Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen độc tố không chịu nhiệt và độc tố chịu nhiệt, tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh do e coli ở lợn

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GENE TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VẬT CHỦ .... KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các

số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thùy Nhung

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS

TS Đinh Thị Bích Lân, Nguyên Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị, cũng như kinh phí để giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin - Viện Công nghệ sinh học và đặc biệt là Th.S Đặng Thanh Long, Th.S Lê Quốc Việt, đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm chuyên môn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc chuyên ngành Thú Y – Khoa Chăn nuôi Thú y, các thầy cô giáo của Phòng đào tạo sau đại học, Trường Đại học Nông Lâm Huế cùng với Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – Đại học Huế đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi học tập cũng như hoàn thành đề tài nghiên cứu

Công trình này được hoàn thành với kinh phí từ đề tài cấp Đại học Huế do BSTY Lê Công Thịnh – Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin - Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế làm chủ nhiệm: “Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen độc tố không chịu nhiệt và độc tố chịu nhiệt, tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng

bệnh do E coli ở lợn” Mã số: DHH2016-15-05

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân và bạn bè

đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Huế, ngày 20 tháng 05 năm 2016

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thùy Nhung

TÓM TẮT

Tiêu chảy là một bệnh gây thiệt hại kinh tế không nhỏ cho ngành chăn nuôi, đặc

biệt là trong chăn nuôi lợn Trong các nguyên nhân gây nên tiêu chảy ở lợn, vi khuẩn E coli với các yếu tố độc lực của nó đóng vai trò vô cùng lớn Độc tố LTa là một độc tố đường ruột do E coli tiết ra, có tác dụng kích thích lớp niêm mạc bên dưới biểu mô

ruột tiết ion Cl vượt quá mức bình thường và ngăn cản sự hấp thu NaCl, kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy Nghiên cứu phân lập

gen eltA , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn

kháng nguyên tái tổ hợp LTa, là cơ sở cho việc sản xuất và ứng dụng trong việc phòng

trừ bệnh tiêu chảy do E coli gây ra ở lợn con sau cai sữa Trong nghiên cứu này, đoạn gen eltA mã hóa cho kháng nguyên LTa được tạo dòng vào plasmid pGEM®-T easy và

biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli TOP10 Thể biến nạp được sàng lọc trên thạch đĩa

LB+Ampicilin+IPTG+Xgal Những khuẩn lạc có màu trắng chứng tỏ phản ứng gắn tạo dòng đã thành công, đoạn gene mong muốn đã được chèn vào vector tạo dòng, những khuẩn lạc màu xanh là âm tính Tách chiết plasmid từ các dòng khuẩn lạc dương tính,

chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu của gene eltA và cặp mồi M13 (được thiết kế sẵn trên

vector pGEM®-T easy) Tiến hành giải trình tự nucleotid và trình tự amino acid, so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng Gene Tinh sạch ADN từ gel agarose 1%

(từ sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gene eltA) ADN tinh sạch được gắn vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO và biến nạp vào vi khuẩn E coli BL21(DE3) Tìm điều

kiện tối ưu về môi trường nuôi cấy, mật độ tế bào ban đầu, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ

IPTG, thời gian biểu hiện trong biểu hiện etlA Sản phẩm của biểu hiện này được kiểm

chứng bằng điện di biến tính trên gel polyacrylamid (SDS - PAGE) Kết quả: đã tạo

dòng thành công gene eltA trong vi khuẩn E coli TOP10, chứng minh được sự biểu hiện gen eltA bằng phương pháp SDS - PAGE; Tìm được các điều kiện tối ưu trong biểu hiện eltA: môi trường nuôi cấy YJ; mật độ tế bào ban đầu OD600 0,8; nhiệt độ nuôi cấy 250C; nồng độ IPTG là 0,8 mM; thời gian nuôi cấy 6 giờ

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1) Ý nghĩa khoa học: 2

2) Ý nghĩa thực tiễn: 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI 3

1.1.1 Hình thái 3

1.1.2 Đặc tính nuôi cấy 3

1.1.3 Đặc tính sinh hóa 4

1.1.4 Phân loại 4

1.1.5 Sức đề kháng 4

1.1.6 Các yếu tố độc lực cơ bản của E coli 5

1.1.7 Vai trò của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 17

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ GENE ĐỘC TỐ LT CỦA VI KHUẨN E COLI 17

1.2.1 Những nghiên cứu ở trong nước 17

1.2.2 Những nghiên cứu trên thế giới 18

1.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E COLI 19

1.3.1 Chủng E coli TOP10 22

1.3.2 Chủng E coli BL21 (DE3) 22

1.3.3 Hệ thống vector tạo dòng pGEM®-T easy 23

1.3.4 Hệ thống vector biểu hiện pET 25

1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GENE TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VẬT CHỦ 27

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 29

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 29

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.3.1 Thu thập mẫu phân lợn tiêu chảy 29

2.3.2 Tách chiết ADN tổng số 30

2.3.3 Phân lập gene eltA bằng phản ứng PCR 30

2.3.4 Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gene 32

2.3.5 Biểu hiện gen trong vector pET200/D-TOPO 34

2.3.6 Điện di SDS- PAGE 35

2.3.7 Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp 36

2.3.8 Nghiên cứu Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp 36

2.3.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng biểu hiện của kháng nguyên LTa 38

2.3.10 Phương pháp sắc ký lọc gel bằng cột Ni-NTA 39

2.3.11 Xử lí thống kê 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ VI KHUẨN E COLI 40

3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE eltA BẰNG PHẢN ỨNG PCR 40

3.3 KẾT QUẢ TẠO DÒNG GENE eltA VÀO VECTOR PGEM®-T EASY VÀ BIẾN NẠP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ E COLI TOP10 41

3.4 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE eltA 43

3.5 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GENE eltA MÃ HÓA TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ

HỢP LTa TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E COLI BL21 (DE3) 45

3.6 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG E COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP 47

3.7 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG E COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP 48

3.7.1 Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau 48

3.7.2 Ảnh hưởng của các tỷ lệ tiếp giống khác nhau 49

3.7.3 Ảnh hưởng của các tốc độ lắc khác nhau 49

3.8 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG CHỦNG E COLI BL21(DE3) 51

3.8.1 Kết quả thăm dò thời gian cảm ứng tối ưu 51

3.8.2 Kết quả thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu 51

3.8.3 Kết quả thăm dò thành phần các môi trường tối ưu 52

3.8.4 Kết quả thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu 53

3.8.5 Kết quả thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µl Microliter

6xHis Homooligohistidine

APS Ammonium persulphate

Bp Cặp bazơ (Base pair)

BSA Bovine serum albumin

DAEC E coli bám dính phân tán (Diffusely adherent Escherichia coli)

AND Deoxyribonucleic acid

Dntp Deoxyribonucleotid

EAEC E coli đường ruột (Enteroaggregative Escherichia coli)

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid

EHEC E coli gây xuất huyết ruột (Enterohaemorrhagic Escherichia coli)

EIEC E coli xâm nhập ruột (Enteroinvasive Escherichia coli)

EPEC E coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic Escherichia coli)

ETEC E coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic Escherichia coli)

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid

kDa Kilo Dalton

LB Luria-Broth

LT Độc tố không chịu nhiệt (Labile toxin)

MAEC E coli gây viêm màng não (Meningitidis-associated Escherichia coli)

Ml Milliliter

mM Millimol

OD Mật độ quang (Optical density)

PCR Chuỗi phản ứng trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SOB Super Optimal Broth

SOC Super Optimal broth

ST Độc tố chịu nhiệt (Stabile toxin)

TNE Tris HCL-NaCl-EDTA

UPEC E coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu (Uropathogenic Escherichia coli)

VT Độc tố gây độc tế bào Vero (Verocytocin)

YJ Yang Jijian

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh hệ thống tế bào vật chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp 20

Bảng 1.2 Thành phần chính của plasmid pGEM®-T easy 25

Bảng 2.1 Trình tự nucleotid của cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA 31

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR phân lập gene eltA của E coli 31

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn 33

Bảng 2.4 Công thức gel polyacrylamide 15% 35

Bảng 3.1 Sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các môi trường khác nhau 48

Bảng 3.2 Sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau 49

Bảng 3.3 Sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các tốc độ lắc khác nhau 50

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 E coli 3

Hình 1.2 Cấu trúc của độc tố LT 6

Hình 1.3 Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT 7

Hình 1.4 Cấu trúc bậc 1 của độc tố ST 8

Hình 1.5 Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STa 9

Hình 1.6 Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STb 10

Hình 1.7 Cấu trúc bậc 1 của độc tố EAST1 11

Hình 1.8 Cơ chế tác động của độc tố VT 13

Hình 1.9 Cấu trúc kháng nguyên O 14

Hình 1.10 Cơ chế biểu hiện của hệ thông pET trong tế bào E coli BL21 (DE3) 22

Hình 1.11 Trình tự và cấu trúc vector pGEM®-T easy 24

Hình 1.12 Cấu trúc Vector pET200/D-TOPO 26

Hình 1.13 Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel 26

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 31

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm về khả năng sinh trưởng của E coli tái tổ hợp 37

