Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển và phân tích một số vitamin trong nấm linh chi th04 trên môi trường thạch, lỏng

Khảo sát sự tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 trong môi trường lỏng trên các môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau .... Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh

664 LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

giảng viên TS Lê Văn Điệp đã giao đề tài, hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt

kiến thức kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt

nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Vinh, ban chủ

nhiệm khoa Hóa học, cùng các thầy cô giáo và các cô ở phòng thí nghiệm khoa Hóa

học đã hết lòng tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này

Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Trần Đình Thắng - Phó

trưởng khoa Hóa Học, ThS Hoàng Văn Trung - giảng viên khoa Hóa học đã tạo

điều kiện, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành đồ án

tốt nghiệp

Một lần nữa tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn sinh viên lớp

50K- Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã

động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Vinh, tháng 12 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Vinh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích 2

3 Yêu cầu 2

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Nấm linh chi 3

1.1.1 Khái quát chung 3

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) 4

1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý của nấm Linh chi 5

1.1.1.3 Chu trình sống của nấm Linh chi 8

1.1.1.4 Vị trí phân loại 8

1.1.2 Thành phần hóa học của nấm Linh chi 8

1.1.3 Giới thiệu sơ lược về hoạt chất có trong nấm Linh chi 10

1.1.3.1 Ganoderma polysaccarit (GLPs) 10

1.1.3.2 Axit ganoderic 11

1.1.3.3 Ganoderma Adenosin 12

1.1.3.4 Hợp chất Saponin 12

1.1.3.5 Germanium hữu cơ 13

1.1.4 Khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi 13

1.1.4.1 Đối với các bệnh tim mạch 14

1.1.4.2 Đối với các bệnh hô hấp 14

1.1.4.3 Hiệu quả chống ung thư 15

1.1.4.4 Khả năng kháng HIV 15

1.1.4.5 Khả năng chống oxy hóa 15

1.1.5 Một số ứng dụng lâm sàng 16

1.1.6 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Linh chi trên thế giới và ở Việt Nam 16

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Linh chi trên thế giới 16

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Linh chi ở Việt Nam 17

1.1.7 Nấm Linh chi TH04 18

1.2 Vitamin 19

1.2.1 Đại cương về vitamin 19

1.2.2 Sơ lược về vitamin E, C 20

1.2.2.1 Vitamin E (tocopherol) 20

1.2.2.2 Vitamin C 21

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 22

1.3.1 Cơ sở lý thuyết 22

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 23

1.3.3 Phân loại 23

1.3.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC 24

1.3.5 Các đại lượng đặc trưng của HPLC 26

1.3.6 Cách đo HPLC 26

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 27

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 27

2.2 Vật liệu nghiên cứu 27

2.2.1 Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển của nấm Linh chi TH04 27

2.2.2 Phân tích một số vitamin trong nấm Linh chi TH04 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phân lập nấm Linh chi TH04 30

2.3.2 Quan sát hình thái sợi nấm Linh chi TH04 31

2.3.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường thạch 31

2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng 31

2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 31

2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 32

2.3.4 Khảo sát sự tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 trong môi trường lỏng trên các môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau 32

2.3.4.1 Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng 32

2.3.4.2 Khảo sát hàm lượng khoáng ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng 32

2.3.4.3 Khảo sát hàm lượng glucose ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng 33

2.3.5 Phân tích vitamin E trong nấm Linh chi TH04 34

2.3.5.1 Sơ đồ xử lý chất chuẩn 34

2.3.5.2 Cách tiến hành 35

2.3.5.3 Điều kiện sắc ký 37

2.3.6 Phân tích vitamin C trong nấm Linh chi TH04 37

2.3.6.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 37

2.3.6.2 Chuẩn bị mẫu 38

2.3.6.3 Điều kiện sắc ký 38

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Phân lập nấm Linh chi TH04 thu thập tại Hà Tĩnh 39

3.2 Hình thái sợi nấm Linh chi TH04 39

3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nấm Linh chi TH04 trên môi trường thạch 40

3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 40

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 41

3.3.3 Ảnh hưởng của pH 43

3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trong môi trường lỏng 44

3.4.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 44

3.4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng 46

3.4.2.1 Hàm lượng MgSO4 46

3.4.2.2 Hàm lượng KH2PO4 47

3.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng glucose 49

3.5 Phân tích vitamin E trong nấm Linh chi TH04 50

3.5.1 Xây dựng đường chuẩn vitamin E 50

3.5.2 Xác định hàm lượng vitamin E trong nấm Linh chi TH04 52

3.6 Phân tích vitamin C trong nấm Linh chi TH04 54

3.6.2 Xác định hàm lượng vitamin C trong nấm Linh chi TH04 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Các hoạt chất triterpenoit có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi

(Ganoderma lucidum) 12

Bảng 1.2: Lục bảo Linh chi và tác dụng dược liệu 14

Bảng 2.1: Hàm lượng MgSO4 vào môi trường 33

Bảng 2.2: Hàm lượng KH2PO4 vào môi trường 33

Bảng 2.3: Hàm lượng glucose vào môi trường 34

Bảng 3.1: Tốc độ lan của hệ sợi trên 3 loại môi trường khác nhau (mm) 40

Bảng 3.2: Tốc độ lan của hệ sợi trên các giá trị nhiệt độ khác nhau (mm) 41

Bảng 3.3: Tốc độ lan của hệ sợi trên các giá trị pH khác nhau (mm) 43

Bảng 3.4: Khối lượng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên 3 loại môi trường khác nhau (g/50ml) 44

Bảng 3.5: Khối lượng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên 4 nghiệm thức khác nhau (g/50ml) 46

Bảng 3.6: Khối lượng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên 4 nghiệm thức khác nhau (g/50ml) 47

