CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chương 2 KỸ THUẬT DI TRUYỀN

NỘI DUNG Mở đầu Khái niệm về ADN tái tổ hợp Các enzym chính sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp Các vector sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp Các hệ thống tế bào chủ Nhân dòng gen Kỹ thuật PCR Xác định trình tự gen CNSH hiện đại khác với CNSH truyền thống ở chỗ lấy kỹ thuật di truyền (genetic engineering) làm trung tâm Kỹ thuật di truyền hay công nghệ gen (gene technology) bao gồm các kỹ thuật thực hiện trên axit nucleic, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen, hoặc tạo ra gen mới, từ đó tạo ra sản phẩm mới hoặc các cơ thể mới Để có thể tiến hành được kỹ thuật di truyền hay các thao tác gen, mọi thực nghiệm đều phải sử dụng ADN tái tổ hợp. Do đó, công nghệ ADN tái tổ hợp (recombinant DNA technology) là chìa khóa của kỹ thuật di truyền

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHOA NÔNG HỌC

Bộ môn Công nghệ Sinh học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHOA NÔNG HỌC

Bộ môn Công nghệ Sinh học

Bài giảng Nhập mônCÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chương 2

KỸ THUẬT DI TRUYỀN

NỘI DUNG

- Mở đầu

- Khái niệm về ADN tái tổ hợp

- Các enzym chính sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp

- Các vector sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp

- Các hệ thống tế bào chủ

- Nhân dòng gen

1 MỞ ĐẦU

CNSH hiện đại khác với CNSH truyền thống ở chỗ lấy kỹ thuật di truyền (genetic engineering) làm trung tâm

Kỹ thuật di truyền hay công nghệ gen (gene

nucleic, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen, hoặc tạo ra gen mới, từ đó tạo ra sản phẩm mới hoặc các cơ thể mới

Để có thể tiến hành được kỹ thuật di truyền hay các thao tác gen, mọi thực nghiệm đều phải sử dụng ADN tái

tổ hợp Do đó, công nghệ ADN tái tổ hợp (recombinant

Năm 1972: CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP ra

đời Nhà sinh hóa tại Stanford, Paul Berg, đã nối hai đoạn DNA đầu bằng cắt từ virus SV 40 và

vi khuẩn E coli lại với nhau, tạo

ra phân tử DNA tái tổ hợp Berg

đã được nhận giải Nobel Hóa học vào năm 1980 cùng với

Walter Gilbert và Fred Sanger

Năm 1972, tại một hội nghị khoa học ở Hawaii, Cohen nghe Boyer trình

bày thí nghiệm với EcoE1 của ông và

kết luận của Boyer rằng các đầu dính của DNA có thể được nối lại với nhau hoặc có thể “bị cắt” bằng DNA ligase Sau đó, hai ông đã gặp nhau và thảo luận về phương pháp kết hợp phân lập plasmid với cắt nối DNA Họ đã đưa ra

ý tưởng về việc chèn đoạn DNA mong muốn vào các plasmid của vi khuẩn để sau đó có thể sản xuất lượng lớn các protein đặc biệt – chất cơ bản của công nghiệp công nghệ sinh học

Năm 1976, NHỮNG BƯỚC ĐỘT PHÁ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử, các tế bào được sử dụng như các nhà máy nhằm sản xuất các hormone và protein với quy mô công nghiệp Các sản phẩm này chính là các “dược phẩm sinh học” có tiềm năng thương mại rất lớn Robert Swanson – một nhà đầu tư táo bạo ở thung lũng Silicon, và Herb Boyer đã cùng nhau thành lập hãng Genetech, Inc với mục tiêu tách dòng insulin của người

Genetech được đưa lên sàn giao dịch vào ngày 14/10/1980, bán ra tới 1 triệu cổ phiếu với mệnh giá 35 $/cổ phiếu- và thu tới 35 triệu $ chỉ trong một buổi chiều Tới cuối phiên giao dịch, cổ

phiếu của Genetech đã lập kỷ lục khi lên giá tới

1978 Insulin của người được các nhà khoa học của Genetech

nhân tách dòng vào E coli

Genetech sau đó đã chuyển giao công nghệ sản xuất insulin cho Eli Lilly Năm 1982, insulin người, hay Humulin, trở thành loại thuốc DNA tái tổ hợp đầu tiên được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Hoa Kỳ (FDA) cấp phép