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu sự biểu hiện của các kháng nguyên LTa 38

Hình 2.4 Sơ đồ Tinh chế protein dung hợp với thể 6xHis trên hệ thống cột sắc ký ái lực Ni-NTA 39

Hình 3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn E coli 40

Hình 3.2 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA trên gel agarose 1% 40

Hình 3.3 Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc 41

Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ các dòng dương tính và kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA từ khuôn mẫu ADN plasmid tái tổ hợp thu được trên gel agarose 1% 42

Hình 3.5 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên gel agarose 1% 43

Hình 3.6 Mức độ tương đồng giữa gene eltA do nhóm đề tài phân lập với gene eltAđã được công bố (K01995.1 ) 44

Hình 3.7 Mức độ tương đồng của trình tự amino acid của kháng nguyên LTado nhóm

đề tài phân lập và kháng nguyên LTa đã được công bố (AEE59980.1) 45 Hình 3.8 Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc LB đặc + kanamycin 100 µg/ml 46 Hình 3.9 Ảnh điện di thăm dò khả năng biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp LTa và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ trên gel SDS – PAGE 15% 47

Hình 3.10 Đường cong sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3)mang gene mã hóa kháng nguyên LTa 47 Hình 3.11 Ảnh điện di thăm dò thời gian cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15% 51 Hình 3.12 Ảnh điện di thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15% 52 Hình 3.13 Ảnh điện di thăm dò thành phần các môi trường tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15% 53 Hình 3.14 Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15% 54 Hình 3.15 Ảnh điện di thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15% 55

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Tiêu chảy ở lợn con luôn là mối lo đối với người chăn nuôi, không những làm giảm tăng trọng, giảm tỉ lệ nuôi sống, mà còn dễ dàng làm xuất hiện các bệnh kế phát

và làm giảm hiệu quả kinh tế Bệnh do nhiều nguyên nhân gây ra, trong đó vai trò của

E coli là quan trọng nhất, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn đường ruột gây

tiêu chảy (Đào Trọng Đạt và cs, 1996)

Vi khuẩn E coli gây bệnh thông qua các yếu tố độc lực mà bản thân chúng có Phần lớn các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh đường ruột (ETEC) được phân lập từ

lợn tiêu chảy có khả năng sản sinh một hoặc nhiều yếu tố bám dính bám vào thụ thể trên bề mặt biểu mô ruột như F4, F5, F6, F18 và F41; và một hay nhiều độc tố ruột (enterotoxin), bao gồm độc tố chịu nhiệt (STa, STb, EAST1) và độc tố không chịu nhiệt (LT) (Gyles and Faibrother, 2010)

Độc tố không chịu nhiệt ( Labile toxin) là một protein có tính kháng nguyên cao, quyết định tới khả năng gây tiêu chảy của ETEC LT do một plasmid mã hóa, có liên quan đến độc tố tả (CT) (Guidry và cs, 1997)

LT bao gồm một tiểu đơn vị A có khối lượng 25 kDa và 5 tiểu đơn vị B, mỗi đơn vị có khối lượng 11,5 kDa Sau khi phần B giúp độc tố bám vào tế bào biểu mô ruột thì phần A được đẩy vào bên trong tế bào, làm hoạt hóa enzyme adenylate cyclase Khi enzyme adenylate cyclase hoạt hóa thì AMPc vòng nội bào tăng lên dẫn đến ức chế hấp thu Na+ ở tế bào niêm mạc ruột, tăng bài tiết Cl- vào lòng ruột, làm cho áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng nhanh Hậu quả là một lượng lớn nước từ trong tế bào được kéo ra ngoài lòng ruột để cân bằng áp lực thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào, gây tiêu chảy (Giannella và cs, 1974)

Trong thực tế hiện nay, việc phòng trị tiêu chảy do E coli chủ yếu dựa vào

thuốc kháng sinh, liệu pháp này đang bộc lộ những hạn chế như hiện tượng đề kháng kháng sinh và có thể ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Nghiên cứu tìm kiếm một

chế phẩm sinh học trong chẩn đoán và phòng trị tiêu chảy trên lợn do E coli là hết sức

cần thiết

Xuất phát từ tình hình đó, tôi tiến hành đê tài: "Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LTa của E coli trong tế bào vi khuẩn E coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện"

Đây là bước quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích sản xuất kháng

thể đặc hiệu để phục vụ trong công tác phòng tránh dịch bệnh tiêu chảy do E coli gây ra

ở lợn

2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu phân lập gene eltA , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích

hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp LTa, làm cơ sở cho việc sản xuất

và ứng dụng kháng thể đặc hiệu trong việc phòng trừ bệnh tiêu chảy do E coli gây ra ở

lợn con sau cai sữa

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1) Ý nghĩa khoa học:

Trong những năm gần đây, kháng nguyên tái tổ hợp đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng ở một số nước trên thế giới, nhưng ở Việt Nam hầu như có rất ít nghiên cứu được thực hiện Kết quả nghiên cứu sẽ giúp chúng ta có thể chủ động sản xuất một lượng lớn protein kháng nguyên tái tổ hợp LTa theo mong muốn tạo nguồn nguyên liệu cho nhiều hướng ứng dụng khác nhau

2) Ý nghĩa thực tiễn:

- Nội dung nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta tiếp cận và ứng dụng được các kỹ thuật hiện đại của Công nghệ sinh học

- Các kết quả này sẽ là cơ sở cho phép nghiên cứu tạo các vaccine tái tổ hợp hoặc

sản xuất kit chẩn đoán để phục vụ trong công tác phòng tránh dịch bệnh tiêu chảy do E coli gây ra ở lợn

Hình 1.1 E coli (Nguồn: Internet)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

Vi khuẩn E coli được phát hiện

lần đầu tiên vào năm 1885 do nhà khoa

học người Đức Theodore Escherich

phân lập được từ phân của một bệnh

nhân nhi (Neil và cs, 1994)

1.1.1 Hình thái

Là trực khuẩn ngắn, kích thước

2 - 3 × 0,6 μm, hiếu khí và yếm khí tùy

tiện Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể

bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu Một

số chủng E coli có khả năng di động

do có lông ở xung quanh thân (Nguyễn

Như Thanh và cs, 1997)

1.1.2 Đặc tính nuôi cấy

E coli phát triển tốt trên các loại môi trường thông thường với phổ nhiệt khá

rộng ( 5-400C) và hình thành nên những khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt được với các vi khuẩn khác (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997) Ở 370C, E coli phát triển nhanh,

khoảng cách thế hệ khoảng 20-30 phút

- Môi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc dạng S tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 - 3mm Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M

- Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng gây dung huyết

- Môi trường nước thịt: phát triển rất nhanh, tốt, môi trường đục đều có lắng cặn màu tro nhạt dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối

- Môi trường MacConkey: khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

- Môi trường CT-SMAC: khuẩn lạc tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, màu hồng cánh sen (lên men đường Sorbitol) hoặc màu trắng đục (không lên men đường Sorbitol)

- Môi trường Simmon citrate: khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục

- Môi trường Endo, SS: khuẩn lạc màu đỏ

- Môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím đen

1.1.3 Đặc tính sinh hóa

- Vi khuẩn E coli lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Fructose, Glucose,

Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắc chắn các loại đường Duncitol, Saccarose và Salixin

Hầu hết các chủng vi khuẩn E coli đều lên men đường Lactose nhanh và sinh hơi, đây là đặc điểm quan trọng để dựa vào đó phân biệt vi khuẩn E coli và Samonella

- Phản ứng Indol, Catalase và MR dương tính; phản ứng H2S, VP, Urea, Oxidase, Citrat âm tính

- Đặc tính khác: Vi khuẩn làm đông vón sữa sau 24 - 72 giờ nuôi cấy ở 370C; không làm tan chảy gelatin (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2012)

1.1.4 Phân loại

+ Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E coli được chia thành các type huyết thanh

Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau (Lior, 1996)

+ Dựa vào vị trí gây bệnh các E coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E coli) hay E coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E coli) (Kaper và cs, 2004)

- Các loại E coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:

 EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli): E coli gây bệnh đường ruột

 ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli): E coli sinh độc tố ruột

 EIEC (Enteroinvasive Escherichia coli): E coli xâm nhập ruột

 EAEC (Enteroaggregative Escherichia coli): E coli bám dính kết tập ruột

 DAEC (Diffusely adherent Escherichia coli): E coli bám dính phân tán

 EHEC (Enterohaemorrhagic Escherichia coli): E coli gây xuất huyết ruột

- Hai loại E coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:

 MAEC (Meningitidis-associated Escherichia coli): E coli gây viêm màng não

 UPEC (Uropathogenic Escherichia coli): E coli gây nhiễm khuẩn đường tiết

1.1.6 Các yếu tố độc lực cơ bản của E coli

1.1.6.1 Giáp mô

Bản chất hóa học là polysaccharide mang tính acid, chúng tạo ra trên bề mặt vi khuẩn điện tích âm gây nên một lực hút với lớp màng trong tế bào biểu mô ruột mang điện tích dương Hiện tượng trên giúp cho vi khuẩn bám dính, xâm nhập tế bào vật chủ một cách thuận lợi

