Ứng dụng kỹ thuật real tiem pcr xác định đột biến gen itga2 và itga3 liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền ở phụ nữ có tiền sử sẩy thai thai chết lưu

Mõ tá đột biên gen JTG.L2 vã JTGB3 liên quan dcn chứng ưa huyết khối di truyền ớ phM nừ có tiẻtì $ư $iy thai, thai chết lưu.. các gcn hên quan dến chứng ưa huyết khói di truyền dã được q

Lời đầu tiên, tòi xin háy to lóng biết tm sâu sẳc nhất vả lời cam im chân thành tới PGS.TS Nguyền Thị Trang, giang viên cao cắp Bộ mòn Y Sinh học

- Di truy ca trướng Dai học Y Hà Nội là người hướng dản khoa học cho lòi

Có lả người đà định hướng dìu dã tôi từ những bước đi đầu tiên trẽn con đường nghiên cim khoa học Nhờ có sự hướng đản ĩán tinh, những kiến thức quý báu X* $ự động viên, quan tóm cùa cỏ đà giúp tói hoan chành khóa luân tốt nghiệp này

Toi xin chân thành cám <m thầy cô anh chi nội tni anh chi kỳ thuật viên trong Bộ môn Y sinh học - Di trụyồn, trưởng Dại học Y Hà NỘI đả chi dạy giúp đờ tỏi rất nhiều trong thời gian học tập và nghiên cứu Tại Bộ mỏn

Tỏi xin tràn trong câm on Ban giam hiệu Phong Dao tạo Dụi học Thư view trường Dại học Y Ha NÔI đã lao dicu kicn thuận lựj cho tôi hoãn thánh khoa luân nãy

Lời cuối cùng, tỏi xin gừi lỏi biết ưn đen bố mc gia đinh, ban bẽ ví đả luôn lã chỏ dựa tinh thần vùng chẩc khích lệ ung hộ tôi trong quá trinh học tâp va thực hiện khỏa luận

Hà Nội ngày 09 tháng 05 nám 2021

Giáp Ảnh Tuyết

Tổi lá Giáp Ảnh Tliyầ sinh vien tỏ 8 lớp Y6B chuyên ngành Bác sỳ

đa khoa, xin cam đoan:

1 Khóa luận l<»t nghiỳp nay hoan toàn đo lôi thực biện dưới sự hướng dần cua POSTS Nguyễn Thi Trang

2 Các sỏ liệu vả kít qua nong khóa luụn là tning thực, khách quan, vá chưa lừng cóng bó iruớc dây

3 Nghiên cứu náy khòng trang lộp vói bat cư nghiên cưu nào khác đà được cong bổ lại Việt Nam

Hả Nội ngày 09 thang 05 nảm 2021

Giáp Ấnh Tuyết

FIGO The International Federation of

Gynecology and Obstetrics

Hiệp hội San phụ khoa thê giới

WHO World Health Organization Tờ chức Y tê thê gióả

ACOG The American College of

Obstetricians and

Gynecologists

Hiệp hội San phụ khoa Hoa Kỳ

MR1 Magnetic Resonance Imaging Chụp cộng hưởng lú

POC Products of conception Nhiêm sác thê dồ tổ chức phôi thaiAPS Antiphospholipid syndrome Hội chúng khang phospholipidLV$ Low vaginal swab Tàm bông âm đạo tháp

HVS High vaginal swab Tâm bông ủm dạo cao

TORCH Toxoplasmosis, other agents Toxoplasma, cãc lác nhán khác

rubella Cwomegalosirus and rubella, cytomegalovirus, herpesHerpes simplex; simplex

HLA Human leukocyte antigen Kliang nguyên bach câu ngườiTSH Thyroid-Stimulating hormone Hormon kích thích tuyên gỉapFT3 Free Trỉiodothyraũn Hormon tuyên giãp T3 tự doFT4 Free Thyroxine Honnon tuyên giáp T4 tự doDNA Deoxyrfoonucleic add

IVIG Intravenous immunoglobulin Thuôc gây mien dịch thụ động1^-hCG Beta human chotionic

gonadohopin

LH Luteinizing Hormone Hoi mon kích thích lioang thèPICSI Physiological intracytoplasmic Tiêm tinh trùng vào bão tương cua

sperm injection noân

IMSI Intracytoplasnic Tiêm tinh trùng có chon lọc hình

morphologically selected sperm

injection

thái váo bào tương noãn

BMI Body mass index Chi sô khôi cơ thê

•• ••••••• ••'••••• ••••••••• ■•••

3 3 3 3 5 _ 10 10 12

Chương I: TÔNG QUAN _

1.1 Đại cương về sây thai thai chềt lưu

1.1.1 Dinh nghía •••••••••••••••••••••• ••••••••• ••••••••••••• ••••••••• ••••••••••••••••• •••••••

1.12 Tinh hỉnh dich tẻ sây thai thai chét lưu _

1.13 Nguyên nhản, yều tổ nguy cơ và điêu trị

1.2 Chững un huyết khối di tniyên (Inherited thrombophilia)

1.2.1 Đại cương vè chửng ưa huyết khối di truyền

1.22 Một sổ gcn hèn quan ưến chứng ưa huyết khỗi di truyền

1.23 Vai trô cua hai đột biến gen ĨĨGA2 C8O7T vàiTGBỈ Leu33Pro 14 1.3 Một số phương pháp xãc định dột biến gen ĨTGA2 va ỈTGB3 13.1 Kỳ thuật giai trinh tự gen

132 Kỳ thuật PCR cồ dicn (classical PCR)

1.33 Kỳ thuật RFLP - PCR

1.3 4 Kỳ thuật ARMS PCR

1.33 Kỳ thuật Real-time PCR

Chương 2; DOI TƯỢNG VÀ PHI ONG PHÁP NGIIIÉN cứt 2.1 Đối tương nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuân lụa chọn 2.12 Tiêu chuẩn loại trừ

2.2 Đìa diêm, thời gian

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kẻ nghiên cửu 2.3.2 Phương pháp chọn màu vả cở mau 2.3 3 Các hóa chất, dụng cư 'à thiềt bị

2.4 Sơ đồ nghiên cứu - -

• •••• ••••«• ••••• • ••• • ••• •• • • • • ••• 10 16

19 20

20

21 24

24

24 25 25

25

25 25 26

2.52 Lấy và xú lý mảu bênh phẩni

2.53 Tãch chiết DNA bàng kit DMA - Express (Lytecb - Nga 1VD) 27

2.5.4 Do nồng độ vả kiêm Ira độ tinh sạch bang mảy quang phó kế Nanodrop 2000 .28

2.5.5 Xảc định đột biển gen ỈTGA2 C807T và ỈTGB.i Leu33Pro bâng bộ kit Real-time PCR Folatv (Russia) 29

2.5 6 Xu lý vá phan tich so 11CU 32

2.6 Dạo đức nghiên cữu «_ 32

Chương 3: KÉT QUẢ NGHÈNcủt _ _ _ 34 3.1 Đánh giá chai luting tách chici DNA từ màu máu bảng bộ kit DNA -Express (Lytech -Nga r\ĩ>) 34

