Nghiên cứu thành phần của chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím

Nghiên cứu chiết tách, xác ñịnh thành phần hóa học các chất có trong hợp chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím.. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hàm lượng anthocyanin chiết từ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Công trình ñược hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: TS HUỲNH THỊ KIM CÚC

Phản biện 1: PGS.TS LÊ TỰ HẢI

Phản biện 2: TS TRỊNH ĐÌNH CHÍNH

Luận văn ñược bảo vệ tại Hội ñồng bảo vệ chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 20 tháng 09 năm 2011

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm thông tin - Học liệu - Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Sư Phạm,Đại học Đà Nẵng

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Anthocyanin là hợp chất màu thiên nhiên, thuộc nhóm flavonoid, có màu từ ñỏ ñến tím có nhiều trong rau quả như bắp cải tím, trà ñỏ, quả dâu tằm, vỏ nho, khoai lang tím, ñậu ñen, dâu tây ñỏ Anthocyanin là thành phần chính trong việc tạo ra màu sắc ñẹp cho các loại hoa quả trong thiên nhiên mà các loại hợp chất màu tổng hợp không thể thay thế Anthocyanin không những có tác dụng giảm nguy cơ ung thư, kìm hãm sự phát triển của các tế bào gây ung thư

mà còn có khả năng chống oxi hóa cao, chống viêm, chống lão hóa

và tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể [37]

Anthocyanin cũng ñược các nhà nghiên cứu bước ñầu xác ñịnh

có chứa một lượng trong khoai lang tím [1] Các thành phần có trong khoai lang rất tốt ñối với sức khỏe của con người [46] Đây cũng là một thành phần quan trọng cần ñược nghiên cứu chọn ñiều kiện nhằm ứng dụng chất màu tự nhiên vào một số sản phẩm thực phẩm Bên cạnh ñó, hiện nay việc sử dụng tràn lan, không kiểm soát các loại phẩm màu tổng hợp không an toàn trong thực phẩm ở nước

ta ñang gây tâm lý hoang man, không tin tưởng ở người tiêu dùng và gây ảnh hưởng xấu, lâu dài ñối với sức khỏe con người, ñang là vấn

ñề ñược quan tâm hàng ñầu trong vệ sinh an toàn thực phẩm Do ñó, việc xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin có nguồn gốc tự nhiên, một số ñặc tính của chúng và các ứng dụng chất màu trong thực phẩm là một vấn ñề cần ñược quan tâm và cấp thiết

Vì lý do trên tác giả luận văn chọn ñề tài “Nghiên cứu thành

ph ần của chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím”

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu chiết tách, xác ñịnh thành phần hóa học các chất

có trong hợp chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác ñịnh một số chỉ số vật lý có trong nguyên liệu như: ñộ ẩm, hàm lượng kim loại

- Nghiên cứu xác ñịnh hàm lượng anthocyanin có trong khoai lang tím

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hàm lượng anthocyanin chiết từ khoai lang tím như xử lý nguyên liệu, tỉ lệ hệ dung môi, nhiệt ñộ và thời gian chiết tách

- Nghiên cứu quy trình chiết tách quy mô phòng thí nghiệm ñể thu nhận hợp chất màu anthocyanin từ khoai lang tím

- Nghiên cứu xác ñịnh thành phần, cấu tạo các chất có trong hợp chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím

- Khảo sát một số ñặc tính của chất màu anthocyanin: ñộ bền màu, hoạt tính kháng oxi hóa, kháng vi sinh vật

- Thử nghiệm ứng dụng chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím trong pha chế nước giải khát

4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Khoai lang tím ñược mua tại chợ Hàn, Thành Phố Đà Nẵng

5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

5.1 Nghiên cứu lí thuyết

5.2 Ph ương pháp thực nghiệm

- Xác ñịnh ñộ ẩm bằng phương pháp trọng lượng

- Xác ñịnh hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ

hấp thụ nguyên tử

- Phân tích, xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím bằng phương pháp sắc ký lỏng – phổ khối liên hợp (LC-MS)

- Xác ñịnh hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai

- Xác ñịnh ñộ bền màu của anthocyanin: là phần trăm màu còn lại, là tỷ số giữa ñộ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực ñại (λmax)so với ban ñầu

- Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp của Shela G., Olga, M B., Elena, K và cs (2003)

- Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ñược thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện ñại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và

ra hướng ứng dụng chất màu tự nhiên trong thực tiễn

7 C ẤU TRÚC LUẬN VĂN

Ngoài phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham khảo và phụ lục trong luận văn bao gồm các chương như sau:

- Chương 1: Tổng quan lý thuyết

- Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ KHOAI LANG

1.1.1 Phân loại khoa học

1.1.2 Thực trạng phân bố, thu hoạch

1.1.3 Công dụng của khoai lang

có một số nguyên tắc chung như sau:

- Flavonoid ở hầu hết các bộ phận của cây: rễ, lá, hoa, quả, hạt…Tiến hành sấy khô, tán bột Cần chú ý các enzyme có thể thủy phân glucoside vì vậy nếu muốn chiết dạng glucoside thì ổn ñịnh nguyên liệu tươi trước khi sấy bằng cách nhúng vào cồn hoặc nước ñun sôi

- Đối với isoflavon, flavanon, ñihydroflavonol, flavol và flavonol có nhiều nhóm metoxy, ít nhóm hydroxy ñều là những chất phân cực yếu, ñể chiết chúng dùng các dung môi phân cực yếu như: benzene, clorofoc, etylacetat

- Các flavon và flavonol có nhiều nhóm hydroxyl, có thể chiết chúng bằng cồn, nước hoặc hỗn hợp Chiết bằng nước nóng áp dụng

tốt ñối với cả polyglucoside và các anthocyanin Đối với anthocyanin thì cho thêm một lượng nhỏ dung dịch HCl vào nước chiết nóng dưới dạng clorua vì chúng khá bền với nhiệt ñộ

Sau khi dùng dung môi ñể tách, ta thu ñược dịch chiết mà thành phần chính là flavonoid và các thành phần khác Để loại bỏ các tạp chất và làm giàu hợp chất màu thì tiến hành tách sơ bộ và tách phân ñoạn như sau:

- Dùng dung môi có ñộ phân cực khác nhau, không hòa lẫn ñể tách phân ñoạn

- Dùng chì ñể kết tủa flavonoid bằng cách hòa tan hỗn hợp vào cồn loãng, cho dung dịch acetat chì vào ñể kết tủa hết flavonoid, lọc, cho kết tủa này vào cồn loãng khuấy ñều sau ñó cho vào trong dung dịch Natri photphat hoặc natri sunfat, natrisufit ñể kết tủa chì

- Dùng than hoạt tính cho vào dung dịch ñể hấp thụ flavonoid Sau ñó rửa than bằng dung môi ñể thu lại flavonoid Có thể dùng dung môi lần lượt có ñọ phân cực từ yếu ñến mạnh ñể tách phân ñoạn

- Tách bằng sắc ký cột: thường dùng các chất hấp phụ là silicagel G, bột polyamid thường hoạt hoá ở 12000C trong một hoặc hai giờ

1.2.2 Anthocyanin trong thiên nhiên

1.2.3 Cấu trúc và ñặc tính của anthocyanin

1.2.3.2 Tính chất quang phổ của anthocyanin

1.2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến ñộ bền màu anthocyanin

1.3 ỨNG DỤNG CỦA ANTHOCYANIN

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

Khoai lang tím ñược mua tại chợ Hàn –Thành Phố Đà Nẵng

Tên khoa học: Ipomoea batatas

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.3.3 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng kim loại

Dùng phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử ñể xác ñịnh hàm lượng kim loại: Hg, Pb, As, Cd, Cu, Zn, Sb có trong khoai lang tím

2.3.4 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng anthocyanin

Sử dụng phương pháp pH vi sai (the pH diffrential method)

2.3.5 Phương pháp xác ñịnh thành phần, cấu tạo một số chất

chính trong hợp chất màu anthocyanin

Để xác ñịnh thành phần, cấu tạo các chất có trong hợp chất màu anthocyanin ta sử dụng phương pháp phổ khối lượng viết tắt là

MS (Mass Spectrometry)

2.3.6 Phương pháp xác ñịnh ñộ màu anthocyanin

Độ màu anthocyanin ñược tính theo công thức

% màu còn lại =

0

D D

.100%

Trong ñó: + D: ñộ hấp thụ của mẫu ở λmax tại thời ñiểm ño + D0: ñộ hấp thụ của mẫu ở λmax lúc ban ñầu

2.3.7 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính chống oxy hóa

Phương pháp ñược tiến hành theo phương pháp dựa trên nguyên tắc:

Sử dụng phương pháp thử nghiệm trên phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate), tại Phòng sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

2.3.8 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm

ñịnh

Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật dựa trên nguyên tắc:

hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ñể ñánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết ñược tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp hiện ñại của Vander Bergher và Vlietlinck

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA KHOAI LANG TÍM 3.1.1 Xác ñịnh ñộ ẩm của khoai lang tím

