Nghiên cứu định lượng rebaudioside a trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm từ cây cỏ ngọt bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao hplc

Tên đề tài: Nghiên cứu định lượng rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm từ cây cỏ ngọt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.. Các thành phần trong cây cỏ ngọt l

664 MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 3

1 Lý do chọn đề tài 3

2 Nhiệm vụ nghiên cứu 5

3 Đối tượng nghiên cứu 5

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt 6

1.1.1 Giới thiệu 6

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây cỏ ngọt 7

1.1.3 Các giai đoạn sinh trưởng phát triển 8

1.1.4 Phân bố và tình hình trồng trọt 8

1.1.5 Thành phần hóa học của cỏ ngọt 10

1.2 Tổng quan về rebaudioside A 11

1.2.1 Tính chất vật lý 11

1.2.2 Tính chất hóa học 12

1.2.3 Tính chất cảm quan 13

1.3 Một số sản phẩm đường ăn kiêng trên thị trường 13

1.4 Những sản phẩm từ cỏ ngọt ở Việt Nam 16

1.5 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 18

1.5.1 Khái niệm 18

1.5.2 Phân loại 18

1.5.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 19

1.5.4 Pha động trong sắc ký pha đảo 20

1.5.5 Sơ đồ hệ thống HPLC 21

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Phương pháp lấy mẫu 24

2.2 Phương pháp phân tích 24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 25

3.1 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 25

3.2 Kỹ thuật thực nghiệm 25

3.2.1 Chuẩn bị hoá chất phân tích 25

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn 26

3.2.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu 26

3.3 Tiến hành phân tích trên máy 28

3.4 Khảo sát đánh giá phương pháp 28

3.4.1.Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 28

3.4.2 Khảo sát độ lặp của phương pháp 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của tỷ lệ diện tích peak stevioside và rebaudioside A vào nồng độ 29

4.2 Phương pháp xử lý kết quả 35

4.3 Đánh giá phương pháp 41

4.3.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 41

4.3.2 Đánh giá độ lặp của phương pháp 42

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề xuất 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đồ án tại các phòng thí nghiệm Hoá thực phẩm, khoa Hoá học, trường Đại học Vinh, Trung tâm Kiểm định An toàn thực phẩm và môi trường trường Đại học Vinh, ngoài sự nỗ lục của bản thân, tôi còn nhận được nhiều sự giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cô giáo, kỹ thuật viên,… Tôi xin gửi lời cảm

ơn chân thành tới:

- Các thầy cô giáo khoa Hoá – những người đã tạo cho tôi nền tảng lý thuyết, phương pháp tiếp cận vấn đề để tôi có thể hoàn thành chương trình

- Cán bộ, kỹ thuật viên Trung tâm thí nghiệm trường Đại học Vinh

- Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thế Tâm – Khoa Hoá học – trường

Đại học Vinh đã tận tình hứng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án này

- ThS Chu Thị Thanh Lâm đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

làm thí nghiệm, phân tích kết quả

Trong suốt quá trình thực tập và viết báo cáo do bản thân chưa có nhiều kinh nghiệm và kiến thức thực tiễn nên còn có những sai sót Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để bài báo cáo này được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nghệ An, tháng 12 năm 2013 Sinh viên

Lê Thị Thành

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất và sử dụng cỏ ngọt ở một số nước trên Thế giới 9

Bảng 1.2 Thành phần % các chất trong cây cỏ ngọt 10

Bảng 1.3 Thành phần hoá học các chất tạo ngọt chính trong cây cỏ ngọt 10

Bảng 1.4 Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng 20

Bảng 4.1 Kết quả thí nghiệm xây dựng đường chuẩn rebaudioside A 29

Bảng 4.2 Kết quả thí nghiệm xây dựnng đường chuẩn stevioside 29

Bảng 4.3 Kết quả phân tích rebaudioside A trong các mẫu 36

Bảng 4.4 Kết quả phân tích stevioside trong các mẫu 36

Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp 41

Bảng 4.6 Kết quả phân tích xác định độ lặp của phương pháp 42

Bảng 5.1 Kết quả phân tích hàm lượng stevioside và rebaudioside A 43

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình i Tinh thể stevioside 5

Hình 1.1 Cây cỏ ngọt (đã trổ hoa) 6

Hình 1.2 Cây cỏ ngọt (chưa trổ hoa) 6

Hình 1.3 Cánh đồng cỏ ngọt 9

Hình 1.4 Nhóm steviol 11

Hình 1.5 Công thức hóa học của stevioside, gồm nhóm steviol liên kết với một phân tử β – D – glucose và một sophorose 11

