cấu trúc mạch

chitosan thông qua phản ứng deamin Công bố của Phúc và cộng sự (2014) tuy chứng minh được sản phẩm tạo ra có phổ FTIR, XRD không thay đổi đáng kể so với chitosan ban đầu nhưng tác giã đã chưa đề cập đến các tính chất về kháng khuẩn khuẩn, chống oxy hoá của chitosan cắt mạch trong khi hai tính chất này có vai trò quan trọng trong các ứng dụng của LMWC

Từ các phân tích trên cho thấy, quá trình cắt mạch chitosan có thể tiến hành khi chitosan ở trạng thái rắn hoặc trạng thái dung dịch với các tác nhân như HCl, H2O2 Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chỉ dừng mới chỉ chú trọng nghiên cứu quá trình cắt mạch và chưa có công bố về ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý đến quá trình cắt mạch Hơn nữa, việc sử dụng tác nhân H2O2 với nồng độ cao trong các nghiên cứu trước có thể làm biến đổi cấu trúc chitosan dẫn đến việc thay đổi các hoạt tính sinh học

cụ thể như hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hoá Mặt khác, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hoá của chitosan cắt mạch nhưng các tính chất sinh học của chitosan thường được đánh giá riêng lẻ và chưa có công bố nào đề cập đến cả 2 tính chất chống oxy hoá, kháng khuẩn của LMWC thu nhận từ quá trình cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 Từ những luận điểm trên đề tài cần tiếp tục triển khai việc đánh giá tác động của quá trình tiền xử lý đến quá trình cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 có nồng độ thấp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hoá của sản phẩm cắt mạch

1.1.3 Tính chất của LMWC

Các tính chất của LMWC (đặc biệt là tính chất sinh học) phụ thuộc lớn vào các thông số DD, Mw, PDI do đó việc kiểm soát trên là rất quan trọng để tính chất của LMWC được ổn định Các tính chất hóa lý và sinh học của LMWC thường bao gồm:

độ hòa tan, pKa, thế zeta, độ rắn cấu trúc, DD, Mw, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm,

kích thích sinh học, chống oxy hoá

a, Khả năng hòa tan của LMWC

Chitosan là polysaccharide có tính kiềm yếu, không tan trong nước, kiềm Chitosan có khả năng hòa tan tốt trong một số dung môi hydrochloric acid, lactic acid, propionic acid, succinic acid, acetic acid, tartaric acid, citric acid và formic acid, nồng

độ các dung dịch acid sử dụng để hòa tan chitosan được thể hiện trong Bảng 1.3 [20, 144] Nitric acid có thể hòa tan chitosan, nhưng sau khi hòa tan, kết tủa keo trắng sẽ

xuất hiện Sulphuric acid đậm đặc có thể gây cắt mạch chitosan trong khi đó sulphuric acid loãng không hòa tan chitosan vì nó sẽ phản ứng với chitosan tạo thành chitosan sulphate, một chất rắn kết tinh màu trắng [42, 144] Khả năng hòa tan của chitosan trong các acid vô cơ là khá hạn chế Ngoài ra, dung dịch acid acetic đậm đặc ở nhiệt

độ cao có thể gây ra hiện tượng cắt mạch chitosan Độ hòa tan chitosan cũng phụ thuộc vào pKa và nồng độ acid, Các nghiên cứu cho thấy độ hòa tan của chitosan thay đổi tùy theo loại dung môi [144]

Đối với mỗi hệ dung môi, nồng độ chitosan, pH, nồng độ ion, nhiệt độ sẽ ảnh hưởng đến độ tan độ nhớt của dung dịch chitosan Lượng acid cần thiết cho quá trình tan chitosan phụ thuộc vào mức độ tương quan giữa [H+] và [-NH2] trong cấu trúc mạch chitosan Ở pH dưới 4, hầu hết các nhóm amino của chitosan được cho là bị proton hóa, và vì hiệu ứng này thúc đẩy tương tác tĩnh điện giữa các nhóm tích điện của cùng dấu hiệu, nó tăng cường khả năng trương nở của mạch chitosan trong mạng lưới polymer [144, 146, 177] Ở môi trường pH > 6,5, sự hòa tan của chitosan bị kìm hãm, trong khi tại pH < 6 sự proton hóa các nhóm amin tự do tạo thuận lợi cho sự hòa tan của phân tử chitosan Chỉ số pKa của chitosan phụ thuộc chặt chẽ vào DD vì vậy tính tan của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl

Bảng 1.3 Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan [20]

Mặc dù có nhiều hoạt tính quan trọng, nhưng độ hòa tan kém của chitosan đã hạn chế khả năng nó, đặc biệt là tại giá trị pH sinh lý (7 - 7,4) chitosan không hòa tan

và hầu như không có tác động [144] do đó, việc cải thiện khả năng hòa tan của chitosan là rất quan trọng Trong chuỗi mạch của chitosan có sự hiện diện của các nhóm amin (-NH2) và hydroxyl (-OH) có khả năng phản ứng cao, các nhóm này có thể được sửa đổi hoặc gắn thêm nhóm chức mới để cải thiện khả năng hòa tan của chitosan trong môi trường có pH thay đổi [165] Quá trình thay đổi cấu trúc chitosan

có thể làm xuất hiện tính chất sinh học mới và đặc biệt là cải thiện được tính hòa tan của chitosan [165]

b, Độ deacetyl (DD) của LMWC

Độ deacetyl (DD) là là tỷ lệ giữa D-Glucosamine (GlcN - tiểu phần D) và Acetyl-Glucosamine (GlcNAc - tiểu phần A), thông số này được sử dụng để phân biệt chitin và chitosan Khi DD > 50%, sản phẩm có tên là chitosan và ngược lại chúng là chitin Độ deacetyl có ảnh hưởng lớn đến mức độ kết tinh, độ hòa tan, mức độ proton hóa và các tính chất sinh học của chitosan Độ deacetyl có liên quan mật thiết đến độ tan của chitosan trong dung dịch acid loãng, chitosan có độ DD càng cao thì mức độ hòa tan càng mạnh Thông thường các chitosan thương mại có độ deacetyl nằm trong các khoảng 50 – 90% [165] hoặc 40 – 98% [43]

N-Những nghiên cứu gần đây về chitosan và dẫn xuất chitosan cho thấy điểm khác biệt quan trọng giữa chitosan với polymer trong tự nhiên khác nhau là nhóm NH2 ở vị trí C2 Đây là vị trí khơi nguồn của những phản ứng hóa học của chitosan như: phản ứng este hóa, phản ứng amin hóa, tạo phức ion kim loại Tuy nhiên, bản chất của các cation là rất quan trọng trong cơ chế tương tác tạo thành phức chất, ái lực của chitosan đối

với các cation được hấp thụ trên màng thể hiện theo thứ tự sau: Cu2+ Hg2+>

Zn2+>Cd2+> Ni2+ > Co2+ Co2+ Ca2+

c, Khối lượng phân tử trung bình (M w ) của LMWC

Khối lượng phân tử trung bình của chitosan (Mw) là một thông số cấu trúc quan trọng, quyết định lớn đến khả năng tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ kim loại, chất màu đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật, khả năng chống oxy hoá của chitosan Khối lượng phân tử trung bình của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin, điều kiện deacetyl và thường rất khó kiểm soát Khối lượng phân tử trung bình của chitosan thường nằm trong khoảng 50 – 1000 kDa [165] hoặc 50 – 2000 kDa [43] Chitosan

phân tử lượng thấp thường có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hoá cao

do đó được ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học trong khi đó chitosan phân tử lượng cao có khả năng tạo màng tốt Do đó tuỳ thuộc vào mục đích ứng dụng để tạo ra các loại chitosan có khối lượng phân tử khác nhau

d, Hoạt tính sinh học của LMWC

LMWC có sự hiện diện của nhóm hydroxyl (-OH) và nhóm amine (-NH2) trong cấu trúc và có thể tương tác với các thụ thể trên màng tế bào sinh vật do vậy LMWC

có tác động đến quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật Ngoài ra, LMWWC

dễ phân hũy sinh học, có khả năng chống oxy hóa, kích thích sinh trưởng, giảm cholesterol [44, 165, 192] nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan là một trong những tính chất quan trọng liên quan đến khả năng ứng dụng của nó trong thực phẩm, công nghệ sinh học, nông nghiệp Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào độ polymer, độ deacetyl, khối lượng phân tử, độ tinh sạch của chitosan [49, 135, 175] và loại vi khuẩn [70], ví

