CHƯƠNG 3 LÊN MEN CÁC SẢN PHẨM TỪ SINH KHỐI TẾ BÀO VI SINH VẬT

1. Lên men sản xuất axit glutamic, lysin, metionin từ vi khuẩn corynebacterium glutamicum: 1.1. Lên men sản xuất axit glutamic: Quá trình sản xuất axit glutamic bằng phương pháp lên men theo sơ đồ sau: Nguyên liệu tinh bột H2O Phối chế HCl Thủy phân Phối chế dịch lên men Nguyên liệu phụ Men giống Thanh trùng dịch lên men Chuẩn bị men giống Lên men Trao đổi ion Tách axit glutamic Hình 16. quy trình lên men sản xuất acid glutamic 1.1.1. Nguyên liệu, phối chế và thủy phân Có thể sử dụng nguyên liệu là tinh bột (sắn, ngô, gạo...) hoặc rỉ đường. Đối với tinh bột phải được thủy phân bằng axit. Để thủy phân có thể phối chế nguyên liệu theo tỉ lệ: tinh bột nướcHCl 100% = 1003500,77. Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 148÷150oC, áp suất = 2,5 kgcm2, thời gian 30÷34 phút. Sau khi thủy phân xong làm nguội dung dịch xuống 60 ÷ 70 oC và tiến hành trung hòa: để trung hòa lần 1 người ta dùng Na2CO3 trung hòa đến pH = 4,8 ÷ 5, tốc độ cánh khuấy 65 vòngphút. Tiếp theo cho than hoạt tính để tẩy màu sơ bộ rồi lọc tách bã than và cặn. Tiếp tục dùng Na2CO3 trung hòa lần 2 đến pH = 6,7 ÷ 7, tốc độ cánh khuấy 60 vòngphút. Dùng Na2CO3 vừa rẻ tiền vừa làm cho dịch đường không có vị đắng như NaOH. 1.1.2. Chuẩn bị môi trường lên men Ngoài dịch đường thủy phân, trong môi trường lên men phải bổ sung thêm 1 số chất khác. Ví dụ: môi trường lên men sau: Dịch đường hóa 13% Cao ngô 0,7% K2HPO4 0,15% MgSO4 0,075% Urê cho ban đầu 2%, bổ sung giữa chừng 1,2% và MnSO4 2% Trong thực tế sản xuất người ta dùng rỉ đường mía thay cho cao ngô và đây cũng là nguồn cung cấp các loại đường cho vi khuẩn sinh tổng hợp axit glutamic. Sau khi phối chế, môi trường được thanh trùng và làm nguội. Yêu cầu dịch đường lên men phải vô trùng tuyệt đối, bảo đảm độ khô 5 ÷ 6 Be. 1.1.3. Lên men dịch đường Chủng nấm men: người ta có thể sử dụng chủng vi khuẩn sau để lên men tổng hợp axit glutamic: Corynebacterium glutamicum (ngoài ra có thể sử dụng Brevibacterium flavum...) Vi khuẩn sử dụng trực tiếp đường và NH3 của môi trường lên men để sinh tổng hợp Laxit glutamic có thể diễn ra theo 2 con đường: Glucoza Hexemonophotphat Axit pyruvic Axit α – xetoglutavic Con đường amin hóa – khử Con đường chuyển amin L – axit glutamic Hình 17. Quy trình lên men sản xuất acid glutamic từ dịch đường Con đường amin hóakhử: HOOCCOCH2–CH2COOH + NADPH2 HOOCCHCH2–CH2COOH + NH2 H2O + NADP Con đường chuyển amin: HOOCCOCH2CH2COOH + RCHCOOH HOOCCHCH2CH2 COOH NH2 NH2 + RCOCOOH Phương trình tổng quát của quá trình lên men: C6H12O6 + NH3 + 32O2 C5H9NO4 + CO2 + 3H2O Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: + Độ pH của môi trường Các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp Lglutamic đều thích hợp ở môi trường trung tính hay kiềm yếu ở pH = 6,7 ÷ 8. Trong quá trình lên men độ pH giảm vì tạo ra axit glutamic và 1 số axit hữu cơ khác. Do đó phải điều chỉnh độ pH thường xuyên bằng NH4+, Nguồn NH4+ sử dụng phổ biến là: urê, nước NH3, khí NH3, NH4Cl... + Sự cung cấp O2 Lên men tổng hợp axit glutamic là quá trình hiếu khí bắt buộc. Do đó sự cung cấp oxi trong khi lên men là hết sức quan trọng. Nếu thiếu O2 thì sản phẩm chủ yếu là axit lactic, nếu thừa oxi thì sản phẩm chủ yếu là axit αxetoglutavic. Oxy được cung cấp cho dịch lên men bằng cách sục không khí vô trùng kết hợp với khuấy trộn liên tục, vận tốc cánh khuấy 150 vòngphút. + Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men là 26÷37oC, trong thực tế lên men giai đoạn đầu ở 30÷32oC và giai đoạn cuối 36÷37oC. + Chất kích thích sinh trưởng Quá trình tổng hợp axit glutamic rất cần biotin. Biotin không chỉ là chất sinh trưởng mà còn là chất xác định thành phần và số lượng các sản phẩm lên men. Sinh khối của vi khuẩn tăng tỉ lệ với hàm lượng biotin nhưng với axit glutamic thì không hoàn toàn như vậy: lượng axit glutamic được tạo thành nhiều nhất khi trong môi trường hàm lượng biotin thấp hơn nhiều so với lượng biotin cần thiết cho sự phát triển tối đa của sinh khối. Biotin không làm thay đổi hoạt lực của các enzim tổng hợp nên axit glutamic mà ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng tế bào, làm cho axit glutamic từ bên trong tế bào vi sinh vật khuyếch tán ra ngoài môi trường lên men. Nồng độ biotin thích hợp nhất cho sinh tổng hợp axit glutamic 2÷5gl. Nguồn cung cấp biotin là cao ngô, rỉ đường mía. Trong quá trình lên men nếu dùng rỉ đường mía làm nguồn cung cấp đường và biotin thì thường xảy ra hiện tượng thừa biotin sẽ không có lợi, sinh tổng hợp axit glutamic ít, nếu sục khí kém sẽ tạo ra alanin và axit lactic. Vì vậy, người ta phải bổ sung thêm penicilin để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường giàu biotin đồng thời tăng trưởng quá trình tổng hợp axit glutamic. 1.1.4.Các phương pháp lên men Có thể lên men gián đoạn, bán liên tục và liên tục. Ở nước ta các nhà máy sản xuất bột ngọt đều dùng phương pháp gián đoạn. Men giống phải được nuôi cấy sẵn từ ống thạch nghiêng và cho đến khi đạt tỉ lệ giống theo yêu cầu. Môi trường sau khi chuẩn bị và thanh trùng xong được làm nguội đến nhiệt độ lên men và cấy men giống vào với tỉ lệ 1% để lên men. Thời gian lên men 32÷38h, nhiệt độ lên men 32÷38oC. Trong quá trình lên men phải cung cấp không khí vô trùng liên tục, bổ sung thêm urê để chỉnh pH của môi trường lên men và phải khuấy trộn. Do môi trường lên men tạo nên axit glutamic cùng với thành phần của môi trường có xu hướng làm tăng sức căng bề mặt. Vì vậy, trong quá trình lên men tạo thành nhiều bọt ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nên phải sử dụng chất phá bọt (dầu lạc, dầu đậu tuơng, axit oleic...).