Giáp mô còn được coi là một yếu tố bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào bằng cách ngăn trở quá trình hoạt hóa bổ thể, đặc biệt là thành phần bổ thể C3b

1.1.6.2 Thành tế bào

Lipopolysaccharide (LPS) và protein màng ngoài của E coli là các yếu tố làm

tăng độc lực của vi khuẩn Lipid A (một thành phần của LPS) kích thích tế bào đại thực bào và một số tế bào khác sản sinh các hoạt chất sinh học thuộc nhóm cytokine gây nên những biến đổi đáng kể ở cơ thể vật chủ Protein màng ngoài tế bào vi khuẩn

E coli liên quan đến khả năng đề kháng với hoạt động diệt khuẩn của huyết thanh

1.1.6.3 Yếu tố kháng khuẩn

Nhiều chủng vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn, có tác

dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV Vì vậy, yếu tố này

cũng được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E coli gây bệnh

(Smith.H.W và Halls.S, 1967)

1.1.6.4 Độc tố đường ruột (Enterotoxin)

Các chủng ETEC có khả năng sản sinh hai loại độc tố đường ruột: Độc tố không bền nhiệt (heat labile enterotoxin - LT) và độc tố bền nhiệt (heat stable enterotoxin - ST)

 Độc tố không bền nhiệt (LT)

Độc tố LT có trọng lượng phân tử cao, tác động kích thích lên niêm mạc ruột, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi nước và chất điện giải Kết quả là làm xung huyết niêm mạc ruột, tăng tính thấm thành mạch, hút nước từ mạch quản vào lòng ruột gây

ra tiêu chảy

* Cấu trúc của độc tố LT:

Độc tố LT gồm 1 tiểu đơn vị A (A-subunit) với 240 axít amin và 5 tiểu đơn vị B (B-subunit) với 103 axít amin (hình 1.2) Tiểu đơn vị A mang hoạt tính enzyme của độc tố và gồm 2 chuỗi peptide A1, peptide A2 Hai chuỗi peptide này liên kết nhau bởi cầu nối disulfide giữa A1- axit amin Cystein (Cys) 187 và A2-Cys199 Chuỗi A2 tạo thành cái móc liên kết không đồng hóa trị giữa tiểu đơn vị A và lỗ hổng giữa của vòng

5 tiểu đơn vị B Năm tiểu phân tử B trong cấu trúc của LT sắp xếp thành vòng nhẫn 5 cạnh bền vững Mỗi tiểu phân tử B có một vị trí gắn với thụ thể tiếp nhận độc tố của tế bào vật chủ (O’Bien và Holmes, 1996)

Quá trình sinh tổng hợp các tiểu phân tử của độc tố LT được thực hiện trong tế bào chất, sau đó được vận chuyển qua lớp màng trong (inner membrane) đến chu chất

và quá trình hoàn thiện độc tố được thực hiện tại đây Gene mã hóa cho tiểu đơn vị A

và B của LT là eltA và eltB nằm trên plasmid và được phiên mã thành một mRNA đơn

(O’Bien và Holmes, 1996) Sau khi quá trình sinh tổng hợp kết thúc, LT có thể được giải phóng ra môi trường bên ngoài hoặc chỉ giải phóng lên trên bề mặt tế bào vi

Đích của độc tố LT trong tế bào là enzyme Adenylate cyclase ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột (Nataro và Kaper, 1998) Do đó, sau khi chuyển đến bào tương, chuỗi peptide A1 bám lên phức hợp protein Gsαβγ Chuỗi peptide A1 có hoạt tính như enzyme ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein của liên kết GTP (GTP-binding protein) là Gsα Quá trình bám của GTP lên

Gsα làm cho Gsα tách khỏi phức hợp protein Gsβγ và gây hoạt hóa enzyme Adenylate cyclase, làm gia tăng cAMP (cyclic adenosine monophosphate) trong tế bào Vì vậy,

cAMP sẽ hoạt hóa enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh ion chloride (Cl-) ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl-

và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế bào lông nhung Hàm lượng ion Cl- trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (hình 1.3) (Nataro và Kaper, 1998)

Hình 1.3 Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT (Bloch, 2006)

Mặc dù sự kích thích của Cl- do sự gia tăng lượng cAMP trong tế bào là cách giải thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT Tuy nhiên, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với những độc tố này có cơ chế phức tạp hơn Một cơ chế tác động khác của độc tố có liên quan đến prostaglandin E (PGE1 và PGE2) và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu Sự tổng hợp và phóng thích những chất chuyển hóa của axít arachidonic như prostaglandin và leukotriene có thể kích thích sự vận chuyển các chất điện giải và kích thích nhu động ruột Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous system) điều hòa nhu động và

sự tiết ion ở ruột (Nataro và Kaper, 1998)

cs, 1983)

* Cấu trúc độc tố ST:

Độc tố STa là một peptide với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa với khoảng

18-19 axít amin Trong đó, có 6 axít amin Cystein tạo thành 3 cầu nối disulfide bên trong cấu trúc phân tử của STa là Cys6 - Cys11, Cys7 - Cys15 và Cys10 - Cys18 (hình 1.4) Đầu tận cùng carbon (14 axít amin) chính là phần mang hoạt tính của độc tố Độc

tố STa có 2 biến thể là STp phát hiện trên các chủng ETEC phân lập được trên lợn và STh phát hiện trên các chủng ETEC phân lập ở người Sự khác nhau giữa 2 biến thể chỉ xuất hiện ở đầu tận cùng N- với 4-5 axít amin (Nataro và Kaper, 1998)

Hình 1.4 Cấu trúc bậc 1 của độc tố ST (Sukumar và cs, 1995)

Tương tự độc tố STa, độc tố STb cũng là chuỗi polypeptide được sản sinh chủ yếu bởi các chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn (Nataro và Kaper, 1998) Độc tố STb gồm có 48 axít amin, trong đó có 4 axít amin Cystein tạo thành 2 cầu nối disulfide giữa Cys10 – Cys48 và Cys21 – Cys36

Gene mã hóa cho độc tố STa, STb lần lượt là estA và estB Gene estA được tìm

thấy chủ yếu trên plasmid cùng mang nhiều gene mã hóa các yếu tố độc lực khác của các chủng ETEC như yếu tố xâm nhiễm, kháng kháng sinh, sản sinh colicin (Nataro và

Kaper, 1998) Tương tự, gene estB được tìm thấy trên plasmid cùng mang nhiều yếu tố

độc lực khác như độc tố LT, STa, kháng kháng sinh, yếu tố xâm nhiễm Độc tố ST được tổng hợp trong trong tế bào chất như là tiền polypeptide Đoạn tiền peptide mang tín hiệu vận chuyển sẽ bị phân cắt khi chuỗi polypeptide vận chuyển từ tế bào chất đến periplasm thông qua hệ thống vận chuyển SecA Trong periplasm, các cầu nối disulfide của độc tố sẽ được hình thành trước khi độc tố được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn qua hệ thống TolC dưới tác động của protein DsbA (periplasmic oxidoreductase protein) (Dubreuil và Daniel, 1997)

* Cơ chế tác động của độc tố ST:

- Độc tố STa:

Sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào vi khuẩn, độc tố STa bám vào các thụ thể tiếp nhận trên lớp tế bào lông nhung biểu mô ruột là enzyme Guanylate cyclase C (GC-C) Sự kết hợp này làm tăng hoạt tính của GC-C, do đó tăng lượng cGMP (cyclic guanosine monophosphate) nội bào (hình 1.5) Sự gia tăng nồng độ cGMP làm hoạt

hóa PKGII (cGMP-dependent protein kinase II) PKGII sẽ tác động lên yếu tố điều khiển quá trình tiết và hấp thụ Cl- là CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) có mặt trên lớp màng lông nhung tế bào biểu mô ruột Kết quả sự tương tác này là kích thích sự phosphoryl hóa kênh Cl- ở màng tế bào biểu mô vượt mức bình thường làm cho lớp tế bào bên dưới tăng tiết Cl- vào trong lòng ruột và/hoặc ngăn cản

sự hấp thụ NaCl (Forte và cs, 1992) Hơn nữa, cGMP có khả năng ức chế PDE3 (phosphodiesterase 3) - đây là enzyme thủy phân cAMP Vì thế, cAMP được tích lũy trong tế bào và gây hoạt hóa enzyme protein kinase A (PKA) Cùng với tác động của PKGII, PKA cũng có tác kích thích tăng tiết Cl- vào lòng ruột Bên cạnh đấy, PKA ức chế quá trình tái hấp thụ Cl- thông qua kênh trao đổi ion NHE3 (Na+

