Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hạt cam thảo dây quế sơn quảng nam

Công trình được hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: TS.. Lê Tự Hải Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp tại Đại học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

PHẠM THỊ CẨM LAI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT HẠT CAM THẢO DÂY

QUẾ SƠN-QUẢNG NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số : 60 44 27

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đà Nẵng – Năm 2013

Công trình được hoàn thành tại

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN MẠNH LỤC

Phản biện 1: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh

Phản biện 2: PGS.TS Lê Tự Hải

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày

31 tháng 5 năm 2013

* Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin- Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

1

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam n m ở v ng nhiệt đới c thảm thực vật phong ph ,

rất nhiều loài cây thuộc chi Abrus thuộc họ Fabaceae được d ng đ

bào ch thuốc ch a nhiều bệnh M c d nh ng loài thuộc c c chi k

trên c nhiều gi trị sử dụng như vậy nhưng c c công trình nghiên

c u về thành ph n ho học, hoạt t nh c a c c cây thuộc chi n i trên vẫn chưa hoàn toàn đ y đ và c t nh hệ thống

Việc nghiên c u chi t t ch, c định thành ph n h a học, ng dụng c c phương ph p hiện đại đ c định cấu tr c và nghiên c u hoạt t nh sinh học c a một số hợp chất c c loài cây thuộc c c chi trên

ở Việt Nam là một hướng nghiên c u c nhiều tri n vọng, c nghĩa khoa học và thực ti n cao

Cây cam thảo dây c tên khoa học là Abrus precatorius L thuộc họ Đậu (Fabaceae) Cam thảo dây là một trong nh ng vị thuốc

Ðông y lâu đời nhất; trong s ch "Th n nông bản thảo" th kỷ th 3 trước công nguyên đã n i đ n cam thảo Nhìn chung c c s ch bản thảo (s ch n i về dược) Ðông y đều cho r ng Cam thảo vị ngọt t nh bình, c t c dụng bổ trung ch kh , giải co thắt giảm đau, nhuận ph giảm kh t, thanh nhiệt giải độc, giải độc thuốc và th c ăn, điều hòa

t nh vị c a c c vị thuốc kh c Vì vậy, ch ng tôi chọn đề tài: “Nghiên

cứu t n p n c d c c t ạt cây c m t ảo dây Qu Quảng N m” làm luận văn Thạc sĩ

Sơn-2 Mục đích nghiên cứu

- Tìm c c điều kiện chi t t ch th ch hợp c c chất t hạt cây cam thảo dây b ng c c dung môi kh c nhau

2

- X c định thành ph n h a học c c chất t dịch chi t hạt cây cam thảo dây

- Thăm dò hoạt t nh sinh học c a protein phân lập t dịch chi t nước c a hạt cây cam thảo dây

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Hạt cây cam thảo dây ở Qu Sơn-Quảng Nam

3.2 Phạm vi nghiên cứu

Thành ph n hóa học c a một số dịch chi t hạt cam thảo dây

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

+ Thu thập, tổng hợp, phân t ch c c tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, thành ph n h a học và ng dụng c a cây và hạt cam thảo dây

+ Tổng hợp tài liệu về phương ph p lấy mẫu, chi t t ch và c đinh thành ph n h a học c c chất t thực vật

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

+ K t hợp gi a thực nghiệm ho học với việc sử dụng c c thi t

bị hiện đại như c c phương ph p HPLC, GC-MS và LC-MS đ định danh c c chất trong dịch chi t

+ Thử nghiệm hoạt t nh sinh học c a protein phân lập t dịch chi t nước

3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Nh ng k t quả nghiên c u trong công trình này sẽ g p ph n cung cấp c c thông tin c nghĩa khoa học về thành ph n và c c

hoạt t nh sinh học được chi t t ch t loài Abrus precatorius và qua

đ g p ph n nâng cao gi trị ng dụng c a ch ng trong ngành dược

liệu

6 Bố cục của luận văn

Luận văn bao gồm trang, 14 bảng, 10 hình, 52 tài liệu tham khảo và 2 phụ lục Cấu tr c luận văn như sau:

Mở đ u (3 trang)

Chương 1 Tổng quan (20 trang)

Chương 2 Nguyên liệu và phương ph p nghiên c u (12 trang)

Chương 3 K t quả và thảo luận (21 trang)

K t luận và ki n nghị (3 trang)

Tài liệu tham khảo (5 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT

1.1.1 Đặc điểm chung của chi Abrus

1.1.2 Giới thiệu về cây cam thảo dây

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên c u là hạt cây cam thảo dây được thu hái vào tháng 4/2012 tại huyện Qu Sơn, tỉnh Quảng Nam (Hình

2.1), c định tên khoa học thuộc loài Abrus precatorius L

Hình 2.1 Cây cam thảo dây

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xác định các thông số hóa lý

a P ương p áp tr ng lượng

b P ương p áp vật lý

5

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

2.2.3 Phương pháp phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết

2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

2.3 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.3.1 Sơ đồ thực nghiệm

2.3.2 Xử lí nguyên liệu

Nguyên liệu là hạt cây cam thảo dây được thu hái vào tháng 4/2012 tại huyện Qu Sơn, tỉnh Quảng Nam Chọn h i nh ng quả đã chín, già

Thu nguyên liệu

Xử l thành dạng bột

X c định hàm lượng kim loại

X c định độ m,

hàm lượng h u cơ

Khảo s t điều kiện tối ưu: thời gian, tỉ lệ rắn/lỏng

Định danh

b ng c c phương ph p GC-MS, LC-

6 Sau đ b c quả ra đ thu lấy hạt Hạt hình tr ng, nhẵn b ng,

to b ng hạt đậu gạo, màu đỏ ch i, c một đốm đen rộng bao quanh

t , rất độc, dài khoảng 0,5 cm

Hạt cam thảo sau khi h i, loại bỏ nh ng hạt đã bị hư, sâu, rửa sạch và đ khô tự nhiên Lấy một ph n đi khảo s t độ m, ph n còn lại đem đi phơi khô rồi đem ay nhỏ, bảo quản trong bình k n

Hình 2.3 Nguyên liệu hạt cây cam thảo dây tươi và bột khô

2.3.3 Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu

* Trong dung môi h u cơ thông thường:

Cho 20g nguyên liệu bột khô được ngâm chi t trong bốn dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol ba l n với mỗi

7

l n 200 ml dung môi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 9 ngày, thu lấy dịch chi t

Lấy ở mỗi dịch chi t khoảng 5 ml đ đem phân t ch GC – MS

c định thành ph n và hàm lượng c c cấu tử c trong mỗi dịch chi t Hệ thống GC-MS với cột t ch mao quản DB-5MS, khí mang

He 10psi, th t ch tiêm mẫu 1μl (split 10:1), ghép máy MS EI+

kèm ngân hàng d liệu và theo chương trình gradient nhiệt độ: t 500

C

đ n 3000

C (5 phút); injector 2500C và detector 500, ch độ quét Fullscan

* Qu trình chi t abrin b ng nước:

Bột hạt cam thảo dây cho vào cốc, cho nước đ n th t ch gấp đôi ph n bột, đun sôi nh , khuấy đều đ n khi th t ch ph n nước ph a trên ấp ỉ ph n bột nhão ở dưới thì ng ng đun Đ nguội, gạn lấy dung dịch ở trên vào cốc Sau đ ti p tục cho vào một lượng nước cất

c th t ch gấp đôi lượng dung dịch v a gạn ra và đun ti p cho đ n khi th t ch ph n dung dịch t ch ra ph a trên ấp ỉ ph n bột nhão ở dưới thì ng ng đun Đ nguội gạn lấy dung dịch cho vào cốc Ti p tục làm như vậy một l n n a và đem lọc lấy ph n dung dịch b ng

