Giáo trình: Công nghệ sản xuất Enzym

PHẦN MỞ ĐẦU LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH ENZIM HỌC MỘT SỐ KHÁI NIỆM CHUNG Định nghĩa: xúc tác sinh học; bản chất protein; hoà tan trong nước và dung dịch muối loãng; phân tử lượng lớn. Đặc tính sinh học: Bị biến tính dưới tác dụng của các yếu tố làm biến tính protein Tính đặc hiệu xúc tác cao. Các enzim nguồn gốc tự nhiên không độc Cường lực xúc tác lớn Tác dụng trong điều kiện êm dịu Nguồn nguyên liệu thu enzim Nguồn động vật: dạ dày lợn (pepsin); dạ dày bê (renin); tuỵ tạng (pancreatin) Nguồn thực vật: nhựa đu đủ (papain); lá và vỏ dứa (bromelin); Nguồn vi sinh vật: vô cùng phong phú; thay đổi hệ enzim VSV bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy; VSV sinh sản phát triển và STH enzim với vận tốc rất lớn; enzim có hoạt tính rất mạnh Các loại chế phẩm enzim sử dụng trong công nghiệp Chế phẩm enzim thô: nhận được sau lên men không qua tinh chế Chế phẩm enzim kỹ thuật: Chế phẩm nhận được sau khi đã tinh chế sơ bộ tách một số protein và enzim tạp Chế phẩm enzim tinh khiết: Chế phẩm enzim đã được loại bỏ hoàn toàn protein và enzim tạp Đơn vị hoạt độ (IU) Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn Đơn vi Katal Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn 1IU = 160 katal = 16,67 nkatal Hoạt độ riêng Số đơn vị hoạt độ enzim trên đơn vị khối lượng protein của chế phẩm IU hoặc katal 1 mg protein Hoạt độ phân tử Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một phân tử enzim trong 1 phút Hoạt độ tâm xúc tác Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một trung tâm hoạt động trong 1 phút Những điều lưu ý khi xác định hoạt độ enzim Tránh những yếu tố có thể gây biến tính protein enzim Enzim tồn tại bền vững và ổn định trong điều kiện phản ứng Lượng cơ chất được chuyển hoá khoảng 20 – 30% Thời gian xác định hoạt độ ngắn, nếu dài cần có các giải pháp tránh sự phát triển của VSV Làm mẫu kiểm chứng với enzim bị vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất Xác định thông số động học của chế phẩm enzim Một enzim cấu tạo gồm 2 dưới đơn vị giống nhau về trọng lượng phân tử 50kDa. Enzim xúc tác phản ứng: Ta có chế phẩm enzim chứa 3 mg proteinml và độ tinh khiết của enzim là 80%. Xác định hoạt độ được thực hiện bằng hấp thụ ánh sáng ở 512 nm. Đây là chiêu dài bước sóng mà sản phẩm phản ứng hấp thụ. Hệ số hấp thụ phân tử của sản phẩm là  = 5000 mol1. L cm1.Môi trường phản ứng bão hoà cơ chất được điều chỉnh tới pH = 7,0 và duy trì nhiệt độ ở 30oC. Thể tích dịch là 3ml. Người ta sử dụng 100ml tách chiết enzim đã được pha loãng 500 lần. Để xác định dùng phương pháp 2 điểm, bằng cách bổ sung 2ml chất dừng phản ứng vào môi trường phản ứng sau 2 phút tiến hành. Sự thay đổi hấp thụ đọc được là 0,6uA. Đơn vị enzim được định nghĩa là lượng enzim có thể xúc tác thuỷ phân 1 M cơ chất trong 1 phút ở 30oC và pH = 7,0. Tính nồng độ hoạt độ enzim xúc tác trong chế phẩm và hoạt độ riêng. Từ đó rút ra hoạt độ phân tử và hoạt độ tâm xúc tác (Tun Over Number) ở 30oC và pH = 7,0. TÝnh to¸n TÝnh nång ®é ho¹t ®é xóc t¸c (theo ®¬n vÞ ml t¸ch chiÕt) TÝnh ho¹t ®é ®Æc hiÖu cña chÕ phÈm Ho¹t ®é t©m xóc t¸c cña enzim Qui trình xin phép sử dung chế phẩm Enzym mới v Nhµ s¶n xuÊt, Nhµ hoµn thiÖn s¶n phÈm vµ Nhµ kinh doanh. Ho¹t ®é enzym chÝnh, c¸c ho¹t ®é enzym phô, c¸ch thøc t¸c dông lªn c¬ chÊt, chÊt th¶i trao ®æi chÊt. §Æc tÝnh ho¸ chÝnh x¸c tæ chøc s¶n xuÊt hay c¸c tÕ bµo ®éng vËt, thùc vËt sö dông, d÷ liÖu vÒ taxonomiques vµ nhËn biÕt chÝnh x¸c chñng s¶n xuÊt. Trong trêng hîp biÕn ®æi gen: nguån gèc gen, ®o¹n codantes hay diÒu chØnh, vect¬, sù cã mÆt cña gen ®¸nh dÊu… Qui tr×nh thu nhËn chÕ phÈm enzim, kü thuËt t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ. Thµnh phÇn cña chÕ phÈm, nh÷ng ®Æc ®iÓm riªng, phï hîp hay kh«ng víi luËt 5.09.89 TÝnh chÊt kh«ng ®éc cña chÕ phÈm vµ c¸c s¶n phÈm t¹o ra do t¸c dông cña enzim (hay c¸c enzim ®îc sö dông trong chÕ phÈm) vµ x¸c ®Þnh ®îc hÖ sè an toµn. CHƯƠNG 1. QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHUNG 1. VI SINH VẬT 1. Các tiêu chí lựa chọn vi sinh vật Không tạo độc tố Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế. Danh sách các chủng được phép sử dụng trong bảng “Generally recognized As Safe”. Không sinh độc tố thậm chí trong điều kiện thuận lơị cho QT này. Khả năng tách chiết Kết thúc quá trình lên men, tiêu diệt VSV này mà vẫn giữ nguyên hoạt độ enzim mong muốn. Ổn định gen Chủng giống phải được bảo quản và tái tạo mãi mà không có bất cứ lạc hướng nào trong quá trì

Tác dụng trong điều kiện êm dịu

Nguồn nguyên liệu thu enzim

Nguồn động vật: dạ dày lợn (pepsin); dạ dày bê (renin); tuỵ tạng (pancreatin)

Nguồn thực vật: nhựa đu đủ (papain); lá và vỏ dứa (bromelin);

Nguồn vi sinh vật: vô cùng phong phú; thay đổi hệ enzim VSV bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy; VSV sinh sản & phát triển và STH enzim với vận tốc rất lớn; enzim có hoạt tính rất mạnh Các loại chế phẩm enzim sử dụng trong công nghiệp

Chế phẩm enzim thô: nhận được sau lên men không qua tinh chế

Chế phẩm enzim kỹ thuật: Chế phẩm nhận được sau khi đã tinh chế sơ bộ tách một số protein và enzim tạp

Chế phẩm enzim tinh khiết: Chế phẩm enzim đã được loại bỏ hoàn toàn protein và enzim tạp

Đơn vị hoạt độ (IU)

Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

Đơn vi Katal

Lượng enzim xúc tác chuyển hoá 1M cơ chất trong 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1IU = 1/60 katal = 16,67 nkatal

Hoạt độ riêng

Số đơn vị hoạt độ enzim trên đơn vị khối lượng protein của chế phẩm

IU hoặc katal / 1 mg protein

Hoạt độ phân tử

Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một phân tử enzim trong 1 phút

Hoạt độ tâm xúc tác

Số phân tử cơ chất được chuyển hoá bởi một trung tâm hoạt động trong 1 phút

Những điều lưu ý khi xác định hoạt độ enzim

Tránh những yếu tố có thể gây biến tính protein enzim

Enzim tồn tại bền vững và ổn định trong điều kiện phản ứng

Lượng cơ chất được chuyển hoá khoảng 20 – 30%

Thời gian xác định hoạt độ ngắn, nếu dài cần có các giải pháp tránh sự phát triển của VSV

Làm mẫu kiểm chứng với enzim bị vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất

Xác định thông số động học của chế phẩm enzim

Một enzim cấu tạo gồm 2 dưới đơn vị giống nhau về trọng lượng phân tử 50kDa Enzim xúc tác phản ứng:

Ta có chế phẩm enzim chứa 3 mg protein/ml và độ tinh khiết của enzim là 80% Xác định hoạt độ được thực hiện bằng hấp thụ ánh sáng ở 512 nm Đây là chiêu dài bước sóng mà sản phẩm phản ứng hấp thụ Hệ số hấp thụ phân tử của sản phẩm là  = 5000 mol-1 L cm-1

Mụi trường phản ứng bóo hoà cơ chất được điều chỉnh tới pH = 7,0 và duy trỡ nhiệt độ ở 30oC Thể tớch dịch là 3ml Người ta sử dụng 100ml tỏch chiết enzim đó được pha loóng 500 lần Để xỏc định dựng phương phỏp 2 điểm, bằng cỏch bổ sung 2ml chất dừng phản ứng vào mụi trường phản ứng sau 2 phỳt tiến hành Sự thay đổi hấp thụ đọc được là 0,6uA

Đơn vị enzim được định nghĩa là lượng enzim cú thể xỳc tỏc thuỷ phõn 1 M cơ chất trong 1 phỳt

ở 30oC và pH = 7,0

Tớnh nồng độ hoạt độ enzim xỳc tỏc trong chế phẩm và hoạt độ riờng Từ đú rỳt ra hoạt độ phõn tử

và hoạt độ tõm xỳc tỏc (Tun Over Number) ở 30oC và pH = 7,0

Tính toán

Tính nồng độ hoạt độ xúc tác (theo đơn vị/ ml tách chiết)

Tính hoạt độ đặc hiệu của chế phẩm

Hoạt độ tâm xúc tác của enzim

Qui trỡnh xin phộp sử dung chế phẩm Enzym mới v

Nhà sản xuất, Nhà hoàn thiện sản phẩm và Nhà kinh doanh

Hoạt độ enzym chính, các hoạt độ enzym phụ, cách thức tác dụng lên cơ chất, chất thải trao đổi chất

Đặc tính hoá chính xác tổ chức sản xuất hay các tế bào động vật, thực vật sử dụng, dữ liệu

về taxonomiques và nhận biết chính xác chủng sản xuất

Trong tr-ờng hợp biến đổi gen: nguồn gốc gen, đoạn codantes hay diều chỉnh, vectơ, sự có mặt của gen đánh dấu…

Qui trình thu nhận chế phẩm enzim, kỹ thuật tách chiết và tinh chế

Thành phần của chế phẩm, những đặc điểm riêng, phù hợp hay không với luật 5.09.89

Tính chất không độc của chế phẩm và các sản phẩm tạo ra do tác dụng của enzim (hay các

enzim đ-ợc sử dụng trong chế phẩm) và xác định đ-ợc hệ số an toàn

CHƯƠNG 1 QUI TRèNH SẢN XUẤT CHUNG

1 VI SINH VẬT

1 Cỏc tiờu chớ lựa chọn vi sinh vật

Khụng tạo độc tố

Cỏc chủng VSV dựng để sản xuất phải tuõn theo luật quốc tế

Danh sỏch cỏc chủng được phộp sử dụng trong bảng “Generally recognized As Safe”