Hình 1.6 Sự liên kết của steviol và các carbohydrate để tạo thành steviolmonoside, steviolbioside, stevioside và rebaudioside A 12

Hình 1.7 104 Stevia 13

Hình 1.8 105 Stevia 14

Hình 1.9 Stevia Extract trắng bột 14

Hình 1.10 Stevia Plus Fiber Packets 15

Hình 1.11 Stevia dạng viên nén 15

Hình 1.12 Chè Artiso – Cỏ ngọt 16

Hình 1.13 Chè sâm quy – Cỏ ngọt 16

Hình 1.14 Chè ngọt 17

Hình 1.15 Chè thảo mộc 17

Hình 1.16 Lương khô Happy Life 17

Hình 1.17 Sơ đồ hệ thống HPLC 21

Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu 27

Hình 4.1 Đường chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ rebaudioside A 30

Hình 4.2 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 10ppm 30

Hình 4.3 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 50ppm 31

Hình 4.4 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 100ppm 31

Hình 4.5 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 250ppm 32

Hình 4.6 Sắc đồ chuẩn rebaudioside A nồng độ 500ppm 32

Hình 4.7 Đường chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ stevioside 33

Hình 4.8 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 60ppm 33

Hình 4.9 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 100ppm 34

Hình 4.10 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 160ppm 34

Hình 4.11 Sắc đồ chuẩn stevioside nồng độ 200ppm 35

Hình 4.12 Sắc đồ mẫu cỏ ngọt khô 37

Hình 4.13 Sắc đồ mẫu cỏ cây ngọt tươi 37

Hình 4.14 Sắc đồ mẫu cành cây cỏ ngọt 38

Hình 4.15 Sắc đồ mẫu hoa cây cỏ ngọt 38

Hình 4.16 Sắc đồ mẫu lá cây cỏ ngọt 39

Hình 4.17 Sắc đồ mẫu cây cỏ ngọt tươi thêm chuẩn 39

Hình 4.18 Sắc đồ mẫu bánh lương khô 40

Hình 4.19 Sắc đồ mẫu nước lipovitan 40

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ACN: Acetonitrile

DAD: Detector Diod Array

HPLC : Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC/UV: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao / tử ngoại

UBND: Uỷ ban nhân dân

UV-VIS: Ultraviolet spectrophotometer – quang phổ tử ngoại khả kiến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

1 Tên đề tài: Nghiên cứu định lượng rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số sản

phẩm từ cây cỏ ngọt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2 Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp

- Nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của các chất ngọt trong cây cỏ ngọt

- Nghiên cứu định lượng rebaudioside A bằng phương pháp HPLC

- Nghiên cứu hàm lượng rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số mẫu thực phẩm chứa đường cỏ ngọt

- Đưa ra một số đề xuất về hướng sản xuất đường cỏ ngọt trong tương lai

3 Họ tên cán bộ hướng dẫn : ThS Lê Thế Tâm

4 Ngày giao nhiệm vụ đồ án : ngày tháng năm 2013

5 Ngày hoàn thành đồ án : ngày tháng năm 2013

Vinh, ngày tháng năm 2013

Người duyệt

(Ký, ghi rõ họ tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘ CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên : Lê Thị Thành

Ngày nay, trên thế giới con người tiêu thụ khoảng 100 tấn đường hàng năm vì tính chất rẻ tiền, bùi miệng, đường lại rất cần thiết cho việc phát dục của cơ thể Tuy nhiên, đường cũng có những mặt trái của nó, vì cung cấp nhiều năng lượng nên nó có thể làm cho cơ thể béo phì mặc dù không phải dùng quá độ Trong miệng, các vi khuẩn có thể chế tạo ra các axit tác dụng lên răng Vì vậy, để tránh lên cân, hư răng, cũng như các bệnh nhân mắc chứng đái đường, người ta buộc lòng phải kiêng cử hoặc dùng đường ít lại, kiêng kẹo, kiêng kem, bỏ chè, bỏ nước ngọt hay tốt hơn là dùng một chất thay thế Chất này phải cung cấp ít năng lượng hoặc có độ ngọt cao hơn để có thể

sử dụng lượng ít hơn Đồng thời, những chất này phải thỏa mãn điều kiện không được

phân hủy trong miệng khi có nước miếng tác dụng và nhất là không biến đổi trong môi trường axit như đường