3.2 DẠc điểm VC tuổi cua nhóm đồi tuợng nghiên cúu 36

3.3 Mõ tá đột biên gen JTG.L2 vã JTGB3 liên quan dcn chứng ưa huyết khối di truyền ớ phM nừ có tiẻtì $ư $iy thai, thai chết lưu 38

3.3.1 Phân bỗ kiêu gen cua gen ỈTGA2 38

3.32 Phân bố kiều gen cũa gen ITGB3 39

3.3 3 Mò tá các loại độí bicn gen cua hai gen ĨTGA2 \á ITGB3 40

3.4 Dành giá mói lương quan giùa dộtbién gen JTG.42 va ỈTGB3 với tuói 42

c hirtrng 4: BẢN LUẬN 44 4.1 Dành giá chát Itrụng tách chiết DNA tù mau máu bảng bộ kit DNA Express (Lyiech - Nga FVD) 44

4.1.1 vè nồng độ DNA 44

4.12 Vé dó tinh sạch DNA 46

4.2 DẶC diêm VC tuèi cua nhom dôi tuọng nghiên cưu 47

4.3.1 về đột biền gen ỈTCỈA2 C&ữTT 484.3.3 Đánh giá mối tương quan giữa đột biến gen ITGA2 C80"T vã

ỈTGB3 Leu33Pn> với ruói 51

KIÊN NGHÍ 54

TÀI LIỆU THAM KHÁO

PHỤ LỤC

Bang 12 Tóm tắt đicu tii với một sỗ nguyên nỉiàn mất thai 7Bang 13 Một sỗ gcn liên quan đen chững ưa huyết khôi di tnjycn 12Bang 2.1: Phân tích kết qua Real-Time PC R 30Bang 3.1 Nông độ vả độ rinh sọch cua DNA tách chiết tử câc mầu máu 34Bang 3 2 Đặc diêm phân b<> m<ii cua nhóm đối lượng nghiên c im 36Bang 33 Phàn bổ kièu gen cúa gen ỈTGAĨ - * 38

Bang 3.4 Phản bố kièu gen cùa gen ỈTGB3 39Bang 3.5 Tần fuắt các loại dột biến gen cua hai gen ĨTGA2 vi ỈTGB3 40Bang 3.6 Mối tương quan giừa đột biền gen vả tuồi 42Bang 4.1 So sánh tý lệ cãc kiều gen ITGB3 vói một số nghiên cứu trẽn

thể giới

Biêu đồ 3.2 Ty lộ đổi tượng nghiên cứu cò dột biên gen 40

Biêu dồ 3.3 Tỳ lệ cảc loọi dôt bicn gen trong tất cả câc trường hợp cỏ gen dột biên 41

Biêu dồ 3.4 Biêu đỏ thề hiên sự xuất hiên các đột biến gen theo tuổi 42

DANH MỤC HÌNH VÉ, sơ nò Sơ dồ 1.1 Tiềp cận các trướng hop mất thai 2 lần 9

Hĩnh l.1 Vi tri cua gen ITGA ĩ ưẽi NST số 5 14

Hinh 12 Mò ta hoạt dộng cua căc Hiu thê kết dinh (imergrin) 15

Hình 13 Vị trí cua gen ỈTGBỈ tiên NST 17 - 15

Hĩnh 1.4 Cấu trúc thụ thê kết dinh trén bề mặt tiểu cầu (fl lb|B 16

Hĩnh 13 Sự khác nhau giừa cẳu tnic của đdNTP vả đNTP lồ Huih 1.6 Bicu đó mòi đương biểu diẻn khucch đ;u ghi nhãn cưởng độ huỳnh quang khi nhân được ãnh sáng kích thích ỡ mỏi chu kỳ nhiệt 23

Hĩnh 2.1 Máy đo quang phò Nanodrop 2000 29

Hình 22 Kiêu gcn đồng hợp tư hình thướng vói gen ĨTGA2 va ỈTGB3 31 I linh 23 Kiêu gen dị hợp tư dột biên với gen ỈTGA2 vã JTGB3 31

Hình 2.4 Kiểu gcn đồng h^vw đột biền gen ĨTGA2 và ỈTGB3 32

Huih 3.1 Kct qua Real-time PCR cua bênh nhan HK.46 với kiêu gen d| hựp tữ dột biên cua gen ỈTGB3 34

Hĩnh 32 Kct qua ReaMime PCR cua bệnh nhẩn HK08 với kiêu gcn dồng hợp tử bính thường của gen ITGA2 35

HUYẾT KHÓI DI TRVYÈN Ở PHỤ NỮ CÓ TIÊN sứ SÂY

THAI. THAI CHÉT LƯU

Tóm tui

Sấy thai thai chết lưu là biến cổ sán khoa Iiáng nề vởi nguôi phụ nừ Tuy nhiên, cô lói khoáng 50% các trường hvp không lim thầy nguyên nhân rô rãng Tứ dãy các gcn hên quan dến chứng ưa huyết khói di truyền dã được quan tâm nghiên cửu dựa trẽn gia thuyết hĩnh thanh cục máu dõng làm giãn đoạn tuần hoàn tư cung - rau that Hai gen JTGA2 vả ITGB3 mà hoa các protein hình thành nén trung gian kềt dinh tiêu cầu Do đỏ dột biến hai gen náy cỏ thế liên quan đến chứng làng đỏng Nghiên cứu mô ta cắt ngang nãy sư dưng kỳ thuật Real-time PCR nhằm xác dinh ty lẽ dõt biển hai gen ỈTGA2 va

JTGB3 ớ dối tượng cô tiền sư sây thai, thai chct lưu Nhóm phụ nữ tham gia nglũẽn cữu cua chúng tỏi có tuỏĩ Trung binh lá 31.99 = 6.02 Kct qua tim dược, ty lệ alcn đột biến(T) cưa gen ĨTGA2 lả 22,0% (CT 34.0% TT 5,0%X gen ĨTGB3 có tỳ lệ alen dột biền (C) là 1.5% (TC 3.0% cc 0.0%) Nghiên cứu này chưa tim ra bang chứng nào về mói liên quan giừa hai gen IT GA 2 vả

ITGB3 với linh trụng sây tltai thai chét lưu cần rica hãnh các nghiên cứu có nhóm chứng, trẽn một cờ mâu lởn lum Va phân tích them vể lương tác giừâ các đột biến gen lẽn tinh trạng nãy

ràr khâaĩ IT GA 2' ỈTGB3 sầy thai thai chểt lưu chúng ua huyết khổi di

truyền

MISCARRIAGES OR STILLBIRTHS

Abstract

Miscamage and stillbirth arc serious pregnancy complications for women Many etiologies have been found However, up to about 50% of cases lias not had clear causes From a hypothesis about thrombi disrupting uteroplacental circulation, recently, researchers are concentrating on genes related to inherited thrombophilia ÌTGẢ2 and ỈTGB3 encode proteins which form adhesion molecules promoting platelet aggregation Hence, different polymorphisms of these genes can associate with thrombophilia This descriptive cross-sectional study applied Real-time PCR technology to determine rates of ỈTGA2 C807T and ỈTGB3 Leu33Pro polymorphisms in women with miscarriages and stillbirths Women in our study had average age

of 31.99 1 6,02 The percentage of allele T of gene ĨTGA2 was 22.0% (CT 34.0% IT 5.0%) while the proportion of allele c of gene ỈTGB3 is 1,5% (TC 3.0% cc 0,0%) Through this study, we cannot conclude any relationship between these two polymotphisms and miscarriages and stillbirths Thus, flier e is a need to conduct controlled studies, on a larger sample size, and tutthei analysis of the interaction between different gene polymorphisms on these obstetric complications