CHƯƠNG 3 LÊN MEN CÁC SẢN PHẨM TỪ SINH KHỐI TẾ BÀO VI

SINH VẬT

1 Lên men sản xuất axit glutamic, lysin, metionin từ vi khuẩn corynebacterium glutamicum:

1.1 Lên men sản xuất axit glutamic:

Quá trình sản xuất axit glutamic bằng phương pháp lên men theo sơ đồ sau:

Nguyên liệu tinh bột

Thủy phânPhối chế dịch lên men Nguyên liệu phụ Men giống Thanh trùng dịch lên men

Trao đổi ion Tách axit glutamic

Hình 16 quy trình lên men sản xuất acid glutamic

1.1.1 Nguyên liệu, phối chế và thủy phân

Có thể sử dụng nguyên liệu là tinh bột (sắn, ngô, gạo ) hoặc rỉ đường Đốivới tinh bột phải được thủy phân bằng axit Để thủy phân có thể phối chế nguyênliệu theo tỉ lệ: tinh bột /nước/HCl 100% = 100/350/0,77 Tiến hành thủy phân ởnhiệt độ 148÷150oC, áp suất = 2,5 kg/cm2, thời gian 30÷34 phút Sau khi thủy phânxong làm nguội dung dịch xuống 60 ÷ 70 oC và tiến hành trung hòa: để trung hòalần 1 người ta dùng Na2CO3 trung hòa đến pH = 4,8 ÷ 5, tốc độ cánh khuấy 65vòng/phút Tiếp theo cho than hoạt tính để tẩy màu sơ bộ rồi lọc tách bã than vàcặn Tiếp tục dùng Na2CO3 trung hòa lần 2 đến pH = 6,7 ÷ 7, tốc độ cánh khuấy 60vòng/phút Dùng Na2CO3 vừa rẻ tiền vừa làm cho dịch đường không có vị đắngnhư NaOH

1.1.2 Chuẩn bị môi trường lên men

Ngoài dịch đường thủy phân, trong môi trường lên men phải bổ sung thêm 1

số chất khác Ví dụ: môi trường lên men sau:

Dịch đường hóa 13%

Cao ngô 0,7%

K2HPO4 0,15%

MgSO4 0,075%

Urê cho ban đầu 2%, bổ sung giữa chừng 1,2% và MnSO4 2%

Trong thực tế sản xuất người ta dùng rỉ đường mía thay cho cao ngô và đâycũng là nguồn cung cấp các loại đường cho vi khuẩn sinh tổng hợp axit glutamic.Sau khi phối chế, môi trường được thanh trùng và làm nguội Yêu cầu dịchđường lên men phải vô trùng tuyệt đối, bảo đảm độ khô 5 ÷ 6 Be

1.1.3 Lên men dịch đường

*Chủng nấm men: người ta có thể sử dụng chủng vi khuẩn sau để lên men

tổng hợp axit glutamic: Corynebacterium glutamicum (ngoài ra có thể sử

dụng Brevibacterium flavum )

Vi khuẩn sử dụng trực tiếp đường và NH3 của môi trường lên men để sinhtổng hợp L-axit glutamic có thể diễn ra theo 2 con đường:

GlucozaHexemonophotphat Axit pyruvicAxit α – xetoglutavicCon đường amin hóa – khử Con đường chuyển amin

L – axit glutamic

Hình 17 Quy trình lên men sản xuất acid glutamic từ dịch đường

Con đường amin hóa-khử:

HOOC-CO-CH2–CH2-COOH + NADPH2 HOOC-CH-CH2–CH2-COOH +

NH2 H2O + NADP

Con đường chuyển amin:

HOOC-CO-CH2-CH2-COOH + R-CH-COOH HOOC-CH-CH2-CH2- COOH NH2 NH2

*Phương trình tổng quát của quá trình lên men:

C6H12O6 + NH3 + 3/2O2 C5H9NO4 + CO2 + 3H2O

* Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

+ Độ pH của môi trường

Các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp L-glutamic đều thích hợp ở môi trườngtrung tính hay kiềm yếu ở pH = 6,7 ÷ 8 Trong quá trình lên men độ pH giảm vì tạo

ra axit glutamic và 1 số axit hữu cơ khác Do đó phải điều chỉnh độ pH thườngxuyên bằng NH4+, Nguồn NH4+ sử dụng phổ biến là: urê, nước NH3, khí NH3,NH4Cl

+ Sự cung cấp O 2

Lên men tổng hợp axit glutamic là quá trình hiếu khí bắt buộc Do đó sự cungcấp oxi trong khi lên men là hết sức quan trọng Nếu thiếu O2 thì sản phẩm chủ

yếu là axit lactic, nếu thừa oxi thì sản phẩm chủ yếu là axit α-xetoglutavicxetoglutavic Oxy

được cung cấp cho dịch lên men bằng cách sục không khí vô trùng kết hợp vớikhuấy trộn liên tục, vận tốc cánh khuấy 150 vòng/phút

+ Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men là 26÷37oC, trong thực tế lênmen giai đoạn đầu ở 30÷32oC và giai đoạn cuối 36÷37oC

+ Chất kích thích sinh trưởng

Quá trình tổng hợp axit glutamic rất cần biotin Biotin không chỉ là chất sinh

trưởng mà còn là chất xác định thành phần và số lượng các sản phẩm lên men

Sinh khối của vi khuẩn tăng tỉ lệ với hàm lượng biotin nhưng với axit glutamic thì

không hoàn toàn như vậy: lượng axit glutamic được tạo thành nhiều nhất khi trong

môi trường hàm lượng biotin thấp hơn nhiều so với lượng biotin cần thiết cho sự phát triển tối đa của sinh khối Biotin không làm thay đổi hoạt lực của các enzim

tổng hợp nên axit glutamic mà ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng tế bào,làm cho axit glutamic từ bên trong tế bào vi sinh vật khuyếch tán ra ngoài môitrường lên men Nồng độ biotin thích hợp nhất cho sinh tổng hợp axit glutamic2÷5g/l.

Nguồn cung cấp biotin là cao ngô, rỉ đường mía Trong quá trình lên men nếu dùng rỉ đường mía làm nguồn cung cấp đường và biotin thì thường xảy ra

hiện tượng thừa biotin sẽ không có lợi, sinh tổng hợp axit glutamic ít, nếu sục khí

kém sẽ tạo ra alanin và axit lactic Vì vậy, người ta phải bổ sung thêm penicilin để

kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường giàu biotin đồng thời tăngtrưởng quá trình tổng hợp axit glutamic

1.1.4.Các phương pháp lên men

Có thể lên men gián đoạn, bán liên tục và liên tục

Ở nước ta các nhà máy sản xuất bột ngọt đều dùng phương pháp gián đoạn.Men giống phải được nuôi cấy sẵn từ ống thạch nghiêng và cho đến khi đạt tỉ

lệ giống theo yêu cầu

Môi trường sau khi chuẩn bị và thanh trùng xong được làm nguội đến nhiệt

độ lên men và cấy men giống vào với tỉ lệ 1% để lên men Thời gian lên men32÷38h, nhiệt độ lên men 32÷38oC Trong quá trình lên men phải cung cấp khôngkhí vô trùng liên tục, bổ sung thêm urê để chỉnh pH của môi trường lên men vàphải khuấy trộn Do môi trường lên men tạo nên axit glutamic cùng với thànhphần của môi trường có xu hướng làm tăng sức căng bề mặt Vì vậy, trong quátrình lên men tạo thành nhiều bọt ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nên phải

sử dụng chất phá bọt (dầu lạc, dầu đậu tuơng, axit oleic ).

Sau khi lên men xong ta chuyển dung dịch sang thiết bị trao đổi ion để táchaxit glutamic

1.1.5 Tách và tinh chế axit glutamic

Người ta sử dụng phương pháp trao đổi ion

Nhựa trao đổi ion (hay còn gọi là rezin) là hợp chất cao phân tử, không tan

trong nước, axit, bazơ và các dung môi hữu cơ Trong phân tử của nó có chứa

nhóm hoạt động hóa học có khả năng phân li thành ion Có 2 loại rezin: rezin trao đổi ion dương (gọi là rezin dương tính) và rezin trao đổi ion âm (rezin âm tính) Bao gồm rezin dương tính mạnh và rezin dương tính yếu, rezin âm tính mạnh và

rezin âm tính yếu Để tách axit glutamic người ta sử dụng rezin dương tính mạnh,chịu được nhiệt độ 100oC, mức độ trao đổi ion: Fe3+ > Ca+3 > Mg2+ > K+ > NH4+ >Axit glutamic> H+

Do vậy, có thể dùng NaOH nhả hấp phụ axit glutamic trên rezin

*Tách axit glutamic bao gồm các công đoạn:

- Phối liệu để dịch trao đổi đảm bảo lượng axit glutamic: 0,45÷0,5kg/m3, pH

≤ 5, nhưng không dưới 3,2 để tránh sự tự kết tinh của axit glutamic do tạo điểmđẳng điện

- Tiến hành trao đổi: dịch lên men đi từ dưới lên trong cột chứa đầy rezin:

1.1.6 Tinh chế axit glutamic

Axit glutamic sau khi tách còn lẫn tạp chất như HCl, chất màu, tạp chất sắt,

Vì vậy, cần phải qua tinh chế Quá trình gồm các khâu sau:

1 Tẩy rửa: Sau khi thu được axit glutamic ngậm HCl, dùng HCl 31% để rửa

nhằm hòa tan hết các axit amin khác ra khỏi axit glutamic ngậm HCl Không nênrửa quá nhiều để đỡ tốn hóa chất

2 Trung hòa: Để tách HCl ra khỏi axit glutamic ngậm HCl, người ta dùng

Na2CO3 hoặc NaOH để trung hòa

3 Khử sắt và canxi: Do trong quá trình sản xuất chúng ta dùng axit mạnh,

nồng độ cao nên sắt từ thiết bị hoà tan vào, canxi trong nước sử dụng để sản xuấtcũng rơi vào sản phẩm Do đó người ta phải khử sắt, canxi bằng hỗn hợp Na2S vàaxit oxalic:

FeCl2 + Na2S FeS + 2 NaCl

C2H2O4 + Ca2+ C2O4Ca + 2H+

FeS và C2O4Ca kết tủa được tách ra khỏi dung dịch bằng lọc hoặc li tâm

4 Tẩy màu: Để bảo đảm tốc độ kết tinh natriglutamat và chất lượng sản phẩm,

trước khi kết tinh cần tẩy màu dung dịch bằng than hoạt tính ở nhiệt độ thích hợp(60oC), sau đó lọc ép tách bã than

1.2 Kỹ thuật sản xuất acid L – Lyzin và methionin

1.2.1 Chủng vi sinh vật

Chủng sản xuất là một thể đột biến cần homoxerin của Corinebacterium

glutamicum (hay còn gọi là Micrococus glutamicus) Dưới điều kiện lên men thích

hợp chủng này có thể sản xuất tới 50 g lyzin/ 1 lít môi trường Nguyên liệu thườngdùng là glucoza hay mật rỉ với nồng độ 150g/lit

1.2.2 Phương trình lên men tổng quát

100C6H12O6 + 219O2 + 86NH3 35C6H14N2O2 + 16C8H13O4 + 262CO2

1.2.3.Cơ chế

GlucozaPyruvatOxalaxetatAspactat(1) β– Aspactyl – photphat

Aspactat – β – SemialdehytLyzin Homoxerin

Treonin methioninIzoleuxin

Hình 18 Sơ đồ cơ chế tổng hợp L – Lyzin của Corinebacterium glutamicum

(1) – enzym Aspactokinaza; (2) – Enzym homoxerindehydrogenaza; (3) –

Enzym dihydropicolinat – syntetaza.

Lyzin là một axit amin thuộc họ aspactat và được tổng hợp qua con đường phân nhánh mà qua đó homoxerin, methionin, treonin, izoleuxin cũng đựoc tạo

thành

Những đường chấm biểu diễn sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng Ở chủng

hoang dại lyzin và treonin cùng gây ra ức chế phối hợp đối với aspactokinaza (1).

Do khuyết homoxerindehydrogenaza (3) mà không có sự tạo thành treonin.

Dihydropicolinat – Syntetaza (2) không mẫn cảm dị lập thể nên sự ức chế bởi sản

phẩm cuối cùng bị triệt tiêu và có sự tổng hợp thừa lyzin (50g/lit).

(3) (2)

1.2.4 Lên men

Nguồn hydrocacbon thích hợp cho tổng hợp lyzin là glucoza, fructoza,

maltoza và saccharoza Các đường lactoza, rafinoza, pentoza các chủng sinh lyzin

không đồng hóa được Cho nên người ta thường sử dụng các loại nguyên liệu như

rỉ đường, dịch thủy phân từ tinh bột (ngô, sắn) để làm môi trường sản xuất lyzin.

Nồng độ đường trong môi trường lên men khoảng 10-12% Trong quá trình

lên men, nhằm để tăng hiệu suất thu hồi lyzin có thê bổ sung thêm đường để nâng cao nồng độ đường lên 25% (nhưng cũng thận trọng vì có khi hiệu suất sinh lyzin

không tăng mà còn ảnh hưởng xấu đến vi sinh vật do làm tăng áp suất thẩm thấucủa môi trường)

Nguồn nitơ dùng là ure, NH3 hoặc các muối amon Tỷ lệ giữa C:N đóng vai

trò quan trọng, nó ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp lyzin Thường bổ sung các

muối amon với hàm lượng 2%

Ngoài ra còn phải bổ sung vào môi trường các chất cung cấp nguồn photphonhư KH2PO4 và K2HPO4 (đảm bảo lượng photpho đạt 0,008 -0,02mg/lít, nếu nông

độ này lên đến 1,6 – 2 mg/lit thì quá trình tổng hợp lyzin bị ngừng) Do đó khôngnên dùng muối amon để làm nguồn cung cấp photpho và nitơ

Phải bổ sung các muối có chứa các nguyên tố Mg, Fe, Cu, Mn (thường bổsung muối MgSO4 – 0,03%, còn Fe, Cu, Mn thì đã có trong cao ngô, và rỉ đường)

Các chất kích thích sinh trưởng: + Biotin: cần khoảng 8-15 mg/lít, nếu quá ít

(1 – 2 mg/lít) thì sản phẩm chủ yếu sẽ là axit glutamic Biotin và B1 có trong cao

ngô, đặc biệt trong rỉ đường mía có nhiều biotin.

+ Thiamin (B1): Nếu không có sẽ tạo thành alanin.

+ Treonin: Không có hoặc ít sẽ kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật nhưng

dư sẽ dẫn tới sự ức chế sản phẩm cuối cùng Hàm lượng thích hợp trong khoảng200-800 mg/lít

+ Methionin: nó có ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.

Hàm lượng thích hợp là 150 – 250 mg/lít

Có thể dùng homoxerin để thay thế cho treonin và methionin.

Bảo đảm môi trường phải có pH = 7 – 7,6 và phải thanh trùng Lượng giốngcho vào để lên men là 5 – 10% Nhiệt độ lên men là 30 – 32oC, cung cấp oxy2-4g/lit.h trong quá trình lên men dùng ure hoặc nước NH3 để điều chỉnh pH.Tổng thời gian lên men 50-72h.

- Bột: Từ dịch cô đặc có thể bổ sung thêm các chất độn (bột xương, cám…)rồi sấy khô và nghiền nhỏ Hoặc dịch cô đặc đem sấy phun để thu chế phẩm dạngbột

- Để thu nhận các tinh thể lyzin thì phải sử dụng nhiều phương pháp và tiếnhành theo nhiều bước

Hỗn hợp lên men Lọc (ly tâm) Sinh khối

Dung dịch

Dùng dung dịch NH4OH 2 -3,5% để nhả hấp phụ Dùng HCl để axit hóa đến

pH = 5 rồi cô đặc đến khi đạt nồng độ 30 -50% sau đó làm lạnh đến 10 – 12oC đểtrợ tinh Để có chế phẩm tinh khiết thì đem chế phẩm kết tinh lần một kết tinh lạinhiều lần (hòa tan trong cồn)

1.3.Kỹ thuật sản xuất acid L – Triptophan

Nhờ vào sự tổng hợp của vi sinh vật, L – triptophan có thể thu nhận bằng hai con đường: chuyển tiền chất của triptophan thành triptophan nhờ sự giúp đỡ của

các hệ enzym vi sinh vật; hoặc thu nhận triptophan nhờ sự đột biến do thiếu tirozin

và fenylalanin của các chủng vi sinh vật.

1.3.1.Phương pháp chuyển tiền chất

1.3.1.1 Tiền chất

Nhờ vi sinh vật có thể thu nhận được triptophan từ các tiền chất khác nhau.

Hiệu suất thu hồi sản phẩm từ các tiền chất khác nhau là không giống nhau Một sốtiền chất hay sử dụng:

Axit antranilic Hiệu suất thu hồi là 98,8%

Để chuyển các tiền chất người ta có thể sử dụng nhiều chủng vi sinh vật khác

nhau Riêng đối với axit antranilic người ta hay dùng nhất là nấm men candica

utilis hoặc hansunella.

