Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất - phụ lục

Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất

Công

thức

nguyên

Trọng lượng phân tử

Điểm nóng chảy

Huỳnh quang dưới tia UV

Bước sóng huỳnh quang khi kích thích bằng tia 365 nm

λEx’ (nm) trong Metanol ACN Chloroform Aceton Nhóm difurocoumacyclopentenone

AFL B1 C17H12O6 312 267 Xanh

lam

AFL B2 C17H14O6 314

303-306

Xanh lam

AFL B2a C17H14O7 320 240 Xanh

lam AFL M1 C17H12O7 328 299 Xanh

lam

428

AFL M2 C17H14O7 330 293 Xanh

lam

430

AFLM2a C17H14O8 346 248 Lục

Nhóm difurocoumarolactone

AFL G1 C17H12O7 328

257-259

Xanh lục

AFL G2 C17H14O7 330

237-240

Xanh lục

AFL G2a C17H14O8 346 190 Xanh

lục

Phụ lục 1: Các đặc tính lí hóa của AFT.

Phụ lục 2: Bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD50 trên động vật (Lu, 1996)

Cực độc (Super toxic)  5 mg/kg

Rất độc (Extremely toxic) 5 -50 mg/kg

Độc tính cao (Highly toxic) 50 – 500 mg/kg

Độc tính khá cao (Moderately toxic) 0.5 – 5 g/kg

Độc tính nhẹ (Slightly toxic) 5 – 15 g/kg

Không độc (Practically nontoxic) > 15 g/kg

Phụ lục 3:

Sơ lược cách chế tạo cột IAC (Viện Pasteur Tp HCM, 2002)

1 Gây miễn dịch

Thỏ để gây miễn dịch phải hoàn toàn khỏe mạnh, 2-3 tháng tuổi, trọng lượng trên

2 kg Lấy 1 ml máu tai trước khi tiêm mũi mẫn cảm để làm chứng Kháng nguyên dùng tiêm là cộng hợp AFB1 – BSA của hãng Sigma Chemical Kháng nguyên được trộn với NaCl 0,9% và tá chất (lắc 30 phút) để thu được huyễn dịch AFB1 – BSA Mũi mẫn cảm: tiêm 2 ml huyễn dịch/thỏ, liều tiêm được chia thành nhiều mũi trên lưng, 100 µl huyễn dịch còn lại tiêm ở một bên đùi Đùi còn lại tiêm 100 µl vaccine

ho gà Mũi nhắc lại 1, 2, 3, 4, 5 tiêm trong 5 tháng (mỗi tháng 1 lần), quy trình tiêm tương tự như trên nhưng lượng kháng nguyên AFB1 – BSA giảm dần và không có vaccine ho gà

2 Tinh chế IgG

14 ngày sau lần tiêm thứ 5, lấy toàn bộ máu từ động mạch đùi Ly tâm thu huyết thanh và tách bỏ hồng cầu, sau pha loãng huyết thanh gấp đôi bằng nước muối sinh

lí Tủa IgG bằng (NH4)2SO4 45% bão hòa Tiếp theo cho huyết thanh phản ứng với BSA để loại các thành phần IgG kháng BSA

3 Tạo cộng hợp sepharose – IgG kháng AFB1

IgG thu được sau khi tinh chế được gắn đồng trị lên sepharose đã được hoạt hóa bởi CNBr theo quy trình của nhà sản xuất Amersham – Biotech Quá trình gắn được thực hiện ở một trong hai chế độ: (1) 22oC – 25oC trong 2 giờ hoặc (2) 4oC trong 24 giờ Trong thời gian tạo cộng hợp, hỗn hợp được trộn liên tục bằng máy lắc nhẹ Khi cộng hợp kết thúc, cần kiểm tra lại IgG còn dư trong hỗn dịch để đánh giá hiệu suất gắn Hiệu suất gắn càng cao thì chất lượng cột càng cao

Cộng hợp sepharose – IgG là gel có độ thấm cao khi cho chất lỏng chảy qua Sau khi xử lí để loại bỏ các IgG còn bám cơ học trong gel, gel được đóng vào cột nhựa kích thước 0.4 cm x 10 cm với lượng 0.1 ml – 0.15 ml/cột Cột được bảo quản

ở nhiệt độ 4oC – 8oC Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất 1 năm (Nguyễn Lê Trang, 2003)

Phụ lục 4: Máy quang phổ (U – 3310 Spectrophotometer – Hitachi)

Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA).