Ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu, xác định methyl hóa promter ebna1 của EBV trong ung thư vòm mũi họng

EBNA1dược biểu lộ ở các thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter: cp, wp và Qp.Tuy nhiên, trong ung thư vòm mùi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt dộng mà chi cỏ Qp diều hòa biể

Người hướng dẩn khoa học:

TS Nguyễn Văn Đô

TS Bùi Công Toàn

Hà Nội, 2012

Đẻ hoàn thành luận án này tỏi xin bày tỏ lỏng biết ơn sấu sắc đến:

TS Nguyền Văn Đô, người thầy đã trực tiếp hướng (lẫn tạo mọi (liều kiện giúp

đờ tôi trong suốt quủ trình nghiên cứu, học rập và hoàn thành luận vãn này.

TS Hùi Công Toàn, Phỏ giám đốc Bệnh viên K Trưởng khoa Xạ trị tổng hợp Bênh viên K, người thầy dà hưởng dẫn, đỏng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

GS TSKH Phan Thị Phi Phi, Nguyên Chủ nhiệm bộ môn Sinh lý bệnh — miễn dịch trường Đại học Y ỉỉà Nội, người thầy dà luôn giúp đỡ, tạo diều kiện cho tói học tập và nghiên cừu khoa học.

PGS TS Phạm Đãng Khoa, Chù nhiệm bộ môn Sinh lỷ bệnh - miễn dịch trường Đại học Y Hà Nội

PGS TS Nguyễn Thị Vinh Hà, Nguyên Chủ nhiệm bộ môn Sinh lý bệnh — miễn dịch trường Đại học Y Hà Nội.

PGS TS Đỗ Hòa Bình,

Là những người thầy, nhà khoa học dã giáng dạy, hưởng dãn, quan tám, dộng viên và có những ý kiến dóng góp quý bàu cho tôĩ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời câm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu Khoa Sau Đại học Trường Dại học Y Hà Nội cùng tập thế cán bộ nhân viên cùa bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch trường Dại học y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tỏi cùng xin cám ơn Ban giâm hiệu, các thầy cô giảo, đồng nghiệp lĩộ môn Sinh

lý bệnh - Miễn Trường Đợi học y Thải Nguyên dã giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cừu và hoàn ihành luận vân.

Cuối cùng tôi xin vô cùng cảm ơn den người thân trong gia dinh tỏi những người luôn bên tôi nâng đỡ và mang đến cho tôi niềm vui lòng tự tin cùng như sự say mê trong công vĩệc.

Hà Nội ngày tháng năm 2012

Nguyên Thị Hông Gấm

Tôi xin cam đoan toàn bộ số liệu trong luận văn này là kết quã trung thực do tôi tiến hành nghiên cứu tại: Phòng thi nghiệm cùa Bộ môn Miền dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà nội.

Bệnh viện K Hả Nội Những số liệu này chưa dược sử dụng và công bố trong bất kỳ một tài liệu hay tạp chí khoa học nào 'loi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những sổ liệu mà tôi dưa ra

Tác gỉả luận văn

Nguyền Thị Hồng Gấm

Acid Desoxyribonucleic Acid Ribonucleic Cluster of Diffcrcnciation Cộng sự

Early Antigen Epstein Barr Virus Epstein Barr virus Encoded RNAs Epstein Barr Virus Nuclear /Xntigen Human Leucocyte Antigen

Latent Membrane Protein Major Histocompatibility Complex Polymerase Chain Reaction

Undifferentiated Carcinoma of Nasopharyngeal Type Ung thư YÒm mũi họng

Viral Capsid Antigen Bam Hl EBV Replication Actlvatcur International Agency For Research on Cancer

ĐẶT VÁN ĐÈ 1

CHƯƠNG 1: 4

1.1 Tình hỉnh ung thư vòm mùi họng trên thế giới và Việt Nam 4

1.2 Nhưng yếu tổ nguy cơ liên quan đến UTVMH 4

1.2.1 Vai trò cùa virut Epstcin-Barr 4

1.2.2 Môi trường sổng và thói quen sinh hoạt 5

1.2.3 Yếu tố di truyền 6

1.3 Bệnh học UTVMH 6

1.3.1 Triệu chứng lâm sàng 6

1.3.2 Chần đoán 7

1.3.2.1 Lâm sàng 7

1.3.2.2 Cận lâm sàng 7

1.32.3 Chần đoán giai đoạn 8

1.3.3 Điều trị 9

1.3.4 Tiên lượng 10

1.4 Virut Epstein- Barr 10

1.4.1 Sinh học của EBV 10

1.4.2 Cấu trúc của EBV 18

1.4.3 Thể tiềm ẩn cùa EBV 13

1.4.4 Các gen ABV của thể tiềm ẩn 14

1.4.4.1 EI3NA1 14

1.4.4.2 EBNA2 15

1 4.4.3 Gia dinh EBNA3 15

1.4 4.4 EBNA - LP ZZZZL 16

1.4.4.5 LMP1 16

1.4.4.6 LMP2A/2B 16

1.5.Yếu tổ ngoại di truyền 17

1.5.1 Methyl hóa ADN và diều hòa biểu lộ gcn 17

1.5.2 Methyl hóa ADN các promotorcùa EBNA1 18

CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 20 2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cửu 20

2.2 Đổi tượng nghiên cứu 20

2.2.2 Ticu chuẩn chọn bệnh nhân 20

2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ 21

2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin 28

2.4 Phương pháp xử lý sổ liệu 29

2.5 Sơ đồ nghicn cửu 29

CHƯƠNG 3: KÉT QƯẢ 30

CHƯƠNG 4: BÀN LƯẬN 39

CHƯƠNG 5: KÉTLƯẶN 40

MỤC LỤC HÌNH Hình l:Sơ dồ cấu trúc cùa EBV 12

Hình 2:Cấu trúc của EBNA1 14

Hình 3: Một cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN 18

Hình 4: Các promoter cúa EBV điều khiển phiên mã EBNA1 19

Hình 5: DNA xử lý bisulfite 22

Hình 6: Ảnh điện di DNA 24

DẶT VÁN DÊ

Theo báo cáo của tổ chức ung thư quốc tc (IARC - 1903), ung thư vòm mùi họng là một trong tám loại ung thư hay gặp [I] Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay dổi rất khác nhau ở các quần thể dàn cư và các vùng dịa lý khác nhau trên the giới Nơi có tỳ lệ ung thư vòm cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlcn, trong khi ở châu Âu lại có tỳ lệ rất thấp Các nước dông nam Á, trong dó có Việt Nam có tỷ lệ UTVMH trung binh (4) Virut Epstein-Barr (EBV), các yếu tổ môi trường khác và sự nhạy câm di truyền dều dược cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mùi họng và EBV là yếu tố dược nghiên cứu nhiều nhất

các gcn quan trọng là EBNA1, LMP1 và LMP2 (7], [35] EBNA1 giúp duy trì bộgen EBV trong tế bào chủ, trong khi LMPI lại là một gcn có chức năng quan trọngliên quan dên dẫn truyền tin hiệu, chống lại sự chết theo chương trình cùa tế bào và

cỏ khả nâng sinh ung thư cho các tế bảo bị nhiễm Các gcn này nằm cách xa nhautrong bộ gen EBV và dược biểu lộ bởi sự hoạt hóa các promoter khác nhau EBNA1dược biểu lộ ở các thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter: cp, wp và Qp.Tuy nhiên, trong ung thư vòm mùi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt dộng

mà chi cỏ Qp diều hòa biểu lộ gen EBNAI [10], [34]

