Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất

Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất

Phần 1 MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Vi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong côngtác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiệncho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất của

một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus….

Trong đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B1, G1, B2 và G2, có thể gây bệnh ởmức vi lượng

Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis,rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sảnxuất giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết Do

đó, hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thấtlớn

Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxinnhiễm từ sữa mẹ truyền cho con

Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vìaflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong môi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt Do vậy,việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxintrong thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết

Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch,

cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc

kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải quanhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn Trước những khó khăn trên, sắc kí

ái lực miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong côngđoạn tinh sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữakháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp kháckhông có được; quy trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản

đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích

Trong số các aflatoxin, aflatoxin B1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộngkhắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B1 cao hơn nhiều sovới các aflatoxin khác

Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài

Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1 Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho

hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B1

Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính,cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật nuôi, hơn nữa cấu trúc hoá học lại khátương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hànhnghiên cứu

Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS.TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh và TS Nguyễn Ngọc Hải,

tôi tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch

do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”.

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Đại cương về aflatoxin

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1960 ở Anh, một vụ dịch bệnh xảy ra làm chết 100.000 gà tây con, khi

mổ xác thấy có xuất huyết hoại tử ở gan kèm tổn thương ở thận mà nguyên nhânkhông được biết rõ Do đó, người ta gọi là bệnh “X” của gà tây

Sau đó, những vụ tương tự cũng được quan sát thấy trên vịt con ở Áo, gà giò

ở Tây Ban Nha, cá hồi ở Mỹ, trĩ con ở Uganda…Các nhà bác học đã nhanh chóngtìm ra mối liên hệ giữa các vụ ngộ độc đó với việc cho ăn khô dầu đậu phộng và họcũng thấy rằng bệnh này không những xảy ra đối với gia cầm mà còn với cả giasúc, đặc biệt là heo, bê, cừu…

Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan,

các nhà bác học đã quan sát và phân lập được loài vi nấm Aspergillus flavus trên

các hạt đậu mốc và lúa mì mốc Việc tinh chế các độc tố từ các loại hạt bị nhiễm

nấm Aspergillus cho ra một loại hợp chất mà trong bản báo cáo của Forgacs và

Carl xuất bản năm 1962, người ta gọi là aflatoxin (A: Aspergillus, fla: flavus vàtoxin có nghĩa là chất độc)

Đến nay, aflatoxin được biết là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp qua con

đường polyketide của một số loài nấm thuộc chủng Aspergillus flavus (khoảng 50% chủng), Aspergillus parasiticus (100% chủng) (Klick và Pitt, 1988)[4], Aspergillus nomius; ngoài ra còn có Penicillium spp, Rhizopus spp nhưng ít có vai trò gây bệnh trong thực tế Ở A flavus và A parasiticus, con đường sinh tổng hợp

aflatoxin liên quan ít nhất 16 phản ứng enzyme được mã hóa bởi 25 gen tập trungthành nhóm trong một vùng DNA 70 kilobase trên nhiễm sắc thể [19]

(1) (2)

Hình 2.1: A flavus (1) [20] và A parasiticus (2) [21].

Việc khám phá ra aflatoxin đã kích thích các nhà khoa học nhiều ngành tậptrung nghiên cứu về tất cả các mặt của aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới sức khoẻ củacon người và động vật.

2.1.2 Phân loại

Có thể nói Sargeant (1962) là người có công xác định các độc tố này Chúng

là các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau và có khung hoá học giống với dẫnxuất của cumarin nên gọi là flavacumarin Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin,

2 nhân furan và 1 vòng lacton [11]

Hiện người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998)[4]

Các aflatoxin được sản xuất trong tự nhiên gồm 4 loại, kí hiệu AFB1,AFB2, AFG1 và AFG2 (được gọi tên do tính chất phát huỳnh quang dưới tia UV:B: Blue; G: Green) Aflatoxin nhóm B và nhóm G khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có

1 nhóm chức lacton trong khi nhóm G có 2 chức lacton

O

OO

OO

OMe AFB1

OO

O

OO

OMe AFG1

L

F: Vòng furan C: Vòng cumarin L: Vòng lactone

P: Vòng pentenone

Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của AFB1 và AFG1.