Khụng sinh độc tố thậm chớ trong điều kiện thuận lơị cho QT này

2 CÁC VI SINH VẬT VÀ ENZIM CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG CễNG NGHIỆP

Danh mục cỏc vi sinh vật và enzim được liệt kờ trong bảng

3.Phõn lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV

Phân lập và tuyển chọn giống VSV

Được phân lập từ đất, nước, không khí, từ một số thực vật hoặc từ bộ sưu tập giống VSV có sẵn Tuyển chọn chủng VSV có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh, sinh tổng hợp enzim mong muốn cao và ổn định

Với mục đích sử dụng trong CNTP, chế phẩm cần phải được kiểm tra kỹ trên phương diện Độ

độc

Cải tạo giống VSV

mục đích:

Tăng hiệu suất tăng trưởng và hoạt động đặc hiệu liên quan tới tổng hợp protein enzim

Gây đột biến cấu trúc khi enzim là enzim cảm ứng

Cải thiện sức đề kháng tốt với các sản phẩm chuyển hoá

Đột biến bằng các tác nhân vật lý hoặc hoá học

Các tác nhân vật lý: gồm có tia cực tím (tia tử ngoại) tia X (rơnghen), tia , hoặc bắn phá bằng hạt nơtron, electron Trong đó thường sử dụng nhất là tia cực tím (UV)

Các tác nhân hoá học: các hợp chất chứa nitơ như: nitrozometylguanidin, metyldicloroetylamin,

nitrithydroxylamin, etylmetylsulfonat

Đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp biến nạp: là sự truyền ADN từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra trong ống

nghiệm khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà không cần có sự tiếp xúc trực tiếp giữa các tế bào

Phương pháp tiếp hợp gen: vật liệu di truyền (ADN) chỉ được truyền từ tế bào cho đến tế bào

nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau, do vậy các VSV có khả năng biến nạp thì không có khả năng tham gia tiếp hợp gen

Phương pháp tải nạp: vật liệu di truyền ADN được chuyển từ tế bào cho đến tế bào nhận nhờ vai

trò trung gian của thực khuẩn thể (Phage) Trong quá trình tải nạp các đoạn ADN được chuyển từ

tế bào cho đến tế bào nhận tiếp hợp với ADN của tế bào nhận do đó làm biến đổi tính chất di

truyền của tế bào nhận

2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

1 Các tiêu chí lựa chọn nguyên liệu

Đáp ứng được các luật hiên hành ở các nước tiên tiến: không có các chất sát trùng, kháng sinh, thuốc trừ sâu, kim loại nặng …

Nguồn cung cấp ổn định về số lượng và chất lượng suốt trong năm

Giá cả rẻ nhất có thể được bao gồm cả bảo quản và vận chuyển

Trong thực tế tất cả các sản phẩm được sử dụng làm môi trường thường được lấy từ các nhà máy nông sản thực phẩm Nguyên liệu của môi trường lên men bao gồm :

Nguồn cacbon: bột ngũ cốc, bột đậu, bột ngô, khoai tây, cám mì hoặc cám gạo, tinh bột,

maltodextrin, xenluloza, glucoza, sacaroza, … nguồn phi gluxit như glyxerol, axit béo

Nguồn nitơ: tách chiết nấm men, casein (13% nitơ), bột cá, khô lạc, khô đậu, sản phẩm thuỷ phân

của casein (nguồn nitơ hữu cơ) Các muối amôn và nitrat … (nguồn nitơ vô cơ)

Các muối vô cơ: mang lại một lượng tối thiểu các kim loại như Mg, Ca, K, Fe, Mn, Zn … Photpho

dưới dạng muối photphat và lưu huỳnh dưới dạng muối sulfat

Các chất tăng trưởng và các chất kích thích tăng trưởng: chất cảm ứng; các coenzym (thiamin

tăng sản xuất pyruvat cacboxylase); sản phẩm của phản ứng enzym (maltodextrin đối với

a-amylase, maltoza đối với pullulanase)

2 Chuẩn bị và thanh trùng môi trường

Nguyên tắc chung

Vệ sinh môi trường nuôi cấy phải được duy trì cho tới thời điểm thu hồi VSV, xử lý tách enzim Không nên thanh trùng tạo ra các sản phẩm bất lợi cho sự tăng trưởng của VSV và tổng hợp enzim (phản ứng Maillard)

Đối với phương pháp nuôi cấy bề mặt

Gồm các nguyên liệu tự nhiên: cám gạo, khô cám, cám mỳ, tấm gạo, ngô (chiếm 90 – 95%)

Bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa (5 – 10%) để làm xốp canh trường

Trước khi gieo VSV, môi trường cần được làm ẩm đến 50 – 65% và thanh trùng 1 at ở 120oC để diệt VSV lạ, sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 – 40oC và tiến hành gieo cấy VSV

Đối với phương pháp nuôi cấy chìm

Dịch dinh dưỡng được cho vào thùng lên men Sau đó đưa trực tiếp hơi nước nống vào thanh trùng

ở nhiệt đô 118 – 125oC trong 45 – 60 phút

Hạ nhiệt độ và bổ sung VSV

3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN

1 Các phương pháp lên men được sử dụng

Ph-¬ng ph¸p lªn men bÒ mÆt

Nguyên tắc: sử dụng một chất mang rắn, trên đó nuôi cấy VSV (thường là nấm sợi)) Quá trình

nuôi cấy diễn ra trong thiết bị dạng giàn làm ẩm hay dạng thùng quay

Ưu điểm: cho phép nâng cao hoạt lực enzim trong sản phẩmlên men Canh trường sau khi sấy khô

vận chuyển được dễ dàng Tránh được nhiễm trùng toàn khối canh trường và ít tốn điện năng

Nhược điểm: năng suất thấp, không nâng cao được năng suất thiết bị Tốn nhiều công lao động thủ

công Khó điều chỉnh thành phần môi trường Khó cơ giới hoá và tự động hoá

Ph-¬ng ph¸p lªn men bÒ s©u

Nguyên tắc: sử dụng môi trường lỏng trong thiết bị phản ứng để nuôi cấy VSV Tất cả các thông

số của quá trình lên men được kiểm tra và điều chỉnh trong suốt quá trình

Ưu điểm: Chủ động điều khiển quá trình lên men Dễ cơ giới hoá, tự động hoá Năng suất cao Có

tính liên tục tiết kiệm được diện tích sản xuất Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi

trường độ đồng nhất trong môi trường lên men tốt, thuận lợi cho quá trình tách chiết

Nhược điểm: Nồng độ enzim trong canh trường thấp Phải cô đặc nên giá thành cao Tốn điện

năng do sục khí liên tục Khi không đảm báo vô trùng tuyệt đối dễ bị nhiễm toàn bộ môi trường

2 Quá trình lên men chính

Kiểu 1: vận tốc ST của VSV hoàn toàn phù hợp chính xác với vận tốc STH enzim

Kiểu 2: Sự không trùng khớp của 02 giai đoạn này được xác định bằng « tuổi thọ » của axit

ribonucleic thông tin hay axit axit ribonucleic khuôn

Theo lý thuyết về các quá trình đồng hoá và dị hoá Ba dạng biểu hiện tương quan các quá trình này:

Dạng 1: Tăng trưởng VSV và STH enzim đi đôi với nhau (hình 1a) Enzim tạo nên bằng con

đường dị hoá, cơ chất chính của lên men cũng là chất cảm ứng enzim

Dạng 2: sản xuất enzim liên tục, thậm chí sau pha tăng trưởng (hình 1b) Enzim tạo nên bằng con

đường dị hoá, nhưng cơ chất chính của lên men và chất cảm ứng enzim là khác nhau

Dạng 3: Một giai đoạn lệch pha giữa pha tăng trưởng VSV và STH enzim (hình 1c) Enzim tạo

nên bằng con đường đồng hoá Sự kìm hãm ngừng lại khi nồng độ của chất kìm hãm đã bị giảm xuống do sự tăng trưởng của VSV

2.2 Khía cạnh hoá sinh

Các tế bào VSV sử dụng oxy (3 – 10 tấn oxy tinh khiết/ ngày/ thiết bị LM 100m3); sử dụng các chất dinh dưỡng của môi trường lên men

Sản sinh ra sinh khối (tăng trưởng từ 1 tới 108 chỉ trong 5 – 10 ngày); CO2, nhiệt (2106kj/h); tiết

ra các sản phẩm trao đổi chất và enzim

2.3.3 Phương pháp lên men liên tục

Cung cấp NL và rút dịch môi trường LM được thực hiện liên tục

Điều chỉnh lưu lượng dòng chảy vào và ra đảm bảo nhận được nồng độ enzim mong muốn tối ưu

và ổn định

2.4 Các thông số vật lý và sinh lý ảnh hưởng tới QTLM

2.4.1 Các thông số vật lý

Nhiệt độ: Lượng nhiệt giải phóng có thể đạt 2106kcal/h Cần phải làm nguội

pH: pH phải được điều chỉnh liên tục nhờ các điện cực bằng các chất kiềm (NaOH, KOH, …)

hoặc các chất đệm photphat hoặc axit vô cơ (photphoric, sulfuric…)

Bọt: Khi khuấy trộn môi trường giàu protein sinh ra bọt Bổ sung các chất chống tạo bọt là các

dầu thực vật, động vật và silicon Các chất này ảnh hưởng không tốt tới sự vận chuyển oxy và đối với VSV

Oxy hoá môi trường: thông số đặc trưng đặc biệt khó điều khiển trong qui mô công nghiệp Khó

khăn ở chỗ các cấu phần chung “lên men - thiết bị lên men” tuân theo các luật tự nhiên khác nhau:

QT vật lý (chuyển khối), QT sinh lý (các VSV), QT hỗn hợp khi có sự tương tác giữa hai QT trên: Phương thức chuyển dịch: trong một hệ thống cân bằng tỷ lệ chuyển dịch oxy (TCO) tỷ lệ tuyến tính với các nồng độ khác nhau của oxy trên bề mặt khí - lỏng Trong QTLM toàn bộ tổng thể khuấy trộn - sục khí – môi trường tương tác với giá trị hệ số chuyển dịch thể tích

TCO = KLa (C* – CL)

C* trong màng khí; CL trong pha lỏng; KLa hệ số chuyển dịch thể tích

Tương tác với hình thái của VSV: trong QTLM các sợi nấm biểu thị những biến đổi hình thái phức tạp Độ nhớt biểu kiến cao sẽ gây trở ngại cho sự chuyển khối Sự cọ xát có xu hướng phá vỡ các sợi khi tốc độ ngoại vi đạt 5.10 m/s trong thiết bị LM có dung tích lớn

Độ hoà tan của oxy trong nước ở 25oC, dưới áp suất 1at (oxy tinh khiết) chỉ là 1,29mM (hoặc 0,041g/l) và giảm xuống khi nhiệt độ tăng lên