ph u lọc ở p suất thấp (k cả ph n lọc gạn ban đ u) Gộp chung tất

cả c c dung dịch v a lọc đem đi cô cạn bớt Đ nguội, lọc lại và cho vào ethanol khan, đ yên cho k t t a uất hiện Lọc lấy k t t a, rửa

b ng cồn Tinh ch b ng c ch hòa tan k t t a trong nước n ng, k t

t a lại b ng cồn, lọc lấy k t t a và đem thử hoạt t nh gây độc t bào

CHƯƠNG 3

3.1.2 Hàm lƣợng tro

Hàm lượng tro trung bình trong hạt cam thảo dây là 0.883%

Điều này dự b o hàm lượng kim loại c trong hạt cam thảo dây là rất

K t quả (mg/l)

K t quả (mg/kg)

Hàm lượng cho phép (mg/kg) [1]

Thành ph n kim loại n ng c trong hạt cam thảo dây thấp Đây

là một trong nh ng chỉ số quan trọng đ đ nh gi việc sử dụng hạt

9 cam thảo dây làm dược liệu an toàn, không ảnh hưởng đ n s c khoẻ con người

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS

3.2.1 Kết quả ảnh hưởng của các loại dung môi

Hình 3.1 Dịch chiết hạt cam thảo dây trong các dung môi: n-hexane,

chloroform, ethyl acetate và methanol

C c dịch chi t thu được c màu nhạt d n theo độ phân cực giảm d n c a dung môi: methanol, ethyl acetate, chloroform và n-

he ane Dịch chi t methanol c a hạt cam thảo dây c màu nâu đỏ, dịch chi t ethyl acetate c a hạt cam thảo dây c màu vàng chanh, dịch chi t chloroform c a hạt cam thảo dây c màu chanh nhạt, dịch chi t n-he ane c a hạt cam thảo dây c vàng rất nhạt

* N ận xét: Khả năng hòa tan hạt cam thảo dây trong các

dung môi giảm d n theo th tự sau: methanol, ethyl acetate, chloroform và n-he ane theo đ ng độ giảm d n t nh phân cực c a các dung môi Điều này dự b o hạt cam thảo dây ch a nhiều chất

10 phân cực Vì vậy, ch ng tôi sử dụng 4 loại dung môi này ti n hành

t ch chất b ng phương ph p chi t ngâm d m

3.2.2 Kết quả khảo sát thời gian, tỉ lệ R/L trong quá trình chiết tách và thành phần hóa học trong các dịch chiết

a Trong dung môi n-hexane

* K t quả k ảo sát t ờ g n, tỉ lệ R/L trong quá trìn c t tách:

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích n-hexane

đến khối lượng cao chiết

Th t ch

n-hexane (ml) 100 125 150 175 200

Thời gian chi t (ngày)

Khối lượng

cao chi t

(gam)

0.139 0.148 0.168 0.169 0.175 4 0.148 0.159 0.165 0.173 0.183 6

0.149 0.164 0.186 0.187 0.188 8 0.149 0.168 0.183 0.188 0.189 10

 N ận xét: Qua bảng 3.6 và hình 3.2 ta thấy, thời gian chi t t 4

ngày đ n 10 ngày và th t ch dung môi t 100 ml đ n 200 ml thì khối lượng cao chi t tăng lên và đạt khối lượng cao nhất ở thời gian chi t