2 Khái niệm về ADN tái tổ hợp

ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) là phân tử ADN được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau Phân tử ADN tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn ADN của các cá thể khác nhau trong cùng một loài hoặc khác loài

Kỹ thuật ADN tái tổ hợp gồm các bước sau

- Nuôi tế bào chủ để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho để cung cấp ADN

- Phân lập gen: Tách chiết ADN plasmid và ADN tế bào cho

- Cắt cả hai loại ADN (plasmid và tế bào cho) với cùng một loại enzym giới hạn

- Trộn hai loại ADN vừa cắt với nhau để chúng bắt cặp

- Bổ sung ligase để tạo ADN tái tổ hợp

- Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng

- Chọn lọc dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp

3 Các enzyme của công nghệ ADN tái tổ hợp

Có 5 nhóm enzym chính được sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp:

- Nuclease: cắt, phá hủy axit nucleic, bao gồm hai loại là exonuclease (cắt ngoại bào) và endonuclease (cắt nội bào)

- Ligase: Nối các phân tử axit nucleic

- Enzym sửa đổi: thêm hoặc bớt các thành phần hóa học của phân tử axit nucleic

- Topoisomerase: làm biến đổi cấu hình không gian

- Reversre – transcriptase: có khả năng xúc tác sao chép ngược từ ARN thành ADN

3.1 Enzyme cắt hạn chế (RE – Restriction endonuclease)

1962, V Arber phát hiện “enzym hạn chế” sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn và gọi là Restriction

endonuclease – RE

1970, H Smith đã tách được RE từ vi khuẩn

Heamophilus influenza và đặt tên là HinII Ngay sau đó các

nhà khoa học đã xác nhận rằng đa số các loài vi khuẩn đều mang loại enzym này để bảo vệ tế bào chống lại sự xâm nhập của các ADN ngoại lai

RE là enzym có khả năng nhận biết những đoạn ADNnhất định và cắt ADN ở tại đó hoặc tại điểm kế cận

RE là một loại nuclease đặc biệt

RE có thể cắt tạo ra đầu bằng hay đầu so le

RE cắt ADN tạo ra các đầu bằng hay đầu so le

4 Các vector sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp

Vector chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được các gen cần thiết

Vector chuyển gen cần phải có các đặc điểm sau:

- Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori)

để tự sao chép và tồn tại độc lập trong tế bào

- Có trình tự nhận biết của RE

- Có các trình tự promoter xúc tiến quá trình phiên mã

- Có các dấu chuẩn chọn lọc để cho phép phát hiện chúng trong tế bào chủ nhận Ví dụ các gen kháng kháng

4.1 Các vector plasmid

Plasmid là những phân tử ADN có kích thước nhỏ (2 – 5 kb), dạng vòng, nằm độc lập trong tế bào chất, có khả năng sao chép độc lập không phụ thuộc vào sự sao chép của ADN nhiễm sắc thể Các plasmid dùng làm vector tạo dòng có các đặc điểm sau: kích thước tương đối nhỏ, mang một hay nhiều gen chỉ thị chọn lọc

Các plasmid đã được cải tiến qua 3 thế hê

- Thế hệ đầu tiên Là các plasmid tự nhiên đến nay hầu như không còn sử dụng nữa

- Thế hệ thứ hai Là các plasmid đa năng (polycloning

cho RE)

Plasmids are extrachromosomal self-replicating

DNA molecules

Plasmid vector pBR 322

Plasmid thế hệ thứ hai

Ba loại plasmid được sử dụng rộng rãi:

- Nhóm các plasmid pUC, kích thước khoảng 2600

bp, mang gen Ampr và gen lac Z’, vị trí đa tách dòng xen

giữa gen lac Z’

- Nhóm các plasmid pGEM, kích thước khoảng 3000

bp, mang gen Ampr và gen lac Z, vùng đa nối, promoter cho các ARN polymerase

- Nhóm các plasmid pBluecript, kích thước khoảng

3000 bp

pUC19

pGEM – T Easy

pBluecripts II SK

thẳng có 2 đầu bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide (đầu cos).

