Phân lập vi nấm kháng vi sinh vật từ đất công viên ở thành phồ hồ chí minh

Chỉ có một số ít các đề tài tiến hành phân lập được các chủng vi nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh trên người và động vật [4].. Một số loại nấm thuộc chi Aspergillus cũng đ

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VI NẤM KHÁNG VI SINH VẬT

TỪ ĐẤT CÔNG VIÊN Ở THÀNH PHỒ HỒ CHÍ MINH

Số hợp đồng: 2020.01.074/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Quang Hạnh Thư

Đơn vị công tác: Khoa Dược – Đại học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện: 03/2020 – 11/2020

TP Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 09 năm 2020

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2020

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VI NẤM KHÁNG VI SINH VẬT

TỪ ĐẤT CÔNG VIÊN Ở THÀNH PHỒ HỒ CHÍ MINH

Số hợp đồng: 2020.01.074/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Quang Hạnh Thư

Đơn vị công tác: Khoa Dược – Đại học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện: 03/2020 – 11/2020

Các thành viên phối hợp và cộng tác:

STT Họ và tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Ký tên

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1 TỔNG QUAN VỀ VI NẤM SỢI 2

1.1 Đặc điểm cơ bản của vi nấm sợi 2

1.2 Nguồn lợi của vi nấm sợi trong đất 3

2 TỔNG QUAN VỀ HỆ VI NẤM SỢI TRONG ĐẤT 5

2.1 Nghiên cứu trên thế giới 5

2.2 Nghiên cứu trong nước 6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 9

1.1 Đối tượng nghiên cứu 9

1.2 Dung môi – hóa chất 9

1.3 Vi sinh vật thử nghiệm 9

1.4 Môi trường nuôi cấy 9

1.5 Trang thiết bị 10

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Phân lập vi nấm từ mẫu đất 10

2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu đất 10

2.1.2 Phân lập vi nấm 11

ii

2.2 Định danh vi nấm sợi 11

2.3 Thử nghiệm khảo sát tính kháng khuẩn và kháng nấm Candida của chất biến dưỡng từ vi nấm 12

2.3.1 Hoạt hóa vi sinh vật thử nghiệm 12

2.3.2 Phương pháp khảo sát tính kháng khuẩn – kháng nấm Candida 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 14

1 KẾT QUẢ 14

1.1 Phân lập vi nấm 14

1.2 Định danh vi nấm 14

1.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của chất biến dưỡng từ vi nấm 15

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 21

3.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm Candida 23

3.2 BÀN LUẬN 25

3.2.1 Phân lập và định danh vi nấm 25

3.2.2 Hoạt tính sinh học của chất biến dưỡng từ vi nấm trong đất 27

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

4.1 KẾT LUẬN 29

4.2 ĐỀ NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1: Môi trường nuôi cấy

iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ec Escherichia coli

LPCB Lactophenol coton blue

MRSA Staphylococcus aureus đề kháng methicillin

iv

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Kết quả định danh vi nấm phân lập từ đất công viên ở Tp.HCM 14

Bảng 3.2 Vi nấm có hoạt tính kháng khuẩn 21

Bảng 3.3 Vi nấm có hoạt tính kháng nấm Candida 24

Bảng 3.4 Tỷ lệ phân bố vi nấm được phân lập từ đất công viên ở Tp.HCM 26

v

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Một số mẫu Penicillium 15

Hình 3.2 Một số mẫu Aspergillus 16

Hình 3.3 Paecilomyces sp G46 17

Hình 3.4 Trichoderma sp T411 18

Hình 3.5 Mucor sp T13 18

Hình 3.6 Fusarium H22 19

Hình 3.7 Phoma sp T23 19

Hình 3.8 Curvularia sp G26 20

Hình 3.9 Cladosporium sp H57 20

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi sinh vật sống ở khắp nơi trên Trái Đất, ngay cả trong những nơi mà điều kiện tưởng chừng hết sức khắc nghiệt vẫn thấy có sự phát triển của vi sinh vật Vi sinh vật trong đất và trong nước có vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp, y tế… Hiện nay, hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng lan rộng và gây nhiều khó khăn cho việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Việc tìm kiếm các hoạt chất có tính kháng sinh mới có nguồn gốc thiên nhiên, đặc biệt là từ các chủng vi sinh vật, đang được nhiều nhà khoa học quan tâm

Trên thế giới, các nhà khoa học đang tập trung theo hướng tìm kiếm các hoạt chất thiên nhiên mới có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm là các chất biến dưỡng từ vi sinh vật Trong nước có một số đề tài tương tự đã được thực hiện ở các vùng như Tp Cần Thơ, huyện Cần Giờ…Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu thường được ứng dụng

để bảo vệ cây trồng [3,9] Chỉ có một số ít các đề tài tiến hành phân lập được các chủng vi nấm sợi có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh trên người và động vật [4] Việc nghiên cứu và sàng lọc vi nấm có hoạt tính sinh học từ đất mang ý nghĩa khoa học thiết thực nhằm khai thác nguồn lợi thiên nhiên một cách hợp lý Với mục tiêu

trên, chúng tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VI NẤM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG

VI SINH VẬT TỪ NGUỒN ĐẤT Ở CÔNG VIÊN THUỘC TP HỒ CHÍ MINH”

Mục tiêu đề tài gồm:

- Phân lập vi nấm từ đất vườn ở một số vùng thuộc Tp.HCM

- Định danh vi nấm đã phân lập và thuần chủng

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng Candida của chất biến dưỡng do vi nấm

sản xuất

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ VI NẤM SỢI

1.1 Đặc điểm cơ bản của vi nấm sợi

Vi nấm được xếp loại trong giới Nấm (Fungi) Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi và thuộc nhóm sinh vật nhân thật (Eukaryote)

Vi nấm là sinh vật dị dưỡng, có đời sống hoại sinh hoặc ký sinh Tế bào vi nấm không

có diệp lục nên không tự quang hợp nhưng có hệ thống enzym dồi dào (cellulase, protease, catalase…) tham gia chuyển hóa chất Chúng tiết các enzym này ra môi trường giúp phân giải các hợp chất phức tạp thành những hợp chất đơn giản để hấp thu Tùy theo cấu tạo, có thể chia vi nấm thành hai nhóm gồm dạng nấm men (yeast)

có cấu trúc đơn bào và nấm sợi (hyphae) có cấu trúc đa bào

Dựa vào vai trò, nấm ở đất có thể được chia thành ba nhóm: [18]

- Decomposers - nấm hoại sinh: nhóm nấm này giúp biến đổi vật liệu hữu cơ chết

thành sinh khối nấm, carbon dioxide (CO2) và các phân tử nhỏ như acid hữu

cơ Những loại nấm này thường sử dụng các chất nền phức tạp như cellulose và lignin Chúng rất cần thiết trong việc phân hủy cấu trúc vòng carbon trong một số chất gây

ô nhiễm Giống như vi khuẩn, chúng đóng vai trò quan trọng giúp giữ lại các chất dinh dưỡng trong đất

- Mutualists - nấm mycorrhizal: đây là nhóm nấm cộng sinh ở rễ các loài cây Để đổi

lấy chất dinh dưỡng từ cây, các vi nấm này giúp hòa tan và chuyển hóa các chất như phốt pho, nitơ, chất vi lượng… có trong đất và không khí cho cây sử dụng

- Pathogens hay Parasites - nấm ký sinh gây bệnh: nhóm nấm này thường gây giảm

năng suất cây trồng, gây bệnh hoặc gây chết sinh vật khi chúng xâm chiếm rễ cây và tấn công các sinh vật khác Các vi nấm thuộc nhóm này thường gặp

như Verticillium, Pythium và Rhizoctonia Chúng gây thiệt hại kinh tế lớn trong nông

nghiệp mỗi năm Tuy nhiên, nhiều loài nấm giúp kiểm soát bệnh trên cây trồng vì chúng là thiên địch đối với một số loài sâu hại hoặc vi nấm gây bệnh khác

3

Theo Elizabeth Tootyll (1984), nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được

mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên Trái đất

1.2 Nguồn lợi của vi nấm sợi trong đất

Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến cuộc sống con người một cách trực tiếp như làm hư hỏng, giảm chất lượng thực phẩm trước và sau thu hoạch, trong chế biến hoặc bảo quản Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo hoặc gây bệnh cho người, động vật và cây trồng

Nhưng bên cạnh đó, vi nấm còn giữ vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu

cơ trả lại độ màu mỡ cho đất trồng Các quy trình chế biến thực phẩm có liên quan đến lên men đều cần đến sự có mặt của vi sinh vật, trong đó có nấm mốc Nấm men được sử dụng để sản xuất rượu vang hay bia Chúng được thêm vào bột để làm bánh

mì có độ nở nhất định, một số được sử dụng để sản xuất pho mát Ở châu Á, một số

vi nấm được thêm vào đậu nành để tạo ra một số thực phẩm như nước tương được ủ

bằng nấm mốc Aspergillus (A.oryzae, A.soyae, A.niger, A.terriol… ) [2]

Nấm có lợi cùng với một số vi khuẩn cũng có thể hình thành các mạng lưới bảo vệ

xung quanh rễ và lá để bảo vệ cây chủ Nấm Trichoderma bảo vệ rễ cây khỏi sự tấn

công của các vi sinh vật có hại Nấm còn cung cấp một lớp vỏ bảo vệ để cung cấp cả

nước và phốt pho cho rễ cây trong hạn hán Bên cạnh đó, Trichoderma có khả năng

sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào như amylase, protease… có khả năng kháng một

số bệnh hại ở cây trồng [5, 23, 24, 26, 28]

Hợp chất cytosporone được chiết tách từ nước dùng lên men của nấm Trichoderma

sp FKI-6626 Cấu trúc hóa học được xác định chủ yếu bằng quang phổ NMR và khối phổ Hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại một số loài vi khuẩn như