2.4.2 Các thông số sinh lý

Cân bằng năng lượng: Một lượng lớn năng lượng phát tán dưới dạng nhiệt cần phải loại bỏ bằng

hệ thống làm nguội của thiết bị Cần phải hướng việc sử dụng năng lượng này cho sự tổng hợp enzim

Áp suất CO 2 : Khí CO2 có mặt trong tất cả các QTLM với tỷ lệ dao động Nó đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng cacboxyl hoá và sự tổng hợp một vài loại enzim Trong trường hợp này sục khí quá mạnh sẽ không có lợi

Áp suất O 2 : Oxy có tác dụng khác nhau trong các giai đoạn sinh trưởng hay tổng hợp enzim:

Tổng hợp penicilinaxylase bởi E coli: Tỷ lệ oxy hoà tan cao tạo điều kiện thuận lợi cho sinh

trưởng, nhưng không thuận lợi cho STH enzim

Tổng hợp glucooxydase bởi Asp Niger: tăng áp suất oxy liên quan tới tăng độ tăng trưởng và phân

tiết đạt giá trị cực đại; nhưng lại giảm xuống nếu tiếp tục tăng áp suất oxy

Cảm ứng - ức chế: Trong một số QTLM người ta cần một chất cảm ứng Một số trường hợp khác

phải tránh sự có mặt của các chất ức chế vào thời điểm ban đầu hay sự xuất hiện của chúng trong QTLM

4 QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT ENZIM

1Làm lạnh môi trường nuôi cấy ngay khi QTLM kết thúc tới 3 – 5 o C

Tránh vô hoạt enzim

Tránh nguy cơ nhiễm tạp VSV

2Phân tách pha chứa enzim

Đối với enzim ngoại bào

Điều chỉnh pH môi trường tới giá trị pH tối ưu của enzim và duy trì suốt trong QTTC

Bổ sung các chất trợ lắng như bột diatomit, silic, xenluloza

Phân tách các vật liệu tế bào và các vật liệu không hoà tan: vi lọc, ly tâm, lọc màng

Siêu lọc dung dịch protein vô trùng để thu nhận được tối đa enzim mong muốn với ngưỡng cắt màng và lưu lượng dòng chảy được lựa chọn Nồng độ enzim nhận được tăng 20 – 40 lần

Đối với enzim nội bào

Sự phân bố enzim trong tế bào VSV

Cấu trúc thành tế bào VSV: bền vững và cấu trúc thay đổi tuỳ theo từng loại VSV; cấu tạo bởi peptido glucan

Khu trú của enzim trong cấu trúc vi thể của tế bào VSV:

Enzim ngoại bào: Enzim được STH trong tế bào và được tiết ra bên ngoài môi trường trong

QTLM

Enzim nội boà: Enzim được STH và sử dụng hoàn toàn bên trong tế bào Chúng tồn tại dưới dạng liên hợp, dạng liên kết hay dạng “bị nhốt trong các bào quan của tế bào

Enzim périplasmique: Enzim nzừm ngoài màng sinh chất nhưng bên trong tế bào

Phân tách pha chứa enzim

Phân giải tế bào ngay sau khi dừng lên men chính:

Các phương pháp phân giải tế bào:

Khi enzim được giải phóng khỏi tế bào các xử lý tiếp theo giống nhau đối với enzim ngoại bào

5 QUÁ TRÌNH TINH CHẾ ENZIM

Thành phần của dịch chứa enzim: nhiều loại enzim; protein; các tạp chất khác

Quá trình phân tách được phân ra 03 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Trích ly cho phép nhận được hỗn hợp phân tử dưới dạng hoà tan có các tính chất lý hoá học rất gần nhau

Giai đoạn 2: Phân đoạn hỗn hợp dựa vào độ hoà tan khác nhau để nhận được một họ các phân tử Giai đoạn 3: Tinh sạch bằng các phương pháp lý hoá học và đặc hiệu sinh học tinh tế hơn để nhận được một phân tử enzim tinh khiết

6 QUÁ TRÌNH CÔ ĐẶC VÀ HOÀN THIỆN SẢN PHẨM

Cô đặc

Siêu lọc: màng bán thấm dạng sợi xốp hay sợi màng; lọc ở áp suất cao (vài atm); các phần tử nhỏ

đi qua màng bán thấm (nước và muối vô cơ)

Làm bay hơi nước ở áp suất thấp (cô đặc chân không)

Làm bay hơi nước ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn (sấy phun)

Hoàn thiện sản phẩm

Dạng bột: bổ sung các chất nền để điều chỉnh nồng độ hoạt độ enzim của chế phẩm

Dạng lỏng: Bổ sung các chất bảo quản NaCl, socbitol, glyxerol, benzoat

7 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM

CHƯƠNG 2 MỘT SỐ CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT ENZIM

1 Các nguyên tắc chung

Tách chiết enzim

Làm cho tế bào trở nên thẩm thấu và giải phóng enzim khỏi tâm gắn của nó

Phá huỷ thành tế bào, màng tế bào và cấu trúc dưới phân tử

Khống chế mức độ phá vỡ để thuận lợi cho giai đoạn tinh chế sau này

Không làm biến tính enzim

Quá trình tách chiết thực hiện ở nhiệt độ thấp

Loại bỏ các mảnh tế bào

Loại bỏ toàn bộ các phần tử rắn, kết tủa của các axit nucleic, protein…

Chọn phương pháp lọc hoặc ly tâm phụ thuộc vào qui mô SX và bản chất của chất rắn

Loại bỏ các axit nucleic

Axit nucleic làm tăng độ nhớt của môi trường

Cần thiết khi phá huỷ hoàn toàn thành tế bào VSV

2 CƠ SỞ CHUNG ĐỂ TRÍCH LY CÁC ENZIM

Năng lượng cần thiết để phá vỡ tế bào phụ thuộc loại tế bào, trạng thái sinh lý của tế bào Phương trình thể hiện quá trình phá vỡ tế bào

Ln.Pm/Pm-P=k.t

Trong đó Pm: Lượng protein tối đa được giải phóng

P: Lượng protein giải phóng ra tại thời điểm xác định k: Hằng số tỷ lệ

: Thời gian phá tế bào

Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzim khi phá vỡ tế bào

Nhiệt độ: cần loại bỏ lượng nhiệt sinh ra khi phá vỡ TB Bổ sung cơ chất hoặc các chất tương tự

cơ chất hoặc các polyol làm bền enzim

Lực cắt: lực cắt có thể phá huỷ enzim; đặc biệt khi có mặt các ion kim loại hoặc trên bề mặt phân tách với không khí

pH: dung dịch đệm rất quan trọng trong việc ổn định hoạt lực enzim

Hoá chất: các chất tẩy rửa và dung môi có thể gây biến tính enzim

Chất chống oxy hoá: các tác nhân khử axit ascorbic, mercapto etanol, ditiotreitol… có thể rất cần thiết

Chất tạo bọt: mặt phân cách lỏng – khí trong các bọt có thể phá huỷ hình thể enzim

Kim loại nặng: các ion đồng, sắt, niken… nhiễm vào từ các thiết bị gây vô hoạt bất thuận nghịch enzim

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ENZIM

1 Các phương pháp cơ học

Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm

Điều kiện: huyền phù VSV; sóng siêu tần 18KHz – 1MHz chuyển động hình sin với bước chuyển

dịch nhỏ < 50m, vận tốc vài m.s-1, gia tốc lớn 80 000g

Nguyên lý: Vô số vi bọt tạo thành, lớn dần lên và xẹp xuống Bọt xẹp chuyển năng lượng âm

thanh thành năng lượng cơ học gây sốc với áp suất hàng ngàn atm (300MPa)

Giải pháp: Một lượng lớn năng lượng chuyển thành nhiệt, nên phải làm lạnh Sóng siêu âm dễ

làm biến đổi cấu trúc enzim và phá huỷ enzim do oxy hoá các gốc tự do, dùng N2O giảm được tác dụng xấu này

Ưu điểm: phương pháp phổ biến, hữu ích, đơn giản, phù hợp với qui mô nhỏ

Nhược điểm: pH, Nhiệt độ, lực ion của MT huyền phù thời gian tác dụng có ảnh hưởng lớn

Lạnh đông và nhả lạnh đông

Điều kiện: huyền phù VSV; làm lạnh đông ở -20oC, nén dưới áp suất cao (10 – 15 tấn/inch

vuông) qua các lỗ hẹp của máy nén

Nguyên lý: Kết quả của việc làm lạnh đông đột ngột tế bào là cô đặc chất hoà tan nằm bên trong

tế bào Sự hình thành các tinh thể bên trong và ngoài tế bào kéo theo việc phá vỡ tế bào Khi nén,

tế bào sẽ bị phá vỡ do sự thay đổi pha và thay đổi thể tích, cũng như do tác dụng của lực cắt các tinh thể đá

Ưu điểm: phương pháp phổ biến, đơn giản, phù hợp với qui mô nhỏ

Nhược điểm: năng suất thấp (10kg/h), thiết bị làm việc gián đoạn từng mẻ một, dễ làm biến tính

enzim

Nghiền hay đảo trộn với bột mài

Điều kiện: huyền phù VSV; các hạt thuỷ tinh (hoặc inox) đường kính 0,2 – 1,0mm Cùng một thể

tích viên bi, sử dụng các hạt nhỏ sẽ cho hiệu quả tốt hơn Số lượng các viên bi tối ưu khi khoảng cách giữa hai viên là 0,22mm

Nguyên lý: huyền phù tế bào được đảo trộn với các viên bi sẽ bị phá huỷ do lực cắt của chất lỏng

cao, do va chạm với các viên bi Mức độ phá huỷ phụ thuộc vào tốc độ và thời gian đảo trộn, nồng

độ VSV, số lượng và kích thước các hạt

Ưu điểm: phương pháp phổ biến, phá huỷ được tế bào của tất cả sinh khối tế bào dạng sợi đơn

bào, đơn giản, năng suất tương đối cao có thể đạt 340kg/h huyền phù sinh khối

Nhược điểm: thiết bị làm việc gián đoạn từng mẻ một, hiệu suất phá vỡ tế bào không cao, dễ làm

biến tính enzim

Phá huỷ ở áp suất cao

Điều kiện: huyền phù VSV; làm lạnh đông ở -25oC được nén dưới áp suất 1 – 2,5 tấn/cm2 qua một đĩa có kích thước lỗ 1,5 – 2,5mm Nhiệt độ của máy được duy trì không đổi nhờ dòng tác nhân lạnh glycol -25oC

Nguyên lý: dư ới áp su ất l ớn huy ền phù t ế bào đi qua c ửa thoát s ẽ đư ợc phá v ỡ t ế bào

Nhược điểm: năng su ất th ấp, thi ết b ị làm vi ệc gián đo ạn t ừng m ẻ m ột, d ễ làm bi ến tính

enzim

Đồng hoá dưới áp suất cao

Điều kiện: huyền phù VSV được bơm vào máy với áp suất 8000 – 20000PSI (150MPa; 10tấn/inch

vuông) với lưu lượng 10 000l/h qua một van xả có miệng hẹp, sau đó áp suất nhanh chóng được đưa đến áp suất khí quyển