1.3.1.3 Cơ chế

Khi sử dụng axit antranilic làm tiền chất thì cơ chế của quá trình như sau:

Hình 19 Cơ chế chuyển tiền chất antranilic thành triptophan

1.3.1.4 Kỹ thuật lên men

Quá trình sản xuất chia làm hai giai đoạn: Thu nhận sinh khối và chuyển hóatiền chất nhờ sự giúp đỡ của sinh khối đã thu được.

Giai đoạn đầu không khác mấy so với quá trinh nuôi cấy các vi sinh vật giốngkhác Tức là quá trình cũng đi từ ống giống gốc, ống nghiệm, bình tamgiác….Lượng sinh khối thu nhận được phụ thuộc vào phương pháp nuôi cấy giống

Họ thấy rằng nếu lượng giống đưa vào lên men càng lờn thì mức độ chuyển hóacủa axit antranilic càng lớn

Nguồn cung cấp cacbon cho giống phát triển là saccharoza hoặc rỉ đường (vớihàm lượng từ 6,3 – 20%), nguồn cung cấp nitơ là ure với lượng 0,5 – 1%, ngoài racòn bổ sung thêm %: K2HPO4 – 0,01; MgSO4 – 0,005; CaCl2 – 0,01 Bảo đảm môitrường có pH = 7,5 – 8,0 và vô trùng Tiền hành nuôi giống ở nhiệt độ 28 – 32oC,thời gian nuôi cấy của mỗi cấp không quá 24h Yêu cầu giống đạt 3-5g sinh khốikhô/1 lít môi trường

Giai đoạn hai được thực hiên trong thiết bị lên men Đầu tiên chuẩn bị môitrường trong thiết bị lên men và chuyển men giống đã nuôi ở giai đoạn một vào.Tiếp tục nuôi giống trong 24h ở nhiệt độ 28 – 30oC và không khí không ít hơn 7gO2/ l.h Nếu trong quá trình nuôi giống có xuất hiện bọt thì phải dùng dầu phá bọt.Sau 24h nuôi giống cho vào thiết bị lên men dung dịch axit antranilic 5%trong rượu và trong amoniac 50% để lên men Lúc này không khí bảo đảm 3-4 gO2/l.h

Sau khi cho dung dịch axit vào được 3 - 4h thì bổ sung thêm dung dịch rỉđường 25% Tiếp theo cứ sau 12h thì bổ sung dung dịch rỉ đường, sau 6h thì bổsung dung dịch amoniac và axit antranilic một lần Tổng thời gian của giai đoạnhai là 120 – 140 giờ Quá trình lên men giai đoạn hai thực hiện trong điều kiện pH

~ 8 và nhiệt độ khoảng 30oC

1.3.1.5 Thu hồi sản phẩm

Dung dịch sau lên men có chứa khoảng 7,8 – 12,5 chất khô, trong đó có 0,3 0,5% triptophan Phần lớn (85% - 88%) triptophan nằm ở pha lỏng Do đó để thunhận chế phẩm tinh khiết thì phải tinh chế dịch lọc còn nêu dùng cho chăn nuôi thì

-sử dụng dạng cô đặc có cả sinh khối nấm men

Để làm thức ăn gia súc thì dịch lên men sau cô đặc còn lại 1/3 thể tích, sau đóđem sấy trong thiết bị sấy phun ( to = 110 – 120oC) để thu nhận bột dùng cho thức

ăn gia súc Trong thành phần của bột này gồm có:

Để thu nhận triptophan tinh khiết thì phải tiến hành các bước sau:

- tách sinh khối bằng li tâm

- Rửa các tinh thể bằng rượu etylic

- Sấy các tinh thể ở nhiệt độ 60oC

Các phế liệu của quá trình tinh chế này có thể dung cho chăn nuôi

1.3.2.Thu nhận từ các chủng đột biến

Sự thu nhận triptophan cũng như tirozin và phenylalanin có thể thực hiện trên

các chủng đột biến của E coli hoặc Basillus Subtilis

Quá trình tổng hợp Triptophan, phenylalanin, tirozin có thể thực hiện qua sơ

đồ sau:

GlucozaAxit forfoenol pyruvic Eritroza – 4 – P

Axit skimic axit antranilicAxit corismic TriptophanAxit prephenic

Axit phenylpyruvic axit hydrophenylpyruvic

Hình 20 Cơ chế tổng hợp triptophan, tirozin và phenylalanin trong tế bào VSV.

2.1 Ưu và nhược điểm của sản xuất protein đơn bào bằng vi sinh vật

+ Nuôi 4 con bò trong vòng 15 – 18 tháng

+ Nuôi 300 m3 vi sinh vật trong vòng 24h

- Không phụ thuộc vào khí hậu

- Thành phần và giá trị dinh dưỡng của sinh khối có thể điều chỉnh được bằngcách thay đổi thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy hoặc tạo giống mới.

- Sử dụng nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền

*Nhược điểm:

- Trong sinh khối của vi sinh vật chứa nhiều axit nucleic (10 -20%) không cólợi cho sức khỏe của con người

- Protein vi sinh vật có hương vị chưa cao

2.2 Các yêu cầu cơ bản của việc sản xuất protein đơn bào

Để đạt được hiệu quả kinh tế cao trong sản xuất sinh khối vi sinh vật cần phảibảo đảm các yêu cầu sau đây:

1 Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền và thu hoạch cao

Để đạt được năng suất cao thì cần chú ý đến hiệu suất chuyển hóa nguyênliệu của vi sinh vật Các dạng nguyên liệu được quan tâm nhiều:

- Cacbuahydro: Vi sinh vật có thể chuyển hóa 100% thành sinh khối.

- Hydrocacbon: (rỉ đường, dịch kiềm sunfit, xelluloza, tinh bột, cặn sữa….).

Vi sinh vật có thể chuyển 50% chất khô này sang sinh khối

2 Tốc độ sinh trưởng cao

Nói chung tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật là rất lớn, thời gian nhân đôingắn:

3 Hàm lượng protein cao

Hàm lượng protein phụ thuộc vào chủng và chịu ảnh hưởng nhiều ở điều kiệnnuôi cấy Nói chung hàm lượng protein ở vi sinh vật đạt 50 – 60%

4 Chất lượng protein cao

Đánh giá chất lượng protein người ta hay quan tâm đến hàm lượng axit aminkhông thay thế Tiêu chuẩn này cũng mang tính chất loài Thành phần axit amincủa protein vi sinh vật giống như trong sữa và thịt Protein trong vi sinh vật giàulyzin nhưng các axit amin chứa lưu huỳnh lại thấp

5 Khả năng tiêu hóa của protein

Khả năng tiêu hóa của protein vi sinh vật bị hạn chế bởi các thành phần nitơ

phi protein ( như axit nucleic, peptit của thành tế bào) Tuy nhiên nếu protein được

tách khỏi tế bào thì vấn đề này không cần phải quan tâm Do đó bản chất thành tếbào là tiêu chuẩn để lựa chọn vi sinh vât trong sản xuất

6 Sự an toàn về độc tố

Các vi sinh vật gây bệnh hoặc chứa các thành phần nghi ngờ thì không được

sử dụng để sản xuất protein đơn bào Yêu cầu hàm lượng axit nucleic phải thấp.Hàm lượng của nó càng cao thì càng làm giảm giá trị của protein Khi tiêu hóa cácaxit nucleic sẽ phân hủy thành các nucleotit, sau đó được phân hủy thành adenin vàguanin và cuối cùng thành axit uric Trong cơ thể người không có enzym urinaza

do đó uric không chuyển hóa tiếp Sự tích tụ axit uric sẽ gây nên bệnh thấp khớp,tạo ra sỏi thân, sỏi bàng quang do độ hòa tan thấp của axit này Lượng axit nucleichấp thụ qua dinh dưỡng không được vượt quá 2g/ngày

Ở động vật vấn đề này không quan trọng vì chúng có khả năng đồng hóa axituric Ta có thể làm giảm lượng axit nucleic bằng các biện pháp sau:

- Giảm mạnh tốc độ sinh trưởng

- Chiết rút ARN bằng NaOH 10% nóng

- Thủy phân ARN bằng kiềm và tách protein hòa tan trong đó bằng kết tủa

- Phân hủy ARN bởi enzym nucleaza đưa vào hoặc của bản thân tế bào Dùng

phương pháp choáng nhiệt theo ba bước: Đầu tiên tế bào được đun nóng đến 68oCtrong 5 giây, sau đó ure ở 52,5 oC trong hai giờ và cuối cùng ở 55 – 56 oC trong 1 h.Việc xử lý này làm biến tính riboxom và hoạt hóa ribonucleaza Các sản phẩmthủy phân được tách ra khỏi tế bào, hàm lượng protein không bị ảnh hưởng, hàmlượng axit nucleic giảm từ 1-2% lượng vật chất khô của tế bào