M13 là phage dạng sợi với DNA mạch vòng đóng, dài khoảng 6.500 nucleotide

Đuôi Đầu

Vector bacteriophage λ họ EMBL được dùng phổ biến trong tạo dòng gen

Vector M13mp (phagemid)

4.3 Vector cosmid:

Cosmid là các vector đặc biệt được xây dựng bởi

plasmid + đầu cos của phage λ dùng để tạo dòng các đoạn

DNA có kích thước lớn của eukaryote

Các đặc điểm chính vector cosmid

- Một marker kháng kháng sinh và một locus khởi đầu

của plasmid (ori).

- Đoạn DNA mang đầu kết dính cos của phage λ.

- Kích thước nhỏ sao cho các đoạn DNA eukaryote dài trên 45 kb có thể thích ứng

Cosmid vector pWEB-TNC

Bảng so sánh giữa ba loại vector phổ biến

4.4 Các loại vector khác

4.4.1 Plasmid Ti

Được sử dụng rộng rãi trong việc chuyển gen ở thực

vật Bắt nguồn từ vi khuẩn trong đất là Agrobacterium

tumifaciens gây bệnh tạo khối u (tumor) ở thực vật Nhân tố gây khối u là plasmid Ti (Tumor inducing) có DNA vòng, kích thước khoảng 200 kb

4.4.2 Vector là nhiễm sắc thể nhân tạo

Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (Yeast Artificial Chromosome – YAC)

Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (Bacterial Artificial Chromosome – BAC)

Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú

(Mammalian Artificial Chromosome – MAC)

5 Các hệ thống tế bào chủ

Mục đích của tế bào chủ:

- Nuôi số lượng lớn plasmid cho thí nghiệm tạo dòng

- Dùng để biểu hiện gen

- Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp

Gồm hai loại:

- Tế bào chủ nhân sơ (prokaryote)

- Tế bào chủ nhân chuẩn (eukaryote)

5.1 Tế bào chủ nhân sơ

E.coli là vi khuẩn gram âm, hình que, không gây bệnh,

thường gặp trong ruột người Hệ gen dạng vòng, kích thước khoảng 4 x 106 bp

Ngoài E.coli, các vi khuẩn khác cũng được dùng làm

vật chủ cho các thí nghiệm tách dòng gen như: Bacillus,

Pseudomonas, Streptomyces

Vi khuẩn Escherichia coli

Ưu điểm của E.coli

- Đặc điểm di truyền, sinh lý sinh hóa đã được nghiên cứu đầy đủ

- Hệ gen đã được giải trình tự

- E.coli dễ nuôi, chu kỳ sinh trưởng ngắn

- Dòng E.coli được sử dụng hiện nay là dòng K12,

không có độc tính đối với người và động vật

5.2 Tế bào chủ nhân chuẩn

Nhược điểm khi sử dụng E.coli làm vật chủ để tách dòng

là do chúng là sinh vật nhân sơ Do đó các gen của sinh vật

nhân chuẩn không hoạt động được

Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) được sử dụng rộng rãi làm tế bào chủ là vì:

- Là VSV nhân chuẩn, có thể nuôi cấy quy mô lớn

- Có các cải biến sau dịch mã (đường hóa, phosphoryl hóa) để tạo protein có đầy đủ hoạt tính sinh học

- Nấm men rất ít tổng hợp protein trong điều kiện bình thường do đó nếu đưa gen lạ vào tổng hợp protein mới thì sản phẩm rất dễ tinh sạch