dụ glucosamin oligomer với DD 92% có hoạt tính kháng E coli và S aureus cao hơn

LMWC có DD 80% [65] Theo Wu và cộng (2004), LMWC có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn HMWC nguyên nhân có thể do LMWC với mạch phân tử ngắn nên tính linh động cao và dễ dàng được hấp thụ trên màng tế bào vi sinh vật hơn so với HMWC [181] Chitosan có phổ kháng khuẩn rộng kháng lại cả nấm, vi khuẩn gram-dương và gram âm [103], Kong và cộng sự (2010) cho rằng, chitosan và các dẫn xuất của nó có khả năng kháng vi khuẩn gram âm mạnh hơn gram dương [101] Trong khi đó, Raafat

và cộng sự (2009) cho rằng, vi khuẩn gram dương nhạy cảm với chitosan hơn vi khuẩn gram âm do đó chitosan có tác động đến vi khuẩn gram dương mạnh hơn gram âm [142] So với chitin, chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì chitosan tích điện dương ở vị trị carbon thứ 2 ở pH < 6 Chitosan có DD > 85% thì có khả năng

kháng khuẩn, kháng nấm tốt Chitosan có khả năng ức chế Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutensis, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger [117] Nồng độ ức chế phụ

thuộc vào loại chitosan, loài vi sinh vật, điều kiện áp dụng và thường được sử dụng trong khoảng 0,0075% đến 1,5% Ngoài ra các dẫn xuất của chitosan cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn tốt ví dụ N-carboxymethylchitosan ở nồng độ 0,1-5 mg/mL

trong môi trường pH = 5,4 làm giảm khả năng sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus [112] Cơ chế kháng khuẩn của LMWC tuy được

nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhưng các giả thuyết để giải thích cơ chế này vẫn chưa rõ ràng Theo Kong và cộng sự (2010), Raafat và cộng sự (2009) chitosan có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn qua các cơ chế chính như sau [101, 142]:

1) Sự tương tác giữa các nhóm amin tích điện dương và các điện tích âm màng tế bào vi sinh vật, dẫn đến sự rò rỉ các thành phần nội bào của tế bào vi sinh vật 2) Chitosan có khả năng liên kết nước và ức chế các enzyme trong tế bào vi sinh vật

từ đó làm rối loạn các quá trình chuyển hoá của vi sinh vật

3) Chitosan có khả năng tạo chelate với các kim loại và sau đó ức chế quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật

4) HMWC có khả năng tạo màng không thấm nước trên bề mặt tế bào, làm thay đổi tính thấm và ngăn chặn sự xâm nhập của các chất dinh dưỡng vào tế bào

5) Chitosan phân tử lượng thấp có khả năng xâm nhập vào nhân tế bào và liên kết với ADN, can thiệp vào quá trình tổng hợp mARN, protein của vi sinh vật

6) Chitosan có khả năng hấp phụ và keo tụ các chất điện từ trong tế bào, điều chỉnh hoạt động sinh lý của vi sinh vật, gây ức chế sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật Như vậy khi xem xét khả năng kháng khuẩn của chitosan cần chú ý đến 4 yếu

tố như sau: (1) chủng vi sinh vật và tuổi tế bào; (2) DD, Mw, nồng độ chitosan, dung môi hoà tan chitosan; (3) trạng thái vật lý chitosan, chitosan dạng rắn hay dạng lỏng và (4) nồng độ ion trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, pH, nhiệt độ và thời gian tiếp xúc giữa chitosan và tế bào vi khuẩn Ngoài ra, khả năng kháng khuẩn của chitosan

được thử nghiệm chủ yếu trong điều kiện in vitro và trên từng đối tượng riêng lẻ do đó

khi áp dụng vào thực tế cần chú ý đến sự tương tác giữa chitosan với các thành phần hoá sinh trong thực phẩm (protein, carbohydrate, lipid, khoáng chất, vitamin) Ngoài

ra, trong thực phẩm thường tồn tại hệ vi sinh vật có đặc tính khác nhau, điều này cũng cần chú ý khi nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan [54]

