CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG 2: TẾ BÀO GỐC VÀ NHÂN BẢN VÔ TÍNH

NỘI DUNG  Tế bào gốc  Nhân bản vô tính động vật1. TẾ BÀO GỐC (STEM CELL)  Định nghĩa  Phân loại  Tiềm năng ứng dụng1.1. Định nghĩa  Tế bào gốc là các tế bào chưa biệt hóa, có thể tự tái tạo (self renew) và phân chia nhiều lần.  Trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể biệt hóa thành các kiểu TB chức năng trong cơ thể như TB cơ tim, TB da, TB não, TB sinh dục…1.2. Phân loại  Theo tiềm năng biệt hóa  Tế bào gốc toàn năng  Tế bào gốc đa năng  Tế bào gốc một vài tiềm năng  Tế bào gốc đơn năng1.2. Phân loại  Theo nguồn gốc thu nhận  Tế bào gốc phôi  Tế bào gốc sinh dục  Tế bào gốc nhũ nhi hay gốc thai  Tế bào gốc trưởng thành  Tế bào gốc ung thư1.3. Tiềm năng ứng dụng  Cấy ghép tế bào gốc  Công nghệ mô và cấy ghép cơ quan  Liệu pháp gen  Kiểm nghiệm hóa chất và dược chất  Điều trị bệnh tự miễn  Biến đổi gen động vật  Trong nghiên cứu cơ bản2. NHÂN BẢN VÔ TÍNH  Dòng và sự tạo dòng  Hiện tượng sinh sản vô tính trong tự nhiên  Lịch sử quá trình tạo dòng vô tính  Kỹ thuật nhân bản  Tương lai của nhân bản vô tính và tế bào g

CHƯƠNG 2

TẾ BÀO GỐC VÀ NHÂN BẢN VÔ TÍNH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHOA CNSH - CNTP

NỘI DUNG

 Tế bào gốc

 Nhân bản vô tính động vật

1 TẾ BÀO GỐC (STEM CELL)

 Định nghĩa

 Phân loại

 Tiềm năng ứng dụng

1.1 Định nghĩa

 Tế bào gốc là các tế bào chưa biệt hóa, có thể tự tái tạo (self renew) và phân chia

nhiều lần

 Trong những điều kiện thích hợp, chúng

có thể biệt hóa thành các kiểu TB chức

năng trong cơ thể như TB cơ tim, TB da,

TB não, TB sinh dục…

1.2 Phân loại

 Theo tiềm năng biệt hóa

 Tế bào gốc toàn năng

 Tế bào gốc đa năng

 Tế bào gốc một vài tiềm năng

 Tế bào gốc đơn năng

 Biến đổi gen động vật

 Trong nghiên cứu cơ bản

2 NHÂN BẢN VÔ TÍNH

 Dòng và sự tạo dòng

 Hiện tượng sinh sản vô tính trong tự nhiên

 Lịch sử quá trình tạo dòng vô tính

 Kỹ thuật nhân bản

 Tương lai của nhân bản vô tính và tế bào gốc

2.1 Dòng và sự tạo dòng

 Thuật ngữ dòng (clone) có nguồn gốc từ tiếng

Hy lạp (klon: nhánh con hay cành con) được sử dụng trong nhiều lĩnh vực

 Trong sinh học, dòng để chỉ những phân tử

DNA, những tế bào hay những cơ thể hoàn

chỉnh có cùng một cấu trúc di truyền

 Tạo dòng (cloning) là khái niệm diễn tả những thao tác kỹ thuật nhằm tạo ra dòng

2.1 Dòng và sự tạo dòng

 Ngày nay, các nhà nghiên cứu thường tạo dòng vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật

để tăng lượng tế bào

 Từ một tế bào đơn lẻ ban đầu được phát triển thành một dòng tế bào (cell lines)

gọi là tạo dòng tế bào (cell cloning)

 Tương tự như vậy, việc tạo dòng DNA

được gọi là tạo dòng phân tử (moleclar

cloning)

2.1 Dòng và sự tạo dòng

 Tạo dòng động vật, thường được hiểu là tạo dòng sinh sản (reproductive cloning) hay nhân bản (cloning) được

sử dụng rộng rãi khi cừu Dolly ra đời (1997), đây là

động vật có vú đầu tiên được tạo dòng từ tế bào sinh dưỡng (soma cell) trưởng thành.