/H+ exchanger 3) Kết quả cuối cùng của quá trình này là sự tích lũy nước trong lòng ruột và gây tiêu chảy Quá trình xâm nhập tế bào biểu mô ruột và gây tiêu chảy của STa xẩy ra rất nhanh Độc tố STa kích thích giải phóng cGMP đạt nồng độ sau 5 phút Tuy nhiên, quá trình này duy trì trong thời gian ngắn (Hitotsubashi và cs, 1992)

Hình 1.5 Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STa (Michael Field, 2003)

- Độc tố STb:

STb cũng là độc tố tác động nhanh nhưng với cấp độ vừa phải Tuy nhiên, cơ chế gây tiêu chảy của STb vẫn chưa được làm sáng tỏ Bằng phương pháp thắt nút ruột non chuột, xác định được rằng STb không làm thay đổi nồng độ của cAMP và cGMP

trên lớp tế bào biểu mô ruột (Hitotsubashi và cs, 1992) Năm 1995, Fujii và cs nhận

thấy sự gia tăng nồng độ của PGE2 trong dịch ruột chuột có liên quan đến sự có mặt của STb Hơn nữa, nồng độ PGE2 tương quan thuận với sự tích lũy chất lỏng trong lòng ruột Nồng độ axít arachidonic và axít phosphatidic cũng được kích thích tăng dưới tác động của độc tố STb (Fujii và cs, 1995)

Thử nghiệm của Dreyfus và cs cho thấy rằng khi độc tố STb bám vào các thụ

thể trên lớp tế bào lông nhung biểu mô ruột thì protein liên kết G (G-protein-linked) được giải phóng (Dreyfus và cs, 1993) Protein này sẽ hoạt hóa kênh vận chuyển Ca2+trên màng bào tương và Ca2+ được vận chuyển từ bên ngoài vào bên trong tế bào Sự gia tăng nồng độ Ca2+ trong tế bào sẽ hoạt hóa enzyme phospholipase, dẫn đến giải phóng axít arachidonic từ lớp màng lipid Axít này sẽ kích thích tế bào sản sinh PGE2

và gây tăng tiết một số ion vào lòng ruột (hình 1.6) Hơn nữa, sự gia tăng nồng độ

Ca2+ trong tế bào cũng có thể kích thích mở kênh Cl-, tăng cường tiết Cl- và HCO-3 vào lòng ruột (Wu và cs, 2008) Kết quả cuối cùng là sự tích lũy chất lỏng trong lòng ruột

và gây tiêu chảy

Hình 1.6 Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STb (Dubreuil và cs, 1997) 1.1.6.5 Độc tố EAST1

Độc tố EAST1 là peptide với trọng lượng phân tử khoảng 4,1 kDa, được sản sinh bởi các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EAEC phân lập chủ yếu ở người Tuy nhiên,

những nghiên cứu gần đây cho thấy các chủng vi khuẩn E coli thuộc nhóm ETEC

phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy cũng có khả năng sinh độc tố này EAST1 có đặc tính sinh học và cơ chế tác động tương đối giống với độc tố STa nhưng không gây miễn dịch chéo (Savarino và cs, 1991)

* Cấu trúc độc tố EAST1:

Trình tự axít amin của độc tố EAST1 được xây dựng dựa trên trình tự nucleotid

trên gene mã hóa được đặt tên là astA Độc tố EAST1 có 38 axít amin, điểm đẳng điện

pI là 9,25 và có mức tương đồng 50% về trình tự axít amin ở vị trí 6-18 với độc tố STa Có 2 biến thể của EAST1 đã được xác định là EAST1 17-2 và EAST1 0-42 Hai biến thể này chỉ khác nhau 1 axít amin tại vị trí 21 (hình 1.7) (Savarino và cs, 1993) Bốn axít amin Cystein tại các vị trí 17, 20, 24 và 27 sẽ hình thành nên hai cầu nối disulfide Axít amin Cys17 được xem là có vai trò quan trọng nhất trong quá trình thể hiện hoạt tính của độc tố

Hình 1.7 Cấu trúc bậc 1 của độc tố EAST1 (Savarino và cs, 1993)

Theo Savarino và cs, gene mã hóa độc tố EAST1 là astA gồm 117 bp, tỷ lệ G+C là 53% và không có sự tương đồng với gene estA (gene mã hóa cho độc tố STa) Gene astA thường được tìm thấy trên plasmid có khả năng liên kết 60 MDa (60-MDa

plasmid mediating aggregative adherence) Plasmid này không những được tìm thấy

trên các chủng vi khuẩn E coli thuộc nhóm EAEC mà còn tìm thấy trên các chủng

thuộc nhóm ETEC (Savarino và cs, 1993)

* Cơ chế tác động của độc tố EAST1:

Cơ chế tác động lên cơ thể vật chủ của độc tố EAST1 vẫn chưa được làm rõ Các phân tích thường cho thấy gene mã hóa cho EAST1 chủ yếu được tìm thấy ở các

chủng vi khuẩn E coli phân lập từ người và gia súc mắc bệnh tiêu chảy có kèm theo

máu Theo Nataro và Kaper, độc tố EAST1 có thể bám lên thụ thể của độc tố STa (GC-C) và kích thích tế bào chủ giải phóng cGMP (Nataro và Kaper, 1998) Một số nghiên cứu khác cho rằng cAMP và Ca++ có thể tham gia vào quá trình tác động của EAST1 Độc tố EAST1 chỉ có thể gây tiêu chảy nhẹ ở gia súc nhưng khi kết hợp cùng độc tố LT thì gia súc sẽ bị tiêu chảy nặng hơn rất nhiều (Ngeleka và cs, 2003)

1.1.6.6 Độc tố gây độc tế bào vero (VT)

Theo Konowalchuk (1977), có hai loại độc tố VT: VT1 và VT2 Độc tố VT1 rất giống độc tố của Shigella dysenteriae typ 1 về mọi phương diện, kể cả miễn dịch học Trong điều kiện in vitro, có thể dùng kháng độc tố Shiga để trung hòa VT1 Vì thế, VT1 còn được gọi là độc tố giống độc tố Shiga (SLT) Độc tố VT2 không có liên quan

gì về miễn dịch học với độc tố của Shigella dysenteriae typ 1, nhưng cũng có khả năng gây độc tế bào như VT1 Konowalchuk nhận thấy rằng một số chủng EPEC có khả năng tổng hợp độc tố VT1 và/hoặc VT2, vì những chủng này gây độc và làm biến dạng tế bào Vero đơn lớp Tuy nhiên, phát hiện này chưa được chú ý đến khi một vụ

dịch do E coli O157: H7 xảy ra ở Mỹ, và vi khuẩn này có khả năng sản sinh VT

Trình tự nucleotit của gene chịu trách nhiệm sản sinh VT1 và trình tự axit amin

đã được xác định và so sánh với gene sản sinh độc tố SLT Mặt khác, VT2 và các biến thể của nó có những đặc điểm khác biệt với VT1 Mức độ tương đồng của trình tự nucleotit và axit amin của VT2 và VT1 khoảng 55 - 60% Các loại VT2 hiện nay đã xác định được gồm có VT2, VT2vha (VT2va), VT2vhb (VT2vb), VT2vp1 (VT2e) và VT2vp2

Cấu trúc chung và cơ chế tác động của các độc tố VT giống với độc tố Shiga Mỗi độc tố có cấu trúc gồm tiểu phần A - B, 1 tiểu phần A (khoảng 33 kDa) và 5 tiểu phần B (khoảng 7,5 kDa) Tiểu phần A có hoạt tính của một enzyme, tác động ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào, gồm có dung giải protein và phá hủy liên kết disulfide Tiểu phần B có mang vị trí tiếp xúc của phân tử độc tố với một receptor glycolipid trên màng tế bào

Stein và cs (1992) đã xác định cấu trúc tinh thể của tiểu phần B của VT1 và nhận thấy nó giống với cấu trúc của tiểu phần B của độc tố LT được sản sinh bởi hầu

hết các chủng E coli VT là protein không chịu nhiệt, nhưng khả năng chịu nhiệt của

các loại VT khác nhau là khác nhau VT2e là kém chịu nhiệt nhất, nó mất hoạt tính hoàn toàn khi ở 650C trong 30 phút VT2d có khả năng chịu nhiệt cao nhất, không mất hoạt tính khi ở 750C trong 60 phút VT1 và VT2 là những độc tố có khả năng chịu nhiệt trung bình

Receptor của VT1 và VT2 là Globotriosylceramide (Gb3), của VT2e là Globotetraosylceramide (Gb4) Gb3 là phức hợp trên màng tế bào nội mạc quản cầu thận Cấu trúc và số lượng những receptor đặc hiệu ở những loài và mô khác nhau tạo nên sự khác nhau về độ mẫn cảm của tế bào, mô hoặc cơ quan đối với độc tố Tuy nhiên, nguyên nhân chính gây phá hủy thận trong bệnh tiêu chảy có liên quan đến HUS vẫn chưa được làm rõ