S.aureus, E.coli, P.aeruginosa và vi nấm gây bệnh như Candida albicans, Aspergillus oryzae, Mucor racemosu…[19]

Trichoderma viride được phân lập từ đất trồng dưa leo tại trang trại Omar Makram

(Beheara Governorate, Ai Cập) vào mùa thu hoạch và mùa đông năm 2012/2013 đã được thử nghiệm như một chất kháng khuẩn, chất chống oxy hoá và chống ung thư

“Thời kỳ vàng son" của kháng sinh bắt đầu từ khi Alexandre Fleming lần đầu phát

hiện ra chất ức chế vi khuẩn penicillin từ vi nấm Penicillium notatum và được Ernst

Boris Chain và Howard Walter Florey tinh khiết hóa thành chế phẩm để dùng trong

điều trị (1941) Khi đó người ta định nghĩa "Kháng sinh là chất do vi nấm hoặc vi

khuẩn tạo ra, hoặc do bán tổng hợp, tổng hợp, có tác dụng điều trị đặc hiệu với liều thấp do ức chế một số quá trình sống của vi sinh vật và đơn bào mà không ảnh hưởng tới vật chủ” (Turpin, Velu 1857)

Trong các chủng Penicillium được phân lập từ đất nông nghiệp ở Bắc Iran thì

P.aurantiogriseum là một trong những loài có hoạt tính mạnh nhất Bên cạnh đó, các

chủng khác bao gồm P.viridicatum, P.citrinum và P.waksmanii cũng cho thấy hoạt động kháng vi sinh vật đáng kể đối với Candida albicans, Bacillus subtilis, S.aureus,

Salmonella typhi và E.coli [17]

Một số loại nấm thuộc chi Aspergillus cũng được biết đến với khả năng sản xuất các

chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học khác nhau cho ngành công nghiệp dược phẩm, chẳng hạn như acid terrecyclic A thể hiện hoạt tính chống ung thư và kháng khuẩn

[15, 29]; lovastatin có tác dụng giảm cholesterol được sản xuất bởi nấm Aspergillus

terreus [14]; echinocandin B được sản xuất bởi A.nidulans có tác dụng kháng

nấm[11]; fumagillin là chất chuyển hóa của A.fumigatus thể hiện tính kháng ký sinh trùng [26] Một số chủng Aspergillus cũng thể hoạt tính kháng khuẩn chống lại

5

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), E.coli, Enterococcus faecalis

kháng vancomycin và Candida albicans [27]

Nghiên cứu phân lập và sàng lọc vi nấm từ đất của các vùng khác nhau ở Punjab, Ấn

Độ thu được hợp chất mới 7methoxy2,2dimethyl4octa4',6'dienyl2H napthalene-1-one từ Penicillium sp thể hiện tác dụng kháng vi sinh vật đáng kể trên các chủng Staphylococcus aureus, S.epidermidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella

-typhimurium, Shigella flexneri, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans [21]

Sự gia tăng đáng kể hiện tượng đề kháng kháng sinh đã dẫn đến việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ vi sinh vật Đất được coi là một trong những môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật [16] Vì vậy, các nhà khoa học đã tận

dụng đất là một nguồn để phân lập ra các vi sinh vật hữu ích

2 TỔNG QUAN VỀ HỆ VI NẤM SỢI TRONG ĐẤT

2.1 Nghiên cứu trên thế giới

Khoa học về các vi sinh vật có trong đất đã nghiên cứu và phân loại vi sinh vật dựa trên khả năng cố định đạm và các phản ứng sinh hóa Trong quá trình nghiên cứu, các loại vi khuẩn, nấm men và nấm mốc đã được phân lập và mô tả

Admetz (1886) là người tiên phong trong việc nghiên cứu vi nấm có trong đất Ông

đã phân lập và đặt tên cho 04 loài nấm men và 11 loài nấm mốc bao gồm cả

Aspergillus glaucus, Penicillium glaucus và Mucor stolonifer

Có 19 loài được tìm thấy trong đất nông nghiệp và 28 loài trong đất vườn ở Bắc 24

Parganas, Tây Bengal Trong đất nông nghiệp, vi nấm chủ yếu là Aspergillus niger,

Rhizopus oryzae và Penicillium expansum Vi nấm chủ yếu trong đất vườn là Aspergillus niger và Fusarium moniliforme Nghiên cứu của Simpson chỉ ra rằng đất

vườn có nhiều vi nấm hơn so với đất nông nghiệp [25] Tại Hà Lan, Oudermans và

Koning phân lập được 45 loài vi nấm bao gồm cả Trichoderma koningi và Mucor

racemosus [30]

Mahmood Khalid và cộng sự phân lập được 42 loài nấm thuộc 16 chi từ mẫu đất của

22 địa phương thuộc Pakistan gồm Penicillium, Aspergillus, Monocillium, Fusarium,