Các loại aflatoxin khác là do sự chuyển hoá của các aflatoxin trên trong nấm

và trong cơ thể động vật

 AFB2 và AFG2 là dẫn xuất hydro hoá của AFB1 và AFG1

 AFB2a và AFG2a là dẫn xuất hemiacetal của AFB1 và AFG1

 AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của AFB1 và AFB2 tìm thấy trong sữa,thận và gan động vật

 Ngoài ra: AFGM1, AFGM2, AFM2a, AFGM2a, AFB3 (parasiticol),dihydroaflatoxin B3, Ro (aflatoxicol), dihydoaflatoxicol, AFP1,AFQ1…

O O

O O

OMe

O

O O

O

O O

OMe

O

O O

O O

O

O

O O

O

O O

O

O

O O

O O OH

OMe

O

O O

O O OH

Hầu hết các loại aflatoxin đều phát huỳnh quang ở khoảng bước sóng 440

nm khi kích thích bởi ánh sáng có độ dài sóng khoảng 365 nm [10]

Các đặc tính lí hóa được trình bày trong phụ lục 1

2.1.4 Tác động sinh học

Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và conngười Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứatuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ của cơ thể, môi trường và hàmlượng chất độc ăn phải

Hấp thu qua đường tiêu hoá là giai đoạn đầu tiên của sự xâm nhập AFB1vào cơ thể với 3 kiểu hấp thu qua niêm mạc ruột: khuyếch tán, hoà tan trong lipid

và vận chuyển nhờ protein mang Sau đó, AFB1 được vận chuyển trong hệ tuầnhoàn nhờ liên kết với các tế bào máu hoặc protein huyết tương (90% ở dạng liênkết với albumin) Sau khi vào gan qua hệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủyếu ở gan [11] Tại đây, AFB1 có sự chuyển hóa phức tạp:

O

O O

O O

OMe

O

O O

OMe

O

O O

O O

O

OMe

O

O O

O O

O

O O

O O

O O OH

OMe

O

O O

O O

OH OMe Protein adducts

GLUCURONIDE Conjugates

DNA adducts

AFQ1 AFM1

AFB2a

Milk AFB1-dhd

Hình 2.4: Các sản phẩm chuyển hoá cuả AFB1 [13].

Các chất chuyển hóa được cơ thể cố gắng bài thải, như: AFM1 và AFM2 quasữa; AFP1 và AFQ1 qua nước tiểu

Đáng kể, dưới xúc tác của hệ enzyme monooxygenase trong cytochrome P450(CYP 450) rất phong phú ở tế bào gan, chất tạo thành là AFB1-8,9-epoxide được coinhư chất biến dưỡng có hoạt tính rất cao, có thể gắn với các đaị phân tử (DNA, RNA

và protein) làm rối loạn hoạt động bình thường của tế bào (Swenson, 1975)

Tính gây độc cấp thể hiện qua liều gây chết 50% (LD50).

Bảng 2.1: LD 50 của AFB1 cho uống một lần duy nhất trên động vật (Ciegler, 1975) [2]

Loài động vật(Xếp theo thứ tựmẫn cảm)

cơ chế phân tử:

O

O

O O

OMe

O

O O

O O O

H O

enzyme Gan

O

O O

CH O

OH H C

H O

OMe

O OMe

N N

H C=O

CH R3 R4

N H R2 C=O

O

O O

C H O

OH H C

H N C H R1

Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của AFB1 ở mức tế bào gan (Cliford and Rees, 1967) [5]

Ở đây, nhóm Dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạothành kiềm Shiff (Shiff’s base) Các kiềm Shiff có thể ức chế sinh tổng hợp DNA,RNA dẫn đến ngăn cản tổng hợp protein làm cho hoạt động ở gan bị rối loạn tạo nêntình trạng nhiễm độc cấp tính

Như vậy, AFG1 cũng có thể tạo thành kiềm Shiff do cũng mang liênkết đôi ở vị trí 8,9 ở đầu cùng trên vòng furan Liên kết này được bão hoà trong cấutrúc của AFB2 và AFG2, do đó, không thể trực tiếp tạo thành kiềm Shiff nên mangtính độc ít hơn so với AFB1 và AFG1[5]