Methyl hóa DNA vùng promoter là một trong các yếu tổ ngoại di truyền cỏ vaitrò rẩt quan trọng trong diều hòa biểu lộ gcn Mức độ methyl hỏa diễn ra ở các vị trícủa dào CpG tại vùng promoter và cxonl cỏ vai trò trong diều hòa biểu lộ gcn, cỏ thềlàm giâm biểu lộ hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gcn mà bình thường vẫn dượcbiểu lộ [36] Methyl hóa promoter ngàycàng dược công nhận là một cơ che hàng dầuchi phổi sự im lặng của gcn liên quan đến ƯTVMH [18], [37]

Trong nghiên cứu cùa Nguyễn Vãn Đô và cs (2006) chi ra rằng mức dộ biểuhiện gen ức che u CDH13 trong dòng tế bào UTVMI1 từ mầu sinh thiết tương quanvới tình trạng methyl hóa promoter Sự methyl hổa cụ thể dược xác định bàng kỳthuật PCR dặc hiệu (MSP: Methylation Spccofic PCR) Sự biểu hiện các gcn khácnhau trong các thể tiềm ẩn cùa EBV dược quy định bời sự methyl hỏa hay không tạicác vị trí CpG cùa promoter khác nhau [36] Vi vậy, việc xác định mức độ methylhóa vùng promoter của một gcn cỏ thể có ỷ nghĩa quan trọng trong tìm hiểu cơ chếbệnh sinh cùa bệnh liên quan dến chức nàng gen dó trong nhiều quá trình bệnh lý áctính Ngoài ra, khi dùng các chất hóa học đe làm mất methyl hóa thì cỏ tác dụng làmgen hoạt dộng trờ lại và thực hiện chức nâng của chúng, giúp cho việc diều trị nhùng

Ngày nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thề xác dịnhdược mức dộ methyl hóa của một gcn dặc hiệu hay toàn bộ bộ gcn Các kỳ thuật nàydựa vào nhùng nguyên lý khác nhau, có những kỳ thuật rất phức tạp, nhưng cónhừng kỳ thuật dơn giàn và thông dụng [16] Chủng tôi sử dụng kỹ thuật PCR dặchiệu methyl hóa sau khi xử lýDNA bằng phương pháp bisulfite dể xác định mức dộmethyl hỏa các promoter \Vp,Cp và Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, dồng thờiphát triển PCR da mồi dối với các promoter dó Việc phát triển PCR da mồi dặchiệu methyl hỏa không chi giúp ích cho nghicn cứu ngoại di

truyền ở mửc dộ DNA của EBV mà còn rẩt nhiều gcn khác liên quan đến ung thư,dặc biệt là các gcn ức chế ung thư

Đe tài này nlìằm mục ticu sau:

/ Xác định điều kiên tổi ưu phản ứng PCR đa mồi đặc liiệu methyl hóa phát hiện mức độ methyl hóa ở các promoter Wp, Cp vù Qp cùa ERV ở các té bào (lòng IÌ95-8, Namahva và Raji.

2 ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu (lể xác (lịnh mức (lộ methyl hóa 3 promoter (liều hòa biểu lộ gen EỈỈNA1 cùa E1ỈV trong các mẫu sinh thiểt ung thư vòm mãi họng.

-■c -ÍM Qỉ ugc V Hl

CHƯƠNG 1

TÔNG QUAN

1.1 Tìnli hình ung tlnrvòm mũi họng (rcn the giới và Việt Nam.

Ung thư vòm mùi họng (UTVMH), một khối u phát triển lử các te bào biểu mônăm ở vị tri cửa mùi sau và vòm họng, là loại bệnh dứng hàng dầu trong sổ các ungllnr vùng dầu mật cổ với tính chất dịch tễ học khá dặc biệt kì liên quan tới địa lý Tỳ

lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3 vùng rất khác nhau: Khu vực

có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung Quổc và Grơnlcn với tỷ lộ mới mắc từ 30 40/100.000 dân/nâm Ngược lại, vùng cỏ tỳ lệ mắc thấp gồm châu Âu, Mỹ chi từ 0,7

1/100.000 dân/ năm Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưng ngày càng có

xu hướng tăng lên, đỏ là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribec và dông nam Á với tỷ lệ

từ 8 - 12/100.000 dân

Ỏ Việt Nam, ung thư biểu mô vòm mũi họng là bệnh dứng hàng dầu trong cácung thư vùng dầu mặt cổ Theo ghi nhận về tinh hìnhung thư Hà Nội năm 1996 thìƯTVMH dứng hàng thứ 5 trong các ung thư nói chung với tỷ lộ mắc bệnh chuẩntheo tuổi là 7,4/100.000 dân và thứ 8 ờ nừ vói tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là4,7/100.000 dân Mỗi năm có khoáng 350 tới 400 bệnh nhàn UTVMH được điều trịtại bệnh viện K [3]

1.2 Những yếu tố nguy cơ liên quan đen UTVMH.

1.2.1 Vai trò của vừut Epstein-Barr.

Cho den nay người ta dà khăng định UTVMH là loại ung thư liên quan gằn gùivới virut Epstein Barr (EBV) [2], và Là một trong các yếu tố môi trường dược xcm

là quan trọng nhát Người ta phát hiện thấy E1ỈV có mặt trong 100% các khối u vòmmũi họng thề ung thư biếu mô không biệt hóa (UCNT) [24], [38], [33] Ngoài ra, cácsàn phẩm gen của EBV là EBER, EBNAI và LMP-1,-2 dà dược xác định ở hầu hetcác mẫu sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thương quá sàn tại biểu mô vòm họng gồm

những dòng tế bão tiền ác tính nhiễm EBV [30] Diều này phù hợp với giả thuyếtcho rằng EBV là một trong những yếu lổ khởi phát trong cà quá trình nhiều btrớcdẫn đến sự phát triển cùa UTVMH [31].

Ngoài việc phát hiện EBV và sàn phẩm của nó trong khối u vòm họng, người

ta cũng xác định dược các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh nhân vớihiệu giá rất cao [5], [8]

Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao chép vả nhân lên cúa EBV là hiện lượngxảy ra Irong suốt quá trình phát triển cùa UTVMH và nó tương quan với nồng dộIgA/VCA Ỏ bệnh nhân UTVMH nồng độ IgA/VCA cao hơn 8-10 lần so với nhữngbệnh nhân ung thư đầu mặt cồ khác hoặc người khỏe về lâm sàng [6] Dặc biệt xácđịnh IgA/VCA (kháng nguyên vỏ cùa EBV) cùng là một xét nghiệm sử dụng rộngrãi, ờ nhiều nước trên thế giới, trong dó có Việt Nam với giá trị để theo dõi và pháthiện nguy cơ mắc UTVMH, dồng thời là một dấu ấn quan trọng theo dõi tải phát saudiều trị bệnh khi nó tăng cao [6], [41]

Trong sổ các yếu tố môi trường, EBV dược xem như có mối liên quan gần vớiUTVMH bởi sự xuất hiện các loại kháng thể (IgG, IgA) chổng lại các kháng nguyênliên quan dến EBV (ZEBRA, EA, VCA) và sự có mặt cùa ADN EBV ờ 100% mẫusinh thiết UTVMH thể ƯCNT [6],[18],[33]

lý lã rầt khác nhau Như vậy, tác dộng của virus có tính chọn lọc cao nghĩa là cỏ sựtham gia của các dồng yếu tố khác nừa trong dỏ EBV có thẻ là một yếu tố cần thiếttrong một chuỗi các dừ kiện dần den sự ác tinh hóa, giống như những virus sinh ukhác ở người [19].