Waksman định danh được hơn 200 loài nấm từ 25 nơi của nước Mỹ Trong số đó, có

4 chi phổ biến là Aspergillus, Mucor, Penicillium and Trichoderma sống rải rác nhiều nơi Đặc biệt, Mucor và Penicillium thường xuất hiện trong đất ở vùng ôn đới hay vùng có khí hậu mát mẻ, Aspergillus có trong đất ở vùng nhiệt đới, Trichoderma xuất

hiện trong đất có tính chất ẩm ướt hay có tính acid [30]

Penicillium, Aspergillus, Trichoderma và Fusarium là các chủng nấm được tìm thấy

nhiều nhất từ các độ cao khác nhau của vùng Iyidere-Ikizdere ở Rize, Thổ Nhĩ Kỳ Các chủng vi nấm này được phân lập từ 40 mẫu đất ở độ sâu 25 cm bằng kỹ thuật pha loãng mẫu đất [20]

Có 61 chủng nấm sợi bao gồm Alternaria, Aspergillus clavatus, A.fumigates,

A.flavus, A.glaucus, A.niger, A.terrus, Fusarium, Mucor, Paecilomyces crustaceus, Penicillum, Phoma glomerata, Phoma, Rhizopus, Trichoderma được phân lập tại

vùng đất trầm tích của một dòng sông tại Ấn Độ [27]

2.2 Nghiên cứu trong nước

Vi nấm phân bố rộng rãi trên nhiều loại cơ chất tự nhiên, phổ biến ở khắp nơi trên trái đất Các nghiên cứu về hệ vi nấm trong đất tại Việt Nam nói chung và tại Tp.HCM nói riêng còn tương đối ít, chủ yếu tập trung ở các vùng đất thuộc rừng ngập mặn Bên cạnh đó, lợi ích từ vi nấm phân lập từ đất của các nghiên cứu trong nước chủ yếu

về khả năng thể hiện hoạt tính sinh học chống lại bệnh hại ở cây trồng

Theo nghiên cứu của Trần Thị Minh Định và Trần Thị Thanh Thủy phân lập được 58 chủng nấm sợi từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ Trong đó, tuyển chọn được 01 chủng

Aspergillus terreus thể hiện hoạt tính kháng mạnh trên vi khuẩn thử nghiệm gồm Bacillus subtilis và Escherichia coli Đồng thời, nhóm tác giả cũng tiến hành khảo

sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được hợp chất có tính kháng sinh từ A.terreus [3]

7

Cũng tại rừng ngập mặn Cần Giờ, theo nghiên cứu của Võ Thị Bích Viên, 476 chủng

vi nấm sợi được phân lập từ các mẫu lá vàng trên cành, lá mục, cành khô, cành mục,

đất mặt, đất sâu 05 – 10 cm; trong đó, có 98 chủng Aspergillus và 168 chủng

Penicillium Kết quả nghiên cứu cho thấy vi nấm sợi có mặt ở hầu hết các cơ chất của

rừng ngập mặn nhưng đất mặt là cơ chất có nhiều chủng nấm nhất Các chủng vi nấm

thể hiện hoạt tính kháng Bacillus subtilis tốt chủ yếu thuộc chi Penicillium [10] Một

nghiên cứu khác từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ của tác giả Nguyễn Thiện Phú và Vũ Thị Phương phân lập được 120 chủng vi nấm sợi Nhóm tác giả tuyển chọn được 6 chủng vi nấm sợi có khả năng sản xuất lovastatin Chủng có hoạt tính tốt nhất được

định danh bằng cách giải trình tự 28S rRNA cho kết quả thuộc loài Aspergillus terreus [8]

Báo cáo của Phạm Thị Ngọc Lan và Hoàng Dương Thu Hương có đề cập đến nhóm

vi nấm sợi hòa tan phosphate vô cơ được phân lập từ đất rừng ngập mặn Thừa Thiên – Huế nhằm cải thiện công tác ươm trồng phục hồi và phát triển hệ sinh thái rừng ngập mặn Từ 18 mẫu đất đã phân lập được 164 chủng vi nấm sợi có khả năng hòa tan phosphate vô cơ, trong đó 02 chủng có khả năng hòa tan phosphate vô cơ mạnh

nhất được định danh đến tên loài đó là Aspergillus oryzae và Aspergillus japonicus

[6]

Có 18 dòng nấm Trichoderma được phân lập từ 26 mẫu đất trồng cây lương thực, cây

công nghiệp và cây ăn quả thuộc các tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp.HCM Đây là các chủng nấm có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào như amylase, protease và có thể khai thác tiềm năng như một tác nhân sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng tại địa phương [5]

Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hà cho kết quả phân lập được

11 chủng nấm sợi từ đất thuộc quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ cho hoạt tính

kháng E.coli và B.subtilis Các chủng vi nấm này gồm Penicillium, Aspergillus,

Fusarium, Trichoderma và Alternaria; trong đó, chủng nấm cho hoạt tính kháng

khuẩn tốt nhất là Penicillium pinophilum và Fusarium solani [4].