2.1.4.2 Độc tính mãn

Thường xảy ra nhiều hơn so với nhiễm độc cấp tính và có tác độngdài hơn do cơ thể có thể chịu đựng được một mức nào đó trong khẩu phần

Khi có sự nhiễm độc mãn tính, các triệu chứng thấy được là kém ăn

và chậm lớn; gan chịu ảnh hưởng nhiều nhất: gan tụ huyết, xuất huyết Khi kiểm tra vithể thì xuất hiện sự thoái hoá tế bào biểu mô, thoái hoá mỡ gan, tế bào lympho bị thâmnhiễm Nhiễm độc kéo dài sẽ gây đột biến, ung thư gan Nếu nhiễm aflatoxin trongthời kì mang thai, thai sẽ bị tật, chết hoặc sinh quái thai (Nguyễn Lê Trang, 2003) [2].Năm 1988, IARC đã xếp AFB1 vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người,đặc biệt là ung thư gan [22] Nếu hấp thu 2,5 mg aflatoxin trong 89 ngày sẽ thấy xuấthiện ung thư gan sau một năm Tại Việt Nam đã có công trình nghiên cứu tìm

aflatoxin trong dịch cổ trướng bệnh nhân ung thư nguyên phát đều có hàm lượng từ1,1 – 3,5 ppb [13].

Cơ chế phân tử của nhiễm độc mãn tính:

O

O O

O O

O

OMe

O O

O

O N N

O O OMe

OH

N

H2

O OPO3

O3PO

N N+

-

-DNA

O OH

-O O

O

O N N H

O O OMe

OH

N

H2

O OPO3

O3PO

N H N

-

-CHO

AFB1-N7-Gua

AP Site

AFB1-FAPY DNA Adduct

AFB1-8,9-exo epoxide

AFB1-N7-Gua DNA Adduct

Hình 2.6: AFB1-8,9-epoxide gắn vào DNA (Smela và ctv, 2001) [14].

AFB1-8,9-epoxide gắn kết đồng trị lên DNA ở vị trí N7 của mộtguanine Do cầu nối glycoside mất ổn định, nhóm purine có thể bị tách khỏi DNA.Hoặc khả năng khác là vòng imidazole trong cấu trúc purine bị mở ra thành cấu trúcformamidopyrimidine (AFB1-FAPY) ổn định và tồn tại trong điều kiện sinh học Cácđiểm đột biến do AFB1 thường nhận thấy là sự đảo chuyển GC TA (dị hoán) Điểmnóng của đột biến đã được phát hiện là ở vị trí thứ ba trong đơn vị mã (codon) 249 củagen p53 Gen này mã hoá cho một phosphoprotein có hoạt tính tăng cường hoặc kiềmchế phiên mã của một số gen có chức năng kiểm soát chu trình nhân lên của tế bào, đểngăn ngừa tế bào tăng sinh thành tổ chức bất thường, có thể dẫn đến hình thành u Khicấu trúc DNA bị biến đổi, tế bào phản ứng lại bằng cách thể hiện nhiềuphosphoprotein p53 để ức chế sự sao chép của DNA bị biến đổi Nếu thời gian sửa

chữa lại DNA kịp thời (do một số enzyme) trước khi DNA biến đổi được sao chép,bảo tồn di truyền được ổn định Các chất độc di truyền tác động trực tiếp hay gián tiếpđều làm tăng mức protein p53 tế bào Khi AFB1 tác động vào gen p53 làm protein p53

bị biến đổi, mất hoạt tính, hậu quả là tế bào tăng trưởng không kiểm soát dẫn đến hìnhthành khối u (Bennett và Klich, 2003) [14] Liên quan giữa nhiễm siêu vi viêm gan B(HBV), ung thư tế bào gan và vai trò của p53 cũng đã được khảo sát và nghiên cứunhiều Với bệnh nhân trong nước tiểu có AFB1-N7-Gua, tỉ lệ phát ung thư tế bào gancao hơn 3 lần so với trường hợp âm tính Với bệnh nhân có kháng nguyên bề mặtHbsAg trong huyết thanh, tỉ lệ này là 6 lần cao hơn bệnh nhân âm tính HbsAg Và nếuxuất hiện cả AFB1-N7-Gua và HbsAg, tỉ lệ này cao gấp 60 lần [14]