Hiện nay, trên thị trường đã có rất nhiều sản phẩm hóa học tạo vị ngọt có thể dùng để thay thế đường (saccharin, sodium cyclamate, sucralose, acesulfame potassium, phổ biến nhất là chất aspartame) Những chất này không có tính dinh dưỡng, đặc biệt là có vị ngọt cao gấp cả trăm lần so với đường nhưng lại cho rất ít calorie chỉ có khoảng 2,2 calo cho mỗi gói nhỏ trong khi chỉ một muỗng cafe đường

đã sinh ra tới 16 calo Các chất hóa học này xuất hiện hầu hết trong các loại thức ăn và thức uống hằng ngày Mặc dù chúng rất rẻ và tiện dụng nhưng người ta rất e ngại rằng chúng sẽ ảnh hưởng về lâu về dài đến sức khỏe Qua một số nguyên cứu về tác hại của chúng thì saccharin đã bị cấm sử dụng ở một số quốc gia vì thí nghiệm cho thấy nó tạo ung thư bàng quang ở loài chuột

Đối với những người mắc bệnh phenylketonuria thì không nên dùng aspartame Đây là bệnh di truyền rất hiếm thấy, trong đó vì sự lệch lạc của một gene của cơ thể

không sản xuất được enzyeme khử bỏ chất phenylalanine Khi ăn vào, aspartame sẽ

phân thành aspartid acid và phenylalanine, chất này tích tụ trong não sẽ gây tổn hại cho hệ thần kinh trung ương và có thể chết

Trước các nguy hại này của chất hóa học, tâm lý chung của người tiêu dùng là muốn tìm lại các sản phẩm thực phẩm từ thiên nhiên Trong nhóm các chất tạo vị ngọt

từ thiên nhiên thì đường có trong cây cỏ ngọt ngày càng được nhiều người chú ý đến Đường cỏ ngọt ngày càng được sử dụng phổ biến và rộng rãi trên toàn thế giới Nghiên cứu cho thấy có 4 hợp chất chính tạo vị ngọt trong cỏ là stevioside (5 – 10%), rebaudioside A (2 – 4%), rebaudioside C (1 – 2%) và dulcoside A (0,5 – 1%)

Trong những năm gần đây, cây cỏ ngọt đã được đưa vào trồng và sử dụng ở một

số khu vực Việt Nam Các thành phần trong cây cỏ ngọt là nguyên liệu được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp thực phẩm và y dược học Trên thị trường Việt Nam đã có nhiều sản phẩm đường cỏ ngọt được sử dụng như thực phẩm ăn kiêng, thực phẩm chức năng,…

Trong các thành phần hoá học tạo vị ngọt trong cây cây cỏ ngọt thì stevioside và rebaudioside A là các hợp chất tạo độ ngọt chính Để xác định chính xác hàm lượng

các loại đường trong cỏ ngọt và một số sản phẩm thực phẩm, tôi chọn đề tài ‘‘Nghiên

cứu định lượng rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm từ cây cỏ ngọt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)’’

Hình i Tinh thể stevioside

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu khảo sát hệ dung môi thích hợp để chiết tách hỗn hợp các hợp chất trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm

- Nghiên cứu việc định lượng stevioside và rebaudioside A bằng phương pháp HPLC

- Xác định hàm lượng stevioside và rebaudioside A trong cây cỏ ngọt và một số sản phẩm thực phẩm

- Đề xuất việc sản xuất và sử dụng stevioside và rebaudioside A trong đời sống

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là dịch chiết từ cây cỏ ngọt (thân cành, hoa, lá) và các sản phẩm chế biến từ cỏ ngọt như lương khô, nước giải khát lipovitan

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu là nguồn tham khảo cho những nghiên cứu sản xuất stevioside và rebaudioside A từ cây cỏ ngọt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt

1.1.1 Giới thiệu [2]

- Tên thường gọi: Cỏ ngọt hay cỏ đường, cỏ mật,cỏ cúc

- Tên khoa học: Stevia rebaudiana

* Phân loại theo loài

Cỏ ngọt có khoảng 240 loài có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico

và một vài tiểu bang miền nam Hoa Kỳ

Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau : Stevia eupatoria, Stevia ovate, Stevia

plummerae, Stevia rebaudiana, Stevia salicifolia, Stevia serrata

Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo sát trên 184 loài cỏ ngoạt thì có khoảng 18

loài đã cống hiến chất ngọt nhưng trong 18 loài này Stevia ribaudiana là loài cho chất

* Nguồn gốc cây cỏ ngọt

Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ

Vào thế kỉ 16, các thủy thủ người Tây Ban Nha đã từng đề cập đến loại thảo mộc này nhưng đến năm 1888, các nhà thực vật học người Paraguay là Mises Santiago

Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi nó là Stevia rebaudianoa Bertoni

Từ ngàn năm nay, thổ dân Guarani người Paraguay đã dùng loại thảo mộc này để làm dịu ngọt các loại thức ăn, nước uống có tính đắng và cũng dùng để trị một số bệnh béo phì, tim mạch, cao huyết áp

1.1.2 Đặc điểm thực vật [2], [3], [4]

Thân cành:

Cỏ ngọt có dạng thân bụi thân tròn có nhiều lông, mọc thẳng.Chiều cao thu hoạch

là 50 – 60 cm, tốt đạt 80 – 120 cm, thân chính có đường kính đạt 2,5 – 8 mm Cỏ ngọt phân cành nhiều, khi ra hoa mới phân cành cấp 2, cấp 3 Cành cấp 1 thường xuất hiện

từ các đốt lá cách mặt đất 10 cm Thông thường, cây cỏ ngọt cho 25 – 30 cành Tổng

số cành trên cây có thể đạt 140 cành Thân non màu xanh, già màu tím nâu, có hệ thân mầm phát triển mạnh

Lá:

Mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có từ 12 – 16 răng cưa Lá hình trứng ngược Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm tròn tới cặp lá thứ tư mới có răng cưa ở mép lá Lá trưởng thành dài khoảng 50 – 70mm, rộng 17 – 20 mm, có 3 gân song song, lá màu xanh lục, trên thân có 70 – 90 lá

Hoa:

Hoa tự, nhóm họp dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4 – 7 hoa đơn lưỡng tính Mỗi hoa đơn hình ống có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh tràng màu trắng khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4 – 5 dính trên tràng có màu vàng sáng, các chỉ nhị rời còn bao phấn dính mép với nhau Bầu hạ 1 ô, 1noãn, vòi nhụy mảnh chẻ đôi, các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả năng tự thụ phấn thấp hoặc không có

Quả và hạt:

Quả và hạt của cây cỏ ngọt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu thẫm, 5 cạnh dài từ 2 – 2,5 mm Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi, nhưng nội nhũ trần nên tỉ lệ này mầm thấp

Rễ:

Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm Hệ rễ chùm lan rộng ở đường kính 40 cm và có độ sâu từ 20 – 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất tơi xốp, đủ ẩm Cỏ ngọt là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0 – 30 cm tùy thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất

1.1.3 Các giai đoạn sinh trưởng phát triển [4], [7]

1.1.3.1 Thời kì nảy mầm

Sau khi gieo hạt 9 – 10 ngày thì mọc, nhiệt độ thích hợp cho nảy mầm từ 20 –

250C, ẩm độ từ 60 – 85% Nhiệt độ dưới 150C, hạt không nảy mầm, trên 350C hạt sẽ chết Hạt nảy mầm sau 50 – 60 ngày mới đủ khỏe để cấy ra ruộng Cây con mọc từ hạt yếu Sản xuất cây con bằng cành giâm sau 5 – 10 ngày cành giâm bắt đầu ra rễ, rút ngắn thời gian ở vườn ươm xuống còn 14 – 20 ngày Điều kiện giai đoạn giâm cành: nhiệt độ từ 25 – 300C, ẩm độ từ 70 – 80%

1.1.3.2 Thời kì trưởng thành

Sau giai đoạn cây con, cỏ ngọt bắt đầu phát triển nhanh, có thể cắt lứa đầu sau khi trồng đến 30 – 45 ngày Nhiệt độ thích hợp thời kỳ này là 15 – 300C, độ ẩm 70 – 75%, nhiệt độ < 50C cây sẽ chết