8

Một nghiên cứu tại Bình Dương của tác giả Đỗ Lương Ngọc Châu và Nguyễn Anh

Dũng thu thập được các chủng Trichoderma từ các mẫu thân, lá cành mục và đất mặt tại các vùng nông nghiệp Thử nghiệm khả năng đối kháng của 08 chủng Trichoderma spp với 02 chủng nấm Sclerotium spp gây bệnh thối thân, thối lá trên lan Mokara và

Dendrobium đều cho kết quả tốt [1]

Trong số 120 chủng vi nấm sợi phân lập từ đất ở 15 địa điểm khác nhau thuộc các huyện Phú Vang, Hương Trà và thành phố Huế, tác giả Phạm Thị Ngọc Lan và Võ Thị Thanh Nhàn đã tuyển chọn được 02 chủng vi nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp

chitinase gồm Aspergillus fumigatus và Aspergillus oryzae [7]

Như vậy, đa phần các nghiên cứu trong nước về vi nấm từ đất đều phân lập được các

chủng vi nấm sợi chủ yếu thuộc các chi gồm Aspergillus, Penicillium và

Trichoderma Các chủng nấm này đều thể hiện hoạt tính sinh học như khả năng kháng

vi khuẩn và vi nấm gây bệnh hại ở cây trồng hoặc có khả năng sản xuất các chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học tốt

9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT

1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi nấm sợi phân lập từ đất thuộc Tp.HCM Loại đất được chọn là đất trồng cây cổ thụ ở công viên, nơi có bóng râm mát

- Thời gian lấy mẫu: Tháng 07/2018

- Địa điểm lấy mẫu:

+ Công viên Tao Đàn, 55C Nguyễn Thị Minh Khai, P.Bến Thành, Quận 1;

+ Công viên Gia Định, đường Hoàng Minh Giám, P.9, Quận Phú Nhuận;

+ Công viên Hoàng Văn Thụ, đường Hoàng Văn Thụ, P.2, Quận Tân Bình

1.2 Dung môi – hóa chất

Dung môi, hóa chất, thuốc thử đạt độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng:

- Hóa chất: acid lactic, phenol (tinh thể), glycerol do Trung Quốc sản xuất

1.3 Vi sinh vật thử nghiệm

Vi sinh vật thử nghiệm bao gồm:

- Vi khuẩn: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Streptococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC 43300

- Vi nấm: Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata PK12B, Candida

tropicalis PK12C

Nơi cung cấp chủng vi sinh vật: Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Tp.HCM (41 Đinh Tiên Hoàng, P.Bến Nghé, Quận 1, Tp.HCM)

1.4 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường Sabouraud (SDA)

- Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

- Môi trường Tryptic Soy Agar (TSA)

- Môi trường Czapeck Dox

- Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA)

- Môi trường Potato Carrot Agar (PCA)

10

- Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) và Chloramphenicol 0,1%

- Môi trường cao nấm men

- Môi trường hỗn hợp nước chiết ngô và cao nấm men

- Nước chiết ngô [33]

1.5 Trang thiết bị

- Lò hấp vô trùng Hiyayma HV-110

- Tủ cấy vô trùngESCO AVC - 4D1

- Máy lắc ổn nhiệtIKA KS 4000i control

- Máy siêu âmElmasonic S120

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss microsopy Gmbtt

- Tủ ấm Memmert INB - 5000

- Tủ sấy Memmert unB - 5000

- Tủ âm SANYO SR - U19JN

- Tủ lạnh SANYO SR - U19JN

- Cân kỹ thuật Sartorius TE412

- Máy vortex Labnet SO200 - 23V - EU

Các thí nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh – Ký sinh trùng, Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành, 300A Nguyễn Tất Thành, P.13 Q.4, Tp.HCM

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phân lập vi nấm từ mẫu đất

2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu đất

Đất được lấy ở độ sâu 05 – 10 cm bằng dụng cụ sạch và đặt trong petri vô trùng Đất được rây qua lưới kích thước lỗ 01 mm để loại bỏ đá sỏi Mẫu được xử lý ngay hoặc được bảo quản ở 40C không quá 48h

Pha loãng mẫu đất với dung dịch NaCl 0,9% đến nồng độ đạt yêu cầu:

- Cần 05 ống nghiệm, mỗi ống 09 ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, đánh số từ 01 đến 05

- Cho 1,0 g đất vào ống nghiệm 01, lắc kỹ (độ pha loãng 01/10), để lắng các phân tử lớn và nặng

11

- Hút 1,0 ml dung dịch 01 cho vào ống nghiệm số 02

- Lặp lại bước trên cho đến ống 05 để có độ pha loãng từ 10-2 đến 10-5 (lắc kỹ mỗi ống trước khi chuyển dịch pha loãng vào ống mới và thay pipet ở mỗi độ pha loãng)