1.2.2 Môi trường sổng và thói quen sinh hoạt

Nhiều tác già dà dề cập den môi trường sống như khi hậu, bụi, khói ô nhiễmliên quan den UTVMH, nhưng dược nói den nhiều nhất là tập quán ăn uống Nhiềunghicn cứu bệnh - chứng dược tiền hành dà thu dược những kct quà phù hợp với ýkiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quàng Đông) lànguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muốingay từ nhô

Lý do là nitrosaminc cỏ thể dược hình thành bàng con dường nội si nh sau quá trình tiêu hóa cá muối Trên thực nghiệm, cho chuột ăn cá muối cùng gây dược khối

ư vòm và có lãng NDMA trong gan, thận (Terracini 1967, Huang 1978) [t89] Mặc dù nitrosamino chưa dược xem như là một yếu tổ sinh ung thư nhưng dạng chuyển hỏa của chúng cỏ thể gây ung thư (Pour và cs 1973, Althoff và cs 1994, Cardcsa và cs 1976, Lijinsky và Taylor, 1978) ( 7] Týp mô bệnh học của UTVMH dược gây ra bởi cá muối không bị giới hạn ở thề không và ỉl biệt hỏa trong khi EBV

có lien quan chặt chè với hai thề này Đặc biệt LMP1, một protein dược mã hóa bời gen EBV, có vai trò ức chế sự biệt hỏa cùa tế bào biểu mô [7]

Nhiều nghiên cửu bệnh - chứng dược tiến hành dã thu được những kết quà phùhợp với ý kiên cho rằng, tập quán ăn cá muối cùa người Trung Quốc

(vùng Quàng Dông) là nguycn nhân quan trọng gây UTVMII, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muối ngay từ nhó Theo Hu.L.F 1996, máu cá muối có chửa

nilrosamine ờ dạng tiền chất (N- nitrosoditncthylaminc - NDMA) và một vài dẩn chất cùa nó

hoặc trực tiếp thông qua ảnh hường dển tăng trưởng den các tế bào chuyển dạng doEBV [20] Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng Tormadchydc cỏ giá trịthấp trong bệnh sinh ung thư vòm họng.

Nhiều tác giả còn cho rằng, các yếu tổ khác như việc ít ăn rau quà tươi chứacác vitamin, dùng cần sa, ăn trầu, hút thuổc, uổng rượu là những yếu tố nguy hiểm

có the làm gia lủng nguy cơ mắc UTVM11 về lập quán dốt hương, hít khỏi, các tácgià nhận thấy ít cỏ liên quan den UTVMII vì bệnh này gặp với tỷ lệ không cao ờnhững người thờ phụng hương khói trong các dền chùa [39]

1.2.3 Yểu tổ di truyền

Người la thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ lệ mắcthấp han so với những người sinh ra ở dất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lộ mắc chuẩnvản cao hơn dân số nói chung Diều dỏ cho thấy rằng yếu tổ di truyền cỏ vai tròtrong bệnh sinh của UTVMH Nghiên cứu ờ Trung quổc chi ra rầng UTVMH cỏ mốiliên quan dến IILA-A2, B14 và B46 [21] Ờ Việt Nam, các kháng nguyên All, A2,B17 và liên kết mất cân bằng A2-B17, AI 1- BI7 có liên quan den UTVMH [4] Việcxác định các gcn khác liên quan với tính câm thụ bệnh lý cùng dã

dược nghiền cứu: CYP 2E1 (chuyền hóa nitrosamino), glutathion transferase M Cơchế tác dộng của chúng cho dến nay vẫn chưa dược rô ràng, song diều hiện nay dà

và dang dược khẳng định là sự phát triển UTVM11 là do sự phối hợp tác dộng của 3yếu tố là môi trường sống, EBV

Mặc dù dân cư toàn thế giới gần như đều nhiễm EBV (xấp xỉ 100%) nhưngnguy ọợ mắc UTVMII cộn liên quan dến chủng tộc và các vừng dịa lý khác nhau.Nhiều công trình nghiên cứu dã chứng minh yếu tổ gen di truyền có liên quan dondặc điểm cùa chủng tộc và cá thề Mối liên quan này thề hiện tính câm thụ bệnh lý

do một cụm gcn chi phối: dó là gen s (susceptibility) Từ lâu người ta cho rằng, hệthống kháng nguyên bạch cầu người (Human leucocyte antigen -11 LA) có liên quanvới tính cám thụ bệnh lý Gần dây, một số tác già dà chửng minh hiện tượng tângtính cảm thụ của UTVMH khi lủng tần suất một số kháng nguyên ỈILA như Al 1,A2, BI7, B46, DR2, DR4 [trích từ 13, 39], dỏ cùng là những kháng nguyên HLAthường gặp ờ người châu Á, dặc biệt là ờ người Trung Quốc Mối liên quan giừa tầnsuất các kháng nguyên này với ƯTVMH cao gấp hàng trăm lẩn so với người Châu

Âu ,trong khi ở người Châu Âu thường gặp các kháng nguyên A2, All, A28, B8, B5,B51, DR 15, DR 15, CW3 [trích từ 13] Sự giảm biểu lộ HLA lớp I và sự biểu lộHLA lớp II (bình thường không dược biều lộ) ờ các tế bào ung thư biểu mô vòm mũihọng dà dược tim thấy ờ da số bệnh nhân UTVMH và thường di kem với tình trạng

di căn hoặc liến triển của bệnh Dây là một yếu tổ góp phần tiên lượng UTVMH[13] Các bệnh nhân UTVMH trong cùng gia dinh hoặc cùng dòng họ thường có một

số haplotype IILA giống nhau, diều này dưa đen giá thiết có một gen câm thụ vớiUTVMI-I nằm trong hoặc sát cụm gcn IILA và thường là gien lặn, chúng di truyềncùng với hệ thống HLA [131,(39]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu mối liên quan giừa HLA và UTVMH chothấy có tăng nguy cơ mắc UTVMII với tăng tần suất các kháng nguyên All, A2, B17

và lien kết mất cân bằng A2-B17, All - BI7 (13],[20] Việc xác định các gcn khácliên quan với tinh cám thụ bệnh lỷ cùng dà dược nghiên cứu : CYP 2EI (chuyển hóanitrosaminc), glutathion transferase MI Cơ che tác dộng cùa chúng cho đến nay vầnchưa dược rõ ràng, song diều hiện nay dà và dang dược khẳng định: sự phát tricn

1.3 Bệnh học ung thư vòm mũi họng.

1.3.1 Triệu chửng lâm sàng

UTVMIỈ là một loại ung thư biểu mô thường xuất phát từ hổ Roscmullcr, mộtvùng vòm mùi họng giàu mô lympho và các dệm Eustachian Ung thư này có thềcùng xuất phát từ nóc vòm mũi họng, rất hiếm khi xuất phát từ thành trước và dướivòm họng Do cấu tạo giài phẫu như vậy nên ƯTVMH rẩt khỏ chẩn đoán ở giai doạnsớm vì hầu như không có triệu chứng dặc hiệu

Các dấu hiệu sớm thường nghèo nàn, bệnh nhân thường không de ý, ngay cảkhi dến khám ở các cơ sở y tế cũng bị nhầm lần và dề bị bò qua Các dẩu hiệu sớmthường là dau dầu thoáng qua, ngạt mùi thoáng qua, hiếm thấy chảy mũi, khi cóthường ở một bên, có thể có ù tai

Các dấu hiệu muộn thường sau 6 (háng kể từ khi xuất hiện triệu chứng dầu tiên do khối u phát triền lại chỏ và xâm lấn gây ra

- Triệu chứng hạch: hạch cổ phổ biến nhất là vị trí hạch cổ cao, dặc biệt hạch

cổ sau trên (hạch ca nhị thân) hay gập nhất Đi căn sớm lan đến hạch sau hầu của Rouvicrc có thề ở một hoặc hai bên cổ Có the có hạch cổ bên dối diện

- Triệu chứng mũi : ngạt tắc mùi, chày máu mùi, xỉ ra nhày lần máu

- Triệu chửng tai: mất nghe một bên do u làm tắc vòi Eustachi

- Triệu chứng mắt thường xuất hiện giai đoạn muộn do u xâm lấn rộng gây chèn ép tổn thương dây thần kinh chi phổi vận dộng mắt : lác, nhìn dôi, sụp mi, giảm

* Phân loại ntô bệnh học

NPC hoặc những di căn hạch liên quan dược chẩn đoán và phân loại bằng kínhhiển vi quang học, dồng thời cung cấp các thông tin cho chẩn doán xác định trên lâmsàng Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) sự khác biệt về mô bệnh học cùa NPC dược phân thành 3 loại [I]: ung thư biều mô tế bào vây, dược gọi là WHO1, biệt hóa cao, với cảc diem dặc trưng là sự tăng trưởng biểu mô và sợi keratin; Ung thư klìòngkeratin hóa w1-102 vần có một hình dạng bỉnh thường và các mẫu biểu mô binh thường cùa tăng trường, và ung thư \VI 103 thể không biệt hóa (UCNT) sàn xuất keratin và thiếu một mô hình tâng trưởng biệt hóa Những ung thư không biệt hỏa bao gồm ung thư biểu mô lympho có các te bào ảc tính thâm nhập vào biểu mỏ và nhiều te bào lympho không ác lính

Tỷ lệ các loại NI’C thì khác nhau ở các vùng dịch tề và không dịch lễ Ờ Hoa

Kỳ (USA), các loại WHO1 chiếm hơn hai phần ba các trường hợp, trong khi ở châu

Á, cùng như trong những người nhập cư châu Á den Mỹ, loại WHO2 và cảc khối uung thư \V1103 không biệt hóa chiếm ưu thề Điều trị bang xạ trị cho khối u thềWHO2 và -3 có hiệu quả hơn so với WI-IO1 [2]

❖ Chẩn đoán tể bào học và mô bệnh học.

Xác định chần doán bằng xét nghiệm mô bệnh học (liêu chuẩn vảng) trên mànhsinh thiết khối u vòm họng

Các dạng mô bệnh học: Theo phân loại của tồ chức Y tế thế giới (WHO):

- Hay gặp nhất là ung thư biểu mô không biệt hoá UCNT- Undiffcrcnciatcdcarcinoma nasopharyngeal type) chicm 75-85% (type III)

- Ung thư biểu mô dạng biểu bì không sừng hoá (type II)

- Ung thư biểu mô dạng biểu bì sừng hoá (type 1)

- Ung thư biểu mô d*ạng tuyến nang

- Các loại khác.

ỉ.3.2.3 Chần đoán giai doạn.

Việc đánh giá mức độ lan rộng của UTVMH và xếp hạng lâm sàng dựa theo phân loại T.N.M vả giai doạn lâm sàng cùa Lien ban phân loại ung thư Hoa Kỳ (AJCC Cancer staging manual) [36]

> ì' (Tumor): u nguyên phát

+ Tx: u nguyên phát không the dánh giá dược.

+ To: u nguyên phát không rõ ràng

+ Tis: u nguycn phát tại chỗ, chưa phá vờ màng dáy

+ TI: u ngưycn phát nằm trong giới hạn vòm

+ T2: u nguycn phát lan tới mô mem cùa họng miệng và/hoặc cuốn mùi T2a : u chưa xâm lấn lới vùng họng miệng

,T2b : u xâm lẩn tới vùng họng miệng

+ T3: Ư xâm lấn các cấu trúc xương và / hoặc các xoang cạnh mũi

+ '1’4: u xâm nhiễm vào trong sọ nào và hoặc xâm lấn các dây thần kinh sọ nào, u xâm lấn vào hổ dưới thái dương, hạ họng hoặc hố mắt

> N (Node): Hạch cổ

+ Nx: Không dánh giá dược hạch vùng cổ

+ NO: Không cỏ hạch di căn

+ N1: Hạch cổ một bên đường kính <, 6 em, ờ trên I1Ố thượng dòn

+ N2: Hạch di cãn cổ hai bên dường kính < 6 em, hạch trên hố thượng dòn+ N3: Hạch to > 6 em

> M (Metastasis): Di Ciin

•» Mx: di cũn xa không the xác định được

+ MO: Không có di căn xa

+ Ml: cỏ di càn xa

xếp loại giai đoạn theo cách phân loại T.N.M và giai đoạn lâm sàng cùa Liênban phân loại ung thư Hoa Kỳ (American Joint Commitcc on Canccr- AJCC), cụthể:

O

O+ Giai đoạn llb: TI-2 NO-1 MO

+ Giai đoạn IVB: T bất kỳ N3 MO+ Giai doạn 1VC: T bất kỳ N bất kỳ MI

1.3.3 Điều trị

Do khối u nằm trong hốc sâu, gần nền sọ, nên diều trị khó khăn, kết quả bị hạnchế, tiên tượng xấu Điều trị chù yếu là dùng hóa, xạ trị Phẫu thuật nạo vét hạch cổtrưởc hoặc sau xạ trị rất ít dược sử dụng vì vòm họng nằm sâu, phầu thuật khó khăn

dề gây nhiều tai biến và khó kiểm soát bệnh

Ngoài ra cớ thể diều trị bằng các phương pháp tác dộng dển hệ mien dịch của

cơ thể như : Miễn dịch trị liệu, chú yếu là tăng khả năng miền dịch cho cơ

> ■<:

the ngân chạn tế bào ung thư di chuyền và tạo dí căn, dồng thời hỗ trạ trong xạ trị.Liệu pháp vacxin, diều trị dự phòng bang vacxin ngãn ngừa EBV Điều trị bang các

tế bào lympho ì’ có khà năng liêu diệt EBV

Gcn liệu pháp và điều trị bằng quang dộng học hiện nay cùng dang dượcnghiên cứu và ứng dụng

1.3.4 Tiên lượng.

l iên lượng của UTVMII phụ thuộc vào một sổ yếu tố!