2.1.5 Sự hiện diện của aflatoxin trong thực phẩm

Theo tài liệu của FAO, không có thực phẩm nào được xem như an toàntuyệt đối khỏi sự nhiễm độc tố vi nấm, và sự nhiễm độc tố này xảy ra ở mọi giai đoạn

từ lúc cây trồng còn ở ngoài đồng đến khi thu hoạch, chế biến, bảo quản và vậnchuyển Và theo ước tính của FAO, hơn 25% sản phẩm nông nghiệp trên thế giới bịnhiễm độc tố vi nấm [4] Hầu hết các số liệu liên quan cho thấy sự nhiễm aflatoxinthường xảy ra nhất ở đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng, bắp và các loại hạtkhác như gạo, lúa mì, đậu nành, hạt bông vải… Theo Carlos A Muro-Cacho (2004),

sự tiêu thụ aflatoxin của con người từ 0 – 30000 ng/kg/ngày, trung bình từ 10 – 200ng/kg/ngày [15]

Nước ta có điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm thích hợp cho sự phát triển vinấm và sản sinh độc tố trong thực phẩm, nhất là aflatoxin Do đó, vấn đề an toàn thựcphẩm được đặt ra nhằm hạn chế những thiệt hại về kinh tế (gây chết đàn vịt, gà, lợn…)cũng như bảo đảm an toàn thực phẩm cho người, vì những dạng chuyển hóa củaaflatoxin còn độc tính vẫn có thể hiện diện trong gan, sữa, trứng, là những thức ănhằng ngày của người

2.1.6 Giới hạn về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc

Aflatoxin hiện diện trong thực phẩm như là một sự nhiễm bẩn tự nhiên nêncon người không thể kiểm soát để ngăn chặn chúng Dựa vào nhiều yếu tố như: số liệugiám sát, sự phân bố aflatoxin trong thực phẩm, dữ liệu về độc chất học, phương phápphân tích và tiêu chuẩn cho phép của các quốc gia có quan hệ mua bán với nhau mà

từng quốc gia, từng khu vực trên thế giới ra các quy định giới hạn hàm lượng aflatoxintổng cộng tối đa cho phép trong các loại thực phẩm và thức ăn gia súc khác nhau.

Bảng 2.2: Quy định hạn chế mức nhiễm aflatoxinB1 trong thực phẩm ở Pháp [14]

Loaị thực phẩm Đối tượng sử dụng Giới hạn (ppb)

Ở Việt Nam, giới hạn về hàm lượng aflatoxin cho phép có trong thực phẩm

hiện đang áp dụng theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm

ban hành kèm theo quyết định số 867/1998 / QĐ-BYT

Bảng 2.3: Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm ở Việt Nam

STT Tên độc tố vi nấm Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối

đa cho phép (ppm)

1 Aflatoxin tổng số hoặc B1 Thức ăn 10

3 Các độc tố vi nấm khác Thức ăn 35

Bảng 2.4: Hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm

(Ban hành theo quyết định số 104/2001 QD-BNN của Bộ Nông Nghiệp và Phát TriểnNông Thôn ngày 31-10-2001)

2.2 Các phương pháp phân tích aflatoxin

2.2.1 Phương pháp sinh vật học

Phương pháp này đã được sử dụng đầu tiên, chủ yếu dựa vào tính mẫncảm của một số loài sinh vật được thử nghiệm với aflatoxin Đây là phương pháp định

tính hay bán định lượng, không chuyên biệt đối với từng độc tố nhưng đơn giản và dễthực hiện.

Thử nghiệm độc tính trên phôi gà (Chicken Embryo Bioassay): Chiết mẫubằng chloroform cô đặc có nồng độ khoảng 200-300 ng/ml, sau đó tiêm vào buồng khíhoặc lòng đỏ của trứng gà Leghorn trắng đã thụ tính và ấp trong 5 ngày, phôi gà sẽchết trong vòng 2 ngày nếu có aflatoxin Thử nghiệm này đã được đưa vào tiêu chuẩnAOAC [10]

Ngoài ra, độc tính của aflatoxin còn được thử nghiệm trên vịt con mới

sinh, ấu trùng của loài giáp xác, tế bào động thực vật nuôi cấy, trên vi khuẩn Bacillus megaterium, trên cá hồi…[10]