- Hút 0,1 ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng, cho lên mặt thạch PDA chứa chloramphenicol 0,1% để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Dùng que tam giác

vô trùng trải dịch đều khắp mặt thạch

- Ủ ở nhiệt độ phòng

2.1.2 Phân lập vi nấm

Các đĩa thạch đã trải mẫu đất được ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của

vi nấm trong 03 – 07 ngày Thời gian theo dõi có thể lâu hơn nếu tốc độ sinh trưởng của vi nấm chậm

Thu sợi khuẩn ty và cấy chuyển sang các môi trường chứa chất dinh dưỡng thích hợp như môi trường thạch khoai tây đường (PDA), thạch Sabouraud (SDA) Thực hiện cấy chuyền vi nấm nhiều lần để tinh sạch chủng Tùy theo tốc độ phát triển của vi nấm, tiến hành ủ mẫu ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của vi nấm trong khoảng 01 – 02 tuần hoặc lâu hơn Kiểm tra độ tinh sạch của chủng bằng cách quan sát sự phát triển đồng nhất của khóm nấm và đặc điểm hiển vi Đánh giá tốc độ phát triển của vi nấm trên các loại môi trường khác nhau để sơ bộ xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

Các chủng nấm thu được từ các mẫu đất, được kí hiệu dựa trên nơi lấy mẫu (T: công viên Tao Đàn, G: công viên Gia Định, H: công viên Hoàng Văn Thụ), số mẫu (1, 2,

3…)

2.2 Định danh vi nấm sợi

Tên khoa học của vi nấm được xác định đến chi Vi nấm sợi được tiến hành định danh dựa trên hình thái khóm nấm và đặc điểm hiển vi Quá trình định danh được thực hiện với các bước cơ bản sau:

Bước 1: Nuôi cấy vi nấm

- Cấy trên đĩa peptri để đo đường kính và các đặc điểm hình thái của khóm nấm, theo dõi sự phát triển, sự thay đổi màu sắc, hình dạng của khóm nấm theo thời gian

12

- Cấy lên lame để quan sát hình thể hiển vi như đặc điểm sợi nấm, bào tử

Bước 2: Quan sát khóm nấm Thời gian tiến hành trung bình từ 03 - 15 ngày Đối với

số chủng nấm phát triển chậm hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính, thời gian quan sát

có thể kéo dài hơn Quan sát các đặc điểm sau:

- Đường kính khóm nấm để đánh giá tốc độ phát triển

- Màu sắc và sự thay đổi màu sắc của khóm nấm

- Đặc điểm sắc tố được tiết vào môi trường nuôi cấy

- Đặc điểm giọt tiết trên bề mặt khóm nấm

- Các đặc điểm khác: mùi, cấu tử đặc biệt…

Bước 3: Quan sát đặc điểm vi nấm dưới kính hiển vi quang học

Khi nấm trưởng thành, tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue (LPCB) để quan sát đặc điểm sợi nấm, bào tử, cơ quan sinh sản… Hoặc tiến hành cấy trực tiếp trên lame để quan sát

Bước 4: Dựa vào các khóa phân loại vi nấm để định danh chủng nấm phân lập được

2.3 Thử nghiệm khảo sát tính kháng khuẩn và kháng nấm Candida của chất

biến dưỡng từ vi nấm

2.3.1 Hoạt hóa vi sinh vật thử nghiệm

Vi khuẩn thử nghiệm được cấy hoạt hóa trên môi trường TSA 24h trước khi tiến hành thử nghiệm Sau đó, vi khuẩn được chuyển sang môi trường TSB để tăng sinh trong vòng 4h Pha loãng môi trường TSB bằng nước muối sinh lý đến mật độ tương đương

108 tế bào/ml (so độ đục với ống Mc Farland 0,5)

Vi nấm Candida thử nghiệm được cấy hoạt hóa trên môi trường SDA 48h trước khi

tiến hành thử nghiệm Pha loãng vi nấm vào nước muối sinh lý và điều chỉnh đến mật

độ tương đương 106 tế bào/ml (so độ đục với ống Mc Farland 0,5)

Vi nấm đã phân lập được hoạt hóa trên môi trường dinh dưỡng phù hợp Sau 03 – 07 ngày, sử dụng dụng cụ để lấy một diện tích khóm nấm nhất định và chuyển sang 02 môi trường dinh dưỡng gồm:

- Môi trường 1: cao chiết nấm men

- Môi trường 2: hỗn hợp nước chiết ngô và cao chiết nấm men

13

Sau thời gian nuôi cấy 10 ngày, tiến hành siêu âm dịch nuôi có chứa vi nấm 30 phút

và thu dịch để thực hiện khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật

2.3.2 Phương pháp khảo sát tính kháng khuẩn – kháng nấm Candida

Nguyên tắc

Những chất biến dưỡng được vi nấm sản xuất và tiết vào môi trường nuôi cấy Các hợp chất có tính kháng khuẩn/kháng nấm sẽ lấn át sự phát triển của vi sinh vật thử nghiệm