Nguyên lý: các tế bào bị nén lại va chạm với nhau, sau đó nổ vỡ ra bởi áp suất giảm đột ngột khi

qua van là nhân tó chủ yếu phá vỡ tế bào Protein được giải phóng tương ứng với phản ứng bậc 1 (đối với nấm men):

2 Các phương pháp không phải cơ học

Xử lý kiềm: pH môi trường pH = 11,5 – 12,5 cho phép thuỷ phân màng TB Kỹ thuật này chỉ áp

dụng cho enzim bền trong MT này ít nhất 20 – 30 phút (L asparaginase, pH = 12,0,  = 20 phút)

Sử dụng chất tẩy rửa: chất tẩy rửa ở dạng ion hoặc không sẽ liên kết với các lipoprotein màng tạo

ra các mixen trong một số điều kiện pH, lực ion, nhiệt độ làm cho màng TB trở nen thẩm thấu Chất tẩy ion laurylsulfat natri (CH3(CH2)10CH2-SO4-Na, Tween 20; chất tẩy không ion Triton X100

Sốc thẩm thấu: huyền phù TB trong môi trường ưa trương (dung dịch 20% sacaroza trong nước) ở

4oC tạo ra sốc thẩm thấu trên màng TB Kỹ thuật này chỉ sử dụng cho vi khuẩn Gram âm để trích

ly enzim periplasmic Không làm biến tính enzim, tinh chế enzim đơn giản Năng suất thấp 400

dm3 cho 10kg huyền phù TB

Dung giải bằng enzim: lysozim xúc tác thuỷ phân các liên kết -1,4 glucozit của các

peptidoglucan giữ vai trò duy trì độ cứng của TB VK Sử dụng kết hợp lysozim với etilendiamin tetraaxetic axit (EDTA) để tạo phức với Ca làm giải phóng các lipopolisacarit và phá huỷ màng

TB Lysozim lòng trắng trứng là enzim dung giải duy nhất được sử dụng ở qui mô thương mại Kỹ thuật này chỉ áp dụng ở qui mô nhỏ vì KT thao tac và giá thành cao

3 Các phương pháp tách chiết bằng dung môi

Nguyên tắc tách chiết: Sau khi phá vỡ tế bào tiến hành tách các chất không phải protein enzim trên

cơ sở tính hoà tan Một dung môi tách chiết tốt phải đảm bảo enzim hoà tan suốt trong quá trình

tinh chế nếu có sự thay đổi về tính đệm MT, T, pH

Định luật Raoult: Các phân tử hoà tan và dung môi độc lập với nhau Hai hướng của luật này là:

Dương: nếu tương tác CHT – CHT; DM – DM mạnh, còn CHT – DM yếu

Âm: nếu tương tác CHT – DM mạnh

Hướng dương tương ứng tính tan yếu, hướng âm với tính tan mạnh

Dung môi tách chiết:

Các dung môi có cực như dung dich muối vô cơ tương tác mạnh với enzim làm cho chúng trở nên hoà tan, nhưng khi nồng độ muối đậm đặc hơn xảy ra hiện tượng giảm tính hoà tan mới

Các dung dịch ít có cực như dung môi hữu cơ làm giảm ĐHT của enzim Trong trường hợp này tách các chất hoà tan không phải protein ra khỏi enzim Dung môi hữu cơ thường dùng butanol, axeton

Các yếu tố ảnh hưởng: pH, nhiệt độ, một số ion đặc hiệu

CHƯƠNG 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZIM

1 LỊCH SỬ PHAT TRIỂN CỦA TINH CHẾ ENZIM

Giai đoạn 1: dựa trên các tính chất lý – hoá học tác động lên các chất phân tử lượng lớn

Giai đoạn 2:

Khai thác các tính chất đặc trưng khác nhau của protein cầu

Phân tách dựa trên các thông số riêng như trọng lượng phân tử, điện tích của protein

Giai đoạn 3: dựa trên những tương tác đặc hiệu và có tính rhuận nghịch giữa enzim và:

Cơ chất

Coenzim

Chất gắn

Chất hoạt hoá

2 NGUYÊN TẮC CHỌN PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZIM

Xác định enzim mong muốn là gì và chọn nguyên liệu giàu enzim

Xác định các đặc trưng của nguyên liệu:

Bản chất của NL: lỏng, rắn

Dạng chung của NL: động vật, thực vật, VSV

Cấu trúc sinh học của NL: tế bào VSV, tế bào thực vật

Xác định vùng chứa enzim: ty thể, tế bào chất, màng tế bào

Xác định các tính chất cấu trúc và lý hoá của enzim: trọng lượng PT, cấu trúc PT, hằng số động học, tính ổn định PT, pH tối ưu, điểm đẳng điện, chất hoạt hoá, chất kìm hãm…

Phải có phương pháp giải phóng protein dưới dạng hoà tan mà không làm mất hoạt tính của nó

Xử lý phải thực hiện ở T thấp (+4OC); môi trường có chất đệm; tác nhân bảo về (nếu cần như EDTA, 2-mecaptoetanol…); thời gian xử lý ngắn

3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ĐỂ PHÂN ĐOẠN ENZIM

Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính

Nguyên tắc:

Protein hoà tan trong các dung dịch muối có pH xa với điểm đẳng điện

Độ hoà tan của P chỉ tăng cùng với lực ion MT trong một khoảng nhất định của [muối], Nồng độ muối cao hơn protein enzim có thể kết tủa

Mối enzim có một khoảng [muối] mà enzim kết tủa hoàn toàn, gọi là nồng độ muối tích Dựa vào tính tan khác nhau mà phân đoạn enzim

Cách tiến hành

Bổ sung vào dịch chứa enzim một thể tích muối bão hoà hoặc một lượng muối trung tính dạng rắn

để đạt được độ phần trăm bão hoà nào đó của muối này

Nếu kết tủa là những phần tử không phải enzim mong muốn thì tách hai pha lỏng rắn và loại bỏ kết tủa thu hồi dịch trong

Nếu enzim cần tinh chế kết tủa thì sau khi phân tách hai pha lỏng - rắn hoà tan kết tủa trong một lượng nhỏ dung dịch đệm

Loại muối và cách tính lượng muối sử dụng

Muối sulfat amôn và muối sulfat natri: giá rẻ, khả năng kết tủa cao, độ hoà tan lớn, protein ít bị biến tính, thao tác đơn giản

Các công thức tính lượng muối cần thiết đưa vào dung dịch như sau:

Y=100(S2-S1)/1-S2; A=0.1(S2-S1)G/1-S2(Vg/1000)

Trong đó:G số gam (NH4)2SO4 trong 1000ml dung dịch bão hoà

(G = 515g ở 0oC; 530,7g ở 15oC; 536g ở 20oC

Vg thể tích riêng biểu kiến của dung dịch (NH4)2SO4 bão

(Vg/1000 = 0,271 ở 0oC; Vg/1000 = 0,288 ở 15oC; Vg/1000 = 0,29 ở 20oC

Y: dung dịch muối bão hoà (ml) bổ sung vào 100ml dịch enzim

A: trọng lượng muối tinh thể (g) bổ sung vào 100ml dịch enzim

S1: độ bão hoà ban đầu của dung dịch

S2: độ bão hoà của dung dịch cuối nhận được

Ưu nhược điểm của phương pháp

Kỹ thuật này cho phép nhận được một phần phân đoạn được làm giàu enzim từ thể tích lớn: loại

bỏ các protein, enzim liên kết hạy các tạp chất khác không hoà tan trước và sau phần phân đoạn có chứa enzim cần tách chiết

Thao tác đơn giản, dễ áp dụng nên được dùng phổ biến, nhưng khi làm việc với thể tích lớn có nhiều khó khăn do đòi hỏi thiết bị phải chịu độ ăn mòn của muối cao (inox)

Khoảng nồng độ muối tích của các protein thường hay trùng nhau nên không bao giờ có thể thu được các phần phân đoạn enzim tinh khiết hoàn toàn

Thường sử dụng phương pháp này vào giai đoạn đầu của quá trình tinh chế enzim

Lọc hay ly tâm để thu hoặc loại bỏ các kết tủa

Ưu nhược điểm của phương pháp

Kỹ thuật đơn giản, dễ áp dụng

Quá trình điều chỉnh pH môi trường có thể dẫn tới biến tính protein enzim ở một vài pH

3 Tác dụng của nhiệt độ

Nguyên tắc:

Enzim có độ hoà tan tăng cùng với nhiệt độ trong giới hạn dưới 40 – 50oC

Vượt qua ngưỡng giới hạn này protein enzim trở nên không ổn định và biến tính

Dựa vào sự khác nhau về độ ổn định của protein enzim ở nhiệt độ cao để phân huỷ một cách chọn lọc một số enzim nhiễm tạp

Ưu nhược điểm của phương pháp

Kỹ thuật đòi hỏi giá thành cao

Cần phải kiểm soát chặt chẽ để tránh tổn thất enzim mong muốn

4 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Protease kết tủa với etanol 76 – 78% (v/v)

-amylase kết tủa với etanol 70%; hoặc izopropanol 55%; hoặc axeton 60%

Glucoamylase kết tủa với etanol 45%

Ưu nhược điểm của phương pháp

Một số dung môi sau khi sử dụng có thể chưng cất và thu hồi lại được

Xử lý phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (trên điểm lạnh đông) vì dung môi là các chất dễ cháy

(-5oC)

Phương pháp chr sử dụng đối với enzim ít bị biến tính bởi dung môi hữu cơ

Dùng với qui mô nhỏ do chi phí cao

5 Kết tủa bằng các polyme có khối lượng phân tử lớn

Các polyme như dextran, polyetylen glycol thường rất háo nước sẽ làm mất lớp vỏ solvat hoá của các phân tử protein enzim, kéo theo sự thay đổi hằng số điện môi của môi trường xung quanh, thay đổi các tương tác không gian của các nhóm háo nước trong các phân tử protein enzim

Polyetylen glycol ở nồng độ 5% (theo trọng lượng) trong nước có thể làm kết tủa phần lớn các protein nồng độ 6 – 20%

Hiệu suất kết tủa phụ thuộc vào nhiệt độ, lực ion, pH, nồng độ protein và khối lượng phân tử của các enzim

6 Kết tủa bằng ion kim loại và các tác nhân đặc hiệu

Liên kết ion kim loại – protein làm giảm độ hoà tan của protein

Kỹ thuật này không áp dụng để tạo kết tủa enzim mong muốn vì phức tạo nên thường không phải

là thuận nghịch (dẫn suất sulhydryl) và biến tính protein enzim

Kỹ thuật này được áp dụng để tách axit nucleic ra khỏi hỗn hợp sau khi phá vỡ tế bào VSV Ion kim loại (Mn+2) tạo muối kết tủa với axit nucleic và được loại ra ngoài Axit nucleic chiếm khoảng 7% ở E coli, có độ nhớt cao ảnh hưởng lớn tới quá trình tinh chế enzim

Axit nucliec có nhóm axit mạnh liên kết với nhóm amin cuỉa protein enzim trong môi trường axit làm kết tủa chúng Bổ sung protein kiềm tính như protamin sẽ thay thế được vị trí của protein trong phức hợp và enzim sẽ tồn tại trong dung dịch Ly tâm để laọi bỏ phức này