Độ ẩm trung b.ình của khoai lang tím tươi là 79,579%

3.1.2 Xác ñịnh hàm lượng kim loại

Khoai lang tím ñược ñem ñi xác ñịnh hàm lượng kim loại:

Hg, Pb, As, Cd, Cu, Zn, Sb… bằng các phương pháp AOAC

Kết quả trình bày ở bảng 3.2

3.1.3 Xác ñịnh hàm lượng anthocyanin

3.1.3.1 Xác ñịnh bước sóng cực ñại của anthocyanin

Anthocyanin chiết từ khoai lang tím có bước sóng hấp thụ

cực ñại là 529nm như hình 3.2

Hình 3.2 Phổ hấp thụ của dung dịch

3.1.3.2 Xác ñịnh hàm lượng anthocyanin trong khoai lang tím

Kết quả xác ñịnh hàm lượng anthocyanin trong khoai lang tím ñược trình bày như bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả ñộ hấp thụ và hàm lượng anthocyanin

3.2 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH

ANTHOCYANIN TỪ KHOAI LANG TÍM

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu ñến

hàm lượng anthocyanin

Kết quả hàm lượng ñược trình bày ở bảng 3.4 và 3.5

Bảng 3.4 Hàm lượng anthocyanin thu ñược từ nguyên liệu

Nhận xét: Từ bảng 3.4 và 3.5 ta thấy ñối với nguyên liệu cắt lát thì thể tích dịch chiết (182,33ml) nhiều hơn so với nguyên liệu ñược xay nhỏ (174,33ml) Nhưng hàm lượng anthocyanin thu ñược

từ nguyên liệu xay nhỏ (88,08mg/100g nguyên liệu) cao hơn so với nguyên liệu cắt lát (78,73mg/100g nguyên liệu) Điều này có thể ñược giải thích khi tiến hành chiết tách thì trong nguyên liệu cắt lát lượng tinh bột có trong khoai lang tím ít bị hòa tan vào trong dung môi, còn trong nguyên liệu xay nhỏ thì lượng tinh bột bị hòa trong dung môi nhiều hơn nên sẽ làm cho thể tích chiết bị giảm Nhưng khi xay nhỏ nguyên liệu thì sự thấm hút dung môi vào nguyên liệu nhiều hơn nên hàm lượng anthocyanin ñược chiết tách ra nhiều hơn Như vậy, trong cùng ñiều kiện chiết tách thì ta thấy ở nguyên liệu xay cho hàm lượng anthocyanin cao hơn

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ hệ dung môi ñến hàm lượng anthocyanin

Kết quả hàm lượng anthocyanin tại các tỉ lệ hệ dung môi ñược trình bày ở bảng 3.6 và trên ñồ thị 3.4

Bảng 3.6 Kết quả hàm lượng anthocyanin theo tỉ lệ hệ dung môi

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết ñến hàm lượng anthocyanin

Kết quả ño ñộ hấp thụ và hàm lượng anthocyanin theo thời gian ñược trình bày ở bảng 3.7

64.0

77.6 79.3

82.9 89.7 89.0 87.3

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của

tỉ lệ hệ dung môi ñến hàm lượng anthocyanin

Bảng 3.7 Kết quả hàm lượng anthocyanin theo thời gian ngâm chiết

Dựa vào kết quả thực nghiệm biểu diễn trên ñồ thị, ta thấy hàm

lượng anthocyanin tăng dần trong khoảng thời gian từ 30 phút ñến 50 phút và ñạt giá trị lớn nhất ở thời gian 50 phút (102,31 mg/100g) và

sau ñó thì hàm lượng chiết anthocyanin giảm dần

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ chiết tách ñến hàm lượng anthocyanin

Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng anthocyanin ở các nhiệt ñộ

50 60 70 80 90 100

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của

nhiệt ñộ ñến hàm lượng chiết tách anthocyanin

Nhận xét: Từ đồ thị 3.6, ta thấy hàm lượng anthocyanin tăng dần trong khoảng nhiệt độ từ 300C đến 400C và đạt giá trị lớn nhất ở nhiệt độ 400 (92,16mg/100g), sau đĩ giảm dần ở 500C So sánh với các kết quả đã cơng bố, khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng anthocyanin đã khẳng định: Khi chiết tách anthocyanin từ quả dâu và bắp cải tím thì hàm lượng anthocyanin cao nhất tại nhiệt

Bước đầu cĩ thể dự đốn các cấu tử cĩ thời gian lưu là 1,36; 2,36; 2,52 tương ứng với các m/z là 306,6; 594,6; 448,9 là Muối

clorua của pelargonidin, Cyanidin-3-O-p-coumarylglucoside, Cyanidin-3-O-glucoside, ñây là các chất phổ biến có trong hợp chất anthocyanin