 Ngoài việc tạo dòng những cá thể động vật hoàn chỉnh, phương pháp chuyển nhân tế bào sinh dưỡng còn được

sử dụng với mục đích khác như để khai thác tế bào gốc (stem cell), trường hợp này gọi là tạo dòng trị liệu

(therapeutic cloning) hay tạo dòng nghiên cứu (research cloning) hay tạo dòng không sinh sản (non -

reproductive cloning).

Phân loại sự tạo dòng

 Tạo dòng phân tử

 Tạo dòng tế bào

 Tạo dòng sinh sản

 Tạo dòng liệu pháp

Phân loại sự tạo dòng

 Tạo dòng phân tử: trong các nghiên cứu genomics thường phải cần sử dụng số

lượng bản sao DNA rất lớn từ một đoạn gen mục tiêu ban đầu

 in vivo

 in vitro (PCR)

Phân loại sự tạo dòng

 Tạo dòng tế bào: có nhiều phương pháp

để có thể phân lập được một tế bào quan tâm Sau đó, các tế bào được hoạt hóa và cấy chuyển liên tục tạo ra một dòng tế

bào

 Chúng được ứng dụng trong nghiên cứu cơ

bản, sản protein, kiểm nghiệm dược phẩm,

thực phẩm, kiểm tra độc tố Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều dòng tế bào đã được

Phân loại sự tạo dòng

 Tạo dòng sinh sản: khái niệm này được hiểu như là phương pháp sản xuất phôi cho ra những cá thể giống nhau hoàn

toàn, là một dòng của cá thể ban đầu, có cùng hệ gen, kể cả hệ gen ty thể

Phân loại sự tạo dòng

 Tạo dòng liệu pháp: còn gọi là tạo dòng trị liệu, kỹ thuật này được sử dụng để sản

xuất phôi nhằm mục đích thu nhận tế bào gốc, sửa chữa mô bị hư hỏng hay khiếm

khuyết

 Các tế bào gốc phôi có thể được biệt hóa in

vitro thành các tế bào chức năng chuyên biệt

để cấy ghép.

2 2 Hiện tượng sinh sản vô tính

trong tự nhiên

 Động vật không xương sống

 Nảy chồi (Budding): có ở loài thủy tức

 Phân mảnh (Fragmentation): có ở loài hải quỳ

 Tái sinh (Regeneration): có ở sao biển

 Động vật có xương sống: Phương thức sinh sản

vô tính hiếm gặp ở động vật có xương sống

 Sinh sản vô tính giúp quần thể phát triển nhanh

trong điều kiện ổn định

 Trong khi đó, sinh sản hữu tính giúp sinh vật thích nghi tốt hơn với các biến đổi của điều kiện môi

2.3 Lịch sử của tạo dòng

 Năm 1865, August Weissmann (Đức) đưa ra giả thiết: thông tin di truyền của các tế bào giảm bớt khi chúng được biệt hóa, được gọi là thuyết chât mầm (germ

plasm theory)

 Năm 1888, Wilhelm Roux kiểm chứng thuyết này, ông

đã phá hủy một trong hai tế bào của phôi hai tế bào

bằng mũi kim nóng Kết quả là các tế bào còn lại hình thành một nửa phôi

 Năm 1894, Hans Dreisch tách các tế bào từ phôi 2 - 4 tế bào của nhím biển (sea urchin) và quan sát khả năng phát triển thành ấu trùng nhỏ Kết quả này đã bác bỏ

2.3 Lịch sử của tạo dòng

 Năm 1901, Hans Spemann (Đức) đã tiến hành thí

nghiệm tách phôi hai tế bào của sa giông (newt) thành hai phần sau đó nuôi chúng phát triển thành hai ấu

trùng hoàn chỉnh Năm 1902, ông đã tách phôi kỳ nhông

ở giai đoạn hai tế bào và mỗi tế bào phát triển thành

 Năm 1962, nhà sinh học phát triển người Anh, John

Gurdon (1933 - ) đã tạo dòng thành công ếch ( Xenopus laevis ) thành thục và trưởng thành từ tế bào ruột của

2.3 Lịch sử của tạo dòng

2.3 Lịch sử của tạo dòng

 Năm 1984, nhà sinh học phát triển người Đan

Mạch, Steen Willsadsen đã tạo dòng cừu bằng

cách chuyển nhân của một tế bào của phôi tám

tế bào vào trứng chưa thụ tinh đã loại nhân

Năm 1986, Steen Willsadsen đã tạo dòng một

con bò bằng cách chuyển nhân tế bào phôi đã biệt hóa một tuần Điều này đã chứng minh rằng thông tin di truyền của một tế bào không bị

giảm bớt khi tế bào biệt hóa và DNA có thể trở

2.3 Lịch sử của tạo dòng

 Năm 1997, các nhà khoa học người Scotland là J.Wilmut, A.E Schnicke, J.Mc Whir, A.J Kind và K.H.S Campbell đã công bố nhân bản thành

công một con cừu từ nhân của tế bào tuyến vú (tế bào sinh dưỡng đã biệt hóa) và đặt tên là