7 Những vấn đề kỹ thuật

Vi sinh vật phải dễ tách, dễ xử lý Các tế bào lớn được tách ra bằng ly tâm tốthơn tế bào vi khuẩn Chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt sẽ làmgiảm chi phí cho việc làm nguội Tính không mẫn cảm với sự tạp nhiễm là tiền đềcho việc làm nguội sản xuất protein không vô trùng Ngoài ra người ta còn chú ýđến khả năng đồng hóa đồng thời nhiều nguồn cacbon khác nhau

2.3.Vi sinh vật dùng trong sản xuất protein đơn bào

2.3.1 Nấm men

Trong các đối tượng vi sinh vật được sử dụng trong sản xuất protein đơn bàothì nấm men được nghiên cứu và sử dụng sớm nhất và đến nay đã và đang được sửdụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới Nấm men giàu protein, vitamin (nhất làvitamin nhóm B) Hàm lượng protein của nấm men dao động từ 40 – 60% khốilượng chất khô Protein của nấm men gần giống với protein nguồn gốc từ động vật,chứa khoảng 20 loại axit amin, trong đó đầy đủ các loại axit amin không thay thế.Thành phần các aminoaxit của nấm men cân đối hơn lúa mì, kém hơn một chút ít

so với sữa, bột cá, và sản phẩm động vật nói chung

Được sử dụng rộng rãi nhất là Candida, Torulopsis, Saccharomyces vì các

loại này khả năng chuyển hóa các chất cao, đa dạng và quy trình công nghệ đơngiản

2.3.2 Nấm sợi

Khi dùng nguyên liệu là tinh bột và xellulo thì không thể sử dụng nấm men

được vì bản thân nấm men không có chứa amylaza, và celulaza do đó phải dùng

nấm sợi Nấm sợi có nhược điểm là thời gian nhân đôi dài và hàm lượng proteinthấp (30%) Nhưng nấm sợi lại có ưu điểm là rất dễ tách sinh khối và tạo hương vịđặc biệt

Để dùng trong thực phẩm người ta sử dụng các loại Morchella Loài này có vịngon, phù hợp cho chế biến thực phẩm Tuy nhiên khó khăn nhất là nuôi cấyMorchella rất tốn kém và dễ bị nhiễm

Hiện nay nhiều nơi sử dụng hỗn hợp giống Trichoderma virid và nấm men

Saccharomyces serevisiae để sản xuất protein Ngoài ra người ta còn sử dụng hỗn

hợp Trichoderma virid với Candida utilis hoặc Endomycopsis fibiniger với

Candida utilis.

3.2.3 3 Vi khuẩn

Vi khuẩn dùng để sản xuất protein đơn bào thường được nuôi cấy trên

cacbuahydro Người ta thường sử dụng các giống Pseudomonas, Flavobacterium,

Mycobacteriuum, Nocardia Các giống vi khuẩn này có khả năng đồng hóa các

ankal, cacbuahydro béo và thơm

Đối với nguyên liệu là metan người ta thường sử dụng Methylomonas

methania, Methylococens capsulatus

2.3.4 Vi khuẩn lam và vi tảo

Tất cả mọi loại tảo có kích thước nhỏ bé và có thể thích hợp với việc sử dụngcác phương pháp nuôi cấy đối với vi sinh vật đều gọi là vi tảo Còn vi khuẩn lamtrước đây thì được gọi là tảo lam Vể quy trình công nghệ sản xuất tạo sinh khốicủa hai loại này về cơ bản là giống nhau

Hàm lượng protein chiếm khoảng 40 - 60% lượng chất khô, thậm chí đối với

Spirulina còn lên đến 60 – 70% Hàm lượng amino axit của hai loại này khá cân

đối, gần với protein tiêu chuẩn

Ngoài ra trong sinh khối của hai loại tảo này còn chứa nhiều vitamin: A, B, K,

pantothenic và dạng tươi còn có chứa vitamin C Ở Spirulina có chứa nhiều

vitamin B12 nên được sử dụng để sản xuất thực phẩm và mỹ phẩm, TAGS (gà chotrứng đỏ, da vàng) Trong sinh khối của vi khuẩn lam còn có chứa kháng sinh nênbảo quản tốt

2.4.Quy trình sản xuất protein đơn bào từ vi sinh vật

2.4.1.Quy trình công nghệ

Nguyên liệu xử lý chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

Sản phẩm Hoàn thiện xử lý tách sinh khối Lên men

Hình 21 quy trình sản xuất protein đơn bào

2.4.2 Nguyên liệu

Thường sử dụng các loại nguyên liêu như: rỉ đường, nước thải của các nhà

máy sữa, dịch kiềm sunfit, dịch thủy phân gỗ, tinh bột, dextrin, cacbuahydro….

- Thủy phân nguyên liệu (tinh bột, cellulose,….)

2.4.4 Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

Ngoài cơ chất chình là cacbon thì trong môi trường cần bổ sung thêm các chấtdinh dưỡng nguồn nitơ, photpho, kali, magie, các nguyên tố vi lượng và các chấtsinh trưởng như cao ngô, cao nấm men… sử dụng các hóa chất để điều chỉnh pHđến giá trị thích hợp

2.4.5 Chuẩn bị giống

Nuôi cấy nhân giống đầu tiên được thực hiện trong phòng thí nghiêm, sau đóđược nuôi cấy tiếp ở phân xưởng sản xuất Tỷ lệ tiếp giống chuyển tiếp là 1:10.Thời gian nuôi cấy mỗi cấp khoảng 18 giờ Trong quá trình nuôi cấy dùng nướcamoniac để điều chỉnh pH và phải sục khí liên tục Trong giai đoạn này cần chú ýđến khử trung môi trường nuôi cấy

2.4.6 Lên men

Thường sử dụng phương pháp lên men chìm và có thể lên men gián đoạn, bánliên tục hoặc liên tục Khi lên men chú ý điều khiển các yếu tố: nhiệt độ, độ pH,môi trường dinh dưỡng, oxy, phá bọt…

- Rửa

- Triết rút protein (loại bớt ARN bằng các phương pháp khác nhau)

- Sấy (tốt nhất là dùng phương pháp sấy phun)

3 Sản xuất vitamin bằng phương pháp lên men vi sinh vật

3.1 Lên men sản xuất vitamin B12

Vitamin B12 là một vitamin nhóm B mà cơ thể cần với một khối lượng cực kỳ

ít, khoảng một vài microgam (1 microgam bằng 1 phần nghìn gam), tuy nhiên vai

trò của một lượng cực kỳ ít ấy lại là cực kỳ nhiều

Vitamin B12 được biết đến như là chất tham gia vào việc tạo hồng cầu, tứctạo máu Ngày nay người ta còn thấy vai trò của vitamin B12 đối với các bệnh lýthần kinh Nhóm người có nồng độ vitamin B12 trong máu thấp sẽ có nguy cơ caomắc một số bệnh như bệnh suy giảm trí nhớ ở người già Vitamin B12 còn tham

gia chuyển hoá để loại bỏ một amino acid có tên là homocystein – đây là chất gây bệnh tim mạch cũng như bệnh não suy ở người cao tuổi (bệnh Alzheimer) Người

cao tuổi là đối tượng có nguy cơ cao thiếu vitamin B12 do khả năng hấp thụ củaruột ở người già đối với vitamin này giảm rõ rệt, do đó cần tăng cường cung cấpthêm vitamin B12 cho đối tượng nguy cơ này.