Key wards: ITGA2 ITGB3 miscarriage, stillbirth, inherited thrombophilia

DẠT VÀN DÈ

sẳy thai vả thai chết lưu lã hai biến cố san khoa thường gộp ánh hương lởn tới súc khoe thè chất vả tinh thần của ngưởi phụ nữ Theo Hiệp hội San phụ khoa thố giới (FIGO), tý lộ sầy thai chiếm khoang 12-15% nhùng trưởng họp đà nhận biết được minh cõ thai [ I] Trong klũ dó theo nghiên cúu khac con sỏ ước tinh tý lẹ thục có thè lén lởi 26% [2] Đỗi với thai chết lưu cùng theo FIGO, trung bính cỏ hơn 7000 ca mỏi ngày trèn thè giói (3] Viộc mẳt thai dê lựi những tâc dộng xẩu lèn sức khóe ngưỏí mẹ vá gia đinh, dục biệt lã anh hướng về tàm lý Những người phu nít mảt thai có 30 50% sê trai qua trạng thai lo king, va khoang 10-15Ọ 0 bi trầm cam [1]

Nhiều yểu tổ đà được xác định lá nguyên nhân hoặc yềư tố nguy cơ dần đen sầy thai, thai chết lim vi dụ như: bắt thường nhiễm sắc thê bất thường vê giãi phẫu từ cung, chan thương cãc roi loan mien dịch vả chuyên hóa nhiêm trũng Tuy nhiên, vàn con khoáng 50% trường hợp chua xác đinh đưực nguyên nhan (4) Dê có thê úm biêu rò lum vẽ cãc cơ chề dàn đen mất thai, ngày nay các nha khoa học đà ứtig dụng sự phát tnèn cua sinh học phàn tư váo việc nghiên cứu sự biêu hiện (dột bi én hoặc tính đa hình) cua các gen liên quan dền sây thai, thai chết lưu Trong dỏ các gen liên quan đến tinh ưạng lâng đông máu dần đen hĩnh thành cãc cục máu đông lãm gián đoạn tuân hoan tư cung thai rất dược quan tâm nghiên cữu [5] Neu tim dư ực mối liên quan giữa tinh trạng mat tliai vã cac gen nảy thi có thê dự doán dược nguy cơ mat thai cùa ngưài phụ nừ vã từ đó có các biộn pháp dự phòng hiộu qua Trên thề giỏi, nhiều nghiên cứu về đột biến tính đa hình cua các gcn liên quan đèn

cơ che tỉing đông mâu dã chi ra môi quan hệ giữa những gen nảy vả bỉcn cố sây thai, thai chết lưu vi dụ như cãc đột biến gen AiTHFK FVL PAĨ‘1 Nhùng thử nghiêm làm sang cùng đà được ticn hanh nhảm danh gia hiẻu qua

cua việc dùng thuốc chóng đông cho nhừng san phụ mang dật biến gcn tảng đông máu có tiền sử sẩy thai, tliaã chểt lưu liên tiếp [5] [6] <í Việt Nam nghiên cưu về các gcn liên quan đền dõng máu ớ phụ nữ có tiên sư sây thai, thai chét lưu côn rất it Một vái nghiên cứu đà khao sát đánh giá ty lệ đột biến cưa câc gen như XĨTHER, FVL F2 hay PAI-J Tuy nhiên chưa cỏ nghiên cứu

não dành giá đột bum hai gen ỈTGA2 va JTGB3, la hai gen mâ hóa cac protein

có và trò trung gian kết dinh tiêu cảu, ờ bênh nhãn có tiền sư sầy thai, thai chết lưu Do đó nhảm cung cẩp nhừng dừ liệu đau nên tại Việt Nam vế vấn

dè nãy chung tôi tiền hanh thục hiện dẽ tai “Ing (lụng kỳ thuật Real-time PCR xác định dật bim fit'll ITGA2 rò ir(ỈB3 iièn quan den chừng ưa huyết khối đi truy ền ở phụ nữ có tiền tư sầy thai, thai chết ftnt“vài hai mục tiéu sau:

7 Đảnh giã chat lượng rách chi rí DNA ỉừ mứu mâu bồng bv kit DNA ExpreỊỊ (Lyteclt - Nga IVDỉ.

2 ,\íổ tu dộĩ blén gcn ỈTG.42 vỏ ITGB3 liên qutifi dền chừng ưa huycf khái dí truyền ờ phụ nừcó tun sưsày thai, thai chét lưu.

\ ao sự phát triền cua hồi sức và chàm sóc so sinh Ở Viet Nam sây thai được đ|nh nghía là hiện tượng két thúc thai nghen trước khỉ thai có thè sống đưọc

cụ thè lá thai bị tồng xuẨl ra khơi buồng, tư cung trước 22 tuần hoộc cân nặng cua thai dưới 500g [8],

Thai choi lưu la hiên tượng thai chẽl trước khi bị trục xuât ra khơi tư cung tử tuần thứ 20 trơ đi WHO 2009 p] Định nghía này của WHO rắt khác so vôi Việt Nam Theo Bộ Y tế Việt Nam thai chết lưu là tất cà các tnròng hợp thai b| chết mà cỏn lưu lọi trong tu cung hèn 48 giò [8]

1.12 Tinh hình dịch tễ sẩy thai, thai chết lưu

Trên thẻ giới theo FIGO, ty lệ sẩy thai ở nhùng trường hợp đà xác định

là cỏ thai khá cao, từ 12-15% [1] Theo Hièp hội San phu khoa Hoa Kỳ (ACOG) dãy la nguyên nhãn mất thai phô biên nhất Con sô ước tmh ty lệ sây thai thực có the lẽn tới 26% Trong do, 80% trường hợp sây thai xay ra trona