Các chất phản ứng thường sử dụng là muối mangan, sulfat streptomycin, sulfat protamin,

bromcetytrimetylamôn, polyetylenimin (polyme cationic) Kinh tế nhất là sử dụng chế phẩm enzim nuclease (ribo và desoxyribo nuclease)

3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÁCH LỎNG - LỎNG VÀ LỎNG - RẮN

Phân tách lỏng - lỏng

Phân tách trong dung dịch có hai polyme không trộn lẫn nhau

Hai polyme tự phân thành hai pha phân biệt nhau, mỗi pha hoà tan được một trong các protein

Sự phân tách phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ của các polyme; khối lượng phân tử của protein; nhiệt độ và lực ion

Hệ dung môi sử dụng có thể là polyetylen glycol/ dextran hay polyetylen glycol/ sulfat amôn Phương pháp này ít được sử dụng trong công nghiệp do giá thành cao

Phân tách dựa vào sự thay đổi tính hoà tan

Thay đổi pH: kết tủa ở điểm đẳng điện

Thay đổi lực ion: kết tủa bằng muối trung tính

Làm giảm hằng số điện môi: dung môi hữu cơ hoà tan trong nước

Phân tách dựa vào điện tích: điện di, sắc ký trao đổi ion

Phân tách dựa vào khối lượng phân tử: ly tâm, lọc gel, thẩm tích, siêu lọc

Phân tách dựa vào vị trí liên kết đặc hiệu bề mặt: sắc ký ái lực

Phân tách dựa vào tính ổn định: tác động nhiệt, axit hoặc kiềm

Túi thẩm tích chứa dịch chiết enzim Túi được cấu tạo bằng một màng bán thấm (selophan)

Đặt túi trong thể tích lớn dung dịch đệm không chứa chất hoà tan cần loại bỏ

Chất hoà tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng độ cho đến khi đạt trạng thái cân bằng

Thay dung dich đệm mới cho tới khi đạt độ tinh sạch mong muốn

Phương pháp trường điện: chất hoà tan dịch chuyển do trường điện

Phương pháp tác động áp suất lên dung dịch phía trước màng lọc: dung môi đi qua (thẩm thấu

ngược); các phần tử nhỏ đi qua (siêu lọc) Phương pháp sử dụng vào cuối QT tinh chế để loại bỏ các tác nhân tách rửa (sắc ký)

4 CÁC PHƯƠNG PHÁP sắc ký

Các khái niệm về sắc ký

Nguyên tắc : Sự phân tách có được nhờ sự chuyển dịch khác nhau trong pha động của các chất

hoà tan ban đầu được gắn trên pha tĩnh ở trạng thái rắn

Pha tĩnh: khả năng gắn các chất hoà tan phải lớn Tương tác giữa CHT và pha tĩnh là kết quả của

cơ chế hấp phụ, phân chia, tương tác ion, rây lọc phân tử, tương tác kỵ nước hay tương tác sinh học đặc hiệu

SK hấp phụ: CHT gắn vào pha tĩnh bằng LK kỵ nước; lực Van der Waals

SK trao đổi ion: CHT gắn vào pha tĩnh bằng LK ion giữa các điện tích của CHT và pha tĩnh

SK lọc gel: CHT khuếch tán vào trong pha tĩnh có dạng hạt xốp tuỳ theo kích thước các phân tử

SK kỵ nước: Phần kỵ nước trong CHT tạo LK với phần kỵ nước của pha tĩnh

SK đặc hiệu sinh học: CHT và pha tĩnh có liên kết sinh học đặc hiệu enzim – cơ chất; kháng

nguyên – kháng thể

Pha động: chất lỏng có khả năng làm thay đổi dần tương tác giữa CHT và pha tĩnh, bằng cách lôi

cuốn CHT cùng với nó

Sắc ký lọc gel

Nguyên tắc : Khi dung dịch hỗn hợp protein chảy qua cột tuỳ theo khối lượng, kích thước và hình

dạng của CHT chúng sẽ xâm nhập nhiều hay ít vào trong pha tĩnh xốp (là các hạt gel xốp chứa đầy trong cột)

Các phân tử có đường kính lớn hơn lỗ xốp của pha tĩnh, không thể kuếch tán vào trong nên bị loại trừ, chúng ra khỏi cột cùng với thể tích rửa bằng thể tích giữa các hạt gel Vo

Các phân tử bé nhất sẽ kuếch tán tối đa vào trong hạt gel Thể tích dịch rửa của chúng sẽ bằng tổng thể tích pha lỏng của cột (Vt)

Các phân tử có kích thước trung gian sẽ khuếch tán hạn chế vào trong hạt.thể bỏ qua nêu các

protein trong hỗn hợp đều là hình cầu

Phân đoạn hỗn hợp protein theo khối lượng, kích thước và hình dạng phân tử

Mức độ phân tách rộng hẹp khác nhau tuỳ theo mức độ tạo mạng của gel

Kích thước phân tử càng nhỏ, đường đi càng lớn, thể tích dịch rửa càng lớn

Chất rửa cột sắc ký thu hồi trong các bình chứa được kết nối với detecteur UV

Gel Sephadex

Gel Sephadex là một loại bột khô, không tan trong nước, nhưng khi ngâm trương ra và tạo thành gel

Gel Sephadex bền trong MT axit yếu, kiềm yếu Liên kết glucozit trong gel sẽ bị thuỷ phân trong

MT axit / hoặc kiềm mạnh

Đặc tính gel của Sephadex như sau:

gel dextran có liên kết ngang giữa các mạch polysacarit với nhau tạo thành mạng lưới ba chiều Gel trung hoà về điện tích nên không có tương tác anion và cation

Mức độ liên kết ngang quyết định kích thước mắt lưới Nếu ít liên kết thì mắt lưới lớn, ngậm nứoc nhiều và ngưộc lại

Tuỳ thuộc mức độ liên kết chia gel Sephadex làm các loại

Một số gel khác Gel Sepharose và Superose: dẫn suất của agarose

Gel Sephacryl: dẫn suất của dextran

Gel Gel Ultrogel: hỗn hợp dẫn suất của agarose và polyacrylamit có liên kết ngang

Kích thước lỗ lớn để tách enzim có khói lượng PT cao trên 75.000 Da với vận tốc dòng cao

Gel chịu nén kém nên không sử dụng với chiều cao cột lớn

Sắc ký trao đổi ion

Nguyên tắc

Sử dụng tính chất lưỡng tính của protein enzim đại phân tử với nhiều nhóm chức tích điện và có tính chất như polyelectrode Nếu sử dụng vật liệu mang điện tích trái dấu với điện tích của protein cần tách sẽ giữ lại được protein cần tách Ngược lại sẽ giữ protein nhiễm tạp

Các protein của hỗn hợp có các nhóm bên ion hoá khác nhau, do đó ở một pH nhất định các

protein sẽ có điện tích không giống nhau Kảh năng được giữ trên nhựa khác nhau

Chất mang

Nhựa trao đổi ion: là khung vật liệu rắn không hoà tan, trên đó có gắn bằng liên kết đồng hoá trị với các nhóm ion hoá được Các nhóm này lại liên kết với các ion đối và các ion đối lại có thể trao đỏi thuận nghịch với các ion trái dấu

Khung mang nhóm tích điện dương và ion đối điện tích âm được gopị là nhựa trao đổi anion Khung mang nhóm tích điện âm và ion đối tích điện dương gọi là nhựa trao đổi cation

Nhựa trao đổi ion có bản chất hoá học khác nhau nhằm đáp ứng mọt số đặc tính cần thiết: độ xốp lớn, háo nước, chịu lực cao, khả năng giữ nước cao, độ phân tách cao, có tính ổn định hoá học và nhiệt, kết quả phân tách ổn định, độ bền cột cao

Sắc ký tương tác kỵ nước

Nguyên tắc

Các protein có nhóm kỵ nước trên bề mặt, chất mang có chứa nhóm kỵ nước và dung môi ưa nước tạo thành hệ ba thành phần và tương tác với nhau Các phân tử được phân tách tuỳ theo mức độ tương tác của chúng với chất mang

Hệ thống ba thành phần có thể bị rối loạn khi thay đổi nhiệt độ, pH, lực ion

Nâng cao lực ion (dung dịch NaCl 4M) sẽ giữ các protein lại Tiến hành rửa giải chọn lọc bằng một trong các cách:

Chất mang

Phối tử

Những chất tương tự cơ chất; chất kìm hãm; cofactơ (ít đặc hiệu) của enzim muốn làm sạch

Phải đặc hiệu với enzim và có ái lực trung bình với enzim

Nồng độ phối tử thích hợp

Cánh tay đòn

Cấu tạo từ một mạch hydrocacbon nhị chức có chiều dài 6 – 8 cacbon

Cánh tay đòn ngắn nhất là axit aminocaproic và hexametylamin

Hoạt hoá chất mang

Phối tử và cánh tay đòn phải được gắn lên chất mang

Chất mang trước tiên phải được hoạt hoá

Chọn phương pháp hoạt hoá tuỳ thuộc vào phối tử và bản chất của nhóm chức hoá học muốn gắn phối tử

Phương pháp loại rửa

Sử dụng một chất cạnh tranh để rửa giải enzim khỏi cột do phức hợp giữa enzim - phối tử có bản chất phi đồng hoá trị và thuận nghịch Dung dịch rửa giải phải có một trong những tính chất sau:

Chứa phối tử (ở dạng tự do) có thể cạnh tranh với phối tử đạng LK với enzim

pH của dung dịch gây biến tính thuận nghịch enzim, làm biến dạng TTHĐ enzim

Làm yếu tương tác đặc hiệu sinh học bằng cách thay đổi lực ion

Một số sắc ký biến thể của sắc ký ái lực

Sắc ký với phối tử là thuốc nhuộm

Phối tử là thuốc nhuộm sợi tổng hợp được gắn đồng hoá trị vào agarose có khả năng hấp phụ các enzim có cofactơ nucleic

Các thuốc nhuộm thường sử dụng là cibacron xanh, procion đỏ, da cam A, xanh lá cây A, xanh lục

B

Cơ chế chưa rõ ràng, xong có sự kìm hãm cạnh tranh giữa thuốc nhuộm và các enzim có cofactơ này

Kỹ thuật này có phối tử rất rẻ tiền và chất mang có thể sử dụng nhiều lần

Sắc ký ái lực chelat kim loại

Phối tử là các ion kim loại nặng tương tác với các gốc cystein (nhóm tiol) và histidin (nhóm

imidazol) của protein

Phối tử là các ion Zn+2 và Cu+2 tạo phức càng cua với axit iminoaxetic vốn đã được kết gắn vào chất mang agarose

Nhả hấp phụ thực hiện bằng cách giảm pH hoặc tăng lực ion của dịch đệm rửa giải

CHƯƠNG 5 Ứng dụng các chế phẩm enzim trong CNTP

Enzim điều chỉnh những khiếm khuyết tự nhiên của nguyên liệu:

Chất lượng nguyên liệu nông sản phụ thuộc vào các yếu tố thời tiết, điều kiện kỹ thuật canh tác, loại cây trồng…