Bảng 3.7 Khối lượng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên 5 nghiệm thức khác nhau (g/50ml) 49

Bảng 3.8: Diện tích pic của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn 51

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Một số hình ảnh về nấm Linh chi 4

Hình 1.2: Nấm Linh chi 4

Hình 1.3: Chu trình sống của nấm Linh chi [5] 8

Hình 1.4: Hình ảnh nấm Linh chi TH04 19

Hình 1.5: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 24

Hình 3.1: Giống gốc phân lập trên đĩa peptri 39

Hình 3.2: Hình thái hệ sợi nấm Linh chi TH04 39

Hình 3.3: Hệ sợi nấm Linh chi TH04 sau 4 ngày nuôi cấy 41

Hình 3.4: Hệ sợi nấm Linh chi TH04 sau 4 ngày nuôi cấy 42

Hình 3.5: Hệ sợi nấm Linh chi TH04 sau 3 ngày nuôi cấy 44

Hình 3.6: Sinh khối nấm Linh chi TH04 sau 9 ngày nuôi cấy 45

Hình 3.7: Sinh khối nấm linh chi TH04 sau 9 ngày nuôi cấy 47

Hình 3.8: Sinh khối nấm Linh chi sau 9 ngày nuôi cấy 48

Hình 3.9 Sinh khối nấm Linh chi sau 9 ngày nuôi cấy 50

Hình 3.10: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được và nồng độ các chuẩn vitamin E 51

Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn vitamin E có nồng độ 10ppm 54

Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn vitamin E có nồng độ 40ppm 54

Hình 3.13: Sắc đồ vitamin E cuả nấm Linh chi TH04 544 Hình 3.14: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được và nồng độ các chuẩn vitamin C 555

Hình 3.15: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm 546 Hình 3.16: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 50ppm 546

Hình 3.17: Sắc đồ vitamin C của nấm Linh chi TH04Error! Bookmark not defined.7

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nấm Linh chi TH04 trên môi trường thạch 40 Biểu đồ 3.2: Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nấm Linh chi TH04 trên môi trường thạch 42 Biểu đồ 3.3: pH ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nấm Linh chi TH04 trên môi trường thạch 43 Biểu đồ 3.4: Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng 45 Biểu đồ 3.5: Hàm lượng MgSO4 ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng 46 Biểu đồ 3.6: Hàm lượng KH2PO4 ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng 48 Biểu đồ 3.7: Hàm lượng glucose ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng 49

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc Các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời Sách “Thần nông bản thảo” đã nói: “Linh chi là thuốc kết tinh được cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm sắc nên có thể giữ sức khỏe cho các bậc đế vương” Đến đời Minh trong sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân đã phân nấm Linh chi thành “Lục bảo Linh chi” theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím và khái quát tác dụng trị liệu của Linh chi theo từng màu Nói chung các loại Linh chi đều có tính bình, không độc, có tác dụng chữa trị tốt đối với những bệnh về tim mạch, phổi, gan…

Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan, suy nhược thần kinh…[3,9] Chính vì thế, việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi đang dần được chú trọng

Hiện nay ở Việt Nam nguồn dược liệu Linh chi trên thị trường chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài trong đó chủ yếu là từ Trung Quốc, Hàn Quốc và một số được nuôi trồng trong nước với giống được nhập ngoại và phân lập ở khu vực rừng núi Lâm Đồng và Tây Bắc Bộ nước ta Trong khi nguồn nấm Linh chi ở ngoài tự nhiên ngày càng cạn kiệt do khai thác để phục vụ cho nhu cầu tăng cường sức khỏe

và chữa bệnh cùng với nhu cầu xuất khẩu

Mặt khác Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa và nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào tạo điều kiện hích hợp cho nghề trồng nấm quanh năm Việc nuôi trồng cũng như thu hoạch nấm Linh chi tốn khá nhiều thời gian Chính vì thế, việc nghiên cứu để tìm ra một phương pháp hữu hiệu nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất nấm Linh chi là một việc hết sức cần thiết để phục vụ nhu cầu sử dụng cho con người

Vitamin là phân tử hữu cơ cần thiết cho hoạt động chuyển hóa bình thường của

cơ thể người Mặc dù các vitamin hoạt động với số lượng rất nhỏ và không tạo

ra năng lượng nhưng chúng vô cùng cần thiết cho quá trình hoạt động và phát triển của tổ chức Vitamin đóng vai trò như chất xúc tác cho các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể Nếu thiếu vitamin, các phản ứng này sẽ chậm lại và quá trình chuyển hóa sẽ bị rối loạn Do đó, việc phân tích một số vitamin trong nấm là điều rất quan trọng

Xuất phát từ tình hình thực tế trên và được sự đồng ý của thầy hướng dẫn, tôi

quyết định thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển và phân tích một số vitamin trong nấm Linh chi TH04 trên môi trường thạch, lỏng”

2 Mục đích

 Phân lập nấm Linh chi TH04 thu thập tại Hà Tĩnh

 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nầm Linh chi

TH04 trên môi trường thạch

 Khảo sát sự tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 trong môi trường lỏng trên các môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau

 Phân tích một số vitamin trong nấm Linh chi TH04

3 Yêu cầu

 Phân lập nấm Linh chi TH04 thu thập tại Hà Tĩnh

 Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nấm Linh chi TH04 trên môi trường thạch

 Khảo sát yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nấm Linh chi TH04 trên môi trường thạch

 Khảo sát yếu tố pH ảnh hưởng đến tốc độ lan của hệ sợi nấm Linh chi TH04 trên môi trường thạch

 Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng

 Khảo sát hàm lượng khoáng ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng

 Khảo sát hàm lượng glucose ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối của nấm Linh chi TH04 trên môi trường lỏng