Dolly

 Sau đó, nhân bản vô tính đã thành công trên

nhiều loài động vật bậc cao như chuột (1998),

bò (1998), dê (1999), lợn (2000), mèo (2001), thỏ (2002), la (2003), ngựa (2003), trâu (2004),

 Chia cắt phôi túi (blastocyst division)

 Kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân (somatic

cell nuclear transfer).

2.4.1 Phân tách các tế bào blastomere (blastomere separation)

 Đầu tiên trứng và tinh trùng được thụ tinh trong ống nghiệm tạo thành phôi

 Phôi này được nuôi cấy cho phát triển đến giai đoạn 2 hoặc 4 tế bào (mỗi tế bào trong khối 2 hoặc 4 tế bào này được gọi là một blastomere)

 Đến giai đoạn này người ta tách bỏ màng bọc phôi và chuyển phôi vào một môi trường đặc

biệt làm cho các blastomere tách rời nhau ra

2.4.1 Phân tách các tế bào blastomere (blastomere separation)

 Mỗi blastomere này sau đó được nuôi cấy riêng biệt cho phép hình thành nên một phôi

 Phương pháp này có thể tạo ra tối đa là 4 phôi bản sao giống hệt phôi ban đầu về mặt di

truyền

 Mỗi phôi mới được tạo ra bằng phương pháp

này sau đó có thể đem cấy vào tử cung một “mẹ nuôi” cho phép phôi phát triển thành thai nhi

trong quá trình mang thai của “mẹ nuôi”

 Trong kỹ thuật này, các cá thể “bản sao” vẫn

mang bộ gen lưỡng bội có nguồn gốc từ hai

bố-2.4.1 Phân tách các tế bào blastomere (blastomere separation)

2.4.2 Nhân bản phôi bằng chia cắt

phôi túi (blastocyst division)

 Đầu tiên trứng và tinh trùng cũng được

thụ tinh trong ống nghiệm tạo thành phôi

 Nhưng khác với kỹ thuật phân tách

blastomere, phôi này được nuôi cấy cho phân chia tới khi tạo thành blastocyst

 Lúc này người ta chia cắt blastocyst đó

thành 2 phần và cấy vào hai nửa đó vào

tử cung của một “mẹ nuôi”

2.4.2 Nhân bản phôi bằng chia cắt

phôi túi (blastocyst division)

 Qua quá trình mang thai tự nhiên, hai nửa blastocyst này phát triển thành hai cá thể sinh đôi giống hệt nhau

 Cũng như các “bản sao” được tạo ra bằng

kỹ thuật phân tách blastomere, các “bản sao” được tạo ra trong kỹ thuật chia cắt

blastocyst cũng mang bộ gen lưỡng bội có nguồn gốc từ hai bố-mẹ

2.4.3 Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào soma (Nuclear Transplanation)

 Để nhân bản bằng kỹ thuật chuyển nhân cần có hai tế bào, một tế bào trứng và

một tế bào cho

 Qua thực nghiệm thấy trứng chưa thụ tinh phù hợp nhất cho kỹ thuật này vì dường như nó dễ dàng dung nạp nhân cho hơn

Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào soma (Nuclear Transplanation)

 Tế bào trứng phải được loại bỏ nhân, quá trình này làm mất đi hầu hết thông tin di truyền của trứng

 Bằng các kỹ thuật khác nhau, tế bào thân được đưa về giai đoạn G0 (pha không

hoạt động) khi đó hoạt động sinh học của

tế bào thân được “tắt” nhưng tế bào

không chết

Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào soma (Nuclear Transplanation)

 Ở trạng thái này nhân tế bào thân đã sẵn sàn

được trứng chấp nhận Đặt nhân tế bào cho vào trong tế bào trứng đã loại nhân

 Sau đó tế bào trứng được kích thích phát triển thành phôi trên in vitro và được đưa vào tử cung

“mẹ nuôi” cho phát triển thành thai

 Nếu tất cả các khâu trong quá trình này được

thực hiện một cách chính xác, một bản sao hoàn hảo của động vật cho nhân sẽ ra đời