8 ngày với tỉ lệ R/L là 10/150 là 0.186g Vậy thời gian chi t tối ưu là

8 ngày và tỉ lệ R/L th ch hợp là 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150ml

dung môi n-hexane

h a học trong dịch chi t n-he ane ch y u là nh ng cấu tử c độ phân cực

y u đ n không phân cực, bao gồm c c hidrocacbon mạch dài 10C ÷ 27C và hidrocacbon thơm C c cấu tử c hàm lượng cao > 5% là n-heptacosane (21.23%), palmitic acid, ethyl ester (10.46%), phenenthrene, 7-isopropyl-1-methyl (6.79%), adipic acid, bis(2-ethylhe yl) ester (6.78%) C c cấu tử còn lại đều c hàm lượng thấp < 5%, bao gồm hidrocacbon no và hidrocacbon thơm

12 Trong dịch chi t n-hexane, palmitic acid ethyl ester là một monoesters béo, đây là chất độc nhưng độc t nh thấp Retene (7-isopropyl-1-methyl phenanthrene) là một hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) cũng gây

ra độc t nh như như dio in, tăng tỷ lệ tử vong, khuy t tật Adipic ethylhexyl)ester (DEHA) gây ra u tuy n và ung thư bi u mô gan ở chuột, nhưng không được cho là chất gây ung thư cho con người theo cơ quan ung

acid,bis(2-thư quốc t

b Trong dung môi ethyl acetate

* K t quả k ảo sát t ờ g n, tỉ lệ R/L trong quá trìn c t tách:

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích EtOAc đến

khối lượng cao chiết

Th t ch

EtOAc (ml) 100 125 150 175 200

Thời gian chi t (ngày)

Khối lượng

cao chi t

(gam)

0.323 0.374 0.435 0.464 0.496 4 0.395 0.456 0.497 0.508 0.523 6

0.401 0.447 0.534 0.549 0.574 8

0.435 0.516 0.605 0.613 0.621 10

 N ận xét: Qua bảng 3.8 và hình 3.4 ta thấy, khi th t ch dung môi

tăng và thời gian khảo s t tăng thì khối lượng cao chi t cũng tăng

d n Ở tỉ lệ 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150 ml dung môi ethyl acetate trong thời gian 10 ngày, khối lượng cao chi t thu được là 0.605g cao hơn khối lượng cao chi t ở tỉ lệ 10g mẫu/ 125ml là 0.516g và nhỏ hơn so với khối lượng cắn ở tỉ lệ 10g mẫu/ 175ml là 0.613g nhưng không đ ng k , đồng thời cũng cao hơn hẳn so với chi t c ng tỉ lệ R/L trong thời gian 8 ngày là 0.534g Vậy tỉ lệ R/L

13

th ch hợp đ chi t hạt cam thảo dây là 10g mẫu hạt/ 150ml dung môi ethyl acetate trong thời gian 10 ngày

* Thàn p n c trong d c c t ethyl acetate:

Bảng 3.9 Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate

8 17.54 0.34 Hexadecanoic acid C16H32O2

9 17.82 0.84 Palmitic acid, ethyl ester C18H36O2

10 17.92 0.17

2-[1-(4-cyano-1,2,3,4-tetrahydronaphthyl)]propanenitrile

C14H14N2

11 17.99 0.40

3-[1-(4-cyano-1,2,3,4-tetrahydronaphthyl)]propanenitrile

độ phân cực trung bình và y u như c c acid h u cơ tồn tại ch y u ở dạng tự do và este, do c cấu tr c tương tự nên c c cấu tử này d dàng phân bố vào pha dung môi ethyl acetate, ngoài ra còn có các dẫn uất phenol C c cấu tử c hàm lượng cao là hexanedioic acid,

bis(2-ethylhexyl) ester (17.90%), γ-tocopherol (5.70%), campesterol

Stigmasterol rất h u ch trong việc ngăn ng a một số bệnh ung thư, bao gồm cả buồng tr ng, tuy n tiền liệt, vú và ung thư ruột

k t Stigmasterol đã được ch ng minh r ng c th c ch sự suy

15 thoái viêm ương khớp do thoái hóa sụn và nó là chất chống o y hóa mạnh

Cũng như stigmasterol, β-sitosterol cũng được sử dụng cho người c bệnh tim và cholesterol cao β-sitosterol được d ng đ

th c đ y hệ thống mi n dịch và ngăn ng a ung thư ruột k t, cũng như sỏi mật, phổ bi n cảm lạnh và c m, HIV / AIDS, viêm khớp dạng thấp, bệnh lao, bệnh v y n n, dị ng, ung thư cổ tử cung, đau