 Phân tích một số thành phần trong nấm Linh chi TH04: vitamin C, E

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 Nấm Linh chi

1.1.1 Khái quát chung

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, người miền Bắc còn gọi

là nấm lim Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung…

Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất xơ Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt hoặc thận Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ đậm hoặc nâu đen Mặt dưới phẳng, có nhiều lỗ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử Cuống nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng

Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách đây hơn 4000 năm Trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi” thời nhà Minh với các khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu

Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh Chi có 6 màu khác nhau:

+ Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi là Hồng chi)

+ Hắc chi (Linh chi đen còn gọi là Huyền chi)

+ Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi là Long chi)

+ Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi là Ngọc chi)

+ Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi là Kim chi)

+ Tử chi (Linh chi tím)

Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crom…Chúng đã được sử dụng là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân

tế bào với hàm lượng rất thấp

Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật bản, Hàn Quốc, Đài Loan…Việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm

Đồng thời nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng

Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (1720-1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định,

đây là nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam Trong quyển “Cây thuốc và

vị thuốc Việt nam” (1991), giáo sư Đỗ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc

tính trị liệu của loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược

Hình 1.1: Một số hình ảnh về nấm Linh chi

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài [3]

Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc

họ đậu Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây

Hình 1.2: Nấm Linh chi

Nấm Linh chi (quả thể) cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm Cuống nấm dài hoặc ngắn đính bên có hình trụ đường kính 0,5-3cm Cuống nấm ít phân

nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông,phủ suốt lên mặt tán nấm Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt Trên vạch mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh- vàng nghệ- vàng nâu- vàng cam- đỏ nâu- nâu tím nhẵn bóng như láng vecni Mũ nấm có đường kính 2- 15cm, dày 0,8-1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm

1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý của nấm Linh chi

 Đặc điểm sinh trưởng của sợi nấm

- Sự sự sinh trưởng của sợi nấm được tiến hành chủ yếu bằng sự kéo dài của phần đỉnh sợi nấm Đỉnh sợi nấm bao gồm phần đầu tận cùng (đỉnh) của sợi nấm với độ dài khoảng 50 - 100µm Phần này không có nhân tế bào Toàn bộ nhân tế bào nấm nằm ở phía sau sợi nấm [2]

Cấu trúc của phần đỉnh sợi nấm bao gồm những bộ phận chủ yếu sau: thể đỉnh nằm tận cùng của sợi nấm, giống như chiếc mũ không có khả năng kéo dài Sau thể đỉnh là phần hấp thụ cực mạnh và tổng hợp cực mạnh, giữa thể đỉnh và phần này

có một vùng cấu tạo rất mềm về mặt cơ học Tiếp theo phần hấp thụ là vùng (γ) bền vững hơn, ở đây sự kéo dài sợi còn được tiếp tục Sau vùng (γ) là đến vùng (δ)

có cấu tạo vững chắc do màng tế bào đã dày lên tạo nên bộ khung vững chắc, vùng này không còn khả năng kéo dài sợi được

Các hợp chất hữu cơ được tổng hợp từ các phần khác nhau trên sợi nấm, các chất mới được hấp thụ từ những phần già của sợi nấm đều được vận chuyển tới đỉnh sợi nấm để phục vụ quá trình kéo dài của sợi nấm Ở đỉnh sợi nấm, các quá trình tổng hợp diễn ra mạnh hơn nhiều so với các phần khác trên sợi nấm Phần đỉnh khác phần kế cận là ở đỉnh giàu ARN, giàu các protein chứa arginin, tyrozin, histidin, các protein chứa nhóm -SH và rất ít glycogen Hàm lượng protein ở phần đầu rất giàu

có liên quan đến quá trình tổng hợp mạnh mẽ ở phần đỉnh và mặt khác là do sự vận chuyển từ các phần phía sau tới để phục vụ quá trình kéo dài sợi nấm Hàm lượng glycogen thấp ở phần đỉnh có liên quan tới việc tạo thành màng của những phần mới sinh ra Vì sự tập trung mạnh mẽ cho quá trình sinh trưởng như vậy, cho nên tốc độ sinh trưởng của nấm là rất lớn

- Sự sinh trưởng của sợi nấm là vô hạn

- Sợi nấm sinh trưởng không chỉ bằng sự kéo dài ra ở đỉnh mà còn kèm theo là

sự phân nhánh liên tục theo hướng ngọn từ phần sau đỉnh sợi nấm, có thể sự kéo dài

diễn ra ngay ở vùng γ và δ Sự phân nhánh diễn ra trước hết bởi sự làm mềm màng

tế bào, ở chỗ trước đây đã vững chắc Các nhánh sợi bên sẽ phát triển từ những chỗ này Mặc dù có sự phân nhánh nhưng ưu thế đỉnh bao giờ cũng được thể hiện, nghĩa

là sự kéo dài theo đỉnh chính chiếm ưu thế so với các nhánh bên [4]

Từ sợi chính sẽ tạo ra sợi bên cấp 1, từ sợi bên cấp 1 sẽ tạo ra sợi bên cấp 2, rồi cấp 3 Sợi chính luôn luôn dài hơn so với nhánh bên của nó và vì vậy toàn bộ

hệ thống sợi sinh ra từ 1 sợi chính có dạng giống như một cây thông với các cành của nó

Sự mọc của nấm trên toàn bộ hệ sợi được hình thành từ bào tử nấm hay từ một phần của mô nấm trên môi trường rắn, đồng nhất về dinh dưỡng và các điều kiện môi trường kết quả sẽ hình thành một khuẩn lạc hình tròn Khuẩn lạc được tạo nên

từ nhiều sợi chính và sợi phân nhánh các cấp Phần non nhất là ở đỉnh sợi nấm vì thế trong hình tròn khuẩn lạc thì phía ngoài cùng cũng là phần non nhất của khuẩn lạc