Do vai trò quan trọng của vitamin B12 nên người ta đang có xu hướng đánhgiá lại chính xác hơn về nhu cầu hàng ngày của loại vitamin này Hiện tại nhu cầukhuyến nghị hàng ngày của vitamin B12 là 1 microgam đối với hệ thống châu Âu

và 2,4 microgam đối với Mỹ và mức này đang bị coi là thấp hơn so với nhu cầuthực sự của người lớn bình thường trong cộng đồng

Khi xác định nhu cầu khuyến nghị hàng ngày cho một vitamin, người ta quantâm đến một mức độ tối thiểu của vitamin đó để tránh bị chứng thiếu vitamin Mộtnghiên cứu gần đây của các nhà nghiên cứu Đan Mạch được đăng trên tạp chí Dinh

dưỡng Lâm sàng của Mỹ (American Journal of Clinical Nutrition, Jan 2006,

vol.83, pp.52-xetoglutavic58) cho thấy nhu cầu hàng ngày của vitamin B12 tối thiểu phải là 6 microgam để có thể làm bình thường hoá tất cả các thay đổi về sức khoẻ có liên

quan đến vitamin B12 Và mức này cho là thích hợp đối với cộng đồng người lớn

nói chung hơn là mức nhu cầu vitamin B12 hiện hành (chỉ có 1 microgam/ ngày).

Vitamin B12 có nhiều trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt trứngsữa và hầu như không hiện diện trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật Do đóngười ăn chay thường có nguy cơ thiếu vitamin B12 Một chế độ ăn bình thường

cân đối sẽ giúp cung cấp đầy đủ 6 microgam vitamin B12 cho cơ thể hàng ngày.

Việc đề nghị tăng nhu cầu khuyến nghị hàng ngày của vitamin B12 sẽ làm thay đổicông thức của các viên bổ sung vitamin và khoáng chất có chứa vitamin B12 cũngnhư các thực phẩm được sản xuất có tăng cường vitamin B12

Để đảm bảo cung cấp đủ 6 microgam vitamin B12 hàng ngày thì 1 viên bổ

sung vitamin cũng như 1 phần ăn của thực phẩm tăng cường B12 cần có ít nhất là

6 microgam vitamin B12 thay vì chỉ có 1 – 3 microgam như trước đây.Cũng liên quan đến việc điều trị chứng thiếu hụt vitamin B12, gần đây các nhànghiên cứu thấy rằng việc dùng vitamin B12 liều cao bằng đường uống cũng hiệu

quả như dùng vitamin B12 bằng đưỡng chích như trước đây Tuy nhiên liềuvitamin B12 dùng để uống có hiệu quả lại rất cao, 600microgam, tức gấp 200 lầnnhu cầu khuyến nghị hàng ngày Các nhà chức trách châu Âu và Mỹ chưa có đượcmức an toàn mới của vitamin B12, tuy nhiên các nhà nghiên cứu ở Anh Quốc chorằng mức này có thể cao đến 2000 microgam/ngày.

- Nhiệm vụ của Vitamin B12

Vitamin B12 hoạt động phối hợp với folic acid trong những phản ứnh sinh hóa

tối quan trọng diễn ra trong cơ thể liên hệ đến tiến trình phân cắt tế bào, và B12 rấtcần thiết cho sự tổng hợp DNA và RNA Các mô trong cơ thể không thể phân cắt

và tăng trưởng bình thường nếu không có B12 Vai trò của B12 còn quan trọnghơn nữa với tủy xương là nơi chế tạo tế bào máu

Một dạng coenzym của B12, gọi là Methylcobalamin, với sự trợ giúp của folic acid, có thể chuyển nhóm methyl để biến đổi homocystein (nồng độ cao của chất này là một yếu tố nguy hại về bệnh tim mạch) thành methionine Dạng coenzym thứ nhì, Adenosylcobalamin, (có khi gọi là Coenzym B12, Cobamamide,

Dibencozide.) liên hệ đến sự chuyển biến vài acid béo có số carbon lẻ trong chuỗi Carbon, cholesterol và đến sự tổng hợp leucin, một acid amin quan trọng trong cơ

thể

B12 cũng tham dự vào sự tái tạo folic acid trong cơ thể: Nếu không có B12 cơ thể không thể sử dụng thích đáng folic acid và sẽ phải cần đến một số lượng rất cao

vượt khỏi khả năng cung cấp của thực phẩm Các phản ứng tái tạo này liên hệ đến

sự biến dưỡng homocystein.

Một nhiệm vụ quan trọng khác của B12 là đóng vai trò chính yếu trong sựbiến dưỡng các chất béo của cơ thể: Các chất béo với chuỗi Carbon chẵn (như 16,

18 C.) sẽ được phân cắt thành từng khúc nhỏ, mỗi khúc có 2 carbon để sau đó đượcđưa vào các phản ứng tạo năng lượng Các chất béo có chuổi Carbon lẻ (như 15, 17

C.) cũng được phân cắt tương tự và B12 sẽ giúp phân cắt khúc có chứa 3 carbonsau cùng.

Vitamin B12, qua vai trò biến dưỡng methionine và homocystein, tham dựvào sự chế tạo myelin, chất bao bọc và bảo vệ sợi thần kinh Những nguời thiếuB12, sẽ bị hư hại myelin, từ đó hư hại thần kinh ngoại vi và thần kinh tủy sống

đây là sự kiện xẩy ra cho những bệnh nhân pernicious anemia.

- Nhu cầu và nguồn cung cấp:

Nhu cầu B12 hàng ngày cho người trường thành theo FAO/WHO là 2

microgram, (Handbook on Human Nutritional Requirements-xetoglutavicWHO Geneva 1974).

Theo Food and Nutrition Board USA, nhu cầu này là 3 microgram (dựa vào giả

thiết cho rằng khi ăn một chế độ có 3 microgram B12, ít nhất 50% lượng này sẽ

được cơ thể sử dụng) Nhu cầu trung bình theo USRDA lại là 6 microgram và với phụ nữ có thai và cho con bú là 8 microgram.(RDA= Recommended Dietary

Allowances là lượng trung bình cần thiết nên đưa vào cơ thể hàng ngày do National Research Council xác định để một người Mỹ mạnh khỏe không bị các

triệu chứng gây ra do ở suy thiếu chất này ; con số của USRDA dựa theo RDA vàdùng cho việc ghi trên nhãn thực phẩm, số lượng thường cao hơn RDA Từ 1993

RDAs được đổi thành RDIs= Reference Daily Intakes và tử 1997 danh từ chính

thức được dùng tại Hoa Kỳ là RDIs)

Một đặc điểm khác của Vitamin B12 là tùy thuộc nhóm Vitamin tan trongnước (nhóm này thường không được tồn trữ trong cơ thể) nhưng gan có một hệthống rất hữu hiệu để trữ B12 thường với số lượng đủ dùng được đến 1000 ngày!

Do đó cho dù chúng ta ngưng hoàn toàn ăn uống những thực phẩm có chứa B12,các triệu chứng thiếu B12 chỉ bắt đầu xuất hiện ít nhất là sau đó 3 năm Ngoài racòn có một hệ thống tái hấp thu nơi ruột khiến B12, đã sử dụng, sau khi từ mật quađường tiêu hóa, lại được hấp thu trở lại để dùng lại

- Nguồn cung cấp B12:

Đa số các sách vở dinh dưỡng đều cho rằng B12 chỉ có trong động vật và

những sản phẩm từ động vật Cobalamin thường có trong cá và sinh vật biển như

sò, ngao, thịt bò, sữa, gan, sò clam, cá Sardine là những nguồn chứa B12 cao nhất; phó mát, các loại chứa nhiều vi sinh vật như Camembert, Gorgonzola cũng chứa

B12 khá nhiều

3.2 Sản xuất vitamin C ( acid L-ascocbic )

Đa số động vật tổng hợp được toàn bộ lượng vitamin C cần thiết cho nhu cầucủa mình và do vậy vitamin này được tìm thấy trong các mô của chúng (chủ yếutrong gan và thận với nồng độ 10-40 mg/100g) Tuy nhiên, người và một số độngvật có xương sống cũng như côn trùng lại phụ thuộc hoàn toàn vàọ nguồn vitamin

C từ bên ngoài, chủ yếu là rau (bắp cải, bina, cà chua, 30-150 mg/100g) và quả(cam, chanh, 40-50mg/100g), đã cung cấp cho con người lượng vitamin C cần thiết(45-70 mg/ngày)

Một số vi sinh vật (nấm, nấm men, tảo) sản sinh một lượng rất nhỏ acid ascocbic cần cho các quá trình trao đổi chất của chúng Cho đến nay chưa tìm thấyacid ascorbic ở vi khuẩn, hình như chúng không cần acid này

L-Ở động vật có vú (trừ nhóm linh trưởng và một số khác) acid L-xetoglutavic ascorbic được tổng hợp từ D-xetoglutavicglucose trong đó C1 của glucose trở thành C6 của acid

ascorbic và ngược lại Sự tổng hợp diễn ra từ D-xetoglutavicglucose tới acid D-xetoglutavicglucuronic và

sau đó thành lacton của acid L-xetoglutavicgulonic.