Sử dụng các nguyên liệu khác thay thế nguyên liệu chính

Enzim bản thể trong nguyên liệu bị vô hoạt do xử lý công nghệ: thanh trùng

Enzim là công cụ công nghệ của các quá trình chuyển hoá:

Sản xuất đường glucoza từ tinh bột

Sản xuất rượu và bia

Sản xuất phomat

Enzim là công cụ nâng cao giá trị của nguyên liệu:

Sản xuất đường hoặc rượu từ tinh bột

Sản xuất cyclodextrin từ tinh bột

Sản xuất bia sử dụng nguyên liệu thay thế malt đại mạch

Enzim là công cụ cải thiện chất lượng của sản phẩm:

Izomerase cải thiện độ ngọt và giảm khả năng hấp thu của glucoza

Papain (protease) tăng độ mềm của thịt

Protease trung tính tăng chất lượng gluten của bột mì

Enzim là công cụ tăng giá trị các phụ phẩm của chế biến thực phẩm

Sản phẩm thuỷ phân làm chất độn giống thịt

Sản phẩm thuỷ phân như nước hầm xương thịt

Sản phẩm thức ăn gia súc từ phụ phẩm của nhà máy chế biến thuỷ hải sản

2 TIÊU CHÍ CHỌN ENZIM TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Độ hoạt động của enzim

Mối quan hệ giữa các điều kiện sử dụng và đặc tính của chế phẩm:

pH của môi trường và pH tối ưu của enzim

Nhiệt độ môi trường với hoạt lực của enzim

Thời gian tác dụng của enzim

Sự có mặt của các chất hoạt hoá và kìm hãm của enzim

Ảnh hưởng của các chất bổ sung trong quá trình công nghệ

Tính đặc hiệu của enzim

Xác định tính đặc hiệu của enzim trong điều kiện công nghệ ứng dụng

Xác định các hoạt tính phụ của chế phẩm

Điều kiện ứng dụng chế phẩm enzim

Lựa chọn chế phẩm enzim dựa trên chất lượng và liều lượng chế phẩm enzim sử dụng

Mức độ thay đổi dây chuyền công nghệ khi sử dụng chế phẩm

Khả năng cung ứng chế phẩm enzim

3 ỨNG DỤNG CÁC CHẾ PHẨM ENZIM TRONG CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỊT CÁ

Protease kim loại Kim loại hoá trị 2 Trung tính

Theo tính đặc hiệu

Aminopeptidase xúc tác thuỷ phân LK ở đầu nitơ

Cacboxypeptidase xúc tác thuỷ phân LK ở đầu cacboxyl

Dipeptit hydrolase xúc tác thuỷ phân các dipeptit

Peptidil hydrolase xúc tác thủ phân các LK peptit nội mạch

Nhiệt độ hoạt động tối ưu: 40 – 50 o C, vô hoạt khi vượt quá 80 o C

Hoạt hoá bởi tác nhân khử: hỗn hợp cystein 0,05M và EDTA 0,001M cho kết quả tốt nhất

Không hoạt động khi có mặt chất oxy hoá

Muối làm mềm thịt:

30g papain/ 1 kg muối ăn

Tiêm chế phẩm enzim trước khi giết mổ

Tiêm chế phẩm enzim sau khi giết mổ

Tăng giá trị các sản phẩm phụ của thịt

Sản phẩm thuỷ phân làm chất độn giống thịt và nước hầm xương

Mục đích công nghệ

Bổ sung chất thuỷ phân cho phép nhận được sản phẩm đồng nhất hơn

Nhờ tính keo dính của chất thuỷ phân, khối thịt nhận được sau phối trộn không tiết nước, chắc hơn và dễ cắt miếng hơn

Tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân bố hương vào khối thịt

Phối trộn với các loại rau thơm để tăng hương vị của các loại súp sấy khô, đóng hộp, các loại nước sốt…

Sản xuất protein thực vật thuỷ phân

Sản phẩm thuỷ phân dùng thay sữa mẹ

Chế phẩm enzim sử dụng là Flavourzym

Nguyên liệu thuỷ phân là cazein và protein của lúa mì

Mức độ thuỷ phân trên 50%

Sản xuất nước chấm mazi

Sử dụng các chế phẩm enzim trong công nghệ chế biến cá

Sản xuất bột cá nhạt

Sử dụng chế phẩm enzim trong công nghệ chế biến sữa

Đông tụ sữa trong sản xuất phomat

Sử dụng chế phẩm Renin chứa protease tách chiết từ dịch vị dạ dày bò non

Thuỷ phân casein K tại vị trí Phe 105 – met 106 tạo ra phần không hoà tan paracassein K

Khi > 85% casein K được thuỷ phân và với sự có mặt của ion Ca +2 chúng sẽ tụ tập lại tạo gel đông tụ

Thúc đẩy quá trình lên men phomat

Bổ sung enzim trực tiếp vào sữa tươi

Phân bố đồng đều enzim trong quá trình tạo vẩy

Protease hoà tan trong nước và phần lớn enzim bổ sung nằm lại trong sữa trong

Tạo ra sự thuỷ phân protein quá sớm nên tạo nhiều peptit đắng trong quá trình ủ chín

Bổ sung enzim trực tiếp vào phomat vẩy sữa

Khó phân bố đồng đều enzim trong toàn khối vấy sữa

Bổ sung enzim được bao bọc vào sữa

Protease được gói trong liposom, đường kính bao 0,2 – 4,5 m

Protease được giải phóng dần nhờ sự thuỷ phân các liposom trong vẩy sữa Tránh được sự thuỷ phân quá sớm protein

Ứng dụng của một số chế phẩm enzim khác

Lactase ( -D-galactozit galactohydrolase) xúc tác thuỷ phân lactose thành glucose và galactose: giảm mức

độ kết tinh và làm tăng độ ngọt của sữa có nồng độ cao

Glucooxydase xúc tác oxy hoá glucoza thành axit gluconic, giảm pH tạo nên kết tủa đẳng điện casein cho ta sản phẩm sữa chua đặc

Glucoizomerase xúc tác đồng phân hoá glucoza thành fructoza tạo ra sản phẩm sữa ngọt hơn

Lactoperoxydase (LP) nằm trong hệ thống sát khuẩn (LTP):

Lactoperoxydase - thioxyanat - hydroxyperoxyt

LP SCN - + H 2 O 2 OSCN - + H 2 O Thiocyanat Hydroperoxyt Hypothiocyanit

Một lít sữa bò chứa 10 – 30 mg LP Không phải là yếu tố kìm hãm hệ thống

H 2 O 2 được tích tụ thông qua chuyển hoá oxygen của một số loại vi khuẩn Lactococcus Cần bổ sung vào sữa tươi

Thiocyanat (SCN - ) dao động 1 – 10 ppm trong sữa bò Cần bổ sung vào sữa tươi dưới dạng muối thiocyanat

Phân loại

Hệ amilase được phân thành các nhóm:

Amilase thuỷ phân các liên kết -1,4 glucozit của tinh bột và các oligosacarit cùng loại: 

-amilase; -amilase; -amilase

Amilase thuỷ phân các liên kết -1,6 glucozit trong các polysacarit và các dextrin cuối:

dextrin-6-glucanhydrolase, amilopectin-6-glucan hydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase

Enzim -amilase (-1,4 glucan-glucanhydrolase)

Enzim xúc tác thuỷ phân các LK -1,4 glucozit bên trong chuỗi mạch polysacarit một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả

Đặc tính sinh hoá:

Enzim cơ kim: trong phân tử enzim có chứa tới 30 nguyên tử canxi

Enzim bị vô hoạt bởi các ion kim loại nặng: Ag+, Hg+, Cu+2…

Enzim có nguồn gốc khác nhau có tính đặc hiệu sinh học khác nhau

Enzim có khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái hạt

Cơ chế tác dụng:

-amilase Tinh bột + H2O -dextrin + maltoza + glucoza

Quá trình thuỷ phân tinh bột

Giai đoạn 1 (dextrin hoá): Chỉ một số LK trong phân tử bị thuỷ phân tạo thành lượng lớn dextrin

PTL thấp Độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh

Giaiđoạn 2 (đường hoá): Các dextrin PTL thấp vừa tạo thành bị thuỷ phân tiếp tạo ra các tetra-;

trimaltoza Sau đó chúng bị thuỷ phân rất chậm tới di- và monosacarit

Sản phẩm cuối cùng sau thuỷ phân

Đối với amiloza: 13% glucoza và 87% maltoza

Đối với amilopectin: 72% maltoza, 19% glucoza, izomaltoza và dextrin PTL thấp 8 - 10%

Một số enzim khác

Enzim cyclodextrin glucantransferase

Enzim xúc tác chuyển hoá các mạch thẳng của tinh bột thành phân tử mạch vòng

cyclodextrin Có ba dạng cyclodextrin được tạo thành -cyclodextrin, -cyclodextrin và 

-cyclodextrin

Đặc tính sinh hoá

Enzim hoạt động tối ưu ở T = 50 – 70oC; pH = 5,0 – 7,0

Nguồn gốc và điều kiện tác dụng của enzim ảnh hưởng nhiều tới tỷ lệ các cyclodextrin tạo thành

Cơ chế tác dụng

Enzim xúc tác ít ra 3 phản ứng trong quá trình tạo vòng:

Tạo vòng từ các phân tử mạch dài

Gn G(n – x) + Cyclo Gx Nối mạch hay liên kết các oligosacarit

Cyclo Gn + A Gn + A Tạo sự không cân xứng

Gn + Gm G(n – x) + G(m + x)

Enzim invectase

Enzim xúc tác thuỷ phân đường sacaroza thành glucoza và fructoza

Enzim hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 55oC pH thích hợp trong khoảng 4,5 – 5,5

Chất kìm hãm hoạt độ enzim là Ag+, Cu+2, Hg+, Cd+2 Enzim vô hoạt hoàn toàn khi có 7 – 8

Ứng dụng trong công nghệ sản xuất đường từ tinh bột

Tính ưu việt của công nghệ có sử dụng chế phẩm enzim

Không cần xử lý nguyên liệu ban đầu

Chế độ công nhệ mềm dẻo, kinh phí đầu tư thiết bị thấp

Ít tạo ra các sản phẩm phụ, hiệu suất thu hồi sản phẩm cao

Xử lý sản phẩm sau thuỷ phân đơn giản

Đa dạng hoá các sản phẩm từ tinh bột

Tính ưu việt của các sản phẩm

Fructoza có độ ngọt gấp 1,6 lần sacaroza, nhưng độ hấp thụ rất thấp

Manitol và socbitol có độ ngọt khoảng 50 – 60% so với sacaroza, độ hoà tan gần với sacaroza,

Điểm nóng chảy và Nhiệt tan có giá trị thấp hơn sacaroza nhiều

Sản xuất mứt quả: giữ được cấu trúc mứt, chống kết dính trong quá trình bảo quản, cải thiện khả năng giữ ẩm