Vì ái lực của VT1 đối với Gb3 lớn hơn so với VT2, người ta cho rằng VT1 gắn với tế bào biểu mô ruột và gây phá hủy các tế bào này cũng như hệ thống mạch quản ở ruột, trong khi đó, VT2 có ái lực nhỏ hơn với Gb3 do đó khả năng vào được hệ thống tuần hoàn lớn hơn, theo máu đến các cơ quan, có thể gây HUS hoặc TTP

Khi độc tố được gắn với receptor, tiểu phần A sẽ xâm nhập vào trong tế bào theo cơ chế ẩm bào Sau đó, nó gây dung giải protein và phá hủy liên kết disulfide, từ đó ức chế việc tổng hợp yếu tố kéo dài chuỗi gắn với ribosome của phân tử RNA vận chuyển Do đó, về cơ bản, sự kéo dài chuỗi peptide bị ngừng lại, ức chế sự tổng hợp protein, dẫn tới giết chết tế bào đích

Hình 1.8 Cơ chế tác động của độc tố VT 1.1.6.7 Độc tố gây xuất huyết ruột (Enterohaemolysin)

Một vài chủng có khả năng gây dung huyết đã được xác định trong các nhóm E coli khác nhau Gây xuất huyết ruột là một đặc điểm điển hình của nhóm EHEC

Schmidt và cs (1995) cho biết hiện tượng xuất huyết ruột là kết quả của sự có mặt của một loại protein - đó là protein gây xuất huyết ruột EHEC (EHEC Hly - EHEC haemolysin protein) EHEC - Hly được mã hóa bởi một plasmid lớn

Khi vi khuẩn đường ruột phát triển trong tổ chức, cơ quan, hàm lượng sắt đảm bảo cho sự phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào chất Siderofordo do vi khuẩn sản sinh ra Chất này có khả năng phân huỷ sắt liên kết trong tổ chức của vật chủ thông qua Heamolyzin, chủ yếu là phân huỷ hồng cầu giải phóng ra sắt, để vi khuẩn sử dụng dưới dạng hợp chất HEM Vì vậy việc sản sinh ra Heamolyzin cũng được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn

Vi khuẩn E coli có bốn kiểu dung huyết, nhưng quan trọng nhất là kiểu α và β Trong đó kiểu β gắn với tế bào và không có vai trò độc lực Kiểu α được sản xuất và giải phóng vào môi trường nuôi cấy ở pha logarit của chu trình phát triển vi khuẩn, đây

là loại protein qua lọc và được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn

1.1.6.8 Cấu trúc kháng nguyên

Vi khuẩn E coli được chia làm các serotyp khác nhau dựa trên cấu trúc kháng

nguyên O, K, H và F Cho đến nay, có ít nhất 173 kháng nguyên O, 89 kháng nguyên

K, 56 kháng nguyên H đã được xác định (Gyles, 2004)

 Kháng nguyên O (Somatic antigene)

Kháng nguyên O còn gọi là kháng nguyên thân, bản chất là polysaccharide Polysaccharide là một thành phần của lipopolysaccharide, đây là thành phần cơ bản cấu tạo nên màng ngoài của vi khuẩn gram âm Kháng nguyên O có khả năng chịu được nhiệt độ, các chất cồn và axit HCN 1N Cấu trúc phân tử lipopolysaccharide gồm

3 phần: gồm chuỗi lipit A, một vùng lõi và chuỗi polysaccharide (kháng nguyên O) Khi làm mất dần từng đơn vị đường của các chuỗi polysaccharide hoặc làm thay đổi vị trí ở các đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn Thành phần lipit trong

kháng nguyên có tác dụng quyết định độc tính của vi khuẩn E coli

Kháng nguyên O không phải là một kháng nguyên đơn (single antigen) mà gồm một số thành phần và thường được gọi là nhóm kháng nguyên O Các nhóm kháng nguyên O khác nhau có thể có một vài thành phần kháng nguyên chung, và do đó có thể gây phản ứng chéo giữa các nhóm

Hình 1.9 Cấu trúc kháng nguyên O (Muhammad and Sangdun, 2014)

Gal, galactose; GalNac, N-acetyl-galactosamine; Glc, glucose; GlcN, glucosamine; Hep, l-glycero-d-mannoheptose; Kdo, 3-deoxy-d-manno-2-octulonic

acid; Man, mannose; NAG, N-acetyl-glucosamine

 Kháng nguyên K (Capsular antigen)

Kháng nguyên K còn được gọi là kháng nguyên vỏ bọc, chúng bao quanh tế bào

vi khuẩn và có bản chất hóa học là Polysaccharide Thông thường, kháng nguyên K sử

dụng để định typ E coli không gây ngưng kết với kháng huyết thanh O tương ứng

Việc xác định kháng nguyên K dựa trên đặc điểm hóa học của kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide Có 3 nhóm kháng nguyên K đã được sử dụng là L, A và B ; chúng khác nhau về đặc tính kháng nguyên và khả năng kết hợp với kháng thể khi ở nhiệt độ

khác nhau Kháng nguyên K nhóm B và L vô hoạt sau khi đun ở 1000C trong 1 giờ, trong khi nhóm A sau 1 giờ nhưng ở 1210C Khả năng kết hợp với kháng thể của nhóm

B không bị mất đi sau khi đun ở 1210C trong 1 giờ, trong khi nhóm L thì bị mất sau khi ở 1000C trong 1 giờ Xác định kháng nguyên K có thể tiến hành bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính hoặc trong ống nghiệm Nhưng hiện nay, kháng nguyên K ít được sử dụng, mà thường sử dụng kháng nguyên O: H Một số nhà nghiên cứu cho rằng kháng nguyên K không có ý nghĩa về độc lực Bên cạnh đó, có công trình nghiên cứu chứng minh kháng nguyên K có ý nghĩa về độc lực vì chúng tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ và giúp gắn kết kháng nguyên bám dính vào tế bào biểu mô nhung mao ruột dễ dàng (Gyles, 2004) Kháng nguyên K có tác dụng chống lại sự thực bào, gồm cả kháng bổ thể trong huyết thanh

Nói chung, các nghiên cứu đều thống nhất về kháng nguyên K với hai chức năng sau:

+ Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết kháng nguyên O của vi khuẩn

+ Tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào cũng như các yếu tố phòng vệ khác của vật chủ

 Kháng nguyên F (Fimbriae antigen)

Theo Nataro và Kaper (1998), hầu hết các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh đều

sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính Kháng nguyên bám dính có bản chất là protein, bao phủ trên bề mặt ngoài của tế bào vi khuẩn với số lượng từ 200 - 400/ tế bào vi khuẩn, cho phép vi khuẩn có thể bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhầy niêm mạc ruột Các kháng nguyên

bám dính quan trọng của vi khuẩn E coli thuộc nhóm ETEC gây bệnh tiêu chảy ở lợn

là F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18 và F41

- F4 (K88)

F4 là một yếu tố độc lực của một số serotypes E coli gây tiêu chảy ở lợn con Kháng nguyên bám dính F4 được Orskov và cs mô tả lần đầu tiên vào năm 1961 (Orskov và cs, 1961) Năm 1966, Stirm và cs đã chiết tách kháng nguyên bám dính F4 bằng phương pháp đun canh khuẩn E coli trong 20 phút ở 680C để nghiên cứu các tính chất hóa học của kháng nguyên (Stirm và cs, 1966) Kết quả cho thấy kháng nguyên bám dính F4 có bản chất là protein Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, kháng nguyên bám dính F4 bao quanh tế bào vi khuẩn như lớp áo mỏng và có cấu trúc không

ổn định (Guinee và Jansen, 1979)

Thành phần chính của kháng nguyên F4 là tiểu phân tử FaeG F4 cho phép các

chủng E coli bám dính vào tế bào biểu mô nhung mao phần trước ruột non lơn con,

đặc biệt là vùng không tràng và hồi tràng tập trung một số lượng lớn vi khuẩn, nơi mà

trong điều kiện sinh lý bình thường, số lượng vi khuẩn E coli thấp hoặc không có mặt

- F5 (K99)

Giống như F4, F5 thực hiện chức năng bám dính vào tế bào biểu mô nhung mào ruột non Dựa vào khả năng này vi khuẩn tăng nhanh về số lượng, đủ để gây bệnh cho động vật Sau khi bám được vào tế bào ruột, giáp mô phát huy vai trò như một chất bao bọc và kết dính vi khuẩn với tế bào ruột, đảm bảo cho chúng không bị đào thải và

nhân lên nhanh chóng Yếu tố độc lực F5 thường phát hiện được ở các chủng E coli

gây tiêu chảy ở bê, nghé, dê, cừu và lợn

- F6 (987P)

F6 thực hiện chức năng bám dính lên các receptor đặc hiệu của tế bào biểu mô nhung mao ruột theo cơ chế giống như F4 và F5 Kháng nguyên bám dính F6 có cấu trúc dạng xoắn với sự sắp xếp của tiểu phân tử chủ yếu FasA và 2 tiểu phân tử thứ yếu

là FasF và FasG Trong đó, FasF và FasG nằm ở đầu ngoài cùng Tiểu phân tử FasG đóng vai trò bám dính, giúp kháng nguyên F6 bám lên các thụ thể có bản chất là glucoprotein và glucolipid trên biểu mô ruột (Shin và cs, 1994)