3 tháng dâu Qua 12 tuần, nguy cơ sây thai giam rỏ rệt [2] Cùng theo FIGO (2015) ước tinh một ngày trên the giói có khoang "*200 ca thai chết lưu Ty lệ

thai chết lưu niỉm 2000 là 24,7 trên 1000 ca sinh, đủ giam xuống 18.4 năm

2015 Tỹ lộ thai chết lưu cỏ su khác biêt lim giừa cảc nước, dai rất thấp ờ một

sỗ nuớc chàu Ảu va con cao ơ các nước châu Phi nơi mã chàm sóc tnrớc sinh

vã sức khoe phu nữ còn kém pbat triến Tuy nhiên một dắu hiệu kha quan lã

tỷ lệ thai chết lưu nói chung dang có nhúng tin hiệu giam khá rích cực (3).Tựi Việt Nam hiỳn nay chưa có con sổ chinh thúc thống kê ty lệ say thai, tuy nhiên theo một số tai lieu, ty lẽ nảy trong khoang 15-20% [9J Đối với thai chit lưu tý lệ này à nước ta chiếm khoang 1010(H) ca đe sóng Nhổm phụ nừ ờ tuỏỉ 20-30 Cổ ty lệ có thai chờ lưu cao nhẩr (chiếm 59.9% sò trưởng hợp thai chết lưu), tiếp dó là nhóm chưa sinh lân não (chiếm 39.7%) [10]

siy thai vá thai chết lưu dưực xem lá một chân thương đối với người phu ĐÙ Không nhùng anh hương xâu tới sức khoe má nó còn tác dộng sâu sac tói tâm lý tinh cám cùa ngươi phụ nữ vá gia đính Theo FIGO, sau khi mất thai 30-50% người phụ nừ sẻ trãi qua lo lâng, vá 10-1 *% bj trầm cám Anh hướng nãy cỏ thè kéo dài nhiều thảng Vả thậm chi ờ nhùng lân mang thai sau những người phu nữ náy cỏ the sê trái qua nhiều lo lãng và đau buồn hơn những người phụ nữ khac Sức khoe tmh thẩn cua ba me co ảnh hương tới hạnh phúc tức thi vã lâu dãi Một sức kliơe tinh thần kém sè hạn che người phụ nừ tham gia vào các hoạt động kinh te và xà hội dõng thời cùng lảm giâm kha năng tự chăm sóc vả chúm sỏc trê em [ l ]

Không nhùng vậy, nghiên cưu con chi ra sây thai la môi yếu tổ nguy cơ cua sấy thai ớ căc lẩn mang thài sau Cụ thỏ, nguy cơ sây thai lần hep theo lá 20% sau 1 lẳn sây thai 28% sau 2 lãn liên tiếp, vả 43% sau 3 lần lien ticp [2] Qua đây cơ the thấy, sây thai, thai chết lưu lã mội trong cac bênh san khoa phờ biến, cớ tác động lỡn tói sức khoe, tâm sinh lý người phu nừ

1.13 Nguyên nhãn, yếu tổ nguy cơ, và điều trị

Co nhi cu nhom nguyên nhãn đà được xác đinh gay ra $áy thai, thai chêt lưu Vá hang loạt các yêu tờ đưọc chi ra là yểu tổ nguy co cưa hai biến cô này.Các nguyên nhân thường gặp gày ra sầy thai thai chét lưu tó bắt thưởng nỉncm sắc thè bát thướng giai ph.ỉu dường sinh dục UK- bẵt thướng về nội

lict mien dich cãc bênh lý nhiêm trung Tuy nhiên vin con khoang ĩ&o

cac Inning họp không xác đinh được nguyên nhàn (4J [ 11 Ị

Báng 1.1 Bâng tóm lắt rộn lãm %Ang cùa một tổ nguyên nhân gảy

cận lảm sàng không cằn thiết

Bắt thường

giải phàn

Siêu ám hai chicutoa chiều và siêu àm bơm nước buồng lư cung hoậc ket hợp nội soi ó bụng vả nội soi buông

tứ cung

MRI

Di truyền Nhiêm sắc the dỗ tố

chức phói thai (POC)

Nhiem sac the đổ cua bỗ mẹ

Chung ưa huyết khối bẩm sinh

Nhiêm trừng Tâm bòng âm dao TORCH;

thâp (Lvsycao(HVS)clđaniydiaSinh thi Ct nội mạc

tư cung và nuôi cấy

toxoplasma cãc tảc nhản kliàc rubella,

cytomegalovirus, herpes simplex

Miên djch Khảng thể khảng

nhàn

HLA

Tc báo diet tự nỉnèn

(chi dung cho nghiên cữu)

Nội tiết Hormon TSH(FT3-4

vã khang thè khang tuyến giáp nêu TSH bất thường)

Prolactin

Yêu tó từ bố Chi số phan manh

DMA cua tinhtrừng

Như vậy, các nguyên nhíin đã lim thay cua tinh trụng sây thai, thai chét lưu cú the lã bãi thưởng cơ quan sinh dục người mụ các ycu tồ di truycn từ

bố hoục các býnh lý rihicm tĩting nội lict, mien d|cb cùa mợ Các nguyên nhan na> hâu het đêu có thè xác định bằng các cạn làm sang chân đoán hình anh xét nghiệm đi truyền, xẽt nghiệm huyết thanh phó biền hiện nay

Bang 1.2 Tóm tắt diều rr| VÓI một só nguyên nhãn mắt thai |4|

Xem xét phiu thuật u

xơ (ỉuởị ni em mac

Vách ngán tư cungPolyp nội mạc tư cungDinh buồng tư cung

Các bất thưởng ống sinh dục khâc

Di rntyẻn Chắn đoán th truyằt

trước khi cấy phới (trong trường hựp dà biết bố mẹ có bẩt thưởng nhiem sic thê)

Sang lọc di truyền trước cầy pbõi

Chứng ưa

huyct khôi

Hội chứng khảng phospholipid (APS):

aspirin và hepatõi không phân doạn

Aspirin

Nhiễm trùng Khàng sinh: nếu cỏ

bằng chứng làm sang cua nhi Ồm trúng

Kháng sinh

dự phong

Thuốc gây mien dịch thu dộng (IVIG) Truyền tể báo

lympho phú bợp

Truyền nhù lương lipid

Nội tiết Kiêm soát đái tháo

đường, suy giáp vã cưởng giáp

Sụy giáp cận lâm sángProgesteron

AndrogensP-hCGLHYeti tổ tứ bổ Sưa đỏi lỗi Sổng Tiêm tinh trung vào

bảo tương cua noàn (PICSI)

Tiêm tinh tTŨngcõ chọn lọc hĩnh thãi vảo hào tương noàn

(IMSI)Antioxidants

Mói

trườug/lỏi

sồng

Dừng hút thuòc sư dụng ma túy

Duy tri B MI ơgiả trị binh thướng

Chăm sỏc chuyên biêi

vã cá nhan hoa tại các phòng khám chuyên khoa

Hạn chc dung caffeine

Trông cốc nguyên nhàn trên, một số cỏ thê diều tri can thi ộp ngay chỡ Ilsai phu đe cỏ the duy tri một thai kỹ khóe mạnh, vi dụ như các bệnh lỷ nhiêm trung, nội ĩict hội chưng khang phospholipid Dồi với cac nguyên nhản khac cẩn được chấn đoán, can thiệp, sàng lọc trước khi maiỉg thai lần sau Tuy nhiên, còn tồn tại một sổ nguyên nhân hiện nay vẫn chưa có phương pháp diều tri hiệu quá.