2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lí

Các phương pháp này dùng phát hiện và định lượng aflatoxin nhanh, chínhxác và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương pháp sinh học; hiện nay được dùngchủ yếu trong các phòng thí nghiệm

Các giai đoạn cơ bản:

2.2.2.1 Lấy mẫu

Mục đích: Lấy mẫu đại diện cho lô hàng hay đối tượng khảo sát.Thông thường, tuỳ theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩmcần phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượngkhác nhau Các mẫu này được tiến hành đồng nhất và từ mẫu đồng nhất này, một

lượng thích hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích aflatoxin, thường từ 20-100gtuỳ thuộc vào loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu.

Chiết aflatoxin: do aflatoxin tan được trong các dung môi hơiphân cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường đượcchiết với các dung môi hữu cơ như dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone,chloroform, hay methanol Thông thường, hỗn hợp dung môi hoặc những dung môivới một lượng nhỏ nước và acid được thấy là hữu hiệu nhất Trong khi độ hoà tan củaaflatoxin trong nước thấp, dung môi có nước có thể thấm vào các mô ưa nước làm cho

sự chiết tách hữu hiệu hơn

Quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắcthông thường trong 30 phút hoặc dùng máy xay tốc độ cao trong 1-3 phút

Một số phương pháp chiết:

 Chiết bằng dung môi chloroform-Phương pháp EEC(European Economic Community)

 Chiết bằng dung môi methanol

- Phương pháp BF (Best Food)

- Phương pháp VICAM

2.2.2.3 Làm sạch mẫu

Mục đích: Loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùngaflatoxin trong dịch chiết mẫu để tránh ảnh hưởng đến việc xác định aflatoxin cũngnhư việc tạp chất sẽ làm bẩn cột, mất thời gian rửa cột và làm giảm tuổi thọ của cột

Các kĩ thuật làm sạch

 Tủa các tạp chất không mong muốn: thường dùng để làmsạch các dịch chiết có nguồn gốc thực vật Các hoạt chất dùng là các muối kim loạinặng, ví dụ Pb(CH3 COO)2, AgNO3, Zn(CH3 COO)2, CuCO3…

 Phương pháp chiết pha lỏng-lỏng: thực hiện trong phễuchiết bằng cách chuyển aflatoxin từ dung môi chiết (acetone hay methanol) vào dungmôi khác (ví dụ như chloroform)

 Loại tạp bằng sắc kí hấp phụ: Kĩ thuật này hiện nay đãđược phát triển và dùng rất nhiều do ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốttrên nhiều loại mẫu khác nhau Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phaseextraction) được chế tạo sẵn chứa các chất nhồi LC-CN có khả năng bắt tốt cácaflatoxin ở hàm lượng thấp Thể tích đưa vào cột rất ít (1-3ml), khả năng loại tạp rấtcao, thích hợp cho phân tích bằng HPLC [12] Tuy vậy, với những giá rắn từ các chấtkhông phân cực như: C18, C8, C2, cyclohexyl, phenyl, florisil…liên kết với aflatoxinhoặc với các tạp chất theo cơ chế kỵ nước không có tính chọn lọc, phân giải kém trongnhiều trường hợp, và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm tỉ lệ nhỏ so với tạp chất [14]

2.2.2.4 Cô đặc mẫu

Chất chiết sau khi được làm sạch thường được cô đặc bằng cáchcho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồichưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ Cặn được hòa tan vào một lượng thể tích nhỏtrước khi qua giai đọan xác định

2.2.2.5 Phát hiện và xác định hàm lượng

Các phương pháp sắc kí thường được sử dụng, dựa trên nguyêntắc phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần táchqua lớp sắc kí Pha tĩnh có tính liên kết với aflatoxin làm chậm sự di chuyển của cácchất (do các đặc điểm lí hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng

Bảng 2.5: Các phương pháp sắc kí trong phân tích aflatoxin

t Cột thủy tinh hay PE có Ø= 5-6

mm, dài khoảng 20 cm được nhồi các

- tốn ít thời gian:

15-30 phút.

- là phương pháp bán định lượng nhanh nhằm

alumina, silicagel và florisil Calcium

sunphate có tính giữ nước được nhồi

ở hai phía đầu.