Sự oxy hoá sau đó của gulonolacton ở vị trí C2, được xúc tác bằng L-xetoglutavic

gulonolacton dehydrogenase, một enzyme không tìm thấy ở người, theo sau là sự

enol hóa sẽ cho acid L-xetoglutavicascorbic Ở thực vật, acid L-xetoglutavic ascorbic được tạo thành từ

D-glucose hay D-xetoglutavicgalactose qua một số con đường chuyển hóa.

Một trong những con đường này giữ không làm cho trật tự của chuỗi cacbon bịthay đổi, song các sản phẩm trung gian của con đường sinh tổng hợp thì còn chưabiết rõ Có thể con đường này cũng giống con đường tổng hợp ở động vật

Hình 23.Con đường sinh tổng hợp acid L-xetoglutavicascocbic

Từ trên 50 năm nay, công nghiệp đã có thể đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng vềvitamin C của con người nhờ phương pháp bán tổng hợp từ glucose Nhiều quá trìnhhoá học và sinh hóa kế tiếp nhau tham gia vào quá trình này và tất cả đều qua mộtsản phẩm trung gian là acid 2-keto-L-gulonic, từ đó sẽ thu được acid L-ascorbic nhờcon đtrờng hoá học bằng cách lacton hoá và đồng phân hoá (hình 3.9.)

Acid-keto-Lgulonic Methyl-2keto-Lgulonate Acid L-ascobic

Hình 24 Các quy trình bắt dầu bằng sự khử D-xetoglutavicglucose

Quy trình công nghiệp này được Reinstein và Gruessner đề ra từ năm 1934 và

đến nay vẫn còn sử dụng Nó bao gồm 5 bước phản ứng kế tiếp nhau, tất cả đều đạtsản lượng tới 90-95% (hình)

Hình 25: Sự tổng hợp acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavicLgulonic từ D-xetoglutavicglucose qua D-xetoglutavic socbitol và L-xetoglutavic socboza.

1 Khử D-xetoglutavicglucose thành D-xetoglutavicsorbitol với sự có mặt của Niken Raney, sau đó loại tới mức tối đa Niken hòa tan bằng cách xử lý dung dịch sorbitol với nhựa

cation.

2 Oxy hóa D-xetoglutavicsorbitol thành L-xetoglutavicsorbose nhờ vi sinh vật : có nhiều chủng

Acetobacter chịu được nồng độ niken tới 10-20 mg/l, thực hiện nhanh chóng phản

ứng này trong các môi trường chứa nồng độ sorbitol cao Quá trình lên men diễn ra

ở 30oC trong một môi trường chứa 200 g/l sorbitol, 10 g/l cao ngô, và 0,5 g/lCaCO3 với một chủng Acetobacter suboxygendans đã hoàn tất trong 24 giờ và cho

khoảng 180g sorbose trong một lit Sau khi lọc, loại ion và cô đặc dịch nuôi,

sorbose được kết tinh (tới độ tinh khiết 99%)

3 Tạo thành diacetone-xetoglutavicsorbose để bảo vệ các nhóm không tham gia vào giai

đoạn sau

4 Oxy hóa hóa học diacetone-xetoglutavicsorbose thành acid diacetone-xetoglutavic2-xetoglutavic keto-xetoglutavicL-xetoglutavicgulonic.

5 Giải phóng acid diacetone-xetoglutavic2-xetoglutavicketo-xetoglutavicL-xetoglutavicgulonic nhờ thuỷ phân.

Giữa những năm 1960 và 1975 nhiều cơ sở nghiên cứu của Mỹ và Nhật đã tìm

cách giảm số bước trong quy trình Reinstein bằng cách oxy hóa trực tiếp D-xetoglutavic

sorbitol hay L-xetoglutavicsorbose nhờ một kỹ thuật vi sinh vật thành acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavicL-xetoglutavicgulonic khi

sử dụng các chủng Acetobacter và Pseudomonas Tất cả những nghiên cứu này đều

không cho kết quả khả quan, năng suất ít khi vượt quá 5 g/l trong các điều kiện tốtnhất với một sản lượng vào khọảng 10% so với sản phẩm ban đầu Vào năm 1981,

các nhà nghiên cứu Trung Quốc cho biết đã sản xuất được 37 g/l acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavic L-xetoglutavic

gulonic từ 100 g sorbose khi sử dụng một chủng Gluconobacter oxygendans.

Đây là một sự cải thiện đáng kể so với các kết quả trước đó

Các quy trình bắt đầu bằng sự oxy hóa D-glucose

Hai con đường đã được nghiên cứu: (1) cái gọi là con đường acid L-xetoglutavic idonic bắt đầu bằng sự oxy hóa glucose ở vị trí cacbon số 5; (2) con đường acid 2,5-xetoglutavicdiketo-xetoglutavicD-xetoglutavic

gluconic.

a) Con đường acid L-xetoglutavicidonic

Con đường này gồm ba bước kế tiếp nhau: (1) oxy hoá sinh hóa học D-xetoglutavic

glucose thành acid 5-xetoglutavicketo-xetoglutavicD-xetoglutavicgluconic qua acid D-xetoglutavicgluconic; (2) khử hóa học (hoặc

sinh hóa học) acid 5-xetoglutavicketo-xetoglutavicD-xetoglutavicgluconic thành acid L-xetoglutavic idonic; (3) oxy hóa sinh hóa học

acid L-xetoglutaviciđonic thành acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavicL-xetoglutavic gulonic

Phản ứng đầu tiên dễ dàng được thực hiện bởi Acetobacter

suboxygendans Chủng ATCC 621 đã chuyển hóa 100 g/l glucose trong 33 giờ với

một sản lượng là 90% Một số phương pháp đã được đề ra nhằm khử acid 5-xetoglutavicketo-xetoglutavic

D-xetoglutavicgluconic Trong thực tế, chỉ có phương pháp hoá học do Grey đề xuất (1947) là

có giá tri Trong phương pháp này, sự khử đạt được nhờ sự hydro hoá có xúc tác

dưới áp lực và không may là dẫn đến việc tạo thành hai đồng phân, acid L-xetoglutavicidonic và

acid D-xetoglutavicgluconic theo những tỷ lệ tương đối mà trong các điều kiện tốt nhất thì là 70

và 30% Hai phương pháp loại acid D-xetoglutavicgluconic vừa tạo thành đã được chú ý: (1) nhờ lên men với Acetobacter uboxygendans, nó có thể bị oxy hóa trở lại thành acid

5- keto-o-gluconic, chất này sau đó sẽ được quay vòng, hay (2) hỗn hợp có thể được

lên men với một vi sinh vật (Pseudomonas fluorescens, P aeruginosa,

Acetobacter melanogenus), bọn này sử dụng acid D-gluconic để sinh trưởng và phân

giải nó hoàn toàn cùng một lúc với việc chuyển hoá acid L-idonic thành acid L-gulonic Bằng phương này người ta đã thu được những kết quả tốt: 67 g/l acid 2-keto-L-gulonic đã được tạo ra từ 100 g/l hỗn hợp chứa 70% acid L-idonic, song còn

2-keto-có những vấn đề kỹ thuật chưa được chấp nhận trên quy mô công nghiệp

Hình 26 : Sự chuyển hoá D-xetoglutavicglucose thành acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavicL-xetoglutavicgulonic qua acid L-xetoglutavicinonic

b) Con đường acid 2,5-diketo-D-gluconic

Con đường này, chủ yếu được nghiên cứu từ năm 1970, gồm hai bước sinh hoá

học: (1) oxy hóa D-xetoglutavicglucose thành acid 2,5-diketo-D-gluconic qua acid D-xetoglutavicgluconic

và acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavicD-xetoglutavicgluconic ; (2) khử acid 2,5-xetoglutavicdiketo-xetoglutavicD-xetoglutavicgluconic thành acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavicL-xetoglutavic gulonic.