3.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHẤT MÀU ANTHOCYANIN

3.4.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến ñộ bền màu anthocyanin

3.4.1.1 Ảnh hưởng của pH

Kết quả ño ñộ hấp thụ ABs tại bước sóng 529nm và bước sóng cực ñại tại các pH khác nhau ñược trình bày ở bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả ño giá trị λ max , ñộ hấp thụ và % ABs còn lại theo pH

Nhận xét: Từ kết quả biểu diễn trên ñồ thị 3.12 ta thấy khi

pH tăng từ 1,0 ñến 6,0 thì cường ñộ màu (% ABs còn lại) giảm mạnh, ñạt thấp nhất khi pH= 6,0 (37,66%), sau ñó cường ñộ màu lại

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự thay ñổi của cường ñộ màu

(%ABs còn lại) theo pH

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự thay ñổi của bước

sóng hấp thụ cực ñại (λ max ) theo pH

tăng khi pH tăng từ 7,0 ñến 9,0 Trên ñồ thị hình 3.13 khi pH thay ñổi từ 1,0 ñến 7,0 thì λmax tăng chậm (từ 529nm ñến 545nm) sau ñó tăng nhanh trong môi trường kiềm yếu (λmax ñạt 570nm tại pH = 9)

3.4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

* Ở nhiệt ñộ 900C

Kết quả phần trăm màu còn lại ở nhiệt ñộ 900C ñược trình bày ở bảng 3.10

Bảng 3.10 Giá trị % màu còn lại sau thời gian 90 phút tại nhiệt ñộ 90 0 C

Thời gian

D

% màu còn lại

% màu còn lại

% màu còn lại (% D5)

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn phần trăm màu còn lại theo

thời gian ở nhiệt ñộ 900C

* Ở nhiệt ñộ 300C

Kết quả phần trăm màu còn lại ở 300C ñược trình bày ở bảng 3.11

Bảng 3.11 Giá trị phần trăm màu còn lại sau 30 ngày tại

D

% màu còn lại (% D3)

D

% màu còn lại (% D5) Ban ñầu 1,164 100 0,865 100 0,651 100

10 ngày 1,132 97,25 0,743 85,9 0,45 69,12

20 ngày 1,12 96,22 0,705 81,5 0,400 61,44

30 ngày 1,09 93,64 0,68 78,61 0,33 50,69 Mối quan hệ giữa phần trăm màu còn lại theo thời gian ở 300C ñược biểu diễn bằng ñồ thị hình 3.15

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn phần trăm màu còn lại theo thời gian ở

nhiệt ñộ 30 0 C

- Tại pH = 3,0: màu anthocyanin tương ñối bền Ở nhiệt ñộ

900C, sau thời gian 90 phút phần trăm màu còn lại là 71,73% Ở nhiệt ñộ 300C, sau thời gian 30 ngày phần trăm màu còn lại là 78,61%

- Tại pH = 5,0 màu anthocyanin giảm mạnh ở cả hai mức nhiệt

ñộ khảo sát Ở nhiệt ñộ 900

C, sau thời gian 90 phút phần trăm màu còn lại là 47,71% Ở nhiệt ñộ 300C, sau thời gian 30 ngày phần trăm màu còn lại là 50,69%

3.4.3 Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất màu anthocyanin

3.4.3.1 Hoạt tính kháng oxi hóa

Kết quả xác ñịnh hoạt tính kháng oxi hóa ñược trình bày ở bảng 3.12

Hình 3.16 Sơ ñồ quy trình pha chế nước giải khát

3.5.2 Khảo sát ñộ bền màu của sản phẩm trong thời gian bảo quản

Để theo dõi ñộ bền màu của sản phẩm nước giải khát, chúng tôi tiến hành giữ mẫu trong tủ ấm ở 300C, cứ 10 ngày ño ñộ hấp thụ 1 lần tại bước sóng 529 nm, theo dõi trong 50 ngày Kết quả trình bày trên bảng 3.14:

Bảng 3.14 Giá trị phần trăm màu còn lại sau 50 ngày

Thời gian D % D còn lại

Từ kết quả trên ñồ thị hình 3.17 chúng tôi nhận thấy: trong thời gian ñầu bảo quản màu anthocyanin giảm nhiều, nhưng càng về sau mức ñộ giảm màu ít dần, màu ổn ñịnh hơn Lúc này, sản phẩm vẫn giữ ñược màu ñỏ ñẹp của anthocyanin [1]

Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian

ñến ñộ bền màu của nước giải khát