Cho mẫu chiết vào cột, chảy qua cột nhờ trọng lực Lớp chất hấp phụ

sẽ giữ AFT lại và ta phát hiện được

khi cho cột chiếu dưới đèn UV λ=

365 nm, có vết huỳnh quang màu

xanh tím ở lớp florisil So sánh với

một cột chuẩn chứa lượng AFT đã

biết, ta có thể đánh giá mẫu chứa AFT

ít hay nhiều hơn so với chuẩn.

- không cần thiết bị phức tạp, đắt tiền.

- có thể dùng tiện lợi trên hiện trường

- thích hợp ở các nước đang phát triển

đánh giá sơ bộ.

- kém nhạy, mức phát hiện khá cao: 20 ppb.

- Không phân biệt các AFT khác nhau.

được nhỏ lên cùng bản mỏng Sau đó,

bản mỏng được cho vào dung môi

khai triển để các đơn chất trong hỗn

hợp có thể tách rời nhau khi di

chuyển bằng lực mao quản.

Việc phát hiện và định lượng tiến hành dưới tia UV có λ= 365nm Dùng

máy densitometer hay mắt để so sánh

cường độ sáng của các đốm mẫu và

đốm chuẩn, từ đó suy ra nồng độ

aflatoxin trong mẫu.

- tương đối đơn giản

- thường sử dụng nhất ở các nước đang phát triển và trong các phòng thí nghiệm.

- khá rẻ tiền so với HPLC.

- Độ nhạy khá cao:

0,5-5 ppb.

- kĩ thuật TLC 2 chiều cho kết quả rất tốt và mức phát hiện cũng thấp, có thể so sánh với HPLC.

- mang tính bán định lượng.

- kết quả phụ thuộc vào người phân tích.

- độ chính xác không cao

do lệ thuộc vào mắt người đọc Densitometer cho độ chính xác cao hơn nhưng không thông dụng cho các phòng thí nghiệm địa phương.

- sai số khoảng 30%.

Vì AFT có độ phân cực thấp nên thích

hợp cho HPLC pha đảo Cột sắc kí

pha tĩnh có độ phân cực thấp sẽ có ái

lực lớn với AFT, sẽ giữ hết AFT trên

cột, dung môi pha động có độ phân

cực cao sẽ tách lần lượt các AFT ra

khỏi cột theo thứ tự độ phân cực của

các AFT giảm dần Việc tạo dẫn xuất

trước qua cột với TFA hay sau qua

cột với I 2 (hoặc Br 2 ) làm tăng khả

năng phát hiện và định lượng Sử

dụng đầu dò hùynh quang với λ Exc =

365 nm và λ Em = 435 nm Dựa vào

thời gian lưu để định tính; dựa vào

diện tích các peak của mẫu và chuẩn

để xác định nồng độ AFT trong mẫu.

- tự động hóa nhiều thao tác.

- khả năng phân giải

và phát hiện cao,

độ nhạy: 0,1 ppb

- cho kết quả định lượng tốt.

- thiết bị đắt tiền.

- tốn thời gian

- dung môi, hợp chất chlor gây ô nhiễm môi trường.

- cần dung môi siêu tinh khiết.

2.2.3 Phương pháp miễn dịch học

Phương pháp này dựa trên nguyên lí kết hợp đặc hiệu giữa khángnguyên và kháng thể Vì aflatoxin là một phân tử nhỏ (hapten) nên nhiều phương phápmiễn dịch học thông thường (chẳng hạn “ELISA kẹp” (sandwich ELISA)) tỏ ra khônghiệu quả

Để phát hiện aflatoxin, một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiệnnay là phương pháp ELISA cạnh tranh (competitive ELISA), hoạt động theo quy tắc:AFT cần xác định cạnh tranh với một lượng cố định (AFT – enzyme) để liên kết đặchiệu vào kháng thể đã được gắn trên pha rắn (polystyrene) Sau đó, các AFT - enzyme

bị giữ lại được xác định bằng cách thêm vào một cơ chất có tính đổi màu khi phản ứngvới enzyme Cường độ màu tạo ra được đo bằng quang phổ kế, máy đọc (Elisa reader)hoặc bằng mắt Nồng độ AFT - enzyme càng thấp thì nồng độ AFT trong mẫu càngcao Thông thường, người ta tạo một đường chuẩn (standard curve) và kết quả tínhtoán dựa trên kết quả đo lường cường độ màu của mẫu