ơ cơ, hen suy n, rụng t c, viêm ph quản, ch ng đau nửa đ u đau

đ u, và hội ch ng mệt mỏi mãn t nh

Campesterol cũng là một loại phytosterol, c t c dụng c ch

sự hấp thu cholesterol trong ruột, chống viêm

Dịch chi t c ch a c c hợp chất đ ng quan tâm là γ-tocopherol

và squalene Γ-tocopherol là một trong 3 dạng c a vitamin E, c khả năng chống o y ho cao do đ ngăn ng a được c c bệnh liên quan

đ n gốc tự do như ung thư, bệnh tim mạch Squalene là một triterpen, là một chất chống o y h a, ngăn ng a nh ng t c hại c a pero y lipid, ngăn ch n tổn thương o y h a t tia tử ngoại và một t c nhân chống ung thư

c Trong dung môi chloroform

* K t quả k ảo sát t ờ g n, tỉ lệ R/L trong quá trìn c t tách:

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích

chloroform đến khối lượng cao chiết

16 cao chi t

(gam)

0.335 0.397 0.443 0.437 0.448 6

0.376 0.445 0.484 0.488 0.491 8 0.381 0.449 0.486 0.492 0.492 10

 N ận xét: T bảng 3.10 và hình 3.6 ta thấy khi tăng d n th t ch

dung môi và thời gian chi t, khối lượng cao chi t thu được cũng tăng

d n Khối lượng cao chi t khi chi t trong thời gian 8, 10 ngày cao hơn đ ng k so với trong thời gian 4, 6 ngày; đồng thời ở c c tỉ lệ R/L cũng tăng lên Ở tỉ lệ 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150 ml dung môi chloroform trong thời gian 8 ngày, khối lượng cao chi t thu được là 0.484g nhỏ hơn so với khối lượng cao chi t ở tỉ lệ 10g mẫu/ 175ml là 0.488g và cao hơn khối lượng cao chi t ở tỉ lệ 10g mẫu/ 125ml là 0.376g, đồng thời cũng nhỏ hơn c ng tỉ lệ trong thời gian

10 ngày nhưng không đ ng k Vậy tỉ lệ R/L th ch hợp là 10g mẫu hạt quả cam thảo dây/ 150 ml dung môi chloroform trong thời gian 8

2(1H)pyridone,3-C14H14N2O

17

 Nhận xét:

T k t quả ở bảng 3.11 cho thấy phương ph p GC-MS đã định danh được 17 cấu tử trong dịch chi t chloroform t hạt cam thảo dây

C c chất h u cơ chi m hàm lượng cao nhất là c c phytosterol

và ester như: stigmasterol (19.63%), β-sitosterol (7.65%), adipic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (30.66%) và 3-β-myristoylolean-12-en-16-β-ol (25.53%) Hàm lượng c c phytosterol acid này trong dịch chi t chloroform thấp hơn khi so s nh với dịch chi t etyl acetat; còn

dimethylethyl)-5-oxo-1,3-C12H21NO4

9 17.81 1.06 Palmitic acid, ethyl ester C18H36O2

10 17.99 0.41

4-(1-cyanoethyl)-1,2,3,4-naphthalenecarbonitrile

tetrahydro-1-C14H14N2

11 18.87 0.67 Methyl

(10E)-10-octadecenoete

C19H36O2

12 19.47 1.61 Ethyl oleate C20H38O2

13 20.87 0.77 Hexadecanedioic acid C16H30O4

14 21.37 30.66 Adipic acid,