Nhân bản bằng chuyển nhân tế

bào soma (Nuclear Transplanation)

 Nếu trứng được dùng trong quy trình này được lấy từ cùng cá thể cho nhân tế bào thân, kết quả

sẽ là một phôi vô tính thừa hưởng toàn bộ vật

chất di truyền của cá thể đó (cả DNA nhân và

DNA ty thể) bởi vì DNA ngoài nhân (DNA ty thể)

có nguồn gốc từ bào tương tế bào trứng của cơ thể “mẹ”

 Nhiều “bản sao” có thể được tạo ra bằng cách

chuyển các nhân giống nhau vào các trứng lấy

Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào soma (Nuclear Transplanation)

 Nếu các nhân tế bào thân và trứng lấy từ các cá thể khác nhau, chúng sẽ không

hoàn toàn giống cơ thể cho nhân vì các

“bản sao” sẽ khác ở một số gen ty thể

Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào soma (Nuclear Transplanation)

Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào soma (Nuclear Transplanation)

Tóm tắt quy trình nhân bản bằng

phương pháp chuyển nhân

 Lấy tế bào trứng (nhân đơn bội) của cơ thể “mẹ”, hút bỏ nhân đơn bội.

 Lấy tế bào soma (máu, da …) của cá thể sẽ nhân bản, đồng bộ hóa chu trình tế bào của tế bào này, hút lấy

nhân lưỡng bội

 Đưa nhân lưỡng bội vào trong trứng đã hút bỏ nhân nói trên (bằng tiêm trực tiếp hoặc bằng kích thích xung

điện) để tạo nên “hợp tử” hay “phôi vô tính”

 Kích thích để “hợp tử” tiếp tục phát triển và phân chia tạo nên khối blastocyst (dùng shock điện hoặc dùng môi trường có chứa chất cytochalasin B)

 Sau đó khối blastocyst này có thể được:

Các phương pháp chuyển nhân tế

bào soma

 Kỹ thuật Roslin (1996)

 Kỹ thuật Honolulu (1998)

 Kỹ thuật Hanmade (2002)

Kỹ thuật Roslin (1996)

 Do Ian Wilmut và Keith Campbell ở viện Roslin (Scotland) dùng để nhân bản cừu Dolly

Kỹ thuật Roslin (1996)

 Đầu tiên một tế bào (tế bào cho thông tin di

truyền) được lấy ra từ tuyến vú của một cừu mẹ

và nuôi cấy in vitro để tăng sinh

 Sau đó một tế bào được lấy ra khỏi nuôi cấy và đồng bộ hóa chu trình tế bào (synchronizing cell cycles) bằng cách để đói trong môi trường thiếu dinh dưỡng (lượng chất dinh dưỡng chỉ vừa đủ giữ cho tế bào không chết) Trong điều kiện này

tế bào tắt tất cả các gen hoạt động tế và chuyển

Kỹ thuật Roslin (1996)

 Loại bỏ nhân của tế bào trứng chưa thụ tinh lấy

từ một cừu “mẹ nuôi”, đặt tế bào trứng này sát vách tế bào cho (đã đưa về pha G0)

 Sau khi rút nhân trứng từ 1 đến 8 tiếng, cho

một dòng điện chạy qua hai tế bào này, shock

có tác dụng hòa tế bào trứng (đã bỏ nhân) và tế bào cho nhân với nhau, đồng thời khởi động tế bào mới tạo thành phát triển thành phôi

Kỹ thuật Roslin (1996)

 Nếu phôi đó sống, nó được cho phát triển trong khoảng 6 ngày và cuối cùng được đặt vào tử cung “mẹ nuôi” cho phát triển thành thai và sinh sản như bình thường

 Kỹ thuật tạo ra cừu Dolly có tỷ lệ thành

công là 1/277

Kỹ thuật Roslin (1996)

Bò Dewey

Kỹ thuật Roslin (1996)

+

Kỹ thuật Roslin (1996)

fibroblast tư tai bo

Trưng loai nhân

Kỹ thuật Roslin (1996)

Nuôi trong

7 ngay

Phôi nhân ban vô tinh

Chuyên phôi vao

Khỉ Tetra Lợn Xena Ngựa Prometea

Kỹ thuật Honolulu (1998)

 Kỹ thuật này được Teruhiko Wakayama và Ryuzo Yanagimachi ở đại học tổng hợp

Hawai giới thiệu năm 1998

 Kỹ thuật của Honolulu hiệu quả hơn nhiều (thành công 3 lần trong mỗi 100 lần thực hiện) so với kỹ thuật của Roslin (thành

công 1 lần trong 277 lần thực hiện)