Khả năng chống oxy hóa

Chitosan có khả năng chống oxy hoá và tính chất này phụ thuộc chủ yếu vào

MW, DD, nồng độ, độ pH và dẫn xuất chitosan [96] Hiện nay, có nhiều giả thuyết giải thích cơ chế chống oxy hoá của chitosan nhưng vấn đề này vẫn còn nhiều tranh luận

do đó cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể giải thích bằng các hướng sau:

(1) Chitosan có thể loại bỏ các gốc tự do hoặc kìm hãm ion kim loại thông qua phản ứng tạo chelate với các ion kim loại

(2) Các nhóm hydroxyl (OH) và amino nhóm (NH2) trong chitosan là nhóm chức năng quan trọng đối với hoạt động chống oxy hóa do nhóm này tham gia phản ứng với các gốc tự do để chuyển thành các gốc ổn định [96] Cơ chế dập tắt gốc tự do của chitosan có thể do các gốc tự do có thể phản ứng với ion H+ từ các ion NH3+ [186] chuyển thành trạng thái gốc tự do đại phân tử (macromolecule radicals) rất cồng kềnh, tính linh động kém Cũng có thể hiểu rằng, chitosan có khả năng nhường hydro (hydrogen – donating) cho các chất oxy linh động (reactive oxy species: ROS) hay các tác nhân oxy hoá trong chuỗi phản ứng oxy hóa có thể phản ứng với nguyên tử hydro linh động trong nhóm hydroxyl (OH) hoặc nhóm amino (NH2) của chitosan [50]

Xie và cộng sự (2001) báo cáo rằng cơ chế xử lý gốc tự do của chitosan có liên quan đến phản ứng giữa với các ion hydro từ nhóm NH3+ để tạo thành một phân tử ổn định [185] Theo Shahidi và cộng sự (1999), cơ chế kiểm soát quá trình chống oxy hoá của chitosan có thể do sự hình thành phức chelate giữa chitosan và ion Fe2+, Fe3+[154] Jeon và cộng sự (2002), Shahidi và cộng sự (2002) cũng cho rằng cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể là do hoạt tính tạo phức với các ion kim loại hoặc do chitosan kết hợp với lipid Ngoài ra, màng chitosan cũng thể hiện tác dụng hạn chế oxy hóa lipid do màng chitosan làm rào cản đối với oxy [85, 155]

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa của chitosan:

- Khối lượng phân tử (Mw): chitosan có Mw thấp thì khả năng chống oxy hóa càng cao Chitosan có Mw cao thường có kích thước lớn, tính linh động kém làm hạn chế khả năng chống oxy hóa [1]

- Độ deacetyl (DD): Chitosan có DD cao thì khả năng tích điện dương lớn tạo điều kiện cho quá trình tương tác và bẩy các nhân tố âm cực vào hệ keo chitosan làm tăng tính chống oxy hóa của chúng [186]

- Độ pH: Ở pH > 6, chitosan không hoà tan trong khi tại pH < 6 chitosan có khả năng hòa tan mạnh Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng chống oxy hóa của chitosan do sự giảm hoạt động của các nhóm amin trong phân tử [105]

- Nồng độ chitosan: Nồng độ chitosan càng cao số lượng nhóm amin trong phân tử càng nhiều điều này làm thúc đẩy khả năng chống oxy hoá của chitosan [186]

1.1.4 Ứng dụng của LMWC

LMWC đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, nuôi trồng thủy sản, công nghệ thực phẩm, xử lý nước [118] Một số ứng dụng của LMWC được tóm tắt trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số ứng dụng của LMWC

Nông nghiệp  Kích thích sinh trưởng thực vật

 Thay thế thuốc trừ sâu hóa học

 Thức ăn bổ sung cho động vật

[118, 143, 156, 187]

Thủy sản  Làm chất kết dính trong thức ăn

 Cung cấp vaccine và vitamin

 Cải thiện chất lượng nước

a, Ứng dụng trong nông nghiệp

LMWC được xem là chất kích thích bảo vệ thực vật, chất kích thích tăng trưởng thực vật, chất bao phủ hạt giống, cải tạo đất và là phụ gia bổ sung trong thức ăn chăn nuôi Các đặc tính bảo vệ thực vật của LMWC chủ yếu dựa trên khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, kháng tuyến trùng [114] LMWC được khuyến cáo sử dụng để chống lại sâu bệnh hại cây trồng và vi sinh vật thay vì thuốc trừ sâu hóa học [194] Ngoài ra, phân bón phủ LMWC cho thấy khả năng kiểm soát tốt sự giải phóng các hợp chất dinh dưỡng ra môi trường, làm tăng hiệu quả sử dụng phân bón, cải thiện chất lượng đất, thân thiện với môi trường [156]

b, Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

LMWC có thể sử dụng như thức ăn bổ sung vào chế độ ăn của động vật thủy sản, tác nhân kiểm soát bệnh, cải thiện chất lượng nước ao nuôi và xử lý nước thải [25, 108] Thức ăn cá được phối trộn LMWC giúp cải thiện sức khỏe của cá thông qua việc tăng cường và kích thích hoạt động của hệ miễn dịch [175], mặt khác việc phối trộn

LMWC vào thức ăn có thể làm tăng thời gian tồn tại của viên thức ăn trong môi trường nước Ngoài ra, khả năng giải phóng vitamin C vào đường tiêu hóa của cá Hồi có thể lên đến 48h khi vitamin C được bao gói bằng bằng nano chitosan [25] LWMC được

sử dụng để xử lý nước ao nuôi thủy sản và tạo phức với ion kim loại [48]

c, Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

LMWC được sử dụng như phụ gia thực phẩm và làm vật liệu bao gói có khả năng kháng khuẩn [187] Dự trên tính chất không độc và hoạt tính kháng vi khuẩn, LMWC đã được sử dụng làm vật liệu bao gói để cải thiện tính an toàn và tăng thời gian sử dụng thực phẩm LMWC được sử dụng rộng rãi để tạo màng kháng khuẩn trong bao gói thực phẩm hoặc màng phủ trực tiếp lên trái cây [152, 175]

1.2 Chitosan hòa tan trong nước (WSC)

WSC có ưu điểm là dễ sử dụng và hoạt tính sinh học đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa ít bị biến đổi nhiều so với chitosan ban đầu [177] Trong các sản phẩm WSC, COS được hình thành từ quá trình cắt mạch trong khi muối chitosan thường được tạo thành từ phản ứng giữa chitosan với các dung môi acid Do vậy, phản ứng tạo muối chitosan là phương pháp cải thiện khả năng hòa tan trong nước của chitosan khá hiệu quả, một số loại muối chitosan đã được nghiên cứu như chitosan hydrochlorate, chitosan acetate, chitosan lactate, chitosan propionate, chitosan ascosbate [97], khi hòa tan muối chitosan vào nước thì tạo thành dung dịch chitosan với tính chất tương tự như khi hòa tan chitosan trong dung môi acid tương ứng [133] Theo Kim và cộng sự (2011),

dung dịch chitosan trong acid loãng thực chất là dạng muối chitosan, đây là loại dẫn xuất được sử dụng phổ biến nhất [97] Chitosan có khả năng tạo muối với acid vô cơ và acid hữu cơ như acid hydrochloric, acid formic, acid glutamic, acid lactic, acid citric, acid acetic, acid ascorbic, và acid propionic [39] Khi tạo muối, nhóm amin ở vị trí C2 phản ứng với gốc acid của các acid nói trên hình thành dạng –NH3+OCOR- và kết quả cải thiện khả năng tan trong nước của muối chitosan [82] Với các nhóm chức hydroxyl và amin, chitosan hoạt động như một bazơ yếu, do vậy chúng có khả năng tác dụng với acid tạo thành muối và tạo ra chất điện ly có độ hòa tan phụ thuộc vào bản chất anion tham gia phản ứng [39, 130, 133] Trong phản ứng giữa chitosan với gốc acid, chitosan và gốc acid liên kết với nhau bằng liên kết tĩnh điện thay vì liên kết cộng hóa trị, nhóm amin ở

vị trí C2 trong phân tử chitosan phản ứng với gốc acid của các acid nói trên kết hợp để hình thành dạng –NH3+R- và kết quả là cải thiện được khả năng tan trong nước của muối chitosan [82, 107] Phản ứng tạo muối chitosan được biểu diễn trong Hình 1.3

O

NH2

O O

H

NH2

OH O

H

O H

NH3+R

-O O

H

NH3+R

-OH O

trọng lượng của phân tử cũng như độ phân tán về khối lượng phân tử của chitosan Gần đây, các dẫn xuất tan trong nước của chitosan đã được chú ý nghiên cứu và ứng dụng, một số dạng chitosan hòa tan trong nước được thể hiện ở Bảng 1.5