 Kháng nguyên H (Flagella antigen)

Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất là protein Việc xác định kháng nguyên H chỉ phù hợp khi khả trong cồn 50% và các enzyme tiêu hóa protein, không bị tác động khi xử năng di động của vi khuẩn được thể hiện tốt qua một hoặc vài lần cấy chuyển trên môi trường bán cố thể Hầu hết các kháng nguyên H đều có tính đặc hiệu cao, ít hoặc không có phản ứng chéo Các chủng không di động được ký hiệu là NM (Non motile) hoặc H-

Kháng nguyên H kém bền vững hơn so với kháng nguyên O, kém chịu nhiệt, bị phá hủy lý bằng formol 0,5%

Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt ngưng kết cũng lớn hơn, giống như những cụm bông Do vậy, vi khuẩn có khả năng di động, khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không di động

Kháng nguyên H không có vai trò về độc lực và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng tạo miễn dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định giống, loài của vi khuẩn (Gyles, 1994)

1.1.7 Vai trò của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn

Ở Việt Nam cũng như hầu hết các nước trên thế giới, hội chứng tiêu chảy gây thiệt hại đáng kể trong ngành chăn nuôi Trong chăn nuôi lợn, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi, đặc biệt là ở lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa Các tác giả trong và ngoài

nước đều nhấn mạnh đến vai trò của vi khuẩn E coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn

Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù vi khuẩn E coli có nhiều loại kháng

nguyên, trong đó có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, nhưng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ

Hồ Văn Nam và cs (1997) cho biết: Khi xét nghiệm 140 mẫu phân lợn không

bị tiêu chảy ở các lứa tuổi và 170 mẫu phân lấy từ lợn bị tiêu chảy ở lứa tuổi tương tự

thì tỷ lệ nhiễm E coli đều là 100% Nhưng có sự bội nhiễm vi khuẩn đường ruột một

cách rõ rệt Trong phân lợn không tiêu chảy số lượng vi khuẩn là 150,70 triệu/1 gam phân, nhưng khi bị tiêu chảy số lượng này đã là 196,35 triệu/1 gam phân, tăng hơn 45,65 triệu (Hồ Văn Nam và cs, 1997)

Đào Trọng Đạt và cs (1996) cho biết, khi sức đề kháng của cơ thể giảm sút E coli thường xuyên cư trú trong đường ruột của lợn thừa cơ sinh sản rất nhanh và gây

nên sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, gây tiêu chảy (Đào Trọng Đạt, 1996)

Các tác giả Hồ Soái và Đinh Thị Bích Lân (2005) đưa ra kết luận khi kiểm tra

độc lực của 5 chủng E coli phân lập từ phân lợn bị tiêu chảy như sau: Có 4 chủng giết

chết 100% và 1 chủng giết chết 50% số chuột được tiêm Các tác giả khác như Nguyễn Thị Kim Lan (2004), Bùi Trung Trực và cs (2004) cũng có kết quả thử độc lực của vi

khuẩn E coli gây chết 100% chuột thí nghiệm Các kết quả này cho thấy, các chủng E coli phân lập được từ phân lợn bị tiêu chảy có độc lực khá mạnh và là nguyên nhân

quan trọng trong hội chứng tiêu chảy của lợn

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ GENE ĐỘC TỐ LT CỦA VI KHUẨN E COLI

1.2.1 Những nghiên cứu ở trong nước

Năm 2008, Phạm Thị Thanh Yến đã triển khai kỹ thuật ELISA để phát hiện

kháng nguyên độc tố LT của các chủng E coli trong các mẫu lòng lợn và tiết canh lợn

thu thập tại một số chợ ở Hà Nội Kết quả có tới 80% mẫu có sự hiện diện của vi

khuẩn E coli (16/20), trong đó 12,5% (2/16) mẫu nhiễm có độc tố LT

Khi nghiên cứu về vai trò của E coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 1-60 ngày

tuôi, tác giả Trương Quang (2005) đã có kết luận: Tỷ lệ mang độc tố không chịu nhiệt

LT trong các mẫu phân lợn tiêu chảy là 90%, trong khi ở mẫu phân lợn không tiêu chảy là 11,11%

Cù Hữu Phú và cs (2004) nhận xét: Vi khuẩn E coli là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ; các chủng E coli có thể mang tổ hợp các yếu tố gây

bệnh như: LT+STa+STb+K88+Hly (29,29%); LT+STa+STb+Hly (8,33%)

Nghiên cứu về gene sản sinh độc tố STa, STb, LT, VT2e của các chủng vi

khuẩn E coli phân lập được trên địa bàn Thừa Thiên Huế, Nguyễn Xuân Hòa và cs

đưa ra kết quả như sau: Với mẫu bệnh phẩm là tim tỷ lệ dương tính với một trong các yếu tố độc lực là 4/6 (66,67%), bệnh phẩm ruột 3/6 (50%) và bệnh phẩm phân 20/49

(40,82%) Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gene LT cao nhất 25/61 (40,98%), kế tiếp là vi khuẩn E coli mang gene STb 18/61 (29,51%) và vi khuẩn E coli mang gene STa 9/61 (14,75%) sau cùng là vi khuẩn E coli mang gene sản sinh độc tố dung huyết VT2e

6/61(9,84%) Gene STa/STb số lượng 2/25 (chiếm tỷ lệ 8%), STa/LT 4/25 (chiểm tỷ lệ 16%), STa/VT2e số lượng 3/25 (chiếm tỷ lệ 12%) Trong tổ hợp 2 gene cao nhất là STb/LT 9/25 (chiếm tỷ lệ 36%) Tổ hợp 3 gene gồm có: STa/STb/VT2e 1/25 (chiếm tỷ

lệ 4%), STa/LT/VT2e 1/25 (chiếm tỷ lệ 4%), cao nhất là STb/LT/VT2e 2/25 (chiếm tỷ

lệ 8%) Tần suất hiện khuẩn lạc mang gene STb (0,43), LT (0,36)

Năm 2011, Trần Thị Quế cũng đã thiết kế và biểu hiện thành công protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC và sản xuất kháng thể đa dòng kháng

LT trên quy mô phòng thí nghiệm (Trần Thị Quế, 2011)

1.2.2 Những nghiên cứu trên thế giới

Khi nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của gene độc tố không

bền nhiệt LT của vi khuẩn E coli, Mundell và cs (1976) đã viết: Trong E coli chủng

H-10407, hoạt tính của độc tố LT đã giảm đi rõ rệt nếu pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đã được giảm đến pH 7,5 (pH ban đầu là 8,5) hoặc thấp hơn Lứa nuôi cấy vi khuẩn có chứa LT có thể được bảo quản ở 40C trong vài ngày không làm cho hoạt tính của độc tố bị hao hụt; Tuy nhiên, việc lưu trữ lâu dài hoặc đông lạnh ở -700C được khuyến khích

Một phương pháp nhanh chóng và đơn giản để thực hiện đã được Germani và

cs (1984) dùng để xác định kháng nguyên độc tố LT của vi khuẩn E coli là ELISA

Phương pháp này cho phép xác định sự hiện diện của gene độc tố LT trong vòng 12h Trong số 54 mẫu phân thu thập được, có đến 40 mẫu cho kết quả dương tính với

10-LT Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để phát hiện các chủng ETEC có trong

phân (Mills và Tietze, 1984; Blanco và cs,1997; Guler và cs năm 2008)

Ngoài phương pháp PCR thông thường mà nhiều tác giả đã sử dụng để phát hiện gene độc tố LT (Jacek Osek, 2001; Lang và cs, 1994) thì O’Meara và cs (1995) cũng đã dùng phương pháp PCR so màu để khuếch đại và phát hiện gene LT trong các chủng ETEC Phương pháp này cho tỷ lệ phát hiện rất cao LT trong các dòng ETEC dương tính với LT (100%)

Trên thế giới nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và sản xuất thành công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị A/B của độc tố LT của ETEC và sử dụng protein tái tổ hợp này

để thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn đoán các ETEC gây bệnh bằng kỹ thuật ELSA và latex đã thu được kết quả tốt (Cryan B, 1990; Yolken và cs,1977)

Trong một nghiên cứu của Feil et al., 1996, tiểu đơn vị A của LT đã được biến đổi gene để trung hòa độc tính của nó Các gen wtLT và NLT được biểu hiện một cách

hiệu quả trong các tế bào vi khuẩn E coli kết hợp các plasmid JM109 Biểu hiện của độc tố LT trong E coli có thể thu được 10% protein trong tổng số protein của vi khuẩn

(De Mattos và cs, 2002) Một số phương pháp lọc protein biểu hiện của độc tố LT cũng được nhiều tác giả nghiên cứu: phương pháp tủa (Cheng và cs, 1999), sắc ký ái lực (Guidry và cs 1997, De Mattos và cs 2002)