1.1.3.3 Thời kỳ ra hoa

Cây cao từ 50 – 60 cm thì ra hoa, nếu thâm canh tốt có thể cao tới 80 cm mới ra hoa Cỏ ngọt là cây phản ứng với ánh sáng nên thường ra hoa từ tháng 6 – 10 dương lịch, từ tháng 10 – 12 cỏ ngọt chỉ cao từ 15 – 20 cm đã ra hoa Do đó, thời kì này cần tăng số lần thu hoạch

1.1.4 Phân bố và tình hình trồng trọt [5], [7]

1.1.4.1 Phân bố

Cỏ ngọt được trồng chủ yếu ở Paraguay, Brazil, Nhật Bản và Trung Quốc

Chúng được nhập vào nước ta từ năm 1988 trồng thử nghiệm Hiện nay, cỏ ngọt đã thích ứng với những vùng khí hậu khác nhau của nước ta, sinh trưởng tốt tại Sông Bé, Lâm Ðồng, Ðắc Lắc, Hà Nội, Hà Tây, Hoà Bình, Vĩnh Phú, Yên Bái

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất và sử dụng cỏ ngọt ở một số nước trên Thế giới

[7]

Năm lượng Sản

(tấn)

Nguồn cỏ ngọt (tấn) Nhật

Bản

Hàn Quốc Loan Đài

Trung Quốc Các nước khác

Hiện nay, cỏ ngọt được trồng rất nhiều và diện tích ngày càng được người dân

mở rộng ở huyện Khoái Châu của tỉnh Hưng yên Điển hình là ở xã An Vĩ – địa phương trồng nhiều cỏ ngọt nhất ở huyện này, diện tích trồng cỏ ngọt đã lên đến gần

25 ha Gần đây, trên địa bàn tỉnh Bắc Giang, Công ty Cổ phần Stevia Ventures và Trung tâm Nghiên cứu Giống

và Phát triển cây trồng Hà Nội

(Viện Dược liệu) phối hợp với

Sở Khoa Học và Công Nghệ

Bắc Giang, UBND xã Nội

Hoàng (huyện Yên Dũng) đã tổ

chức hội nghị triển khai dự án

cây cỏ ngọt với kế hoạch là mở

rộng diện tích vùng nguyên liệu

cỏ ngọt để đáp ứng thị trường

xuất khẩu

Mỗi lứa cỏ, nếu chăm sóc tốt chỉ khoảng 1 tháng là cho thu hoạch Tuy nhiên, nhiều hộ có kinh nghiệm trồng cỏ ngọt cho biết, cỏ ngọt đòi hỏi cả công chăm sóc, vốn đầu tư về phân bón, thuốc bảo vệ thực vật và kỹ thuật canh tác nên chi phí cho trồng

cỏ ngọt cũng cao hơn nhiều so với trồng lúa Đất trồng cỏ phải đánh luống cao, có rãnh chứa nước và thoát nước, đủ độ ẩm thường xuyên nhưng không được ngập úng

Hình 1.3 Cánh đồng cỏ ngọt

Nên nếu giá thu mua cao thì người dân lãi cao, nếu giá xuống thấp cộng với năng suất giảm thì sẽ lãi ít hoặc thua lỗ Chỉ cần những rủi ro nhỏ như: nắng dài ngày thiếu nước tưới, mưa vài ngày không tiêu nước kịp là có thể bị mất trắng Mặt khác, việc trồng và mua bán cỏ ngọt tại Khoái Châu vẫn ở dạng tự phát, tiêu thụ sản phẩm dựa vào tư thương, giá cả biến động theo thị trường nên dù hiện nay giá cao nhưng bấp bênh, đầu ra không ổn định

Thành phần hóa học của cỏ ngọt rất phức tạp, có hàng chục glycoside khác nhau

và sau đây là các chất tạo ngọt chính trong của cỏ ngọt :

Bảng 1.3 Thành phần hoá học các chất tạo ngọt chính trong cây cỏ ngọt [7]

so với glucose

Hàm lượng (%)

1.2 Tổng quan về stevioside và rebaudioside A [3], [10]

khác nhau, cũng nhƣ liên quan đến các tính chất cảm quan riêng của mỗi chất

Phân tử Stevioside gồm nhóm steviol liên kết với một glucose (bằng liên kết β)

và phần còn lại là một glucose-glucose disaccharide (hai phân tử β-D-glucose liên kết

với nhau bằng liên kết 2-1, hay còn đƣợc gọi là sophorose)