 Vai trò của nguồn dinh dưỡng và các yếu tố ngoại cảnh đối với sinh trưởng nấm

- Nguồn cacbon: Nguồn cacbon được cung cấp từ môi trường ngoài để tổng

hợp nên các chất như: hydratcacbon, axit amin, axit nucleic, lipit…Cần thiết cho sự phát triển của nấm Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu cacbon cũng khác nhau, nhưng hầu hết chúng dùng nguồn đường đơn giản là glucose, với nồng độ đường là 2% [7]

Trong tự nhiên, cacbon được cung cấp chủ yếu từ các nguồn polysaccharit như: cellulose, hemicellulose, lignin, pectin,… Các chất này có kích thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất Muốn tiêu hóa được cơ chất này, nấm tiết ra emzym ngoại bào phân hủy cơ chất thành các chất có kích thước nhỏ hơn, đủ để có thể xâm nhập được vào trong thành và màng tế bào [13, 14]

- Nguồn đạm (N): Đạm là nguồn cần thiết cho tất cả các môi trường nuôi cấy,

cần cho sự phát triển hệ sợi nấm Hệ sợi nấm sử dụng nguồn đạm để tổng hợp các chất hữu cơ như: purin, pyrimidin, protein, tổng hợp chitin cho vách tế bào Nguồn đạm sử dụng trong các môi trường ở dạng muối: muối nitrat, muối amon Trong tế

bào, ion NH4+ thường gắn với cetoglutamic và những amin khác được hình thành từ những phản ứng chuyển hóa amin Sự hiện diện của NH4+ trong môi trường ảnh hưởng đến tỷ số C/N, chúng đánh giá mức độ hoạt động của vi sinh vật [7, 13]

- Dinh dưỡng khoáng: Cần cho sự phát triển và tăng trưởng của nấm [13]

+ Nguồn phosphat: Tham gia tổng hợp ATP, axit nucleic, phospholipit

màng.Nguồn cung cấp phospho thường là từ muối phosphat

+ Nguồn kali: Đóng vai trò làm đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho các loại

enzym hoạt động Đồng thời đóng vai trò cân bằng khuynh độ (gradient) bên trong

và ngoài tế bào

+ Magiê: Cần thiết cho sự hoạt động một số loại enzym, nguồn magiê được

cung cấp từ sulfat magiê

- Vitamin: Những phân tử hữu cơ này được dùng với lượng rất ít, chúng không

phải là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào.Vitamin cần thiết và giữ chức năng đặc biệt trong hoạt động của enzym Hầu hết nấm hấp thụ nguồn vitamin từ bên ngoài và chỉ cần một lượng rất ít nhưng không thể thiếu Hai nguồn vitamin cần thiết cho nấm là biotin (vitamin H) và thiamin (vitamin B1)

- Nhiệt độ: Nhiệt độ là nhân tố hết sức quan trọng trong việc xác định tốc độ

sinh trưởng của sợi nấm Nhiệt độ phát triển thích hợp của nấm Linh chi đối với giai đoạn nuôi sợi: từ 25 - 30ºC, đối với giai đoạn quả thể: từ 22 - 28ºC Nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ thích hợp sẽ làm cho hệ sợi nấm sinh trưởng chậm lại hoặc chết hẳn [10, 11]

- Nước: Nước cần thiết cho sự sống của nấm chủ yếu thông qua độ ẩm Độ ẩm

cơ chất nấm là 60 - 65% và độ ẩm không khí 80 - 95%

- Các chất khí: Nấm rất cần O2 nhưng nhu cầu về O2 của các loài nấm rất khác nhau Hàm lượng CO2 trong môi trường có ảnh hưởng thúc đẩy tốc độ mọc của sợi nấm nhưng khi nồng độ CO2 cao quá có thể không cho quả thể

- Ánh sáng: Ánh sáng làm cho sợi nấm nhanh chóng bị thoái hóa Vì thế, trong

pha sợi người ta thường để nấm mọc trong tối

- Độ pH: Độ pH môi trường có ý nghĩa to lớn đối với sự mọc của sợi nấm, nấm

Linh chi thích nghi trong môi trường trung tính đến axit yếu (pH từ 5 - 7)

1.1.1.3 Chu trình sống của nấm Linh chi

Hình 1.3: Chu trình sống của nấm Linh chi [5]

Loài : Ganoderma lucidum Karst

1.1.2 Thành phần hóa học của nấm Linh chi

Các phân tích của G - Bing Lin đã chứng minh các thành phần hóa dược tổng quát của nấm Linh chi như sau [18]:

Nước: 12 - 13%

Cellulose: 54 - 56%

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpen mới, bao gồm lucidumol A và B, các axit ganoderic: A, B, E, F, H, K, Y và R Trong đó kiểu Lanostan triterpen có thành phần chính là lipophilic Có khoảng 130 hợp chất được

ly trích từ quả thể, hệ sợi và bào tử nấm Linh chi Thành phần và hàm lượng triterpen phụ thuộc vào nguồn giống, yếu tố môi trường Vai trò của triterpen có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV

Hàng loạt các nghiên cứu của Shufen Zhou chứng minh rằng polysaccharit và triterpen của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính Ganopoly ức chế quá trình dịch mã của ADN polyme của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt động của virút Ngoài ra polysaccharit và triterpen tác động hữu hiệu trong việc điều trị bệnh đái đường loại 2 (type II diabetes mellitus) cho các bệnh nhân [17]

Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử

của Polysaccharit từ G.lucidum là khoảng 7,100 – 9,300 Những tổng kết về vai trò

sinh dược học của nhóm polysaccharit ở các loài nấm Linh chi đã được giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa

kỳ [10]:

He, Y et al (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharit đồng nhất

có hoạt tính tăng miễn dịch Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycosit

Hikino, H et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết

của nhiều polysaccharit Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư Các ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan Đây chính là cơ sở trị liệu

trên các bệnh nhân đái tháo đường Các phức hợp polysaccharit – protein có hoạt

tính chống khối u và tăng tính miễn dịch Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai

hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp Protoplast giữa chủng G.lucidum với

G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương (Lentinus edodes), qua đó tăng cường

hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức polysaccharit – protein lên đáng

kể

Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2 (Interleukine-2) và hoạt tính ADN polyme ở chuột già tuổi bởi polysaccharit, càng soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi

Những nghiên cứu về polysaccharit không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu

lực chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và

G.applanatum [1]

Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponin, triterpenoit và các axit ganoderic Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng histamin, ức chế Angiotensin Conversino emzym (ACE), ức chế sinh tổng hợp Cholesterol và hạ huyết áp [3]

1.1.3 Giới thiệu sơ lƣợc về hoạt chất có trong nấm Linh chi

1.1.3.1 Ganoderma polysaccarit (GLPs)

Có trên 200 loại polysaccharit được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharit, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 - 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM) Một phần polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan

trong nước nóng Ngoài polysaccharit từ quả thể, polysaccharit cũng được thu nhận

từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị [19]

Một trong 4 loại polysaccharit có đặc tính chống khối u mạnh nhất là glucan, có tác dụng chống ung thu và tăng tính miễn dịch cho cơ thể

β-D-Vai trò dược học của polysaccharit:

- Kích thích hệ miễn dịch cơ thể

- Gia tăng khả năng dung nạp oxy

- Giảm gốc tự do hydroxyl

- Ức chế khối u phát triển

- Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ

- Tăng chức năng gan

- Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường

- Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein [20]

1.1.3.2 Axit ganoderic

Axit ganoderic được định hướng là một cyclopropen hoặc cyclopenten Hàm lượng axit ganoderic thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganoderma Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng Hàm lượng axit ganoderic cao thì có nhiều vị đắng

Triterpenoit là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren Các triterpen có bộ khung chính từ 27-30 nguyên tử cacbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật Các triterpenoit tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; eter -O-; C=O; nối đôi C=C Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong ete dầu hỏa, hexan, etyl ete, cloroform),

ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosit [1, 3]

Bảng 1.1: Các hoạt chất triterpenoit có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi

(Ganoderma lucidum)

Hoạt chất Hoạt tính

Axit ganoderic R,S Ức chế giải phóng histamine

Axit ganoderic B, D, F, H, K, S,Y Hạ huyết áp

Axit ganodermic Mf Ức chế tổng hợp cholesterol

Axit ganodermic T.O Ức chế tổng hợp cholesterol

Axit ganodermic Ức chế tổng hợp cholesterol

Triterpenoit đặc biệt là axit ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan Hiện nay, đã tìm thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic Trong đó ganodosteron được xem là chất kích thích hoạt động của gan và bảo vệ gan

1.1.3.3 Ganoderma Adenosin

Adenosin thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc axit nucleic Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosin, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh [18]

Chức năng của adenosin [21]:

- Giảm độ nhớt máu

- Ức chế kết dín tiểu cầu

- Ngăn chặn hình thành cục nghẽn

- Tăng lượng lipoprotein 2-3 phosphricglycerin

- Gia tăng khả năng vận chuyển oxy, tăng lượng máu cung cấp cho não

- Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể

1.1.3.4 Hợp chất Saponin

Saponin là một loại glycosit, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon

- Saponin triterpenoit: Phần aglycon của saponin triterpenoit có 30 cacbon, cấu

tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm [2]:

+ Saponin triterpenoit pentacyclic

+ Saponin triterpenoit tetracyclic

- Saponin steroit: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan,

1.1.3.5 Germanium hữu cơ

Germanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm

1885 Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxy và thay thế chức năng của oxy Nó kích thích khả năng vận chuyển oxy tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa [16, 18]

Cơ thể con người là thành phần của các electron Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý Germanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể

và bảo vệ sức khỏe Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất Germanium sẽ điều hòa và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển

Chức năng của Germanium:

- Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư

- Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ

- Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

1.1.4 Khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi

Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của Linh chi Chúng đã được khẳng định là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào

Tài liệu cổ nhất nói tương đối cụ thể về khả năng trị liệu của nấm Linh chi cũng của Lý Thời Trân (1595) Theo tác giả trong 6 loại Linh chi thì mỗi loại có đặc tính riêng

Bảng 1.2: Lục bảo Linh chi và tác dụng dược liệu

Thanh chi Xanh Vị chua, tính bình,không độc chủ trị sáng mắt, bổ gan

khí an thần, tăng trí nhớ

Hồng chi Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng

tim, bổ trung, chữa trị tức ngực

Hoàng chi Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí

Bạch chi Trắng Vị cay, tính bình, không độc,ích phổi, thông mũi, an

thần, chữa ho nghịch

Hắc chi Đen Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu

Tử chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức khớp xương Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng với một số bệnh:

1.1.4.1 Đối với các bệnh tim mạch

Nấm Linh chi có tác dụng điều hòa, ổn định huyết áp Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng nhiều thì huyết

áp ổn định Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi

có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hóa dinh dưỡng Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh chi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm

hệ số sinh bệnh Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ

mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng rất hiếm Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô Hiện nay, chỉ số Germanium trong các dược phẩm Linh chi được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư [2, 3]

1.1.4.2 Đối với các bệnh hô hấp

Nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là những ca điều trị viêm phế quản dị ứng - hen phế quản tới 80%, có tác dụng làm giảm và nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn [7, 8]

1.1.4.3 Hiệu quả chống ung thƣ

Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hóa trị, giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt – khối u tiêu biến hoàn toàn Các nhà khoa học ở Đại học Haifa, Israel khẳng định nấm Linh chi – một loài nấm dại thường dùng trong Đông Y ở Trung Quốc và Việt Nam – có thể chữa ung thư tuyến tiền liệt