Bảng 1.5 Các loại chitosan tan trong nước

Chitosan hòa tan

Chitosan adipate Chitosan + H2O + acid adpate  sấy 105oC [133]

Chitosan Fumarate Chitosan + H2O + acid Fumaric  sấy 105oC [133]

Chitosan acetate Chitosan + Ethanol  + acid acetic  sấy khô [107]

Như vậy, từ chitosan có thể tạo ra nhiều dẫn xuất chitosan tan trong nước [131] Các dẫn xuất chitosan có tính hòa tan trong nước tốt hơn so với chitosan ban đầu nên

dễ dàng được ứng dụng ở quy mô lớn do vậy WSC tồn tại ở dạng muối chitosan được đánh giá là có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế

Quá trình sản xuất WSC bằng phản ứng tạo muối là phản ứng giữa gốc amin của chitosan với gốc acid do đó phản ứng dễ gây ra hiện tượng cắt mạch chitosan, phản ứng cắt mạch phụ thuộc vào bản chất của gốc acid, nhiệt độ và thời gian phản ứng Theo Osorio và cộng sự (2010), nhiệt độ cao có khả năng thúc đẩy phản ứng cắt mạch chitosan khiến khối lượng phân tử của muối chitosan giảm Ở nhiệt độ thấp (4oC), cấu trúc của chitosan có thể được giữ nguyên tới 90% Ở nhiệt độ phòng, khi chitosan phản ứng với acid có khả năng làm giảm độ rắn của mạch chitosan dẫn đến quá trình cắt mạch và làm giảm khối lượng phân tử [131] Theo Belamie và cộng sự (1997), chitosan hydrochloride có thể được hình thành khi khí HCl phản ứng trực tiếp với chitosan ở trạng thái rắn, trong trường hợp này khí HCl luôn ở trạng thái dư thừa

và gốc -NH2 trong cấu trúc chitosan có khả năng chuyển thành gốc -NH3+ Tuy nhiên,

quá trình tiếp xúc giữa khí HCl và chitosan thường bao gồm cả phản ứng hydrate hoá gây tăng nhiệt cho hệ thống phản ứng điều này thúc đẩy quá trình cắt mạch làm giảm khối lượng phân tử của sản phẩm do đó nhiệt độ trong hệ thống phản ứng cần được kiểm soát bằng cách đặt chúng trong một bình kín ổn nhiệt [32]

Phản ứng giữa chitosan và acid có thể diễn ra ở trạng thái rắn hoặc trạng thái lỏng Ở trạng thái lỏng, chitosan thường được hòa tan trong môi trường acid tương ứng sau đó thực hiện các phương pháp tách nước (sấy phun, đông khô) để tạo thành muối chitosan dạng bột

Theo Adamiec và cộng sự (2005), có thể sản xuất WSC bằng phương pháp sấy phun sau khi pha chitosan có DD = 71%, Mw = 500 kDa trong dung dịch acid ascorbic (1,7%) và acid acetic (0,6%) Nồng độ dung dịch chitosan là 1% Ngoài ra, glutaraldehyde hoặc triphotphate có thể thêm vào dung dịch chitosan trước khi sấy

phun để thu được sản phẩm muối chitosan có kích thước hạt khác nhau [21]

Nghiên cứu của Adamiec và cộng sự đã chứng minh sự việc hình thành các dạng muối chitosan có thể cải thiện khả năng hoà tan của chitosan trong nước nhưng phương pháp tạo muối trong nghiên cứu này vẫn tồn tại một số vấn đề cần khắc phục như phương pháp này phải thực hiện nhiều công đoạn phức tạp (hoà tan, điều chỉnh pH, sấy phun) và hiệu suất tạo muối thấp (do lượng chitosan hoà tan tối đa trong dung dịch acid chỉ từ từ 1 – 3%) hơn nữa sản phẩm muối chitosan tạo ra có khối lượng phân tử thấp hơn nhiều lần so với chitosan ban đầu và các tính chất như kháng khuẩn, chống oxy hoá của muối chitosan vẫn chưa được đánh giá đầy đủ

Mirna và cộng sự (2011) cũng đã sản xuất thành công muối chitosan (chitosan lactate, chitosan citrate, chitosan acetate) bằng phương pháp sấy phun dung dịch chitosan 4% Các muối chitosan sau sấy phun tồn tại dạng bột mịn nhưng chitosan acetate có khả năng hấp thụ nước mạnh nhất, tiếp đến là chitosan lactate và cuối cùng

là chitosan citrate Tuy nhiên, độ nhớt của chitosan acetate (273.6 mPas) cao hơn

chitosan lactate (249,0 mPas) và chitosan citrate (220,9 mPas) [39] Tương tự như

nghiên cứu của Adamiec, nghiên cứu của nhóm Mirna vẫn chưa rút ngắn được các công đoạn trong quá trình tạo muối do đó vẫn phải dùng nhiều công đoạn để thu nhận sản phẩm muối chitosan Hơn nữa, sản phẩm muối chitosan tạo ra chưa được đánh giá đầy đủ về tính chất kháng khuẩn, chống oxy hoá trong khi các tính chất ứng dụng của muối chitosan phụ thuộc chủ yếu vào các tình chất trên

Ngoài phương pháp sấy phun, Li và cộng sự (2007) cũng đã sản xuất được muối chitosan sau khi ngâm chitosan trong ethanol 95% và acid acetic đậm đặc trong thời gian 2h, sản phẩm sau được rửa cồn và sấy khô để thu nhận chitosan acetate Kết quả cho thấy chitosan acetate có pH = 5,03; độ tan > 99% và độ nhớt thấp hơn so với chitosan ban đầu [107] Nghiên cứu của Li và cộng sự cho thấy việc tạo muối chitosan acetate có thể tiến hành khi chitosan tồn tại ở trạng thái rắn nhưng sản phẩm muối chitosan acetate tạo ra thường tồn tại dạng khối, khó tách rời nên gây khó khăn khi ứng dụng Từ những phân tích trên cho thấy, muối chitosan có khả năng hoà tan tốt trong nước nhưng phương pháp tạo muối thường bao gồm nhiều bước phức tạp, khối lượng phân tử của muối chitosan thường thấp hơn nhiều lần so với chitosan ban đầu do

đó cần có các nghiên cứu sâu hơn để đơn giản hoá các bước trong quá trình tạo muối

và hạn chế quá trình cắt mạch chitosan trong phản ứng tạo muối chitosan

Tại Việt Nam, các nghiên cứu WSC tập trung chủ yếu vào hướng cắt mạch tạo oligochitosan [1, 14] Theo Lê Thanh Long và cộng sự (2018), WSC có thể thu nhận sau quá trình cắt mạch chitosan bằng H2O2 Điều kiện thủy phân tốt nhất để thu hồi WSC là H2O2 5,4%, nhiệt độ 47,1oC và thời gian 3,4 h, tỷ với lệ thu hồi đạt 85,6% WSC có Mw = 31,5 kDa với và cấu trúc mạch phân tử hầu như không thay đổi so với chitosan thương mại ban đầu Trong điều kiện in vitro, WSC ức chế mạnh sự phát triển

của 3 loài nấm C gloeosporioides L2 C musae D1 C capsici B4 [12] Ngoài ra, WSC còn có khả năng kháng E.coli do đó WSC có khả năng ứng dụng như một tác nhân có

tính kháng nấm, kháng khuẩn [12, 14] Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2008) cho rằng, chitosan oligosaccharide thu nhận sau phản ứng với H2SO4 có khả năng chống oxy hoá mạnh, điều kiện để thu nhận là H2SO4 250 mM, 24h, 30oC [1]

1.2.3 Tính chất của chitosan hòa tan trong nước

Theo Li và cộng sự (2007), dung dịch chitosan acetate nói riêng và muối chitosan nói chung có tính chất tương tự như dung dịch của chitosan hòa tan trong acid tương ứng vì vậy, muối chitosan vẫn giữ cấu trúc và hoạt tính kháng khuẩn của chitosan [107] Hơn nữa, muối chitosan ổn định hơn so với dung dịch chitosan mặt khác trạng thái rắn của muối chitosan thuận tiện hơn trong việc sử dụng so với chitosan Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ về khả năng kháng khuẩn của WSC trên các đối tượng

vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ lên bề mặt tế bào Các phân tử muối chitosan khi phân tán quanh tế bào vi sinh