- Là vi sinh vật an toàn

- Hệ gen nấm men đã được giải trình tự vào năm 1996,

Các vi nấm khác cũng được dùng làm tế bào vật chủ

trong các thí nghiệm tạo dòng gen như nấm mốc (Aspergillus

nidulans, Neurospora crassa, Pichia pastoris)

Nấm men S cerevisiae

Các tế bào chủ thực vật

Ví dụ như loài tảo đơn bào Chlamydomonas reinhardii

Các tế bào chủ động vật

Ví dụ tế bào thận khỉ xanh châu Phi (African green

monkey kidney), Tế bào thận chuột đồng nhỏ (Baby hamster kidney), tế bào tuyến trùng (Caenorhabditis elegans)

6 Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp

Trong phần trước chúng ta đã biết, 2 yếu tố quan trọng trong công nghệ ADN tái tổ hợp là sử dụng enzym để

cắt, nối các phân tử ADN in vitro và hệ thống tế bào chủ để

đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ để nhân lên

Mỗi tế bào chủ khi nhân lên sẽ tạo nên một dòng chứa bản sao của một gen cần thiết, đó là tách dòng gen

(gene cloning)

6.1.Quá trình tách dòng gen gồm các bước cơ bản sau

- Tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu, xử lý bằng RE

- Gắn vào vector nhân dòng, tạo vector tái tổ hợp

- Biến nạp vào tế bào chủ

- Chọn lọc dòng cần tìm

Chọn dòng mang DNA tái tổ hợp

Trong thí nghiệm tạo plasmid tái tổ hợp, các dòng vi khuẩn mọc lên có 3 loại như sau:

- Không mang plasmid

- Mang plasmid không có gen lạ (tự đóng vòng)

- Mang plasmid tái tổ hợp

Vector thường mang các dấu chuẩn chọn lọc như các gen kháng kháng sinh và gen tạo màu Dựa vào các dấu

chuẩn đó chọn lọc được các dòng mang DNA tái tổ hợp

The general procedure for cloning with plasmid vectors

6.2 Biểu hiện của gen được tạo dòng

Muốn gen tạo dòng có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector có các yếu tố phiên mã và dịch mã Các

vector này gọi là vector biểu hiện

Vector biểu hiện là các vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện phiên mã va dịch

mã trong tế bào vật chủ nhận Có các đặc điểm sau:

- Mang các gen chọn lọc

- Trình tự điều hòa (promoter) phiên mã

- Trình tự kiểm soát dịch mã

Vector biểu hiện pRSET

Ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp

Trong dược phẩm: Sản xuất các protein tái tổ hợp như insulin, hormon sinh trưởng ở người, interferon,

interlukin,…

Trong nông nghiệp: Cây trồng biến đổi gen (kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu, kháng cỏ dại), động vật biến đổi gen (sản xuất dược liệu)

Trong y học: Chẩn đoán phân tử, liệu pháp genTrong nghiên cứu cơ bản: genomics, proteomics

7 Kỹ thuật PCR

PCR (polymerase chain reaction) được K Mullis phát minh năm 1985

Nobel năm 1993

PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ

enzyme Taq DNA polymerase khuếch đại in vitro các nucleic

acid đặc trưng trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn

PCR cho phép khuếch đại (amplification) theo hàm mũ lên

đến hàng triệu bản sao các đoạn

DNA có chiều dài từ 200 –

3000bp Đoạn DNA khuếch đại

được nhận dạng nhờ các cặp mồi

NGUYÊN LÝ CỦA PCR

Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase

 PCR thường được thực hiện trong khoảng từ 25-35 chu kỳ.