- Kích thước khối u nguyên phát, tỉnh trạng di căn hạch và di căn xa

- Giai đoạn lâm sàng: giai doạn càng sớm tiên lượng càng tốt, giai đoạn càngmuộn tiên lượng càng xấu do nguy cơ di căn và tái phát cao [6|, [7],

- Loại mô học và dộ mô học của khối u

- Liều lượng và sự đáp ứng vởi xọ trị

EBV nhãn lên trong tế bào biểu mô tuyến nước bọt, sau <ló qua biểu môvòm họng rồi xâp nhập vào tế hào lympho B qua thụ the CD2I trên bề mặt tế bào.Sau khi di vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở dạng vòng là chù yếu và tự nhân lên nhờnguyên liệu cùa tế bào [19] Tuy nhiên, EBV cũng tích hợp vào DNA của nhiễm sắc

thể te bào chú, ví dụ ờ te bào dòng Namalwa, nó tích họp vào nhiêm sắc thể ở vị trí Ip3 5 Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong lympho B, EBV biểu lộ rất ít kháng nguyên, hơnnữa với số lượng tế bào nhiễm quá thấp (1 tế bào lympho B/lml máu) do dó EBVkhó bị tiêu diệt bờỉ hệ miễn dịch Khi ở the dung giải, EBV nhân len nhiều và giãiphóng ra ngoải rồi lại nhiễm vào các tế bào lympho khác, chúng den tuyến nước bọt

và hỉnh thành chu kỳ nhân lên EBV trong cơ thể

• Nhiễm EB V cùa tẻ bào biểu mõ (lien bào).

EBV dược lây truyền qua dường miệng, (hông thường nhất bởi nước bọt từnhững cá thể nhiễm EBV Ngoài dường này thi ghép, truyền máu cũng là dường lâytruyền bệnh [9J

Người ta cho rằng, virus dược tái sao ờ liên bào tuyến nước bọt mang tai vàbiểu mô dường hô hấp trên (Miller 1990; Sixbcy 1992; Wolff và cs 1984) [trích từ39] Virus dược phóng thích một cách không liên lục trong nước bọt cùa hầu hếtnhững người nhiễm EBV, sau dó chúng vào tế bào lympho B và tể bào biểu mô vòmhọng qua rcxcplơ CD21 và bởi hiện lượng thực bảo qua trưng gian rcxcptơ với IgA.Phân tử nhận biết CD21 cùa EBV là gp 350/250, CD21 còn dược phát hiện ở liênbào vòm họng và liên bào ống tuyến nước bọt (Young và cs 1986, Sixbcy và cs1987) [trích từ 39] Nhờ thụ thề này mà virus lại vào các tế bào khác và hình thànhthể tiềm ẩn (latent) Vì thế lympho B và liên bào vòm họng là ổ chúa và sao chépEBV [39]

Với những tể bào biểu mô không biêu lộ rcxcptơ CD21, người ta cho rằngvirus có thẻ vào bằng nhùng cách sau:

- Khả nàng thử nhất có thể xảy ra là sự tiếp cận giừa tế bào biểu mô vòm họng

và tế bào nhiễm EBV Te bào B đi vào chu trình dung giãi, bung ra các bán sao củavirus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus mới cho các tể bào khác trên một diệnrộng (Bayliss và Wolf 1980,1981) [trích từ 89]

- Khả nâng thứ hai: virus vào té bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào quatrung gian rexeptơ với IgA (Sixbcy và Yao, 1992) [trích từ 89]

Virus có thẻ dược tim thấy ờ nước bọt với dặc tính ngắt quàng trong nhiều

Nhiễm EBV gây ra 2 thế trong te bào chù :

+ Thể dung giãi (nguyên phát) tạo ra một chu kỳ sao chép virus hoàn chinh bao gồmviệc tạo thành những hạt virus con và giải phóng chủng ra ngoài sau khi phả vỡ tếbào chủ Tiếp theo, virus con lại nhiễm vào tế bào mới nhờ rcxcptơ CD21

+ Thể tiềm an: Sau khi virus con xâm nhập vảo tế bào lành (tế bào mới) khácthì cỏ một lượng nhất định gen virus dược biểu lộ nhưng không sàn xuất hạt viruscon hoàn chinh (ngủ yên) và không ly giài tế bào dó dược

Kiều hình của nhiễm EBV ở thề tiềm ẩn dược chia làm 3 týp (I, 11, III) tùytheo sự biểu lộ của 10 gien tiềm ẩn UTVMH thuộc týp II với sự biểu lộ của LMPI-2A, 2B, EBER, EBNA1 trong dó LMPI là một trong sổ các protein của EBV thườngdược biểu lộ ở các khối u vòm họng (gạp 60- 70% bằng phương pháp hóa mô miendịch ) [89]

Theo nhiều tác già, LMPI dóng vai trò then chốt (rong sự biến dổi ác tínhcủa lympho B invitro và là gen EBV duy nhất có tác dụng biến dổi và ức chế sự biệthóa cùa tế bào biểu mô Vì tỉiể, nhiều tác già cho rằng LMPI có vai trò quan trọngtrong phát sinh và phát triển cùa UTVMH [89],[ 124],[134]

Với nhùng t4 bào biểu mỏ không biếu lộ rexcptơ CD21, người ta cho răngvirut cỏ the vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có the xây ra là sv tiếp cậngiừa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV Tố bào B di vào chu trình dunggiãi, bung ra các bàn sao cúa virus, cung cấp một sổ lượng lớn các hạt virus mới chocác tế bào khác trên một diện rộng Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu môbởi hiện tượng thục bào qua trung gian rcxcptơ với IgA [39] Ngoài ra, phân tử

EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gcn cùa nỏ khoảng

172-kb và DNA là chuỗi dôi, GC chiếm 60% tồng số nuclcotid EBV hình thành phân từDNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm (hĩnh 1A) Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95-8bằng cmzym cắt giới hạn BamHI, câc đoạn gen tạo ra dược ký hiệu theo bàng chữcải và theo thứ tự kích thước giảm dần (hình 1B) Thuật ngừ sử dụng cho từng đoạnnhư sau: Mỗi chữ cái là ký hiệu cho từng doạn (A, B ), khung dọc mở trái hoặcphải và tiếp theo là thứ tự (0,1,2,3 ) vi dụ như BARF0 và

TU/ -.ựíi 4 : u;c V HL Hí:

BARFI Toàn bộ bộ gcn EBV của dòng tế bào B95-S dược giải trình lự gcn dầu ticn, và có mà sổ tại ngân hàng gcn là VOI555

Các EBV sân xuất khoảng 100 kháng nguycn khác nhau (các phân tử protein lớn) trong thề dung giãi của nó, ngược Lại, chi có khoáng 10 kháng nguyên dược sànxuất trong các the nhiễm tiềm ẩn [32]

EBVvLP ÊBNA2 EBW E6W3 E8MA3C E6XVi LVPl

Hình 1 Sư đồ cắn trúc của EBV: A) cẩu trúc EBV dạng vòng biêu thị các vùng promoter và các gen thể nhiễm tiềm ẩn: EBER1 và 2: EliK Early RNA,

EBNAI-6: ẸBV Nuclear Antigen, LMPl và 2: Latent Membrane Protein B) EBV ở dạng thẳng gồm các đoạn gen dược tạo ra sau khi xừ lý với enzym giới hạn BamHl

và vị tri các gen cìta thể tiềm ấn.