1.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E COLI

Từ đầu thập niên 1990 đến nay, hầu hết người ta sử dụng E coli làm tế bào vật

chủ để sản xuất các protein tái tổ hợp phục vụ trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống con người

Protein tái tổ hợp được sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hướng: sản

xuất nội bào (tế bào chất), trong chu chất và sản xuất ngoại bào Trong đó, sản xuất protein tái tổ hợp trong nội bào là chiến lược được sử dụng phổ biến nhất Protein tái

tổ hợp tạo ra có thể ở dạng tan hay không tan (thể vùi), do đó khuyết điểm chủ yếu của chiến lược này là hình thành protein ở dạng thể vùi không có hoạt tính, đặc biệt là khi biểu hiện vượt mức Protein mục tiêu sau khi thu nhận phải được tái gấp cuộn để có hoạt tính Nhiều cải tiến đã được tiến hành như nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thấp,

thay thế các acid amin, sử dụng các chủng E coli khác nhau, đồng biểu hiện với

chaperone gấp cuộn, thay đổi pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở điều kiện stress

 Biểu hiện ở tế bào chất

Hầu hết protein được biểu hiện ở E coli đều được thiết kế biểu hiện ở tế bào chất của tế bào Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli gặp

nhiều khó khăn như protein thường được tạo ra ở dạng không tan, không có hoạt tính

sinh học gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E coli không có cơ chế thúc

đẩy sự hình thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, hiện nay việc biểu hiện protein tái tổ

hợp trong tế bào chất của E coli vẫn là phương án được sử dụng phổ biến nhất do mức

độ biểu hiện cao hơn so với các vị trí khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng đơn giản hơn Ngoài ra, hiện nay người ta cũng phát triển nhiều phương pháp nhằm cải thiện tính tan của protein trong tể bào chất như đồng biểu hiện các phân tử chapreron;

sử dụng các chủng E.coli đột biến gene trx

 Biểu hiện ở chu chất

Khoang chu chất của tế bào E coli là nơi có tính oxi hóa cao do có chứa 22 các

enzyme xúc tác cho việc hình thành liên kết disulfide Tuy nhiên trong khoang chu chất lượng protein thường được biểu hiện với hiệu suất thấp Mặt khác, để protein có thể chuyển từ màng trong ra ngoài khoang chu chất là đoạn peptide tín hiệu Không

phải peptide tín hiệu nào cũng hoạt động tốt trong tế bào E coli Khi tăng sự tổng hợp

peptide tín hiệu sẽ làm giảm mức độ biểu hiện của protein để tránh tình trạng ùn tắc hệ thống vận chuyển qua màng, làm tăng sự tổng hợp protein đóng vai trò chuyển màng Bên cạnh đó khi biểu hiện ở chu chất, protein cũng có thể tồn tại ở dạng thể vùi

 Tiết ra môi trường

E coli tiết rất ít (hầu như không có) protein ra ngoài môi trường nuôi cấy

Protein được định hướng tiết ra ngoài môi trường sẽ phải qua hai màng: màng trong và

màng ngoài của E coli Cơ chế chuyển qua màng là rất đặc hiệu Người ta cho rằng có

hai cách để định hướng protein được tiết ra ngoài môi trường đó là sử dụng con đường tiết sẵn thông qua việc sử dụng các đoạn peptide tín hiệu; cách thứ hai là sử dụng các yếu tố thẩm thấu ảnh hưởng tới việc tiết protein có lựa chọn nhưng lại hạn chế được tính thấm của màng ngoài Nhìn chung protein tạo ra bằng những phương pháp này là rất hiếm gặp

Việc sử dụng E coli cũng có một số ưu-nhược điểm nhất định so với các hệ

thống khác (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 So sánh hệ thống tế bào vật chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp

(Hoàng Văn Quốc Chương, 2010)

Đặc tính E coli Nấm men Tế bào

côn trùng

Tế bào động vật

Sự tăng trưởng tế bào Nhanh (30’) Nhanh (90’) Chậm (24 giờ) Chậm (24 giờ) Môi trường tăng trưởng Đơn giản Đơn giản Phức tạp Phức tạp

Mức độ biểu hiện Cao Thấp-Cao Thấp-Cao Trung bình

Biểu hiện ở ngoại bào Chu chất Môi trường

nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy Tái gấp cuộn protein Cần Cần Không cần Không cần

Glycosyl hóa liên kết N Không Mannose cao

Đơn giản, không có sialic acid

Phức tạp

Hiện nay việc tạo dòng và biểu hiện gene trong E coli được rất nhiều nhà khoa

học trên thế giới thực hiện

Sau khi phân lập được đoạn gene mã hóa cho enzyme catalase bằng phản ứng

PCR, Yang và cs (2003) tạo dòng vào vector pET-22b (+) và biểu hiện trong E coli

BL21 (DE3), kết quả cho thấy enzyme catalase tái tổ hợp chiếm 24,4% hàm lượng protein tổng số sau khi cảm ứng bằng IPTG trong 3 giờ ở 370C Như vậy, enzyme này

đã có hoạt tính cao khi biểu hiện trong E coli (Yang và cs, 2003)

Khi nghiên cứu về chức năng sinh học của protein B7-H3 trong việc hoạt hóa tế bào lympho T, Guang và cs (2004) đã tạo dòng gene B7-H3 vào vector pGEX-5X-3 và

biến nạp vào E coli (Guang và cs, 2004) Năm 2006, Zhinan và cs đã thành công trong

việc tạo dòng và biểu hiện gene

Human-beta-defensin-4 (hBD4) vào E coli, là một protein có tác dụng chống

nhiễm khuẩn ở người, với vector biểu hiện pET32-smhBD4 (Zhinan và cs, 2006) Cũng trong năm 2006, Jinshu và cs đưa được gene mã hóa GnRH vào hệ thống biểu hiện dựa trên T7 RNA polymerase trong vector pED-GnRH3, GnRH là hormone điều hòa quá trình tiết hormone kích thích nang trứng (FSH) và hormone kích thích thể vàng (LH), do vậy có ý nghĩa rất lớn trong việc điều trị bệnh liên quan đến hormone này (Jinshu và cs, 2006)

Nguyễn Thị Trung và cs (2006) đã nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Roi tái tổ

hợp đặc hiệu cho Salmonella Typhimurium Các protein tái tổ hợp được tinh chế bằng

phương pháp sắc ký ái lực, sau đó được kiểm tra khả năng liên kết với kháng thể

kháng S Typhimurium trong huyết thanh gà bằng phương pháp lai Western blot Kết quả chỉ ra rằng các protein đều liên kết đặc hiệu với kháng thể kháng S Typhimurium

Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng không độc từ đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên liệu phục vụ cho việc chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố SEB (Nguyễn Thị Hoài Thu, 2014)

Đinh Thị Bích Lân và cs (2009) cũng đã biểu hiện thành công gene kháng

nguyên bề mặt SAG2 của Toxoplasma gondii trong E coli (DH5α) để sản xuất kháng

nguyên tái tổ hợp cho việc sản xuất que chẩn đoán nhanh (dipstick) bệnh Toxoplasmosis ở bò và ở người (Đinh Thị Bích Lân và cs, 2009) Tại Thừa Thiên-Huế, các tác giả đã dùng que chẩn đoán nhanh để nghiên cứu tình hình nhiễm

Toxoplasma gondii ở mèo và lợn, kết quả cho thấy: tỷ lệ huyết thanh dương tính với Toxoplasma gondii ở mèo rất cao (60%) và ở lợn trung bình 38,66% Năm 2015, nhóm

tác giả cũng tạo dòng và biểu hiện thành công gene mã hóa kháng nguyên 3-1E của

cầu trùng gà (Eimeria) trong tế bào E coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu

hiện Sắc ky lọc gel 6xHis cho thấy sản phẩm protein dung hợp 6xHis-3-1E có khối lượng phân tử vào khoảng 26 kDa (Đinh Thị Bích Lân và cs, 2015)

1.3.1 Chủng E coli TOP10

E coli chủng TOP10 không chứa T7 RNA polymerase, thường được sử dụng

trong tạo dòng gene là lí tưởng cho nhân bản và đảm bảo tính ổn định của các plasmid tái tổ hợp Sự hiện diện của T7 RNA polymerase, thậm chí một lượng thấp, có thể dẫn đến quá trình biểu hiện của các gene tạo dòng xẩy ra ngay trong cả trường hợp không

có bổ sung chất cảm ứng Nếu gene quan tâm có tính độc hại cho vật chủ, làm cho các

plasmid tái tổ hợp không ổn định hoặc tế bào vật chủ sẽ chết đi Do đó E coli chủng TOP10 là chủng có ưu điểm trong tạo dòng gene Mặt khác, chủng E coli TOP10 cho

số lượng bản sao lớn trong quá trình tạo dòng, hiệu suất thu hồi ADN plasmid là 1 x