Kỹ thuật Honolulu (1998)

 Wakayama thực hiện đồng bộ hóa chu

trình tế bào bằng phương pháp khác với Wilmut

 Wilmut dùng tế bào tuyến vú, một tế bào phải được đưa vào giai đoạn G0

Wakayama ban đầu dùng ba loại tế bào: các tế bào Sertoli (tế bào lát ống tinh

hoàn), các tế bào não, và các tế bào gò trứng (cumulus cells)

Kỹ thuật Honolulu (1998)

 Bình thường trong cơ thể cả hai loại tế

bào Sertoli và tế bào não đã được duy trì

ở pha G0 và các tế bào gò trứng hầu như luôn ở pha G0 hoặc G1 (trạng thái ngủ

hay tình trạng ẩn dật)

 Các trứng chuột chưa thụ tinh được dùng

để nhận nhân cho Sau khi loại bỏ nhân, đưa nhân tế bào cho vào trong tế bào

trứng bằng tiêm nhân trực tiếp

Kỹ thuật Honolulu (1998)

 Nhân của tế bào cho được lấy ngay trong vài phút khi tế bào thân được lấy từ cơ thể chuột Khác với kỹ thuật Roslin, kỹ thuật

Honolulu không nuôi cấy tế bào thân

 Sau một giờ, tế bào trứng chấp nhận nhân mới

Kỹ thuật Honolulu (1998)

 Trứng được để yên thêm 5-6 giờ nữa rồi đưa vào ủ trong môi trường nuôi cấy hóa học (có chứa chất cytochalasin B) để khởi động tế bào phân chia

 Môi trường này có vai trò giống shock điện nhưng diễn ra êm ái hơn và ít gây tổn

thương tế bào hơn

này sau đó được

cấy vào tử cung

“mẹ nuôi” cho

mang thai và sinh

nở bình thường

Kỹ thuật Honolulu (1998)

Kỹ thuật Honolulu (1998)

Kỹ thuật Honolulu (1998)

Kỹ thuật Honolulu (1998)

Kỹ thuật Roslin Kỹ thuật Honolulu

- Dùng ngay, không nuôi cấy ngoài cơ thể Đưa nhân tế bào cho vào tế bào nhận

bằng shock điện

Đưa nhân tế bào cho vào tế bào nhận bằng

tiêm trực tiếp

Đồng thời với nhận nhân trứng được

dòng điện hoạt hóa luôn

Trứng sau nhận nhân (“thụ tinh”) được để yên (không có kích thích nào khác) 5-6 giờ

để cho phép chấp nhận nhận mới và có thời

gian tái lập trình nhân tế bào Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển

thành phôi bằng shock điện

Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển thành phôi bằng ủ trong môi trường hóa học có Một số khác biệt giữa kỹ thuật Roslin và Honolulu

Kỹ thuật Handmade (Handmade

cloning – HMC)

 Được phát triển bởi Gábor Vajta at the

Danish Institute of Agricultural Sciences in Tjele và Ian Lewis, programme leader for the Cooperative Research Centre for

Innovative Dairy Products in Australia

Phương pháp này, màng zona được tách ra sau khi trứng trưởng thành và trước khi loại

nhân Đầu tiên những tế bào

trứng được xẻ làm đôi, phần

chứa nhân bị loại bỏ, hai nửa

không có nhân được gắn lại với nhau cùng với vật liệu di truyền của tế bào cho nhân làm thành một trứng mới

Kĩ thuật này không cần sử dụng hệ thống vi thao tác để loại nhân và dung hợp tế bào, vì vậy các tác giả gọi kĩ thuật này là

2.4.6 Nhân bản trị liệu (therapeutic

cloning)

2.4.6 Nhân bản trị liệu (therapeutic

“cá thể hóa”), nuôi cấy và làm biệt hóa các tế

bào gốc người này và sử dụng chúng vào điều trị Mục đích của nhân bản trị liệu là tạo ra các mô/tạng phù hợp (khỏe mạnh và không bất

đồng miễn dịch) để ghép cho người bệnh

2.4.6 Nhân bản trị liệu (therapeutic

cloning)

2.4.6 Nhân bản trị liệu (therapeutic

cloning)

2.4.6 Nhân bản trị liệu (therapeutic

cloning)

2.4.6 Nhân bản trị liệu (therapeutic

cloning)