1.4.3 Thể tiềm ẩn của EBV

Giống như tất cả các virut herpes, EBV cỏ thề tồn tại dạng không hoạt dộng trong tế bào bị nhiễm Ờ thề này, EBV biểu lộ 12 gcn nhưng chi có 10 gen trong số này dược dịch mà dể tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein là kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNAI, 2,3A,3B,3C, -LP; 3 loại protcnin màng tiềm ẩn

-■c -ÍM Qỉ ugc V Hl

(Latent Membrane Protein): LMP1, LMP2A và 2B; 2 loại RNA không mà hóa protein (EBV Early RNA): EBER1 và2 Có bốn thể tiềm ần dược phân loại dựa trên

sự biểu lộ gcn cùa virut, dược liệt kê ở bảng dưới dây

Bảng ỉ: Các thề tiềm ẩn của EBỈ/

Thể Biểu lộ gcn Ngưửi thường và các bệnh liên

LMP2A

+/-I EBER1 &2 u lympho Burkitt, ƯTVMII

EBNA1

II EBERI & 2 UTVMH, u lympho Hodgkin,

EBNA1 ư lympho tế bào T, ung thưLMP1 tuyến nước bọt

LMP2A&2BIII EBER1&2 u lympho sau ghép tạng, u lympho

EBNA1 - 6 ở bệnh nhân AIDS, bạch cầu dơn nhânLMP1 nhiễn khuẩn, LCL

LMP2A & BDấu ấn là những chất nói lên sự hiện diện cùa nó Dấu ấn EBV có thề có trong huyết thanh (các kháng the IgG và IgA chổng VCA, EA, EBNA )

1.4.4 Các ỊỊCH EBV cùa thề tiềm àn

1.4.4 ì EIÌNAI

Protein EBNAI cũa I-BV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng khoáng

66-95 kl)a và chiều dãi là 641 axit amin Kích thước này dược thay dổi ớ các chungkhác nhau do sự khác nhau ớ đoạn lập lại glycin- alanin (Gly-Ala) |23| Các cẩu trúc

cơ ban cùa I-BNAI dược chia thành bốn vùng rò ràng: một vùng cơ bân nằm ớ dầu Ngồm <S9 acid amin vùng lặp lại (Ìly-Ala gồm 239 acid amìn, vùng cơ bàn ngắn vàmột vùng gần DNA ỡ dầu c cò chiều dài từ axit amin 459-64(29] (I linh 2)

Hình 2 Cấu trúc của EBNA1: ElỉNAl bao gồm 641 axit a/nin và trình tự

Vùng lạp Gly-Ala coban Vung

liẽnket ADN

45 9

EBNAI là protein biểu lộ hầu như lất cà các tể bào nhiễm EBV và nó dóngmột vai trò quan trọng trong việc duy tri cpisom của EBV (dọng vòng) trong nhân

tể bào chủ, cùng như chức năng phiên mà của virut (40] Vùng gắn DNA cúaprotein EBNA1 tương tác với hai khu vực nằm ở vùng orip cùa promoter Cp, baogồm gia dinh lặp di lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nuclcotid cỏtrình tự lặp, doạn DS (Dyad Symmetry) có 4 vị trí gắn, và một vùng có hai vị trígắn sau promoter cùa Qp

Liên ket EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so vói DS và Qp và khi gằnvớĩ FR thi nó diều hòa phiên mà các gen EBNA Các gcn này dược biểu lộ dưới sựkiểm soát cùa promoter Cp hay Wp EBNA1 cũng cỏ thể lien kct với các introndầu tiên xuôi chiều của promoter Qp làm lự diều hòa biểu lộ protein EBNA1 Ỏcác thể nhiễm liềm ẩn I và II, các promoter Cp và wp không hoạt động và biểu lộcủa EBNA1 dược thực hiện bởi Qp, Cp và Wp không hoạt dộng do các yếu tốphicn mà và methyl hóa AND [36]

Protein EBNAI là yếu tố diều hòa trans (trans-regulator) gắn vào ADN dặchiệu ờ doạn có trình tự TGGATAGCATATGCTATCCA bên trong ori p

(vùng FR và DS) de khởi dộng sao chép ADN tiềm ẩn cùa virus và duy tri cpisomc(Yatcs và cs 1984, 1985) [7] Vùng EBNA I gắn với ADN đặc hiệu trong ori p khutrú ở 1/3 cuối cùa dầu -C tận (Polvỉno-Bodnar và cs 1988) Nguyền Vân Đô và cs

2003 cho thấy các biến dị hay mất doạn thường gặp ở dàyịl5Ị

Gcn EBNAI còn gắn với vùng diều hòa cis (cis regulator sequence) thôngqua vùng IR -Gly-Ala (Snuddcn và cs 1994) làm cho te bào 13 từ trạng thái nghi

chuyền sang biểu lộ các EBNA, nhung không gây tác dụng tâng trưởng tế bào Tebào lympho B chuột nhắt dược chuyển gen EBNA I sè gây dược lymphoma vàleukemia (Wilson và Levine 1992) nghĩa là EBNA1 cỏ the tham gia vào biến chuyềnchọn lọc thành tế bào ung thư [7]

1,4.4.2 EBNA2

Protein EBNA2 cỏ trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa Do có trinh tự gcnkhác nhau ở các chúng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A và EBNA2B, cùng làdấu ấn quan trọng dể xếp loại EBV typ I và typ 11[9] Các protein EBNA2A vàEBNA2B chứa 484 và 443 axit amin một cách tương ứng và giống nhau về trình tựkhoáng 57% EBNA2 là một trong những protein vi rut dầu tiên dược biểu lộ ờ các

te bào lympho B bị nhiễm EBV, nó xuất hiện khoảng 24-48 giờ sau khi nhiễm EBV

trong nuôi cấy tế bào /7» vitro [28] Protein này là một chất kích hoạt phiên mã một

số gen cùa virut và te bào bao gồm cà những gcn như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc,

và là cần thiết cho sự bất tử của tế bào B trong /7; vitro EBNA2 không gắn trực tiếp

với DNA, nhưng tác dộng thông qua các protein in khác như RBP-JK), PU1 cácprotein khác của tế bào

1.4.4.3 Gia dinh EBNA3 ( EBNA3A, 3B và 3C)

Các gcn trong gia dinh EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B vả 3C nằm ở giữa bộgcn EBV, có cấu trúc cxon-intron tương tự và có trọng lượng phân tứ từ 140-180kDa Các chuồi acid amin EBNA3A, 3B và 3C giừa EBV typ I và II cỏ giống nhau ở84%, 80% và 72% một cách tương ứng Các protein này hoạt dộng có chức năngphiên mã và cùng có thế tương tác với các protein RBP-JK [20]

1.4.4.4 EBNA-LP

Các protein EBNA dần dầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ 20-130kDa, Là kết quà cùa hoạt dộng promoter \vp Cùng với EBNA2, EBNA-LP là mộttrong những protein dầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro

Theo nghiên cứu cùa một số tác giã (6J,[ 13].(15],[25],[34], giá trị giúpchần doán UTVMH của EBNA chi dược dè cập đến khi chúng cỏ mặt ờ mô sinhthiết vòm họng Loại EBNA có biểu lộ ở tế bào biểu mô vòm họng liên quan dếnUTVN4H là EBNA-I Trong huyết thanh, IgG/EBNA thường không cỏ giá trị chẩnđoán bới chúng cũng xuất hiện ngay cả trong huyết thanh người bình thường vàngười bệnh Burkitt Lymphoma (BL) Tuy nhicn, IgG/EBNA cùng có giá trị theo dõidiễn biển cùa bệnh Theo Trần Ngọc Dung, Phan Thị Phi Phi 2000: trước diều trị,hiệu giá IgG/EBNA càng cao thì tiên lượng càng tốt và ngược Lại, nhưng sau diềutrị, nếu IgG/EBNA giảm xuống thì bệnh ồn dịnh và tiếp tục tãng thi cỏ khả núngxuất hiện tái phát [13],[25]