1.1.4.4 Khả năng kháng HIV

Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong nấm Ganoderma

lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virut

HIV–1 trên các tế bào lympho T ở người Sự nhân lên của virut được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV–1 Kết quả có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virut này Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau:

- Ganoderiol F và Ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV–1

- Axit ganoderic B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV–1

- Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth–A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma)

Ngoài ra các ganoderma alcohol và lanostan triterpen với nhóm hydroxyl OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV–1, Meth- A và LLC ở chuột [2]

(-1.1.4.5 Khả năng chống oxy hóa

Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponin và triterpenoit, mà trong đó axit ganoderic được coi là hiệu quả nhất Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selen (một yếu tố khoáng có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh) vào nấm Linh chi Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hóa từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng [2]

Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do trong cơ chế chống lão hóa, chống ung thư Bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia

chiếu xạ Linh chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả

các kim loại nặng như: Chì, germanium

1.1.5 Một số ứng dụng lâm sàng

- Trị suy nhược thần kinh

- Trị chứng cholesterol máu cao

- Trị viêm phế quản mãn tính

- Trị viêm gan mãn tính

- Trị chứng giảm bạch cầu

- Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc

- Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não

- Giải độc các loại khuẩn…

1.1.6 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Linh chi trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Linh chi trên thế giới

Hiện nay, nghề trồng nấm đã phát triển trở thành một ngành công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt phải kể đến là Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ

Việc nuôi trồng nấm linh chi được ghi nhận từ năm 1621, nhưng đến 300 năm sau (1936), với thành công của GS Dật Kiến Vũ Hưng (Nhật) thì ngành nuôi trồng nấm mới được phổ biến Nếu tính từ 1979 sản lượng nấm linh chi khô ở Nhật đạt 5 tấn/năm thì đến năm 1995, sản lượng lên đến gần 200 tấn/năm Như vậy là 16 năm, sản lượng nấm linh chi của Nhật đã tăng gấp 40 lần [9]

Hàng năm, thế giới sản xuất khoảng 4300 tấn nấm linh chi, trong đó riêng Trung Quốc trồng khoảng 3000 tấn, còn lại các quốc gia khác như: Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Hoa Kỳ, Malaysia, Việt Nam, Indonesia, Srilanca Trong khi Nhật Bản là nước đưa ra kỹ thuật nuôi trồng nhưng hiện nay đứng sau Trung Quốc Kỹ thuật nuôi trồng linh chi ngày càng phát triển và tại Việt Nam nhiều nhà nghiên cứu đã thành lập một trại nuôi trồng và bào chế linh chi ở Sài Gòn từ năm 1987 [12]

Nhóm nấm quý họ linh chi (Ganodermataceae) sống trên cây, trên gỗ hay rễ cây mục Cho tới nay đã có 386 tên loài được ghi nhận trên toàn thế giới, trong đó

221 loài được các nhà khoa học công nhận, hơn 200 loài còn lại là các loài đồng nghĩa, các loài được sắp xếp nhầm vào họ linh chi và gần 10 loài chưa xác định loại được

Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan thì từ lâu nấm linh chi đã được nghiên cứu và sử dụng vào việc phòng và điều trị bệnh Đến nay công nghệ nuôi trồng nấm ở các quốc gia này đã phát triển ở quy mô công nghiệp hiện đại và đem lại nguồn thu khá lớn trong kim ngạch xuất khẩu Sản xuất nấm phát triển đã tận dụng nguyên liệu thừa trong các ngành công nghiệp, nông lâm nghiệp, cùng một lúc đem lại sản phẩm có giá trị, hiệu quả kinh tế cao, đồng thời góp phần không nhỏ trong việc bảo vệ môi trường

Đến nay việc nghiên cứu về nấm linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nước Trung Quốc, mà đã mang tính toàn cầu Hiện nay có khoảng 250 bài báo của các nhà khoa học trên thế giới đã được công bố liên quan tới dược tính và lâm sàng của linh chi Tháng 7 /1994, Hội nghị Nấm học thế giới tại Vancouver, Canada

đã nhất trí thành lập viện nghiên cứu linh chi Quốc Tế, đặt trụ sở tại NewYork (Hoa Kỳ) [14]

Nhiều công trình nghiên cứu về linh chi đã chứng minh trong linh chi chứa nhiều hợp chất germanium và polysaccharid có tác dụng thúc đẩy quá trình trao đổi chất; làm chậm quá trình lão hóa; tăng cường miễn dịch cho cơ thể; nâng cao khả năng đề kháng bệnh; điều tiết hệ thần kinh trung ương, giúp thăng bằng cơ năng; ổn định huyết áp; bảo vệ gan; bổ não, tăng trí thông minh, tăng trí nhớ; giảm nhẹ các tác dụng phụ ở bệnh nhân ung thư khi điều trị bằng hóa dược liệu Chính vì thế mà

ở châu Á việc sử dụng linh chi làm thuốc, thực phẩm chức năng, trà thuốc trở nên rất phổ biến và số người sử dụng linh chi ngày càng một tăng trong những năm gần

đây

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Linh chi ở Việt Nam

Từ những năm 70, đặc biệt trong các năm 80 và 90 của thế kỷ XX ở Việt Nam nấm linh chi đã được quan tâm và nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý và quy trình sản xuất ra các chế phẩm Hiện nay, các chế phẩm từ linh chi đã được con người ưa chuộng và sử dụng ngày càng rộng rãi với nhiều hình thức đa dạng về chủng loại như: thuốc tiêm, cồn thuốc, cao dán, thuốc xông và cao thuốc dùng ngoài Việc nghiên cứu phân lập nhóm hoạt chất làm thuốc còn rất hạn chế, cần được quan tâm nhiều hơn Trong công nghiệp điều chế, nhóm polysaccharit rất được chú ý, ngoài ra các axit amin và các nguyên tố vi lượng cũng được quan tâm [6]