Mỗi chu kỳ PCR bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ khác nhau:

Gây biến tính: 90-950C

Ủ để gắn primer: 40-650CTổng hợp: 70-720C

T

T T

A

A

PCR product

pGEM-T pCR 2.1-TOPO

Walter Gilbert

8.1 Phương pháp hóa học (1977)

Phương pháp xác định trình tự nucleotide (DNA sequencing) của Maxam và Gilbert (1977) còn gọi là phương pháp hoá học Các đoạn nucleotide giống nhau (ví dụ dài 11 N) được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’

Đoạn đã mang dấu phóng xạ được chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm chịu một xử lý hoá học làm biến đổi một

hay hai base Cụ thể là:

- Xử lý methyl hoá (bằng dimethyl sulfat) làm mạch đứt ở G

- pH = 2 làm đứt ở A hoặc G

- Hydrazine làm đứt ở C và T

- Hydrazine ở nồng độ muối cao làm đứt ở C

Sau khi xử lý, mỗi nhóm chứa một đoạn nucleotide

có chiều dài khác nhau Bốn nhóm được điện di trên gel acrylamide ở phía cực âm, các đoạn ngắn hơn sẽ di

chuyển xa hơn về phía cực dương

Dựa vào kết quả điên di có thể xếp các đoạn ADN theo thứ tự từ ngắn đến dài, điểm mốc chuẩn là đầu 5’

mang đầu phóng xạ P32 được phát hiện nhờ phương

pháp phóng xạ đồ tự ghi (autoradiography) biểu hiện ở vệt đen trên giấy in ảnh Tổng hợp kết quả của 4 nhóm trên bản điện di phản ánh đầy đủ trình tự của các nucleotide của đoạn ADN kể từ đầu 5’

Phân tích trình tự nucleotide bằng phương pháp hóa học (Maxam-Gilbert )

MAXAM-GILBERT CHEMICAL SEQUENCING (1977)

Frederick (Fred) Sanger

8.2 Phương pháp enzyme (1977)

Cũng vào năm 1977, Sanger và cộng sự đã phát minh ra phương pháp giải mã trình tự nhờ enzym, hay còn gọi là phương pháp dideoxy Các tác giả này đã lần đầu tiên giải mã hoàn chỉnh

bộ gen của phageX174 Sanger cùng với Maxam và Gilbert được nhận giải thưởng Nobel năm 1980

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp dideoxy dựa vào hoạt động của enzym ADN polymeraza trong quá trình tổng hợp ADN Enzym ADN polymeraza xúc tác phản ứng gắn các

nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng hợp ở vị trí 3’ – OH, khi gặp một phân tử dideoxynucleotit (dNTP) bình thường và bổ

sung khoảng 1% một loại dideoxynucleotit ddNTP (ddATP,

ddGTP, ddCTP, và ddTTP) cho mỗi loại phản ứng Các

dideoxynucleotit mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 Khi mạch

Mỗi phản ứng được thực hiện riêng rẽ với ADN khuôn, ADN mồi (được đánh dấu phóng xạ 35S hoặc 32P, trong đó 35S

có thể sử dụng trong 3 tháng, còn 32P sử dụng được trong 14 ngày), đầy đủ các loại dNTP, enzym Taq ADN polymeraza,

dung dịch đệm và các điều kiện thích hợp, đồng thời có thêm 1% một loại ddNTP Tương quan nồng độ giữa dNTP và

ddNTP làm cho quá trình tổng hợp ADN thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên, làm phản ứng tổng hợp

ADN dừng lại Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn

oligonucleotit dài ngắn khác nhau một nucleotit có thể nhận biết nhờ phương pháp điện di

O(P)-(P)-(P)-

SANGER DIDEOXY SEQUENCING

5’-DNA Polymerase +dNTPs + one of:

In the ddGTP reaction there is a

random chance a ddGTP will be

incorporated across from a C

C T A G

ddNTP Reaction Mix

5’

C G T A A G G T A T C C 3’

SANGER DIDEOXY SEQUENCING

End labeled

Sequence is complementary

to the strand being sequenced!

autoradiograph of dried sequencing gel

5’-DNA Polymerase +dNTPs + one of:

In the ddGTP reaction there is a

random chance a ddGTP will be

incorporated across from a C

C T A G

ddNTP Reaction Mix

5’

C G T A A G G T A T C C 3’

SANGER DIDEOXY SEQUENCING

End labeled

Sequence is complementary

to the strand being sequenced!

autoradiograph of dried sequencing gel

Phân tích trình tự nucleotide bằng phương pháp enzyme (Sanger)