LMP1 có cấu trúc giống gia dinh rhodopsin R, nỏ dược phát hiện dưới dạngmàng cùng với LMP2A (Hennessy và cs 1984; Mann và cs 1985 ; Licbowitz và cs1986; Longncdccr và Kieff, 1990Dạng hoạt hóa của LMP1 là dạng protein hoànchinh, khi bị thúy phân (protcolysc) thành các doạn polypeptid từ 25-35 kD thì bị bấthoạt (Moorthy và Thorlcy-Lawson, 1990) LMP1 dược phosphoryl hóa chú yếu ởserine, cả ở thrconin (Baichwal và Sugden 1987, Mann và Thorlcy - Lawson 1987) ởdầu tận -C, khi dó nó dược giâi phóng vào bào tương

Các vị trí phosphoryl hỏa cùa LMP1 rất quan trọng cho chức năng Hai khángthe LMP1: S12 (monoclonal) và CS1-4 (cocktail cùa 4 KT monoclonal) có thề nhậnbiết dược những quyết định kháng nguyên ờ dầu-C tận trong bào tương của LMP1

và thường dược sừ dụng dể phát hiện nó

> BiểulộLMPl

LMPI có thời gian phân hủy rất ngắn, từ 2-3 giờ (Baichwal và Sugden 1987;Mann và Thorlcy-Lawson 1987, do khả nâng dễ tách cùa dầu-C tận giải phóng mành

25 kD vào bào tương, còn mảnh 35 kD nằm lại trên màng bào tương Chi cỏ 30-50%

tế bào trong LCL tổng hợp LMP1 tại một thời điểm bất kỳ (Mann và cs 1985; Rowe

và cs 1987), gợi ý rằng sự tổng hợp của nó liên quan den chu kỳ tế bào (Boos và cs1987)

> Vai (rò của LMI’1 trong bệnh sinh cùa UTVMII

+ !<hã năng sinh u cùa LMP1

Pathmanalhan và cs 1995 phát hiện thấy LMP1 cỏ mặt ờ tất cà 6 mẫu sinh thiếtvòm mùi họng cỏ tồn thương tiền ác tinh (quá sân) bằng kỷ thuật hóa mô miễn dịch(HMMD) với kháng the CSI - 4 (cocktail sera 1-4) [12] Kot quà này cho thấy, cóthể LMPI góp phần vào sự phát triền tiếp tục cúa tinh ác linh của lổn thương [23].Phái hiện này cùng phù hợp với nhận XÚI cho rằng, LMPI có liên quan den rối loạndiều hòa phát triển cùa tế bào biểu mô

Theo Gregory và cs 1991, LMPI hoạt hỏa gcn gây ung thư cùa tể bào là

bcl-2 (B cell lcukcmia/lymphoma), cỏ tác dụng chống lại hiện tượng chết theo chươngtrình (apoptosis) trong tế bào B cùa người Vì vậy, sự câm ứng cùa bcl -2 thông quaLMP1 có thể góp phần cho sự sống sót cùa virus trong quần thể những tế bào B trínhớ sống dài ngày Trong tế bào biểu mô, LMP1 dưỡng như ngăn cân sự biệt hỏa vàchống Lại hiện tượng chết theo chương trình theo cách dộc Lập (không giống bcl-2),bắng cách tăng biểu lộ gen A20, là gcn có khả nâng ngăn cân apoptosis trong những

le bào B và cả tể bào biểu mô (Opipari và cs 1995)

Protein LMP1 dược phicn mã từ vừng BNLF1 nằm ờ gần cuối dầu 3* của bộgen EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chùng virus Ở chủngEBV của tế bào dòng B95-8, protein này có 386 axit amin và chia thành ba vùng,(i)một vùng dầu N gồm 24 axil amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước dược kết nổibởi ba vòng bên ngoài và hai vòng nội bão, (iii) một vùng dằu c có 200 axít aminbao gồm hai lĩnh vực chức năng quan trọng dược gọi là vùng hoạt hỏa CTAR1 (C-Tcrminal Activation Region 1: aa 194-232) và CTAR2 ( aa 351-386)

LMP1 tham gia ba chức nãng chính là chuyển dạng, di cũn và chồng lại chếttheo chương trinh LMP1 dược coi là sản phẩm cùa một gcn sinh ung thư vi nó cóthể làm chuyển dạng các nguycn bào sợi dộng vật gặm nhẩm Biểu hiện cùa LMP1cũng tác dộng ảnh hưởng dáng kề đen sự tăng trưởng của tế bào biểu mô, ức chế sựbiệt hóa của chúng, gây biển dồi hình thái của một số dòng tế bào biểu mô và làmtăng biểu hiện các yếu tố lăng trường biểu bì EGFR[22]

1.4.4 6 LMP2A/2B

1.4.4.7 Biển thể gen của EBV

Giống như tất cà câc virút herpes, nhiều chùng / biến thể khác nhau cùa EBV

có mặt trong các quần thề dân cư có tính da hình về trình tự gcn tại những vị trínhất định ẸBV typl và 2 (hoặc typ A và B) dược phân biệt trcn cơ sở trinh tự củacác gen EBNA2, EBNA3A, 3B và 3C, biểu lộ các sàn phẩm protein có độ giốngnhau 55%, 84%, 80% và 72% một cách tương ứng

Mối liên quan của hai typ EBV khác nhau ở các quằn thề người khác nhauvới bệnh tật cùng cần phải nghiên cứu cụ thể hơn Phân lập virúl và các nghicn cứudịch tễ huyết thanh cho thấy rằng EBV typ 1 chiếm ưu the ờ các

nước phương Tây và châu Á, trong khi cà hai loại là phổ biến ờ xích dạo châu Phi,New Guinea và cỏ lê một số khu vực khác [57, 133], EBV typ I gây chuyển dạng

nhiều hơn EBV lyp 2 ở tế bào B in vitro Da số người khỏe mạnh chi bị nhiễm một

loại EBV, nhưng một số người bị nhiễm nhiều chủng EBV[121, 134],

Các bộ gcn của ba chùng EBV, bao gồm hai typ 1 (B95-8 và GDI) và một typ

2 (AG876) dà dược giải trình tự loàn bộ bộ gcn [36, 135, 136) Dây là những chùngEBV phân lộp từ bệnh nhân vả chưa có một biển thề nào dược lấy từ người binhthường Trong ba chủng của EBV dó các biến thể gcn xuất hiện trong 7 gcn sau: FR,EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, EBNA1 vàLMPI [137]

Dựa trên kết quà giãi trình tự nuclcotid từng gcn hoặc một phân đoạn ngẩn củacác ADN của virut, một số biến thể gcn khác cúa EBV dà dược phát hiện Ví dụ, cácbiến thể cùa gcn cùa LMPI [138], LMP2 [122], EBNAI [139], FR [140] và BZLF1[141] có mặt trong các quần the khác nhau với các bệnh khác nhau Nhiều công trinhtập trung nghiên cứu vào việc xác định câc biến thể khác nhau của LMP1 có thể liênquan den bệnh ung thư (142] Sự khác biệt địa lý về tần suất cùa bệnh lien quan đếnEBV có thê Là do sự khác biệt về các phân nhóm của EBV với tính chất bệnh lýkhác nhau

Hầu hết các nghiên cứu sinh học EBV dà dược thực hiện ở virut, phân lập từbệnh nhân bị bệnh bạch cầu dơn nhân nhiễm khuân (B95-8) Một chủng (MABA)thu dược từ bệnh nhân NPC phần lớn là giống EBV cùa dòng B95-8 [143] Chủngthứ hai liên quan den NPC (NPC-K1) dã dược phân lập từ PCR trực tiếp cùa các tếbào khối hòa màng với một dòng tê bào biêu mô tuyên của người [144] Cả hai hình

thái sau có thể chuyển dạng tể bào lympho in vitro.