Tạo huyết thanh thỏ kháng aflatoxin B1

Tinh chế kháng thể

Cộng hợp kháng thể lên giá thể

Phương pháp này nhằm sàng lọc cùng một lúc nhiều mẫu Ưu điểm củaphương pháp là thực hiện dễ dàng; việc phân tích nhiều mẫu cùng lúc sẽ làm giảm chiphí cho xét nghiệm Tuy nhiên, độ nhạy và khả năng lặp lại của phương pháp còn kém

Do đó, một phương pháp khác ra đời: phương pháp dùng sắc kí ái lực miễn dịch(Immunoaffinity Chromatography) để đồng thời cô đặc và tinh chế aflatoxin của mẫucần thử nghiệm

2.3 Sắc kí ái lực miễn dịch

Qui trình phân tích aflatoxin của các phương pháp đề cập trên phải qua nhiều giaiđoạn chiết xuất, làm sạch và cô đặc Việc định tính và định lượng aflatoxin dễ bị sai số

do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn

Hơn nữa, với nhu cầu ngày càng lớn của công nghệ thực phẩm, yêu cầu về chấtlượng cuộc sống ngày càng tăng, qui định về tiêu chuẩn an toàn thực phẩm ngày càngtrở nên nghiêm ngặt; đặc biệt, trong giao dịch quốc tế, với nhu cầu về độ tin cậy caotrong các kết quả phân tích, thì một kĩ thuật sắc kí mới ra đời, đó là sắc kí ái lực miễndịch (IAC), sử dụng kháng thể đặc hiệu với aflatoxin(s) mang nhiều ưu điểm mà cácphương pháp hóa lí không có được:

 Mang tính chọn lọc, có khả năng loại trừ các tạp chất để đạt kết quả xétnghiệm đáng tin cậy Ưu điểm này được xem là tiến bộ nhất

 Tỉ lệ thu hồi aflatoxin có tính thuyết phục rất cao

 Rất đơn giản

 Thời gian phân tích nhanh

 Sử dụng ít dung môi hữu cơ (chloroform ) nên thân thiện với môi trường

 Việc cô đặc và tinh chế aflatoxin xảy ra đồng thời Aflatoxin tinh chế khôngkèm theo tạp chất như với các cột hoạt động theo qui tắc lí hóa

 Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất là 1 năm

 Việc đọc kết quả dễ dàng, ít bị nhầm lẫn cho kết quả dương tính giả

Bên cạnh đó, AFB1 là aflatoxin phổ biến nhất, có tính độc cao nhất và luôn xuấthiện trong bất kì quy định về mức nhiễm aflatoxin trong thực phẩm nào Do vậy,kháng thể dùng trong sắc kí ái lực cần có tính đặc hiệu cao nhất đối với AFB1.

Từ những cơ sở trên, việc sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt AFB1 đã được thựchiện và hoàn thành tại Viện Pasteur Tp.Hồ Chí Minh gồm những bước:

(Xem chi tiết ở phụ lục 3).

 Tạo huyết thanh thỏ kháng AFB1

Với bản chất là hapten, không có đặc tính sinh đáp ứng miễn dịch, khôngtạo kháng thể được nên aflatoxin phải cộng hợp với một protein giá, là albumin huyếtthanh bò (BSA) Sự cộng hợp có thể là:

 Dạng (H2N – protein): vị trí cộng hợp ở phía vòng dihydrofuran Khi

đó, kháng thể sẽ đặc hiệu với cấu trúc phía vòng cyclopentenone củaAFB1

 Dạng (AFB1 – O – carboxymethyl oxim – protein): vị trí cộng hợp ởphía vòng cyclopentenone Khi đó, kháng thể sẽ đặc hiệu với cấu trúcphía vòng dihydrofuran của AFB1, và chính ở vị trí này xảy ra phảnứng tạo độc Do đó, sử dụng dạng cộng hợp này để tạo kháng thể AFB1 - BSA conjugate được tiêm vào thỏ để gây miễn dịch trên thỏ Khi