Ở nước ta, nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học đã khẳng định nấm linh chi có thể chữa khỏi hoặc hạn chế các bệnh hiểm nghèo như: ung thư, đái

đường, tim mạch, hô hấp… Giá trị dược liệu của nấm linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ, cách nay hơn 4000 năm Trong “Thần nông bách thảo” đã đề cập đến 365 dược thảo và linh chi được xếp vào loại thượng dược, ở vị trí số một sau đó mới đến nhân sâm và phân biệt linh chi thảo theo màu sắc: xích chi (Linh chi đỏ), hoàng chi (Linh chi vàng), hắc chi (Linh chi đen), tử chi (Linh chi tím), bạch chi (Linh chi trắng) và thanh chi (Linh chi xanh) có tác dụng làm thuốc tốt nhất nên gọi Lục Bảo Linh chi [7]

Đại danh y Lý thời trần viết: “Linh chi, dùng lâu người nhẹ nhàng, trẻ lâu, sống lâu như thần tiên” Ngành nuôi trồng nấm dược liệu trong những năm gần đây phát triển mạnh mẽ, tổng sản lượng ước tính đạt khoảng 100000 tấn/năm Với công nghệ ngày càng hiện đại, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu thành công các nguồn nguyên liệu nuôi trồng nấm linh chi thay cho mùn cưa cao su trước đây Kết quả này đã góp phần tránh lãng phí và hạn chế sự ô nhiễm môi trường bởi nguyên liệu được sử dụng là phế thải của các nhà máy đường, công nghiệp dệt như: bã mía, bông thải…[7]

Đặc biệt với công nghệ sản xuất nấm linh chi sinh khối, PGS-TS Nguyễn Thị Chính là người đầu tiên ở nước ta sản xuất thành công sinh khối linh chi ở dạng sợi So với loại nấm linh chi trên thị trường hiện nay (chủ yếu dạng quả thể), thì nấm linh chi của PGS-TS Nguyễn Thị Chính sản xuất là dạng sợi Nó đã được phân tích một số thành phần quan trọng như: protein, lipit, đường vitamin, nguyên khoáng, đặc biệt thành phần polysacharit (chính thành phần này đã được các tác giả trên thế giới khẳng định có hoạt tính chống u) Việc nghiên cứu và sản xuất ra loại sinh khối linh chi theo hướng thực phẩm chức năng của bà đã có tác dụng hỗ trợ

trong việc chữa bệnh, tăng sức khoẻ cho con người

Nấm Linh chi TH04 có màu đỏ tươi đẹp, chân nấm nhỏ và ngắn, quả thể to

Hình 1.4: Hình ảnh nấm Linh chi TH04

1.2 Vitamin

1.2.1 Đại cương về vitamin

Vitamin là những chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau, có hoạt tính sinh học, cơ thể có nhu cầu thấp, nhưng đặc biệt cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển

Các vitamin và tiền vitamin được tổng hợp chủ yếu trong cơ thể thực vật Rất

ít loại được tổng hợp trong cơ thể động vật và nếu có tổng hợp thì cũng không đủ cho nhu cầu dinh dưỡng Trong cơ thể sống vitamin mang vai trò của chất xúc tác,

đa số vitamin có tác dụng như coenzim, nếu thiếu vitamin sẽ gây nên những rối loạn nghiêm trọng trong quá trình trao đổi chất Do đó, con người cần được cung cấp vitamin qua quá trình dinh dưỡng Nhưng nếu vitamin được cung cấp dư thừa thì cũng sẽ gây nên những rối loạn nghiêm trọng, vì thế sử dụng vitamin như thế nào cho thích hợp là một vấn đề cần chú trọng trong quá trình dinh dưỡng của con người

- Vitamin được chia làm 2 loại: hòa tan trong nước và hòa tan trong chất béo

+ Vitamin hòa tan trong nước: B, B2, B5, B6, B12, C, H…

+ Vitamin hòa tan trong chất béo: A, D, E, K…

- Các vitamin có 6 tính chất chung như sau:

+ Không sinh ra năng lượng

+ Cơ thể rất cần nhưng chỉ với một lượng rất nhỏ

+ Cơ thể không tự điều chế được nên phải lấy từ các thực phẩm hoặc dược

phẩm

+ Các vitamin không thể thay thế được cho nhau

+ Các vitamin đều cần thiết cho sự hoạt động và phát triển của cơ thể do

chúng có vai trò xúc tác thúc đẩy sự tiêu hóa thức ăn, sự trao đổi chất Ngoài ra, chúng còn giúp các điểm tổn thương của cơ thể chóng bình phục

+ Cơ thể thiếu vitamin sẽ dễ mắc một số tật bệnh hiểm nghèo, có thể dẫn tới

 Cấu tạo hóa học

Nhóm vitamin E gồm α–tocopherol, β–tocopherol, γ–tocopherol, δ–tocopherol Trong đó dạng α là có hoạt lực cao nhất

Các tocopherol có công thức phân tử là C29H50O2

- α-tocoferol thiên nhiên có thể kết tinh chậm trong rượu metylic ở nhiệt độ thấp