Sản xuất kẹo cao su: thay thế đường tạo vị ngọt và tạo độ dẻo cho kẹo

Sản xuất kẹo socolat: sử dụng dạng bột để thay thế toàn bộ đường

Sản xuất các loại bánh ngọt: Tăng khả năng giữ nước, tránh khô bánh quá nhanh

Sản xuất kem: Ngăn cản quá trình tạo tinh thể, cải thiện chất lượng sản phẩm và cấu trúc kem

Ứng dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì

Sử dụng chế phẩm enzim a-amilase từ nấm mốc: thuỷ phân hạn chế tinh bột, tạo lượng đường cần thiết cho nấm men phát triển

Enzim từ nấm mốc có hoạt tính đường hoá trội hơn từ vi khuẩn

Enzim có khoảng pH thích hợp nằm trong vùng axit yếu thích hợp với môi trường lên men bột nhào

Enzim nhạy cảm với nhiệt độ Nhiệt độ tới hạn của enzim 70 – 80oC, nêm bị vô hoạt ngay khi nâng nhiệt độ, tránh thuỷ phân sâu sắc ảnh hưởng tới chất lượng bánh

Sử dụng chế phẩm enzim protease

Bổ sung protease axit vào thời điểm lên men

Thuỷ phân hạn chế protein (< 10%) cho phép thay đổi tính chất đàn hồi của gluten, làm mềm mạng lưới gluten

Bổ sung đồng thời chế phẩm amilase và protease cho phép tăng hiệu quả tác dụng của protease vì enzim dễ tiếp cận với cơ chất hơn

Ứng dụng innvectase trong SX nước giải khát, bánh kẹo

Sản xuất nước giải khát: thuỷ phân một phần đường sacaroza sẽ làm giảm nguy cơ kết tinh đường nâng cao nồng độ của siro sử dụng để bổ sung vào nước giải khát

Sản xuất bánh, mứt, kẹo: thuỷ phân một phần sacaroza tránh nguy cơ kết tinh đường trở lại (hiện tượng hồi đường) làm giảm chất lượng sản phẩm theo thời gian bảo quản

Ứng dụng CD sản xuất từ enzim CTGase

Trong CNTP và hương liệu:

Bảo vệ chất màu, chất thơm, chất dễ oxy hoá; giữ độ ổn định của sản phẩm theo thời gian bảo quản

Trộn CD với dầu béo để tách cholesterol khỏi các sản phẩm dầu (HS tách 80%) hoặc loại bỏ các axit béo khỏi dầu; Sử dụng -CD để loại bỏ chất béo khỏi sữa; Sử dụng-CD (1%) trong sản xuất nước quả và rau đóng hộp để loại bỏ tác dụng của các hợp chất phenol

Tăng độ hoà tan của một số chất có lợi cho sức khoẻ nhưng lại khó hoà tan như flavonoit và

Trong phân tích: CD được sử dụng để làm phối tử cho pha tĩnh trong sắc ký điện di, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực…

Trong xử lý môi trường: CD sử dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm hữu cơ trong nước thải, loại bỏ

dư lượng các chất bảo vệ thực vật ô nhiễm trong nước

5 ENZIM TRONG CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN NGUYÊN LIỆU GIÀU PECTIN

Hợp chất pectin

Khối lượng phân tử của pectin thường dao động từ 20.000 tới 200.000 phụ thuộc vào nguồn pectin

Vai trò của hợp chất pectin

Tính chất lý hoá học của tế bào quả

Khả năng giữ nước của quả Khả năng tách chiết dịch quả

Trong dung dịch có ảnh hưởng tới khả năng lọc và cô đặc

Phân loại

Protopectin: có cấu tạo hoá học rất phức tạp Protopectin chứa phân tử pectin; xenluloza; các ion

Ca, Mg; các gốc axit photphoric, axetic và đường khử Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh Pectin hay pectin hoà tan: là este metilic của hợp chất axit polygalacturonic cao phân tử Pectin tự nhiên có khoảng 2/3 nhóm cacboxyl được metoxy hoá Mức độ metoxy hoá cao tạo ra khả năng tạo gel trong dung dịch có nồng độ đường 65% và môi trường axit

Axit pectinic: là phân tử axit polygalacturonic cao phân tử trong đó một phần nhỏ các nhóm

cacboxyl được este hoá bởi metanol

Axit pectic: là phân tử axit polygalacturonic cao phân tử được giải phóng hoàn toàn khỏi nhóm metoxy Nghĩa là có một nhóm cacboxyl tự do trên mỗi đơn vị axit galacturonic

Hệ enzim pectinase

Enzim xúc tác phân giải các hợp chất pectin, làm giảm khối lượng phân tử và giảm độ nhớt của dung dịch chứa pectin

Phân loại hệ enzim pectinase

Enzim phân giải vùng “trơn bóng”

Enzim thuộc nhóm này phân giải các đoạn mạch chỉ chứa các chuỗi polygalacturonic

Người ta phân chúng thành 03 nhóm nhỏ: pectinesterase; polygalacturonase và transeliminase

Pectinesterase (Pectimetylhydrolase; PE): enzim thuộc nhóm này xúc tác thuỷ phân đề metoxy

hoá hợp chất pectin Sản phẩm thuỷ phân là hợp chất metanol và các gốc cacboxyl tự do xuất hiện trong chuỗi mạch polygalacturonic

Cơ chế xúc tác:

Đặc tính sinh hoá

Enzim thu nhận từ nấm mốc, vi khuẩn và thực vật

Enzim từ nấm mốc có pHopt= 4,5 – 5,5; Topt = 30 – 45oC và Tth= 55 – 60oC Enzim tác dụng tới các nhóm metoxy một cách ngẫu nhiên

Enzim từ thực vật có pHopt = 5,0 – 8,0 Enzim tác dụng lên các nhóm metoxy đứng ngay cạnh gốc

SƠ ĐỒ PHÂN LOẠI ENZIM PECTINASE

Enzim phân giải vùng “gai góc”

Enzim phân giải các vùng nhánh của pectin được tạo nên từ một khung xương

Rhamnogalacturonic mang các nhóm axetyl và các mạch bên trung tính (arabinoza hay galactoza)

Rhamnogalacturonase: enzim thuộc nhóm này thuỷ phân liên kết glucozit giữa Rhamnoza và

axit galacturonic giải phóng ra các oligome Enzim này được sinh tổng hợp từ nấm mốc, đặc biệt

từ Aspergillus

Esterase: Enzim thuộc nhóm này xúc tác thuỷ phân các liên kết giữa nhóm axetyl với vùng

Rhamnnogalacturonic và giải phóng ra các axetyl

Arabinase: Enzim phân giải một cách ngẫu nhiên liên kết a-1,5 giữa hai gốc arabinoza nằm trong đoạn arabinan giải phóng ra các monome-; dime- và trime arabinoza

Galactanase: Enzim thuỷ phân liên kết nối gốc galactoza bên trong mạch galactan hoặc

arabinogalactan loại I và loại II Enzim được sinh tổng hợp từ nấm mốc và thực vật

Ứng dụng chế phẩm enzim pectinase trong Công nghệ chế biến rau và quả

Một số chế phẩm enzim pectolytic

Pectinex Ultra- SPL

Sản xuất từ một chủng chọn lọc Asp Niger

Màu thẫm, mùi thơm đặc trưng của sản phẩm lên men

Chứa chủ yếu enzim pectinase và có hoạt tính nhất định của hemixenlulase Enzim xúc tác phân huỷ màng tế bào thực vật giải phóng dịch quả khỏi các khoang tế bào

Sử dụng trong quá trình xử lý nguyên liệu để ép tách dịch quả

Pectinex 3XL và Pectinex AR

Sản xuất từ một chủng chọn lọc Asp Niger

Màu thẫm, mùi thơm đặc trưng của sản phẩm lên men

Chứa chủ yếu enzim pectinase, Có khả năng thuỷ phân hoàn toàn araban thành arabinoza; thuỷ phân hoàn toàn các hợp chất polysacarit

Sử dụng trong quá trình xử lý làm trong dịch quả

Ép chiết dịch quả

Phá vỡ thành tế bào quả, tạo điều kiện cho dịch quả thoát ra ngoài, tăng hiệu suất thu hồi dịch quả

Phá huỷ sâu tế bào quả tạo điều kiện trích ly các chất màu và chất thơm của quả, tăng giá trị cảm quan của sản phẩm ép

Phân cắt các hợp chất pectin làm giảm độ nhớt của dịch quả ép tạo thuận lợi cho quá trình lọc ép thu hồi dịch quả và làm trong dịch quả ép

Ngâm dầm và ổn định nectar Nectar là loại nước uống đậm đặc có độ nhớt cao, chứa một lượng lớn các hợp chất ở dạng huyền phù, đặc biệt là các hợp chất pectin

Pectin có độ metoxy hoá thấp sẽ kết hợp với canxi tạo kết tủa pectat canxi, làm giảm chất lượng sản phẩm

Cần sử dụng chế phẩm enzim PMG, tránh sự có mặt của enzim PE để tăng độ hoà tan của các hợp chất pectin và hiệu suất xúc tác của enzim PG

Dịch hoá - nước quả đục

Nước quả đục chứa các hợp chất hoà tan trong thịt quả Đòi hỏi phá vỡ triệt để thành tế bào quả Cần có tác dụng đồng thời của pectinase và xenlulase

Để đảm bảo độ đồng thể của dịch quả cần có độ nhớt cao Không được phân cắt quá nhỏ các hợp chất pectin Không sử dụng chế phẩm enzim endo-PG Cần có tác dụng đồng thời của enzim TE, xenlulase và hemixenlulase

Làm trong dịch quả

Nguyên tắc làm trong: các phẩn tử gây đục trong dịch quả được cấu thành bởi protein (ở pH của dịch quả) tích điện dương được bao quanh bởi các lớp pectin tích điện âm Khi phân huỷ pectin sẽ giải phóng ra một phần protein tích điện dương Phần này sẽ tương tác tĩnh điện với pectin tích điện âm tạo kết tủa

Kết tủa các phần tử gây đục được chia làm 03 giai đoạn:

Giai đoạn bất ổn: giảm độ nhớt sâu sắc, gọi là trạng thái phá vỡ

Giai đoạn kết lắng: bắt đầu từ trạng thái phá vỡ đên khi kết tủa hoàn toàn

Giai đoạn cuối cùng: kết thúc giai đoạn pectin phân, đặc trưng bằng sự vắng mặt kết tủa pectin với canxi

Xử lý enzim các hợp chất gluxit trong chế biến nước quả

A: Pectinase hỗ trợ ép

B: pectinase hỗ trợ chiết rút

C: Pectinase + xenlulase

D: Pectinase làm trong

5 ENZIM TRONG CÔNG NGHỆ ĐỒ UỐNG

Một số chế phẩm enzim thương mại

Termamyl 120L

Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus

licheniformis

Sản phẩm thuỷ phân chứa chủ yếu là các dextrin phân tử lượng thấp

Chế phẩm chứa enzim chịu nhiệt: Topt = 95oC, Tth = 105oC

pHopt = 6,0 – 6,5

Độ bền hoạt lực enzim tăng lên khi có mặt của ion Ca+2: [Ca+2]opt = 50 – 70 ppm

Bảo quản chế phẩm ở T = 25oC hoạt tính enzim duy trì được thời gian 3 tháng; ở 5oC hoạt tính duy trì 1 năm