Sophorose

Hình 1.5 Công thức hóa học của stevioside, gồm nhóm steviol liên kết với một phân tử

β – D – glucose và một sophorose

Hình 1.4 Nhóm Steviol

Người ta nhận thấy stevioside ngoài vị ngọt còn có hậu vị đắng Vài dạng chất ngọt tương tự khác đã được nhận biết (có ít nhất tám loại steviol glycoside), tuy nhiên chúng chưa được nghiên cứu rõ và không cho lợi ích thương mại cao bằng stevioside

và rebaudioside A

Steviol glycoside có thể được phân tích bằng phương pháp HPLC sử dụng nước/ acetonitrile C2H3N là chất tách rửa

Hình 1.6 Sự liên kết của steviol và các carbohydrate để tạo thành

steviolmonoside, steviolbioside, stevioside và rebaudioside A

1.2.2 Tính chất vật lý

Stevioside là chất tạo ngọt bền vững Một nghiên cứu chi tiết đã kiểm tra tính bền vững của chất tạo ngọt này cho thấy, chúng có tính ổn định khi tiến hành kiểm tra trong acid phosphoric carbonate và trong các loại nước giải khát có chứa acid citric Sau hai tháng cất giữ ở 370C, người ta đã xem xét những sự thay đổi có thể xảy ra, nhưng không có biến đổi nào được ghi nhận đối với các sản phẩm nước giải khát được lưu trữ tại nhiệt độ phòng, kết quả tương tự khi lưu trữ với nhiệt độ thấp hơn trong vòng 5 tháng bằng cách phơi nắng trong 1 tuần thì stevioside hoàn toàn bền vững Đặc biệt, Stevioside không tạo calorie, không lên men và rất ổn định ở nhiệt độ cao

198oC (388oF ), không trở nên xạm màu, và cũng không trở thành đường caramel đặc

là stevioside), đồng thời cho cảm giác giống tính chất của cam thảo

Mặc dù nhiều cố gắng từ rất sớm để nhân giống và phát triển rộng cây Stevia

rebaudiana không thành công nhưng những nỗ lực đáng kể ở Nhật cuối cùng cũng cho

kết quả khả quan Ngày nay, cây Stevia rebaudiana được trồng từ rễ và được trồng

thương mại rộng khắp ở nhiều quốc gia, gồm Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc, Trung Quốc và Brazil Thành phần của steviol glycoside phụ thuộc vào nguồn cây trồng, nhưng trong đa số các trường hợp, stevioside là dạng chiếm ưu thế hơn Do stevioside

có một hậu vị đắng dễ nhận thấy, nên chất làm ngọt này chưa được chấp nhận ở một số thị trường, và trong nhiều năm chỉ phổ biến ở một thị trường vừa phải

1.3 Một số sản phẩm đường ăn kiêng trên thị trường [7]

Trên thị trường hiện nay có các loại sản phẩm đường được chế biến từ chiết xuất

stevioside của cây cỏ ngọt như sau:

1.3.1 Thuốc thay thế đường trắng cho người béo phì

Tên gọi: Thuốc số 104 stevia

Công dụng:

Hạ đường huyệt cho bệnh nhân bị bệnh tiểu

đường Ngoài ra, sản phẩm này còn có tác dụng

là giảm sự thèm ăn đường, ăn tinh bột và nhờ vậy

mà hiện nay stevia đang rất thịnh hành với các

bệnh nhân tiểu đường hoặc những người muốn

xuống cân

Sản phẩm này không những được ưa

chuộng tại Mỹ mà còn nhiều nước khác trên thế

giới

Hình 1.7 104 Stevia

1.3.2 Tinh chất bột thay thế đường

Tên gọi: 105 stevia

Công dụng:

- Sản phẩm này cũng có công dụng

giống như sản phẩm 104 stevia nó thay thế

đường trắng đối với người béo phì

- Giảm thiểu sự thèm ăn đường, ăn

tinh bột

- Dùng cho các bệnh nhân tiểu đường

hoặc những người muốn xuống cân

1.3.3 Stevia Extract trắngbột (25 g)

Thành phần: 100% chất chiết từ stevia

nguyên chất trong đó có tối thiểu là 90%

stevioside (gồm 40% rebaudiosde A)