(1) (2) (3) (4) (5)

Hình 27 Sự chuyển hoá D-xetoglutavicglucose thành acid 2keto-xetoglutavicD-xetoglutavicgulonic

(1)-xetoglutavic D-xetoglutavicGlucose ; (2)-xetoglutavic Acid D-xetoglutavicgluconic ; (3)-xetoglutavic Acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavic gluconic

(4)-xetoglutavic Acid 2,5-xetoglutavicdiketo-xetoglutavicD-xetoglutavicL-xetoglutavicgluconic

(5)-xetoglutavic Acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavic D-xetoglutavicgluconic

Bước một không gặp trở ngại gì nghiêm trọng Ngay từ năm 1974 các nhà

nghiên cứu Nhật Bản đã cho biết về một năng suất 220 g/l 2,5-xetoglutavic diketo-xetoglutavicD-xetoglutavicgluconat

canxi đạt được từ 200 g/l glucose sau 3 ngày lên men nhờ Acetobacter fragi Vào

năm 1982 các nhà nghiên cứụ ở Shionogi đã sử dụng: (1) cho bước một, một thể

đột biến của Erwinia có khả năng sản xuất 328 g/l 2,5-xetoglutavicdiketo-xetoglutavicD-xetoglutavicgluconat canxi

trong 26 giờ; (2) trong bước hai, họ đã sử dụng một chủng đột biến của

Corynebacterium tạo ra 106 g/l 2-xetoglutavic keto-xetoglutavicL-xetoglutavicgluconat canxi trong 66 giờ.

Sau bước lên men đầu tiên, môi trường nuôi Erwinia được khử trùng bằng cách xử lý với 0,25 g/l dodecylsulfate natri ở 28oC trong 6 giờ Sau khi làm lạnh,

người ta bổ sung glucose (0,2 kg/kg acid 2,5-xetoglutavicdiketo-xetoglutavicD-xetoglutavic gluconic) dùng làm chất cho hiđro trong phản ứng khử, từ đó sinh ra acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavicL-xetoglutavicgulonic Chất này được đưa vào môi trường nuôi Corynebacterium vào cuối pha sinh trưởng Sản lượng chuyển hóa tính theo phân tử gam sẽ là 94% và ở bước hai là 92% so với 2,5-xetoglutavic

diketo-xetoglutavicD-xetoglutavic gluconat canxi sử dụng Xét toàn bộ, sản lượng phân tử gam của acid 2-xetoglutavic keto-xetoglutavicL-xetoglutavicgulonic thu được vào cuối bước lên men thứ hai so với lượng glucose sử

dụng trong bước lên men thứ nhất là 86%

Đây là quy trình hiệu quả nhất đối với sự sản xuất acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavicL-xetoglutavicgulonic kể từ khi quy trình Reinstein ra đời vào năm 1934 và nó loại bỏ tất cả các bước hóa học.

Số lượng các bước đã được giảm từ năm xuống chỉ còn hai Việc tách acid 2-xetoglutavicketo-xetoglutavic

L-xetoglutavicgulonic vào cuối bước lên men thứ hai đã đạt được với một sản lượng là 90%

bằng cách xử lý dịch nuôi với carbonate natri và bằng cách cô đặc tới lúc 2-xetoglutavicketo-xetoglutavic

L-xetoglutavicgluconat natri kết tinh.

Đã có những công bố về kết qnả nghiên cứu nhằm thu nhận acid 2-xetoglutavic keto-xetoglutavicL-xetoglutavic

gulonic từ glucose chỉ bằng một lần lên men Các chuyên gia của hãng Genetech

vào năm 1985 đã đạt được điều này nhờ việc nhân lên ở chủng Erwinia herbicolaATCC 2 1988, chủng này thực hiện tốt bước một trong quy trình Shionogi, gen mã

hóa cho việc tổng hợp acid 2,5 diketogluconic reductase tách ra từ

Corynebacterium sp ATCC 31090 Gen này đã biểu hiện tốt trong tế bào chủ song

quy trình còn lâu mới có thể sử dụng cho sản xuất công nghiệp

Nồng độ glucose cực đại được thể tái tổ hợp này chấp nhận còn ở mức tươngđối thấp và năng suất còn rất nghèo nàn (0,6 g/l acid 2-keto-L-gluconic được tạo rasau 57 giờ trong một môi trường chứa 20 g/l glucose) Vì rằng sự sinh tổnghợp acid L-ascorbic ở động vật đã được biết rõ, người ta hy vọng một ngày nào đó

sẽ có thể đưa các gen mã cho các enzyme có liên quan vào một vi sinh vật thích hợp

để cuối cùng có thể thu nhận vitamin C trực tiếp từ glucose

4 Sản xuất một số kháng sinh từ vi nấm và xạ khuẩn

4.1.Lên men sản xuất penicillin

4.1.1.Đặc điểm chung

Penicillin được xem là loại kháng sinh phổ rộng, được ứng dụng rộng dãitrong điều trị và được sản xuất ra với lượng lớn nhất trong số các chất kháng sinh

đã biết hiện nay

Chất kháng sinh penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928 Trong khi

làm vệ sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp

petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillillm notatum có xuất hiện

hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm Khi ống cấy nấm mốctrên thử nghiệm lại trên một số loài vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiệntượng tương tự xảy ra Từ đó ông kết luận là nấm mốc đã tiết ra môi trường một

chất nhất định làm tan vi khuẩn và ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin

để đặt tên cho chất kháng sinh này (1929)

Penicillin tác dụng lên hầu hết các vi khuẩn Gram dương và thường được chỉ

định điều trị trong các trường hợp viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí

dụ như viêm màng não, viêm tai-mũi-họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu,

nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin được ứng dụng điều trị rất hiệu quả.

Tuy nhiên, chỉ vài năm sau đã xuất hiện các trường hợp kháng thuốc và hiện tượngnày ngày càng phổ biến hơn Trên con đường nhằm vô hiệu hóa khả năng kháng

thuốc của vi khuẩn và mở rộng thêm tính năng ứng dụng điều trị của penicillin, năm 1959 Batcherlor và đồng nghiệp đã tách ra được axit 6-xetoglutavicaminopenicillanic Về

sau, axit này được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất ra hàng loạt chế phẩm

penicillin bán tổng hợp khác nhau.

Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở

sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai, ngay mỗi bằng sángchế cũng chỉ giới hạn ở những công đoạn nhất định Vì vậy rất khó đưa ra đượccông nghệ sản xuất chung Theo công nghệ lên men của hãng Gist – Brocades (Hà

Lan), toàn bộ dây chuyền sản xuất chất kháng sinh penicillin có thể phân chia làm

bốn công đoạn chính sau đây:

Nhân giống nhỏ Chuẩn bị môi trường lên men

Lọc tách sinh khốiTrích ly bằng dung môiHấp phụ bằng than hoạt tínhNhả và lọc lại than

Kết tinh penicillinLọc tách tinh thểRửa tinh thể

Sấy khôPenicillin bán tổng hợpPenicillin thương mại

Bảo quản

Hình 28 sơ đồ sản xuất penicillin (theo Gist-xetoglutavicBrocades Copr)

4.1.2 Tuyển chọn chủng công nghiêp P chrysogenum

Vào những năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng các chủng có hoạt lực cao thuộc loài P notatum và P baculatum Nhưng từ khi trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập được chủng P chrysogenum có hoạt tính cao hơn

thì chủng này dần dần đã thay thế và từ khoảng sau những năm 50 của thế kỷ XX

đến nay tất cả các công ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử dụng các biến chủng P chrysogenum công nghiệp này.

4.1.3 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P chrysogenum

Theo quan điểm phổ biến hiện nay, quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P chrysogenum có thể tóm tắt như sau: từ ba tiền chất ban đầu là α- aminoadipic, cystein và valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit δ-xetoglutavic (α -xetoglutavic aminoadipyl)-xetoglutavic

cysteinyl-xetoglutavicvalin; tiếp theo là quá trình khép mạch tạo vòng β -xetoglutavic lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-xetoglutavicn; rồi trao đổi nhóm α -xetoglutavic aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo ra sản phẩm penicillin G (hay penicillin V)

4.1.4 Thành phần môi trường lên men

Trong sản xuất penicillin V và penicillin G nói riêng, hay trong công nghệ lên

men sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học giá trị kinh tế cao nói chung, đểduy trì ưu thế cạnh tranh, các hãng sản xuất thường bảo mật chặt chẽ thành phần