109 cfu/ g

1.3.2 Chủng E coli BL21 (DE3)

Chủng E coli BL21(DE3) thường được dùng trong biểu hiện protein dung hợp

với 6xHis bằng vector biểu hiện pET Hệ thống này cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế tối đa hiện tượng phiên mã rò rỉ khi không có chất cảm ứng Đây là chủng có thể sinh trưởng trong môi trường tối thiểu, được làm suy thoái hai protease chìa khóa là lon protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng

ngoài tế bào) Vì vậy, E coli BL21(DE3) có ưu điểm là hạn chế sự phân cắt của

protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân hủy và ổn định hơn sau khi tổng hợp Ngoài ra, ADN bộ gene của chủng chủ này chứa gene T7

mã hóa T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ bacteriophage DE3 dạng tiềm tan (Hình 1.10) Gene T7 chịu sự điều khiển của promotor lac Gene lacI có khả năng tạo ra một lượng lớn repressor của lac operon (lacO) tham gia kiểm soát âm sự phiên mã của T7

Sự ức chế phiên mã sẽ được hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO

Hình 1.10 Cơ chế biểu hiện của hệ thông pET trong tế bào E coli BL21 (DE3)

1.3.3 Hệ thống vector tạo dòng pGEM ® -T easy

Có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại trong

tế bào vật chủ trong nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gene của tế bào vật chủ Vector này mang đầy đủ những đặc điểm của một vector tách dòng:

 Đầu lồi thymidine 3’ cho phép dễ dàng PCR cloning: Các vector pGEM®-T easy được thiết kế với một đầu lồi 3’- thymidine T-nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc tự gắn vòng của vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi các enzyme tổng hợp

 Lựa chọn các thể chuyển nạp xanh / trắng: Vector pGEM®

-T easy là vector

có số lượng bản copy cao, chứa các promoter T7 và RNA polymerase nằm cạnh vùng MCR (multiple cloning region), bên trong có chứa đoạn mã cho α-peptidee và enzyme β-galactosidase Khi gene mục tiêu được chèn vào vector làm bất hoạt enzyme β-galactosidase, đây là cơ sở cho việc lựa chọn khuẩn lạc xanh trắng

 Có nhiều vị trí cắt cho enzyme giới hạn: Vector pGEM®

-T easy chứa một số lượng lớn vị trí cắt của các enzyme giới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR Vùng MCR của vector pGEM®-T easy gồm các vị trí nhận biết của enzyme EcoRI, BstZI và NotI, cho phép 3 enzyme có thể cắt các đoạn chèn vào một cách độc lập

 Gắn nhanh chóng: vector pGEM®-T easy được cung cấp với đệm 2x rapid ligation buffer Phản ứng gắn thường được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng (tốt nhất là

để qua đêm)

 Các trình tự và vị trí nhân dòng của vector PGEM®

-T easy Vector pGEM®

-T easy có thể được làm thẳng ở vị trí base thứ 60 bằng enzyme EcoRV và thêm một base T vào đầu 3’ Vị trí cắt của EcoRV sẽ được khôi phục lại bằng phản ứng gắn của vector và đoạn cài

Hình 1.11 Trình tự và cấu trúc vector pGEM ® -T easy (Promega)

Bảng 1.2 Thành phần chính của plasmid pGEM ® -T easy

Điểm khởi đầu phiên mã T7 RNA polymerase 1

SP6 RNA polymeraza promoter (-17 đến 3) 139 – 158

Điểm khởi đầu phiên mã SP6 RNA polymerase 141

Vị trí bám mồi pUC / M13 ngược 176 – 197

Vùng mã hóa lac operon 2836 – 2996, 166 – 395

Vị trí bám mồi pUC / M13 xuôi 2941 – 2957

1.3.4 Hệ thống vector biểu hiện pET

Hệ thống vector biểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ

hợp ở dạng dung hợp với một homooligohistidine (6xHis) trong tế bào E coli Sự biểu

hiện của gene mục tiêu được kiểm soát bởi promotor T7 và nhờ hoạt tính của T7 RNA polymerase của tế bào vật chủ được biến đổi bởi phage T7 Vector biểu hiện này chứa đoạn ADN mã hóa oligo-histidine gọi là thẻ His (His-tag), đoạn này có thể chứa 6 hoặc 8 hoặc 10 amino acid Tùy theo plasmid mà His-tag có thể dung hợp ở đầu N hay đầu C hay nằm ở giữa protein dung hợp với vai trò hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và còn giúp cho sự phát hiện protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag Protein tái tổ hợp chứa 6xHis có thể được thu hồi với độ tinh sạch trên 90% bằng cách hấp phụ lên cột sắc ký Ni2+ -nitrilotriacetic acid (Ni-NTA), nhờ tương tác giữa 6xHis và Ni2+ (Hình 1.10) sau đó ly giải ở pH thấp hoặc dùng chất kìm cạnh tranh là imidazone

Một ưu điểm quan trọng của hệ thống này là khả năng duy trì trạng thái không phiên mã của gene đích khi không được cảm ứng Đầu tiên, gene đích được tạo dòng

trong vật chủ không chứa gene T7 ARN polymerase để tránh sản xuất nhiều protein dẫn đến gây độc cho tế bào vật chủ Khi tiến hành biểu hiện, plasmid được chuyển vào vật chủ có chứa bản sao của gene T7 ARN polymerase dưới sự kiểm soát của lacUV5 promoter và sự biểu hiện được cảm ứng bằng cách bổ sung IPTG ở nồng độ thích hợp (Mierendorf và cs, 2000)

Hình 1.12 Cấu trúc Vector pET200/D-TOPO (Invitrogen)

Hình 1.13 Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel

1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GENE TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VẬT CHỦ

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường phải được thiết lập và theo dõi kỹ lưỡng vì chúng có vai trò quan trọng trong quá trình biến dưỡng để tạo sinh khối tế bào và sinh tổng hợp protein tái tổ hợp Để nuôi cấy tế bào đạt mật độ cao, cần phải thiết kế một môi trường

có sự cân đối về các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho tế bào tăng trưởng và tránh

được các tác nhân gây ức chế tế bào Một trong những cách để đạt được tế bào E coli

mật độ cao là tối ưu hóa môi trường tăng trưởng dùng để nuôi cấy trong giai đoạn đầu

- Ảnh hưởng của mật độ tế bào trước khi cảm ứng (thời điểm cảm ứng)

Thời điểm cảm ứng có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng lên sản lượng protein tái

tổ hợp của cả quá trình Mỗi một loại protein tái tổ hợp khác nhau, sự cảm ứng sẽ được thực hiện ở các thời điểm khác nhau Theo Kim và cs (2009), enzyme glutathione reductase của Brassica rapa subsp pekinensis được sản xuất mạnh khi mật độ tế bào đạt OD600 = 0,6 Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu trong biểu hiện Proinsulin người

tái tổ hợp ở hệ E coli BL21 với vector pET – 28a(+), Trần Hồng Vân và cs (2008) đưa

ra kết luận mật độ tế bào ban đầu OD600=0,6-1 là tốt nhất

- Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng

Nồng độ chất IPTG cảm ứng cũng là yếu tố ảnh hưởng khả năng biểu hiện của gene tái tổ hợp trong tế bào vật chủ Các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả trước đây không đưa ra một mức chung nào cho nồng độ IPTG dùng để cảm ứng Hoàng Văn Quốc Chương (2010) cho rằng nồng độ IPTG thích hợp nhất khi sản xuất insulin tái tổ hợp là 0,3mM Nghiên cứu của Byun (2007) kết luận nồng độ IPTG thích hợp nhất khi cảm ứng biểu hiện enzyme Guanosine 5′-diphosphate-D-mannose-4,6-dehydratase và guanosine 5′-diphosphate -4-keto-6-deoxymannose 3,5-epimerase 4-reductase là 0,1mM Lillehoj (1998) lại khảo sát nồng độ chất cảm ứng thích hợp nhất

khi biểu hiện protein interferon-gamma của người vào E coli BL21(DE3) là 3mM

- Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng

Nhiệt độ cảm ứng là một thông số thiết yếu quyết định đến sự phát triển và biểu hiện protein tái tổ hợp của vi sinh vật Hầu hết các công trình nghiên cứu đều rút ra kết

luận về nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của E coli dao động từ 370C-390C Tuy nhiên, nhiều tác giả cũng đã chứng minh được việc giảm nhiệt độ cảm ứng từ 370C xuống còn 200C-300C giúp tăng cường sự tổng hợp và cuộn xoắn của các protein chức năng, tăng tính ổn định của các protein tái tổ hợp, cải thiện hoạt tính cũng như độ tinh khiết của các protein ngoại bào (Lee và cs, 2000) Một số tác giả khác lại cho rằng cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp ở nhiệt độ cao cho kết quả tốt hơn so với nhiệt độ

thấp Li và cs (2007) khi tiến hành thăm dò nhiệt độ biểu hiện chitinase của B cereus

CH2 nhận thấy rằng hoạt tính của enzyme này biểu hiện mạnh và ổn định ở 400C