Bằng cách sir dụng enzyme giới hạn để phân tích và tìm biến thể trỏng hệ gcncùa virut, một số clnìng dặc hiệu dã dược phát hiện trong các quần the cư dân khácnhau [145] Một biến thể phổ biến, dược gọi là Cf và được phát hiện ờ 86% mầusinh thiết bệnh nhân NPC ở miền nam Trung Quốc, dà bị mất các vị trí cẳt bởi

BamH\ giữa mãnh Wỉ và II (biến thể C), thường xuyên liên quan den một vị tri cắt

-■c -ĩỊK ZK ■■ -u Mê:

them cùa ĩìamHỈ trong doạn 1' (f biến thể) Một tính da hình tại vị trí Xho\ cũng có

mặt trong hầu hết các bệnh nhân NPC Trung Quổc, nhưng không thấy ở các bệnhnhân NPC châu Phi[146)

Các biển the gen LMP1 và EBNA1 là liên quan đen sự khác biệt chức nâng,

có the dóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển cùa NPC [147- 149] bang cáchthay dổi mối quan hệ vật chủ-virut, tác dộng den nguy cơ tiền triển bệnh LMP1không biểu lộ ở các tế bào lympho máu ngoại vi thể nhiễm tiềm ẩn, nhưng cỏ một ởcác trường hợp tiền xâm lấn của NPC với một tỷ lệ dáng kể [150] Có thể, các tế bàobiểu mõ bị nhiễm EBV biểu lộ một loại LMP1 mà không dược nhận biết bởi hệthống miễn dịch do cpitop bị thay dổi và do dó vẫn tồn tại, trong khi các tế bào biểu

lộ epitop LMP1 dược trình diện sê bị loại bỏ Như vậy sự chọn lọc âm tinh nhùngchùng trong máu do hệ thống miền dịch có the dtrợc phàn ánh tru thế nồi trội cũachủng China 1 trong khối u [151] Tuy nhiên, các hiểu biết còn hạn chế, phần lởn là

do cờ mẫu nhỏ và thiết kế nghiên cứu chưa phù 11Ợ, cảc biến thể gen LMP1 nêndược phân tích với cở mẫu lớn hơn ở các quần thể cư dân khác nhau

Trinh tự cúa protein LMP1 biểu lộ dược phân lộp ở một chủng EBV TrungQuốc, CAO, dà cho thấy dột biến thay thế một sổ acid amin, cũng như mất đoạn 10acid amin, so với chủng EBV dòng B95-8 Các tế bào biến nạp với hai chủng này cókhác nhau về mặt hình thái và chi cỏ chủng CAO mới gây ra các khổi u ớ chuộtnude Khả nâng sinh u cùa chùng CAO trong các tế

bào BAI.B/c3T3 có liên quan den mất đoạn 10 acid amin ờ dầu c lận [147] Sự da

hình của Xho\ liên quan đến thay dơi các vị tri axit amin ở dầu c tận và mắt đoạn 10

axit amin nên dược cân nhắc là những dấu ấn trong các nghiên cứu sau này

1.5 Yen tố ngoại di truyền

Ngoại di truyền là nghiên cứu các cơ che làm không biểu lộ gcn mà khôngliên quan đến sự thay dổi trinh tự nuclcotid của gcn Những biến dổi ngoại di truyền

cỏ thể di truyền dược từ thế hệ tể bào này sang tế bảo khác Khi nói den ngoại ditruyền người ta thưởng nhẩn mạnh 3 yếu tố là: methyl hóa DNA, sứa chừa histon vànuclcosom Các thay dổi này là dộc hập với nhau và methyl hỏa xây ra ở mức dộDMA trong khi 2 yếu tố còn lại diễn ra ở mức độ protein

Các quá trinh ngoài gcn có thể làm cho gcn không biểu lộ mà không có sựthay dổi trong chuồi nuclcotid cùa gen dó Giống như những thay dồi về gen, một sốloại thay dổi ngoài gen có thể dược truyền từ the hệ tế bào nây sang thế hệ tế bào ketiếp Ba yếu tố ngoài gcn dược chú ý nhiều hiện nay là methyl hóa ADN, sừa dổihiston và nuclcosom Hai quá yếu tố sau liên quan den sự thay dổi ở các protein.Ngày nay, bộ gcn người dược cho là có chứa khoảng 23.000 gen và số proteinbiểu lộ có thể tàng 3-4 lần ở các thời điềm chinh xác trong các te bào khác nhau.ADN của tế bào có nhân dược bao bọc bời các protein histon hình cầu dể tạo thànhnucleosom [169], chúng nối với nhau dể hình thành chất nhiễm sắc Khi cấu trúc cùachất nhiễm sẳc này được cô dặc (im lặng), gen có thể khổng phicn mã và do dỏ bấthoạt (tắt), trong khi nhiễm sắc thể mờ (hoạt dộng) thi cho phép các gcn được biểu lộ(bật)

rình trạng này dược kiểm soát bời sự methyl hóa ADN và sửa dổi cùa histone,

là các quy trình cần thiol cho sự phát triển bình thường và lãng trưởng cùa các tebào Tuy nhiên, khi các cơ chế kiểm soát ngoài gcn trờ nên bất thường, chúng có thể

1.5.1 Methyl hóa DNA và điều hòa hiểu lộ gen.

Methyl hóa DNA là sự kiện diễn ra do một gốc CH3 liên kết dồng hóa trị với

vị trí cacbon số 5 cùa Cytosin nằm ở vị trí hai nuclcotid Cytosin-Guanin viết tắt làCpG (p là liên kếi phosphodicslc) Khi CpG tập hợp nhiều trong khoáng 200bp tạimột ví trí nào dó trong gcn có GC chiếm hơn 50% thì người ta gọi là đào CpG.Khoảng 10-15% CpG ở dộng vật có vú nằm ở vùng dâo CpG và nó thường xuấthiện, ở vị trí vùng promoter và cxonlcùa khoáng 40% các gcn cùa dộng vật có vú

Cơ chế gắn gốc CH3 vào DNA trong quá trình phân bào nhờ các enzymmcthyltransfcrase (DNMT) Có 4 loại DNMT được xác định ở dộng vật có vú vả cà

4 enzym dều chuyền nhóm CH3 từ S-adcnosyl inethionin sang DNA Trong các môbinh thường các đào CpG thường không bị methyl hóa Khi chúng bị methyl hóa ớvùng promoter dẫn đến hai cơ che diều hòa biểu lộ gcn: Một là, ức chế các yểu lốdiều hòa biểu lộ gcn gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gán vào Cytosin, cơ chenày dược minh họa trong (Hình 3) Hai là, có các protein gắn dặc hiệu với CpG