Nhu vậy, cỏ the tháy có rẩt nhiều nhom nguyên nhãn da dạng đản đến tinh trang sây thai, thai Chet lưu Do dó, trẽn lảm sàng khi tiếp cận một trường họp sảy thai, thai chết lưu, cần có những bước đảnh giả đẳy du nhÀm tránh bõ sỏt nguyên nhãn

Su đố 1.1 Tiềp cận các trướng họp mat thai 2 lân (4Ị

Ngoải các nguyên nhãn trẽn, khoáng 50% câc trump, hợp sây thai, thai chết luu vàn chưa xác đinh được nguyên nhân rồ lãng Nhiều giá thuyểt được đãi ra trong đó giai thuyết về tinh trang tảng đông Iiiau dàn đền hiiih thanh huyẽt khối lãm gián đoạn tuằn hoãn tữ cung thai đuọc rẩt nhiều nhà khoa hpc quan tâm Từ già thuyết náy câc nghiên cứu trên thề giói vá tại việt Nam

dà lãp trung vào các gen liên quan dến quá trinh đông máu (5), (6) (12], [13].1.2 Chứng ira huy à khói (U truyền (Inhrritrd thrombophilia I

1.2.1 I>ại cương vè chứng ưa huyết kliẮí di truyền

Chửng ưa hu vet khối dược dặc trưng bời xu hướng hi nil thành các cuc mâu đông trẽn lâm sâng hoặc những bắt thường mức dộ phân tir trong quá trình cầm máu dản đen khuynh hướng cõ các huyết khôi gãy tắc mạch [14] Huyết khối có thê hĩnh thành ờ cã tính mạch và dộng mạch gây ra triệu chứng tác nghẽn tại chỏ hay tại noi chủng di chuyên đến vã tic Iíừ vi dụ như nào phèà Chửng ưa huyểt khối có the gýp ở niụi lứa tuôi ơ ca nam vã nữ tuy nhiên có xu hướng biêu hiên tại phu nữ hơn dơ tình trụng táng dõng máu khi H13IỊỊ thai hoặc sư dung cãc thuồc tránh thai

Chững ưa huyết khối cỏ hai loại là mắc phai vả di truyền, chửng ưa huyết khối mẳc phải thướng gáp trong Hội chửng kháng phospholipid (Antiphospholipid syndrome - APS) dặc trưng bơi sự huừi thánh huyết khối

vá sụ hiện diện cua chàt chóng dông lupus và kháng thề gan phospholipid APS CÔ ticu cbuân dê chin đoản vả liêu pháp can thiộp mang lại biộu qua Trong khi dó chửng ưa huyết khói (li truyền bao gom một nhóm nhưng bát thường VC yếu lố tiền dóng máu yếu lố dông máu dan lới tâng nguy cơ thuyên tie lính mạch, do các độc biến gcnda hình gcn gây ra

Mối liên quan giữa chứng ưa huyểt khối di truyền và tinh trạng mầt thai dặc biệt là các trường họp mất thai tái (liên:

Một Thai kỳ Thánh cóng phụ thuộc vảo sự phát Triẻn cua tuần hoãn rau thai binh thường và đẩy đu su bốt thường cua các mach mâu rau thai cỏ thê dàn đến một số bệnh lý thaiky bao gồm sấy thai, thai chăm phai triền trong tư cung thai chềt lưu hay rau bong non va tiẻn sán giật

Xhiùi nghiên cứu dà chi ra lã có mối liên quan giữa đột biến da hình các gcn liên quan đen huyết khối với súy thai, thai chết lưu Trong khi đờ một số nghiên cưu khác lại không ung hộ mỗi quan hộ này Tuy nhiên bảng chửng các ngluẽn cửu nay đưa ra còn chua đu manh

Trong nghiên cứu cua Men Ulas Band vã cộng sự năm 2018 tại Thố Nhf

Kỳ 2660 bệnh nhan co tiừi sư sầy thai trước tuấn thứ 20 it nliat 2 lan đà được lầy mau ngoại vi và xét nghiêm tun các dột bicn gen yếu tố V Leiden (H1299R) prothrombin G202I0A MTHFR C677T -\JTHFR A1298C PAỈ’1 4G'5G va P.-U-J 4G'4G Va kết qua cho thày sự khac biệt có V nghía thống

kè (p<0.01) trong mòi quan he giừa mát thai tái diẻn và các đa hình gcn liên quan dốt bệnh huyết khói như yổu lố d| hợp tư r Leiden H1299R di hụp tư

prothrombin G20210A P a I-J 4G/5G và PAĨ-Ỉ 4G-4G [6] Nghiên cúu cua

Benjamin Brenner tại Isarcl năm 1999 đã so sánh giữa nhonr 110 san phụ có các bệnh lý thai kỹ lã tiền san giật, thai chậm phát trí ôn trong tư cung, rau bong non hoặc thai chết lưu với nhỏm 110 san phụ có Thai kỳ- bính thường

Sổ liệu cho thấy một trong ba đột biến huyết khối phó biền lả yểu tố V Leiden,

yêu ró iỉ G20210A hoỉc MTHFR C67TT dược tim thấy ở 52% nhóm cỏ bênh

lý vã chi 17?0 à nhõm bính thường [15],

Trong khi dỏ các nghiên cim khác vi dụ như một nghiên cửu ờ Argcminia nảm 2017 lại chi ra không cõ sự khác biệt não trong sự phân bố cùa các biền thẻ di truyền giừa nhõm mất thai tải điền và nhỏm dổi chửng [ló] [17]

Nhin chung két quã cùa các nghiên cứu tnrớc đây cho thầy ring, dâ cỏ nhùng bâng chững giá tri VC mối quan 11Ộ giữa dụt biến các gen huyết khồi với tinh trang sảy thai, thai chết lưu Tuy nhiên, chửng ưa huyết khỏi di truyền anh hướng bởi da biến di truyền Do đó đẽ cõ thê kháng định mồi liên quan nây vả xem xét những can thiệp y khoa đối với nhóm bênh nhản có chứng ưa huyết khối di troyền, vần cần có them nhùng nghiên cửu chuyên sâu toan diôn him nửa

1.2.2 MỘI W Ren Uên quan đến chứiiỊi ưa huyết khối di truyền

Bang 1.3 Một sổ gcn liên quan đến chứng ưa huyết kliói di truyền (5)

(I2].|13|.|15J.(18J.|Í9JProtein Gen Đột bỉcn/da

co hình thành cục máu dông nong linh mụch yếu tố nguy

co huyct khồi

Prothrombin (yểu tó II) F2 G2O21OA Tảng nòng dộ prothrombin =>

tàng nguy co huyết khôi

tố XIII dần đèn tăng nguy Cỡ

hl nil thành cục mâu đóng

Chat ire die hoạt bóa

plasminogen-1 (PAI-1)

Serpineỉ 4O/5G Tâng hoại động => yếu tổ

nguy cơ huyết khối tinh mạch

vả các biên chửng thai kỳ

ChuẴi beta Fibrinogen FGB •455G-A Thay dõi chức nâng fibrinogen

=> ting nguy cơ hình thảnh huyét khói

integral subunit alpha 2 ITGAĨ C807T

(Phe224Phe)

La protem hình thành nên trung gian kết dinh tiêu cầu chưa rõ anh hương cua đột biến lên quá trinh dông máuintegrin súbuni I beta 3 ĨTGBỈ T1565C

1.2 J Vâl trò cũa hai đột biến gen ỈTGA2 C807T vá ÍTGB3 LeuUPro

• Gen ITGA2 nàni tiéti cảnh dãi nhiễm sác thể sổ 5 (5ql 1.2) nứ hóa tiểu

đưn vị alpha 2 một thự thè kết dinh xuyên mảng (inteigrin) cưa tiêu cầu với collagens vá các protein liên quan

Chr $

5 5959 9995 .’»**59 555 5^59 9 55’’**9.955_599

i lÈãi simas a ill m ? 3 3 â 5 5*553 3635 I m

Hình 1.1 Vị U i cua grn ỈTGa2 tròn NST sổ 5 [20]

Mồ ta đột bi en gen ITGẨ2: C3Ơ7T

Protein dược mà hõa ỉa inlegnn subunit alpha 2 kẽt hop VỚI tiêu đon vi beta 1 tao thanh trung gian cho sự lcắ dinh cua tiêu cầu vã các loai tế bao khac vói chắt nền ngoại bão (intergnn «2|5I ) [20Ị Dột biên ỈTGA2 C807T dẩn đen 5ự thay đôi các thụ thê cũa tiêu cầu đối với collagen vả tâng tỷ lệ kết dinh tiểu cẩu Nhiều nhà nghiên cữu dâ chi ra mổi liên quan giữa sự hiện diện cua alm T trong gen ỈTỮA2 CSOT với nguy cư nhối mâu cư tim đột quy do thiều mau cục bộ và huyết khôi tấc mựch đác biệt là ư tuõi tre [21 ]

Hĩnh 1.2 Mỏ tá hoạt động €ÚJ| các thụ thê lcct dinh (hitergiin)

Gen ĨTGB3 nầm trẽn canh dãi nhiễm sắc thê 17 (rq21.32) ină hoa ticu dơn vi beta 3 lả một protein bề mặt tề bào kết hợp với các tiêu dơn vi alpha tao thanh cảc thụ the kết dinh allb|ỉ3 vả avfỉ3 tren bẽ mật tiêu cầu Cac Ihv thê nay cổ vai trò quan trụng nong kết tập tiêu cầu [22]

Ow 17

5 5 5- 5 3 3 3

ĩ 5 1 ỉ s ĩ 5 5

Hình 1.3 Vị rri cùa gen ITGB3 tròn NST 17 (221

Mó ta đột biến gen ĨTGBĨ: Leu33Pro, T196C T15Ổ5C, rs591S

nỏt bicn ITGBÌ Lcu33Pro lâm thay đồi cấu trúc câc thụ thê kct dinh giừa cac tiêu câu

Hinb 1.4 ciu trúc thụ thê kết dinh trẽn bể mật tiêu cầu ưllb|B (23]Trong klú thu thề u2|il có vai irò kết dinh tiêu cầu vào thành mạch bi thương thi các thụ thê (illbộ3 vá avịB đóng vai trờ chinh trong kết tập câc tiểu cẩu lại Như vậy khi hai gen nảy bi đột biển, sè lủm thay dổi cãc thụ thè kết dinh giừa cãc tế bao lieu câu va giữa tiêu cầu vói cac cấu true ngoại bảo Điều này cỏ the dần tới hiện tượng king dóng.

Dà có riliừng nghiên cửu VC tác dộng cua gen ỈTGAĨ va ỈTGBS len cac

biền cố khác như nhôi máu cơ lim nhồi mâu phôi nào Các nghiên cứu vè mốt quan hê giừa hai gen nãy với cac biễn cồ san khoa hiên tai đang cô nhửug két luận khac nhau, thực hiện trẽn cờ mảu cỏn nho nên chưa dưa ra được kết luận tồ ràng [21], (24]

Do đò cần thiết đê cõ những nghiên cứu sâu h<m về hai gen này vã vai trò cua chúng trong mói quan hệ đa hicn cua các gen với chứng ưa huyết khơi

di truyền

13 Một số pliưirng pháp siic định dột biến gen /FGíJvà ITGB3

13.1 Kỹ thuật giãi trình tự gen

Giai trinh tự gen lả kỹ thuỹt dùng dê xác dinh trinh tụ nucleotide cứa một gen cụ thê

Cỏ mộĩ số phương pháp giã trinh tự gcn nhưng hiện nay phô biển lã phương pháp giâi ninh tư gen theo nguyên lý Sanger và phương pháp giãi trĩnh tu gen thề hộ mới.

Phucmg pháp giai trinh tự th tú nguyên lỹ Sanger

Phương pháp giãi trmh tụ theo nguyên lý Sanger được phãt minh bởi Frederick Sanger (1977) và ngày nay được ãp dụng bơi hầu het các thiết bi '-ã

kỹ thuật giai trinh tự DNA tiên tiểu

Phương pháp này còn có len lả phưimg pháp dideoxy (chain tennination)

do có nguyên lý lá sử dụng dideoxynucleotide triphosphates (ddSTPs) làm chắt châm dirt kéo dải chuôi DNA (Chain terminators) Trong quả trinh tông hợp DNA, enzyme DNA polymerase xúc tác gân các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tông hợp ớ vị tri 3’ có chửa nhõm -OH tu do, khi gặp nucleotide không cỏ nlióm 3-OH thi phán ứng tồng họp bj dùng lại Trong phương pháp này khi một ddNTP dưục gân ’.ao mach don DNA dang tông hơp thay vi một nucleotide thòng thương (deoxymicleotide triphosphate dNTPX quả tnnh tông họp mạch đơn DNA sè dinig lại lại đó vi không có nbóm 3-OH cần thièt cbo sự gản nucleotide tỉèp theo cua enzyme DNA polymerase Từ dỏ sè tạo ra các đoụn polynucleotide có chiêu dái khác nhau

Đè xác djnh trinh tu nucleotide, người ta diện di ket qua thu được trẽn gel polyacrylamid Các doạn polynucleotide có kích thưỏc khac nhau sê di chuyên vói lốc độ khac nhau trèn bão gel Lúc này thuc hiên phan ứng hiên hình phổng xạ có thê quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bảng các vạch trên bán gel Tổng hợp kết quả sè thu được trinh tự sáp xềp các nucleotide của đoạn geu Kỳ thuật nảy xãc định trực ticp trinh tự cãc nucleotide, sẽ xác định được tất cả câc bất thường đa hĩnh gen cỏ dô chinh xâc cao vá dưực coi lá

tiêu chuân vàng trong xác định biến đỏi gen Tuy nhiên gi ai trinh tự mất nhiều thời gian, giá thảnh cao.

điơroxyniKleotiđr «MNTP) đeoxynuclrotiđe (dNTP)

The difference between the stopnucleóde ddNTP and a

normal nucleotide dNTP

Hình 1.5 Sự khác nhau gjữa cấu trúc cua dd.VTP và d.VTP

Phuưng pháp giãi rrìnlì tự gen thề hỉ mài (NGS - Next Generation Sequencing}

Khac phục các hạn chê cua phương pháp Sanger, giai trinh tụ gen the hệ mới là phương phốp giãi trinh tự gcn (lìơng lượng cao cbữ phép phàn tích song song nhiều trinh (U DNA Nguyên lý hoạt dộng co ban van tương tư như phương pháp Sangcr sơng kỳ thuật nay cho phep giai trinh IU với một lượng lĩn các đoạn DNA khac nhau tại cung một thời diêm, tử đĩ tiết kiệm thời gian

và cho lượng dừ liệu đầu ra vĩ cũng lơn so với phương pháp Sangcr Mặc đù giâ ihãnh dà giam hơn rắt nhiều so với giai trinh tự bang phương pháp Sangcr nhưng nĩi chung, giá thành cua giai trinh tự gen vàn cỏn khả cao một khác cẩn trang thiết bi đát tiền Do do khử ap dụng tụi nhiểu cơ su dảc bi ả lá các

cơ MI tuycn dưới trang tlũct bi con h?n che

132 Kỷ thuật PC R có dicn (clAMictl PC R)

Pohiurrasc Chain Reaction (PCR) ỉa một kỳ thuât smh hục phan tư dùng đồ tống hợp DNA trong óng nghiêm chuối DNA dưọc khuẽch đại theo cấp lũy ihùa bảng each sư dụng enzyme Taq DNA polymerase trong một phán ứng phụ thuộc vảo nhiệt độ Phương pháp này dược Kary Mullis đề xuất

ra vảo nãrn 19X5

Nguyên ly cua PCR dưa ừẽn sự thay đói nhiệt độ cưa pfaan t'nig chu kỳ nhtẻt nóng lạnh, được chia làm ha giai doụn:

- Giai đoạn biẻn tinh (9(f'c • 95°C): chuỗi DNA SỢI kép được chuyên

thành sợi dơn dưới tác dụng cua nhiệt độ cao do các liên ket hydro giữa hai sọi DNA bị phá vở

- Giai đoạn u (55ộc - 65'C): lúc này nhiệt độ dược ha xuống DNA được

ũ với moi liên kểt Cãc đoạn mồi sè tạo ra những vj tri dỏ khới đầu quả trinh tông hụp

- Giai đoạn kéo dãi (72**C): enzyme Taq DNA polymerase su dụng đầu 3’ cua đoạn mồi đê bằl dâu tông họp DNA bang each gấn thêm cac nucleotide vào SỢI DNA dang tông hợp

Các hước này được lập lai khoáng 25-40 lần trong dó mỏi lần DNA dược nhân dõi lén

Các kỹ thuật liên quan tói l*c R và có úng dụng nhiều irong phát hiện các dột biền gen bao gồm: kỹ thuật PCR cô diên kỷ thuật RFLP PCR kỳ thuột ARMS PCR kỳ thuát rral-tíme PCR

PCR cố điền lá kỷ thuật mã sau khi khuếch đại DNA cẳn thục hiện thêm câc bước dê phàn tích san phàm khuếch đụi xem có Sim phàm mong muon hay không Thông thương san phân khuếch đại sê dược điện di trẽn gel

agarose, hoặc dùng các đoạn dò dẠc hỉệu (trẽtt mảng, trẽn giếng hoộc phiền nhựa ) đế xác dinh đoạn DNA cần lim.

Đây lá phương pháp dề thực hiện, chi phế thàp, tuy nhiên mất nhiêu thời gian, độ độc hiệu không cao vá sư dụng một số hoa chất độc hại đê nhuộm ban get

133 Kỹ thuật RFLP PCR

RFLP-PCR (Restriction fragment length polymotphisms PCR) lả kỹ thuật PCR su dụng tinh dặc lũệu cua enzym cất gin hụn đối với vị tri nhộn biềt cữa chúng trên doụn l>NA dè nghiên cứu tinh da hình chiều dài cũa các đoạn DNA Sau khi tiến hành PCR với mối dặc hiệu cho da hình cẩn tim mẫu dược ú vói enzyme giới hạn thích hợp ờ dung dịch đệm thkh hợp vóị pH nhict độ hợp lý sè tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau Sân phàm sau dỏ được điện di Dựa ưèn sự khác nhau ciìa các bàng DNA sau diên dĩ sẽ phai hiên dược du hình

Kỹ thuật náy tuy kinh te hem giai tnnh tự gcn nhưng lợi không xãc định dược toàn bộ các biển đồi gcn Cảc bước thực hiện cổn phúc tạp tồn thời gian 13.4 Kỳ thuật ARMS - PCR

ARMS - PCR (Amplification-refractory mutation system PCR) là kỳ thuật dược sư dụng dê phát hiện bắt kỳ dột biến nào liên quan đen những thay dôi bazơ dơn le ho(ỉc sự mất đoan nhỏ

Nguyên lý cua kỹ thuật này la sứ dụng các đoạn inồi dậc hicu do đỏ nỏ chí cho phép phan ủng khuếch dại xay ra khi doạn DNA chửa alcn đích cần tim Sau phân ứng ARMS, sự hiện diện cô hoặc không cũa sân phàm PCR giúp xác dmh cô hoặc khống có alen dích cằn tim ữong mầu ban đầu Phan ứng dung cãc mồi dộc hiệu có trinh tụ đàu 3' bõ sung với iilen đột biến va một mồi

chung ngược chiều với với mồi độc hiộu alen Kct qua PCR được diện di vã phản tích kết qua cỏ thể ưa lởi cỏ alen đột biển cần lim hay không, tiều cỏ thi kiều gen la dóng hơp hay di hợp Khang đinh không cờ alcn đột biền với kiẻu gen bính thường cùng được thề hiện bảng hình anh lãêu thị toẽn máy chụp gel nhỡ sư dung ca mồi alcn thướng việc sư dụng ca chứng dương (gen có alen đột biến đù biết irưỏc) hay chứng am (gen không mang alen đột biền) giup cho vice kiêm chứng chất lượng cua cặp mồi đặc hiỹxi đưực chính xác hơn.