Phương pháp đục lỗ

Môi trường thử nghiệm là thạch đĩa MHA dày 04 mm Sử dụng tăm bông vô trùng

để thấm huyền trọc vi sinh vật đã pha loãng và trải đều lên bề mặt thạch Sử dụng dụng cụ đục lỗ để tạo giếng có đường kính 06 mm Nhỏ 70 µl dịch nuôi vi nấm vào giếng Đặt đĩa thử nghiệm vào ngăn mát tủ lạnh 2h để chất biến dưỡng của vi nấm khuếch tán vào môi trường thạch Sau đó, đặt đĩa thử nghiệm vào tủ ấm 37°C Tiến

hành đọc kết quả sau 24h đối với vi khuẩn và sau 48h đối với vi nấm Candida

Thực hiện tương tự với mẫu chứng âm là môi trường nuôi cấy vi nấm gồm:

- Môi trường 1: cao chiết nấm men

- Môi trường 2: hỗn hợp nước chiết ngô và cao chiết nấm men

Thử nghiệm được lặp lại 3 lần

Kết quả

Hoạt tính kháng khuẩn/kháng nấm được xác định theo đường kính vòng ức chế (mm)

G32, G41, G48, G55, G57, G58;

H12, H16, H23, H31, H35, H42, H43, H44, H54, H55, H56, H59

2 Aspergillus 17 T14, T111, T24, T217, T218;

G13, G21, G24, G31, G33, G42, G43, G51, G52, G53, G54;

H14, H17, H18, H19, H21, H24, H34, H36, H37, H38, H51, H52, H53, H510

không đủ cơ sở để định danh

Hình 3.1 Một số mẫu Penicillium

Các mẫu Penicillium có đặc điểm khóm nấm khá đa dạng Trên môi trường PDA, đa

phần các mẫu cho khóm có màu xanh lục xám hoặc xanh lục đậm, rìa khóm màu

trắng thường gặp ở Penicillium; T22, T25, T28, T36, T37, T38, T39, T310, T314,

16

T33, T34, T311 có khóm dạng bông hoặc bột, màu trắng Mẫu T22, T25 có nhiều giọt tiết màu vàng chuyển dần sang nâu hoặc đen; T11, T16, T17, T18, G23 có nhiều giọt tiết không màu trên mặt khóm; G55, G57, G58, H23, H59 có mặt trái màu đỏ

cam đến đỏ 37 mẫu này có đặc điểm hiển vi điển hình của Penicillium với cấu trúc

mang bào tử dạng chổi

17

cấu trúc mang bào tử có 1 – 2 lớp thể bình, bào tử màu đen có gai; 2 mẫu (G42, G43)

có đặc điểm tương tự A.flavus với khóm có màu vàng lục đặc trưng và cuống bào tử

có gai; 3 mẫu (T24, T217, T218) với cách đính bào tử và màu khóm đặc trưng của

A.fumigatus; mẫu G53 có xuất hiện tế bào Hull hình móng ngựa

Mẫu Paecilomyces G46 cho khóm màu vàng trên môi trường PDA và đặc điểm hiển

vi tương tự với Penicillium nhưng thể bình phình ở đáy, hẹp dần ở đỉnh tạo cổ bình

thuôn dài Ngoài ra, G46 còn cho bào tử bao dày

Hình 3.3 Paecilomyces sp G46

06 chủng Trichoderma sp T35, T411, G12, G34, G56 và H32 được phân lập có khóm

mịn như len, màu trắng, sau xuất hiện màu vàng hoặc xanh lá Đặc điểm hiển vi đặc trưng với thể bình phình ở đáy, thường 03 thể bình mọc trên một cuống, bào tử hình cầu, màu xanh, đính thành chùm ở đầu thể bình

18

Hình 3.4 Trichoderma sp T411

03 chủng Mucor sp T13, G23 và H11 có khóm dạng bông, nhô lên cao, màu xám

nhạt chuyển xám đen trên PDA Có 02 dạng bào tử:

- Bào tử túi: cuống mang bào tử phình ở đầu Bào tử có dạng hình cầu, trơn nhẵn, nằm trong một bọc tròn gọi là túi

- Bào tử bao dày: hình tròn hay oval, dạng riêng lẻ hay dạng chuỗi, xuất hiện ở giữa hoặc đính đầu sợi nấm

Hình 3.5 Mucor sp T13

02 chủng Fusarium G35, H22 có khóm mịn như nhung, màu trắng chuyển dần sang

hồng nhạt trên PDA Có 03 dạng bào tử:

- Bào tử đính lớn: dạng lưỡi liềm, 04 – 06 tế bào, số lượng ít

- Bào tử đính nhỏ: dạng bầu dục, 01 – 02 tế bào, số lượng nhiều

- Bào tử bao dày: đính giữa sợi nấm

19

Khóm nấm trên PDA Bào tử đính lớn và bào tử đính nhỏ

(1000x) Bào tử bao dày (400x)