Fungamyl 800L

Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase được sản xuất từ nấm mốc

Aspergillus oryzae

Sản phẩm thủy phân chứa nhiều maltoza

Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 55 - 60oC

pHopt = 4,5 – 6,0

Độ bền hoạt lực enzim ít thay đổi khi có mặt của ion Ca+2:

Bảo quản chế phẩm ở T = 25oC hoạt tính enzim duy trì được thời gian 3 tháng; ở 5oC hoạt tính duy trì 1 năm

Sansuper

Chế phẩm dạng lỏng, màu nâu, chứa enzim -amilase được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus

oryzae; ngoai ra con chuas cac enzim phu -milase va protease

Sản phẩm thủy phân chu yeu la glucose

Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 50 - 55oC

pHopt = 5,5 – 6,0

Bảo quản chế phẩm ở T = 25oC hoạt tính enzim duy trì được thời gian 3 tháng; ở 5oC hoạt tính duy trì 1 năm

Maturex 200L

Chế phẩm dạng lỏng, màu xám, chứa enzim -axetolactat decacboxylase được sản xuất từ

vi khuẩn Bacillus subtillis Enzim xúc tác decacboxyl hóa axetolactat thành axetoin

Nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt độ Topt = 30 - 35oC

Khoảng pH hoạt động là pH = 4,5 – 6,0 pHopt = 6,0

Bảo quản chế phẩm ở 5oC hoạt tính duy trì ít nhất trong 6 tháng

Ứng dụng trong sản xuất bia

Ý nghĩa công nghệ

Có thể nâng cao tỷ lệ gạo thay thế malt đại mạch, giảm chi phí trên một đơn vị sản phẩm

Linh động hơn trong việc lựa chọn nguyên liệu thay thế

Kiểm soát tốt hơn và cải tiến qui trình nấu

Ổn định và nâng cao chất lượng bia

Giảm được thời gian sản xuất, nâng cao năng suất thiết bị

Những công đoạn công nghệ có sử dụng enzim

Dịch hóa nguyên liệu phụ: Sử dụng chế phẩm Termamyl 120L

Bổ sung chế phẩm ngay từ khi hòa bột gạo: thủy phân tinh bột sống, enzim phụ là protease Không cần giai đoạn hạ nhiệt độ sau khi nâng tới nhiệt độ hồ hóa của gạo: enzim chịu nhiệt Kiểm soát nồng độ ion Ca trong nước hòa bột: độ bền hoạt lực enzim

Liều lượng sử dụng: 0,5 kg/tấn nguyên liệu phụ

Đường hóa: pH khối dịch được điều chỉnh pH = 5,5

Dừng ở T = 52 o C cho protease của malt thủy phân protein giải phóng ra peptit và axit amin Với chất lượng malt kém hoặc sử dụng tỷ lệ nguyên liệu thay thế cao có thể bổ sung chế phẩm Neutrase 0,5L Liều lượng 0,3 – 0,5 kg/tấn malt

Trong công đoạn này để giảm thời gian lọc dịch đường có thể sử dụng chế phẩm Cereflo 200L nhờ độ nhớt của khối dịch giảm Liều lượng 0,5 – 2 kg/ tấn malt

Dừng ở T = 65 o C cho b-amilase của malt thủy phân tinh bột để tạo đường lên men maltose Các dextrin phân tử lượng cao đượctạo ra ở giai đoạn này

Dừng ở T = 72 o C cho a-amilase thủy phân nốt tinh bột và các dextrin vừa được tạo thành trở thành dextrin phân tử lượng thấp

Lên men

Bổ sung chế phẩm Malturex 200L giảm được thời gian lên men 5 – 7 ngày Liều lượng 1 – 2 kg/ 1000 lít dịch đường Có 03 phương pháp bổ sung Malturex:

Trộn chung vào thùng men giống và bơm vao thiết bị lên men

Trộn trực tiếp tren đường ống dẫn dịch đường lạnh vao thiết bị lên men

Trộn chung với dịch đường trước khi vào máy lạnh nhanh

Nếu chất lượng dịch đường kém có thể sử dụng chế phẩm Fungamyl 800L vào giai đoạn này

để tăng hiệu suất lên men Liều lượng 2 – 5 g/ hl

Cải thiện quá trình lọc bia và tránh đục bia sử dung chế phẩm Finizym Liều lượng 0,5 – 1,0 kg/ 1000 lít bia

CHƯƠNG 1 QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHUNG

Không tạo độc tố

Các chủng VSV dùng để sản xuất phải tuân theo luật quốc tế

Danh sách các chủng được phép sử dụng trong bảng “Generally recognized

Danh mục các vi sinh vật và enzim được liệt kê trong bảng

3.Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV

2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

1 Các tiêu chí lựa chọn nguyên liệu

2 Chuẩn bị và thanh trùng môi trường

Đối với phương pháp nuôi cấy bề mặt

Gồm các nguyên liệu tự nhiên: cám gạo, khô cám, cám mỳ, tấm gạo, ngô (chiếm 90 – 95%)

Bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa (5 – 10%) để làm xốp canh trường

Trước khi gieo VSV, môi trường cần được làm ẩm đến 50 – 65% và thanh trùng 1 at ở 120oC để diệt VSV lạ, sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 – 40oC và tiến hành gieo cấy VSV

Đối với phương pháp nuôi cấy chìm

Dịch dinh dưỡng được cho vào thùng lên men Sau đó đưa trực tiếp hơi nước nống vào thanh trùng ở nhiệt đô 118 – 125oC trong 45 – 60 phút

Hạ nhiệt độ và bổ sung VSV

3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN

Các phương pháp lên men được sử dụng

Ph-¬ng ph¸p lªn men bÒ mÆt

Nguyên tắc: sử dụng một chất mang rắn, trên đó nuôi cấy VSV (thường là nấm sợi)) Quá trình nuôi cấy diễn ra trong thiết bị dạng giàn làm ẩm hay dạng thùng quay

Ưu điểm: cho phép nâng cao hoạt lực enzim trong sản phẩmlên men Canh trường sau khi sấy khô vận chuyển được dễ dàng Tránh được nhiễm trùng toàn khối canh trường và ít tốn điện năng

Nhược điểm: năng suất thấp, không nâng cao được năng suất thiết bị Tốn nhiều công lao động thủ công Khó điều chỉnh thành phần môi trường Khó

cơ giới hoá và tự động hoá

Ph-¬ng ph¸p lªn men bÒ s©u

Nguyên tắc: sử dụng môi trường lỏng trong thiết bị phản ứng để nuôi cấy VSV Tất cả các thông số của quá trình lên men được kiểm tra và điều chỉnh trong suốt quá trình

Ưu điểm: Chủ động điều khiển quá trình lên men Dễ cơ giới hoá, tự động hoá Năng suất cao Có tính liên tục tiết kiệm được diện tích sản xuất Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường độ đồng nhất trong môi trường lên men tốt, thuận lợi cho quá trình tách chiết

Nhược điểm: Nồng độ enzim trong canh trường thấp Phải cô đặc nên giá thành cao Tốn điện năng do sục khí liên tục Khi không đảm báo vô trùng tuyệt đối dễ bị nhiễm toàn bộ môi trường

2 Quá trình lên men chính

2.1 Khía cạnh sinh học

Khi nuôi VSV tạo enzim có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: sinh khối VSV và tích tụ enzim Hai quá trình này không phải lúc nào cũng trùng khớp nhau về mặt thời gian

Theo lý thuyết hiện đại giữa vận tốc ST và vận tốc STH enzim có mối tượng quan phụ thuộc Hai kiểu phụ thuộc giữa các quá trình này:

Kiểu 1: vận tốc ST của VSV hoàn toàn phù hợp chính xác với vận tốc STH enzim

Kiểu 2: Sự không trùng khớp của 02 giai đoạn này được xác định bằng

« tuổi thọ » của axit ribonucleic thông tin hay axit axit ribonucleic khuôn Theo lý thuyết về các quá trình đồng hoá và dị hoá Ba dạng biểu hiện tương quan các quá trình này:

Dạng 1: Tăng trưởng VSV và STH enzim đi đôi với nhau (hình 1a) Enzim tạo nên bằng con đường dị hoá, cơ chất chính của lên men cũng là chất cảm ứng enzim

Dạng 2: sản xuất enzim liên tục, thậm chí sau pha tăng trưởng (hình 1b) Enzim tạo nên bằng con đường dị hoá, nhưng cơ chất chính của lên men và chất cảm ứng enzim là khác nhau

Dạng 3: Một giai đoạn lệch pha giữa pha tăng trưởng VSV và STH enzim (hình 1c) Enzim tạo nên bằng con đường đồng hoá Sự kìm hãm ngừng lại khi nồng độ của chất kìm hãm đã bị giảm xuống do sự tăng trưởng của VSV

2.2 Khía cạnh hoá sinh

Các tế bào VSV sử dụng oxy (3 – 10 tấn oxy tinh khiết/ ngày/ thiết bị LM 100m3); sử dụng các chất dinh dưỡng của môi trường lên men

Sản sinh ra sinh khối (tăng trưởng từ 1 tới 108 chỉ trong 5 – 10 ngày); CO2, nhiệt (2106kj/h); tiết ra các sản phẩm trao đổi chất và enzim

2.3.3 Phương pháp lên men liên tục

Cung cấp NL và rút dịch môi trường LM được thực hiện liên tục

Điều chỉnh lưu lượng dòng chảy vào và ra đảm bảo nhận được nồng độ enzim mong muốn tối ưu và ổn định

2.4 Các thông số vật lý và sinh lý ảnh hưởng tới QTLM

Oxy hoá môi trường: thông số đặc trưng đặc biệt khó điều khiển trong qui

mô công nghiệp Khó khăn ở chỗ các cấu phần chung “lên men - thiết bị lên men” tuân theo các luật tự nhiên khác nhau: QT vật lý (chuyển khối), QT sinh lý (các VSV), QT hỗn hợp khi có sự tương tác giữa hai QT trên:

Phương thức chuyển dịch: trong một hệ thống cân bằng tỷ lệ chuyển dịch oxy (TCO) tỷ lệ tuyến tính với các nồng độ khác nhau của oxy trên bề mặt khí - lỏng Trong QTLM toàn bộ tổng thể khuấy trộn - sục khí – môi trường tương tác với giá trị hệ số chuyển dịch thể tích

TCO = KLa (C* – CL)

C* trong màng khí; CL trong pha lỏng; KLa hệ số chuyển dịch thể tích Tương tác với hình thái của VSV: trong QTLM các sợi nấm biểu thị những biến đổi hình thái phức tạp Độ nhớt biểu kiến cao sẽ gây trở ngại cho sự chuyển khối Sự cọ xát có xu hướng phá vỡ các sợi khi tốc độ ngoại vi đạt 5.10 m/s trong thiết bị LM có dung tích lớn

Độ hoà tan của oxy trong nước ở 25oC, dưới áp suất 1at (oxy tinh khiết) chỉ

là 1,29mM (hoặc 0,041g/l) và giảm xuống khi nhiệt độ tăng lên

2.4.2 Các thông số sinh lý