Kỹ thuàt náy đặc biệt hữu dung trong việc phát toện một độc biến cụ thè trẽn gen không càn thiẽt phai giã truth tự tẩt ca các nucleotide trẽn đoạn gen mâu mã chi cần phát hiện có chứa đột biến nào đó hay không thông qua việc xác đinh kích thước cúa sản phàm PCR thu được Do đó till kiệm được nhiều thời gian vá kinh phí hơn thục hiện dim gián và thuận tiện hơn

1-3.5, Kỹ thuật Real-time PCR

Kỳ thuât Real-time PCR dưực sư dụng vàn với mục đích lã khuếch đụi phán tư DNA tuy nhiên khac với kỹ thuãt PCR thông thương ki*t qua cua nõ dược phân tích vã dơ lường, hiẽn thi ngay sau mơi chu ký nhiẽt cua phan ứng

do đỏ kỳ thuật náy cõ ĩẽn là Real-time hay còn dược gọi lá PCR dịnh lượng (Quantitative PCR) Trong kỹ thuật PCR thông thưởng chi sau khi phân ửng khuếch dụi kết thuc san phim cua PCR mới được xác dinh bằng diên di trên gel agarose Kỳ thuật Real-time PCR vỉn sư dụng Taq polymerase mồi đNTPs kểt hợp chu trinh nhiêt lồi ưu de khuếch đụi DNA

Cô hai phương pháp phò biền dề xác định san phẩm trong kỳ thuật Real-time PCR đó là:

- Sư đụng các dye phát huỳnh quang không đặc hiệu gÀn vào bẩt kỹ đoạn DMA mạch đôi nào đó

- Sừ dụng các dầu dỏ DNA dặc hiệu cổ chửa các đoạn oligonucleotide dà được đánh dầu vin chất phải huỳnh quang, từ dó cho phép phát hiện chi khi co sự lai giữa dầu dò với một trinh tu bố sung với no.

Real-time PCR được thực hiên trong một mây gja nhiệt cỏ kha nàng chiếu sáng mỏi một mầu vin một chúm ánh sảng cỏ chiêu dãi bưóc sõng nhất dịnh vả xảc dinh được ânh sãng huỳnh quang phải ra từ càc phân tư huỳnh quang bi kích hoại Khi DNA dich có du sô luựng nhản ban sê lảm cho ống phan ủng phát huỳnh quang nhận đư<x nguón sáng kích thích, ngược lại $ê không thê phải được huỳnh quang nều khòng cổ san phàm khuếch dại trong ống Nhu vậy ncu trong máu ban dẩu sổ lượng DNA đích nhiều thi sè cần it chu kỳ nhiêt hơn dê tạo dược số lưựng ban sao du phát tin hiéu huỳnh quang mây ghi nhạn dược, trường họp mầu ban dầu cỏ ít DNA dích thì sỉ cần nhiều chu ky nhiệt hơn Trong trướng hợp màu ban đầu không cỡ DNA đích, máy sẽ không pbat biên đưực tin liệu huỳnh quang

Có thè tinh toán sơ ban sao cũa DNA đích han dâu dựa vảo dường biêu diên chuân (dưục tao nén bin các mầu chuẩn đà biêt trước nồng dột xác dinh mồi quan hé giữa chu kỳ ngưởng với sỡ lượng bán sao DMA đích có tiQUg ong phân ững Khi cường độ tin hĩộu huỳnh quang cua mầu vượt qua dường tín hiệu huỳnh quang nền (base line) cùa phan ứng mảu thi được xem lả dương tinh vả người ta lấy thin diêm vượt qua dỏ (biêu hiện qua giã ưị chu ki ngường- Ct- Cycle tlưeshold) để so sánh với 1 dường cong chuân (stADNard curve) dã biết dê suy ra nóng dô trinh tụ DNA dích nong thu nghiệm ban đầu Đương cong chuân có chưa san phàm đếch dã bict trước nóng độ

Hình 1.6 Biéu đồ một đưừng biêu (liễn khuếch dại ghi nhịn cường độ huỳnh quang khi nhận được ánh sáng kích thích cr mòi chu kỳ nhiệt.Hiện nay kỹ tliuột Real-time PCR đang nói bặt với các ưu diêm là tiết kí<in thời gian và cõng sức cho phép định lượng sồ bán sao ban đầu, chi phi thấp, phu hợp sư đụng Trong phat hiện các đa hình gcn đà dược xác đ|nh.

Ilièn nay tại Bộ môn Y siltfl hục • Di truyền Tnròng Dai học Y Há Nội, xét nghiệm xác dinh các dột biến gen liên quan đen huyết kbỏi bao gom Ca hai gcn ỈTG.42 và JTGB3 được thục hiện bang kỹ thuật Real-time PCR

Chuưng 2

2.1 Đối tưọng nghiên cửu

Đối tượng nghiên cứu lã cac phụ nừ có lien sứ sẩy thai, thai chét lưu đen khám, tư vấn và làm XCI nghiệm tại Bộ môn Y sinh hục - Di truyền Trưởng Đai hục Y Ha Nội từ 11/2019 dển 11/2020

2.1.1 Tlcu chuân lựa chọn

Đổi lượng thoa màn dong thm cac tiêu chuàn sau:

- Có lien sư sây thai, thai chềt lưu lừ một lan trớ lén

- Cãc lần có thai là thai tự nhiên hoặc bảng các phuong pháp hò trự sinh sán

- Đồng ý xct ngluệm tìm dột biền ĨTGA2 C807T và/TƠ&? Leu33Pto

- Dois’, ý tham gia nghiên cứu

2.12 Tiêu diuân loại trừ

Thưa màn một trong củc liêu chí:

- Tien str có thai bi lòng xuàt ra khoi buồng lư cung sau 22 tuân hoặc trọng lượng thai lớn hơn ílMlgram

- Tien sư thai ngoài lư cung, thai trứng

* Tien sư đính chi thai nghén tự nguyên hoặc do d| lật cỏ chi định cua bỉc sỷ

- Các trướng hợp đà xác đinh được nguyên nhãn sấy thai, thai chết lưu thu^c cãc nhõm nguyên nhàn khác

- Không đồng ỷ tham gia nghiên cứu

2.2 I)ia diêm thòi gian

Nghiên cưu dưọc ticn hanh tai plìõng Di truyền phân tư Bộ món Y sinh học - r>i truyện Trường Dại llọc Y Hà Nội trong thời gian tư tháng 11/2019 đền thang 5/2021

2.3 Phưong pháp nghiên cứu

2.3.1 Thict ke nghiên cứu: Nghiên cữu mỏ tỉ cit ngang

2.3.2 Phinmg pháp chọn màu và cỡ máu

Chọn mầu thuận tiộn trong thoi gian từ 11/2019 11/2020: 100 phụ nừthõa màn tiêu chuẩn lựa chọn đôi lưọng nghiên cửu

• Dụng cụ: Ong Eppendorí 1.5 ml micropipet cãc loại (0.5-10pl 20-

100 pl 200-1000 ui) các loụi đàu côn phủ hợp với micropápette

2.5 CỂc buức tiến hãnh

(1) Thu tìiập thóng tin đồi nrợng tham gia nghiên cúu

(2) Lấy vả xư lý mầu bệnh phàm

(3) Tách DNA từ mầu nghiên cứu bầng bộ kit DNA - Express (Lytech - Nga IVD)

<4> IX* nàng độ vi laêm tra độ linh sụch bang mây quang phó kẽ Nanoditip 2000

(5) Tiến hành xác định đột bicn gen JTGA2 C807T vả ỈTGB3 Leu33Pro bang bộ kit Real-time PCR Folaty (Russia)

(ó)Xư lý sả liệu