Đặc điểm:

- Sản phẩm này rất ngọt không có dư vị

đắng khi sử dụng ít

- Stevia Extract có nhiệt độ ổn định và

an toàn cho bệnh nhân tiểu đường vì không

có calore, không carbohydrats và không

hypoglycemics

- Có chất lượng tinh khiết cao

- Được Kosher chứng nhận

- Stevia extract được sử dụng cho các loại

bánh nướng và các nhu cầu của nấu ăn

Hình 1.8 105 stevia

Hình 1.9 Stevia Extract trắng bột

1.3.4 Stevia Plus Fiber Packets

Mô tả: Dạng gói nhỏ cho vào hộp giấy,

trong hộ có 100 gói nhỏ, mỗi gói nhỏ có

- Không đường tinh chế, không

maltodextrin, không saccarin

- An toàn cho bệnh nhân tiểu đường vì không có carbohydrate và có chứa chất

Đây là chất ngọt tự nhiên, được bào

chế dưới dạng viên thuốc herboagar

Stevia có dạng gần đường và đang được sử

dụng như một dạng thay thế đường và chất

ngọt nhân tạo Sử dụng stevia tinh khiết,

duy trì các điều kiện vệ sinh tiêu chuẩn

làm cho sản phẩm này rất hữu ích cho tất

cả các cá nhân có ý thức và giúp y tế trong

việc quản lý các bệnh

Công dụng:

- Tiểu đường: giúp kích hoạt các tế

bào của tuyến tụy tiết insulin

- Nhiều hơn đồng thời làm tăng dung

Hình 1.10 Stevia Plus Fiber Packets

Hình 1.11 Stevia dạng viên nén

nạp glucose ở bệnh nhân tiểu đường

và hương liệu tự nhiên

- Công dụng: làm nước giải khát, mát gan,

thông mật, giải độc, an thần, hạ cholesterol

- Do trung tâm cây thuốc Đà Lạt sản xuất

1.4.2 Chè sâm quy – Cỏ ngọt

- Thành phần: sâm ngọc linh, tam

thất, đương quy, thục địa, táo, long nhãn,

ngũ gia bì và cỏ ngọt

- Công dụng: bổ huyết, tăng lực, tiêu

hóa, tiêu độc, giải nhiệt, giúp giảm tiêu

đường, ngủ ngon

- Do trung tâm cây thuốc Đà Lạt

sản xuất

1.4.3 Chè Stevin

- Thành phần: lá dừa cạn (Folia vincae roseae), cúc hoa (Flores chrysangthemi

sinensis), hoa hòe (Flores sopharae japonica) và cỏ ngọt

- Công dụng: tăng sức đàn hồi, làm bền vững thành mạch máu, có tác dụng lưu thông khí huyết, chống nhiễm xạ

- Do xí nghiệp Dược phẩm trung ương 2, Hà nội sản xuất

Hình 1.13 Chè sâm quy – Cỏ ngọt

Hình 1.12 Chè Artiso – Cỏ ngọt

người mắc bệnh tiểu đường, béo

phì, người có bệnh tim mạch, cao

huyết áp phải kiêng đường kính

1.5 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [1], [8]

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương

pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

1.5.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ

sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

1.5.2 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

- Sắc ký phân bố (partition chromatography)

- Sắc ký ion (ion chromatography)

- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000)

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography)

* Sắc ký pha thường:

- Pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái

- SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

- Trong pha thường, chất kém phân cực ra trước, chất phân cực ra sau

- Dung môi rửa giải là các dung môi kém phân cực như n - hexan, benzen, ete dầu hỏa,

- Trong pha đảo, chất phân cực ra trước còn chất kém phân cực ra sau

- Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT

1.5.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

- Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng – lỏng (liquid – liquid chromatography)

- Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

+ Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng – lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

+ Do pha tĩnh của sắc ký lỏng – lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

1.5.4 Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

- Hòa tan mẫu phân tích

- Phù hợp với đầu dò

- Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

- Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

- Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade)

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải Dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index),

độ rửa giải (eluent strength) Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký

Bảng 1.4 Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng [7]

cực (ε)

Độ rửa giải (ξ)

Độ nhớt (cP) ở

25 o C

Chỉ số khúc xạ (ở 25 o C)

Nhiệt độ sôi ( o C)