-35oC thu được tinh thể hình kim có nhiệt độ nóng chảy 2,5 - 3,5oC

- Tocopherol khá bền với nhiệt Nó có thể chịu nhiệt tới 170oC trong không khí

- Tia tử ngoại có thể phá hủy nhanh chóng tocopherol, nhạy cảm với ánh sáng

do đó cần bảo quản trong nắp kín

 Vai trò

- Chống oxi hóa sinh học trong cơ thể & trong thức ăn: dùng vitamin E để

bảo quản thức ăn khi thức ăn có chứa nhiều caroten, vitamin A & lipid, ngăn chặn

sự hình thành peroxyt & bảo vệ các acid béo chưa no

- Ngăn ngừa ung thư: Vì nó kết hợp với vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng

làm chậm sự phát sinh của một số bệnh ung thư

- Ngăn ngừa bệnh tim mạch: Vitamin E làm giảm các cholestrol xấu và làm

tăng sự tuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch

- Hệ thống miễn dịch: Vitamin E kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình

thường bằng việc bảo vệ các tế bào, hoặc tăng cường sức mạnh hệ miễn dịch khi có dịch bệnh tấn công

- Chống vô sinh: Do nó đảm bảo cơ năng sinh dục được bình thường vì vitamin

E có liên quan đến sự tiết kích thích tố sinh dục (Gonadotropin) ở tuyến yên

- Chống lão hóa: Do phản ứng chống oxy hoá bằng cách ngăn chặn các gốc tự

do, nên người ta dùng nó để sản xuất các chế phẩm dưỡng da hoặc làm trẻ hóa

1.2.2.2 Vitamin C

 Cấu tạo hóa học

Axit ascorbic có khả năng hoàn nguyên các chất, bản thân bị oxy hoá sang dạng axit dehydroascorbic không có hoạt tính vitamin Do đặc điểm này nên việc bảo quản vitamin C rất khó

- Có vị axit, không mùi

- Có tính hoạt quang

- Tính khử mạnh

- Bền trong môi trường axit và trung tính

- Dễ bị oxi hóa bởi oxy không khí, khi có mặt của Fe, Cu… Sẽ làm tăng tốc độ

oxy - hóa Sự oxy hóa cũng xảy ra khi có enzim – oxy hóa vitamin C (ở thực vật)

- Vitamin C tồn tại và chuyển hóa thuận nghịch 2 dạng oxy hóa và khử

 Vai trò của vitamin C

- Vai trò sinh hoá học: Tham gia quá trình oxy hoá hoàn nguyên

+ Có tác dụng kích thích hoạt động của enzym aconitase trong chu trình

Krebs, do đó nó gián tiếp ảnh hưởng tới sự chuyển hoá glucose

+ Vitamin C có liên quan chặt chẽ đối với sự trao đổi protein, đặc biệt là

protein của các mô chống đỡ như gân, xương Chức năng chủ yếu của vitamin C là

sự sản xuất collagen, một protein chính của cơ thể

- Chức năng miễn dịch: Vitamin C làm tăng cường hệ thống miễn dịch, đặc biệt

trong ngăn ngừa và điều trị cảm cúm trông thường

- Chức năng chống oxi hóa: Vitamin C hoạt động như một chất chống oxi hóa

trong môi trường nước của cơ thể - cả nội bào lẫn ngoại bào

- Ngăn ngừa ung thư: Vitamin C đảm nhiệm chức năng quan trọng trong bảo

vệ cơ thể, tăng cường chức năng miễn dịch, chống ung thư, bao gồm hoạt động chống oxi hóa và bảo vệ cấu trúc tế bào tránh các tổn thương

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.3.1 Cơ sở lý thuyết

HPLC là viết tắc của 4 chữ cái đầu bằng tiếng anh của phương pháp sắc ký

lỏng cao áp (high performance liquid chromatography)

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh và pha động Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗ hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác với pha tĩnh và pha động

của chúng khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách

ra khỏi nhau

Ưu điểm của phương pháp HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt,

độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất

 Đây là phương pháp phổ biến để phân tích vitamin E, C

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trong quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp thụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chúng

ta cần có pha động Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C…Vào cột phân tích, kết quả của các chất A, B, C… Sẽ được tách

ra khỏi nhau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác F1, F2,F3

Chất phân tích A + B + C F1 F2

Pha tĩnh F3 Pha động

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó F1

và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột

+ Sắc ký phân bố (partition chromatography)

+ Sắc ký ion (ion chromatography)

+ Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion

có khối lượng phân tử không quá lớn Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:

+ Sắc ký hấp thụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không

phân cực

+ Sắc ký hấp thụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

 Hiện nay chủ yếu sử dụng loại sắc ký hấp thụ pha đảo (RP-HPLC)

1.3.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC

- Thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:

+ Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích

+ Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gốm cột tách, đôi khi có

cột phụ trợ

+ Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detector, phần

khuếch tán, computer và phần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu

Hình 1.5: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Trong đó:

1 Bình chứa dung môi pha động

2 Bộ phận khử khí

3 Bơm cao áp

4 Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample)

5 Cột sắc ký (pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt)

 Bộ khử khí Degasse

- Mục đích: loại trừ bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động

- Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

+ Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời

gian lưu của peak thay đổi

+ Nếu bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể pump

sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

+ Pump phải tạo dòng liên tục, lưu lượng từ 0,1- 9,999 ml/phút

+ Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt

 Bộ phận tiêm mẫu (injection)

- Mục đích: để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy

+ Bằng mẫu thủ công (tiêm bằng tay)

+ Tiêm mẫu tự động (autosample)

A = k.C

Trong đó: A - Tín hiệu đo được

- Thừa số dung lượng K’

- Sự loãng pic và hình dáng pic

- Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết

- Chiều cao đĩa lý thuyết và sự loãng pic

1.3.6 Cách đo HPLC

Mỗi máy có các cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hang sản xuất, phần

mềm sắc ký Tuy nhiên cách vận hành luôn phải tuân theo nguyên tắc sau:

+ Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hét bọt khí có trong hệ thống

ống dẫn trược khi cho vào cột

+ Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như: Cấu hình máy, tỷ lệ các dung môi pha

động, bước song, thành phần mẫu, các thong số của quá trình phân tích yêu cầu