Hình 3.6 Fusarium H22

Chủng Phoma T23 có khóm dạng da, màu xám, dạng bông ở trung tâm, có hạt màu

cam và đen xuất hiện xen kẽ trên mặt khóm, có giọt tiết màu cam Có 02 dạng bào tử:

- Thể quả: hình cầu hoặc bầu dục, chứa nhiều bào tử hình đa giác gồm 01 tế bào Bào

tử thoát ra ngoài nhờ lỗ trên thể quả

- Bào tử dao dày: hình bầu dục, xuất hiện ở đầu sợi nấm

Khóm nấm trên

PDA Bào tử bao dày(1000x) Thể quả (1000x) Bào tử (1000x)

Hình 3.7 Phoma sp T23

Mẫu Curvularia G26 cho khóm nấm màu nâu, có dạng bông mịn Bào tử đính lớn

màu nâu, có 04 – 05 tế bào với tế bào ở giữa sậm màu hơn và phát triển rộng hơn các

tế bào khác làm bào tử có dạng cong Bào tử đính thành chùm ở cuống bào tử

20

Hình 3.8 Curvularia sp G26

Mẫu Cladosporium H57 có khóm nấm nhăn, có dạng mịn như nhung, màu rêu đen

Bào tử màu nâu, hình bầu dục, có sẹo ở 2 đầu, đính thành chuỗi phân nhánh Bào tử

ở gốc nhánh thường lớn và có dạng hình khiên

Hình 3.9 Cladosporium sp H57

21

1.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của chất biến dưỡng từ vi nấm

Thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm Candida được tiến hành

Nhận xét: Có 27/103 chủng vi nấm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn Trong đó:

- Có 10 chủng Penicillium thể hiện hoạt tính kháng khuẩn Chủng T18, G55, G58, H23 và H43 cho hoạt tính kháng S.aureus tốt với vòng ức chế 15 – 26 mm, nổi bật là

chủng H23 Chỉ có 03 chủng gồm T18, T33 và H43 cho hoạt tính kháng MRSA tương

đối tốt với vòng ức chế 12 – 13 mm Các chủng Penicillium cho hoạt tính kháng vi khuẩn Gram âm yếu với chủng T216 kháng E.coli với vòng ức chế 11 mm và chủng H43 kháng P.aeruginosa với vòng ức chế 08 mm Như vậy, các chủng Penicillum

chủ yếu thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương Tính kháng khuẩn của các

chủng Penicillium thể hiện không đồng nhất khi nuôi trên 2 loại môi trường

23

- Có 11 chủng Aspergillus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, nổi trội là chủng G51 và H13 Riêng chủng G52 chỉ thể hiện hoạt tính kháng đối với S.aureus và MRSA; G53 chỉ thể hiện hoạt tính kháng trên vi khuẩn Gram dương - đặc biệt là đối với S.feacalis với vòng ức chế 20 mm; G42 và G54 thể hiện hoạt tính kháng 04/05 loài vi khuẩn thử nghiệm, đặc biệt là trên vi khuẩn Gram âm là E.coli và P.seudomonas với vòng

ức chế trong khoảng 11 – 15 mm Kết quả cho thấy đa phần các chủng Aspergillus

được nuôi trong hỗn hợp nước chiết ngô và cao chiết nấm men cho hoạt tính kháng khuẩn rộng và tốt hơn

- Có 03 chủng Trichoderma thể hiện hoạt tính kháng khuẩn Trong đó, chủng T35 cho tác động kháng 04/05 loài vi khuẩn thử nghiệm, đặc biệt là trên S.feacalis và

S.aureus với vòng ức chế lần lượt là 16 và 20 mm Các chủng Trichoderma chủ yếu

thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương, chỉ riêng chủng T35 cho tác động

kháng yếu đối với vi khuẩn Gram âm P.aeruginosa Kết quả cho thấy Trichoderma

được nuôi trong môi trường cao chiết nấm men lại cho hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn

- Có 03 chủng chưa định danh được thể hiện hoạt tính kháng khuẩn Trong đó, chủng

T212 cho hoạt tính kháng khuẩn tốt trên E.coli và P.aeruginosa với vòng ức chế 20

mm Chủng H14 và H34 cho tác động yếu trên vi khuẩn Gram dương với vòng ức chế 07 – 11 mm

Như vậy, các chủng thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram âm đáng kể gồm các

09/11 chủng Aspergillus và 01 chủng chưa định danh T212; các chủng cho tác động yếu đến trung bình gồm 02 chủng Penicillum và 01 chủng Trichoderma Cả 27 chủng

vi nấm đều thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương đối với vi khuẩn S.feacalis hoặc S.aureus hoặc cả hai Hoạt tính kháng MRSA xuất hiện chủ yếu ở 10/11 chủng

Aspergillus, rải rác ở 03 chủng Penicillium, 01 chủng Trichoderma và 01 chủng chưa

định danh H34

3.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm Candida

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm Candida của chất biến dưỡng do các chủng vi

nấm sản xuất được ghi nhận trong bảng 3.3