Khóa luận nghiên cứu về vai trò của gen gerk trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử của cấu trúc kháng sinh DIHYDROCHALCOMYCIN

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘIKhoa Công Nghệ Sinh Học ---***---ĐỀ TÀI: : NGHIÊN CỨU VỀ VAI TRÒ CỦA GEN GERK TRONG NHÓM GEN SINH TỔNG HỢP GỐC ĐƯỜNG KHỬ CỦA CẤU TRÚC KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Khoa Công Nghệ Sinh Học

-*** -ĐỀ TÀI: : NGHIÊN CỨU VỀ VAI TRÒ CỦA GEN GERK

TRONG NHÓM GEN SINH TỔNG HỢP GỐC ĐƯỜNG KHỬ CỦA CẤU TRÚC KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN

Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

Lớp

: : :

TS Tạ Thị Thu Thủy Phạm Chí Công

KS CNSH 06-04

Hà Nội – Tháng 6/2010

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Khoa Công Nghệ Sinh Học

-*** -ĐỀ TÀI: : NGHIÊN CỨU VỀ VAI TRÒ CỦA GEN GERK

TRONG NHÓM GEN SINH TỔNG HỢP GỐC ĐƯỜNG KHỬ CỦA CẤU TRÚC KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN

Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

Lớp

: : :

TS Tạ Thị Thu Thủy Phạm Chí Công

KS CNSH 06-04

Hà Nội – Tháng 6/2010

LỜI CÁM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành nhất tới các thầy côgiáo khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội đã trang bị chotôi những kiến thức, thiết bị và hóa chất nghiên cứu để tôi có thể hoànthành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy– Người đã trực tiếp giao đề tài và hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện

để tài

Tôi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên

em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài

Qua thời gian nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân đã có nhiều cốgắng, nhưng khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế, rấtmong nhận được những ý kiến góp ý của các thầy, cô giáo cũng như cácbạn trong lĩnh vực nghiên cứu

Xin trân trọng cám ơn

Hà Nội, ngày 26 tháng 5 năm 2010

Sinh viên

Phạm Chí Công

MỤC LỤC

NHỮNG TỪ NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT 4

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG I: 6

TỔNG QUAN 6

1.1 Đại cương về kháng sinh 6

1.1.1 Lịch sử ra đời và phát triển của kháng sinh 6

1.1.3 Định nghĩa kháng sinh 6

1.1.4 Đơn vị kháng sinh 8

1.1.5 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 8

1.1.6 Phân loại kháng sinh 10

1.2 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh 12

1.2.1 Gốc đường trong cấu trúc kháng sinh 12

1.2.2 Một số nghiên cứu về gốc đường khử 13

1.3 Giới thiệu về Enzyme giới hạn 15

1.4 Giới thiệu về gerK 15

1.5 Vector 18

1.5.1 Vector tách dòng 18

1.5.2 Vector biều hiện pET 32a+ 18

CHƯƠNG II: 21

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Hóa chất và vật liệu 21

2.1.1 Một số hóa chất đã được sử dụng: 21

2.1.2 Một số thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu 21

2.1.3 Chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy 22

2.1.3.1 Chủng vi sinh vật: 22

2.1.3.2 Điều kiện nuôi cấy: 22

2.1.4 Vector và plasmit tái tổ hợp 22

2.1.5 Môi trường nuôi cấy 23

2.1.6 Phân tích trình tự gen 23

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu của đề tài 24

2.2.2 Kỹ thuật tách plasmit từ vi khuẩn E.coli 25

2.2.3 Chạy điện di DNA plasmit trong Agarose 25

2.2.4 Kỹ thuật chuyển gen: 25

Các bước trong kỹ thuật chuyển gen: 25

2.2.5 Thiết kế mồi 26

2.2.6 Kỹ thuật cắt gen gerK 26

2.2.7 Kỹ thuật nối gen 27

2.2.8 Chạy PCR 27

CHƯƠNG III 29

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả 29

3.1.1 Sản phẩm PCR của gen gerK 29

3.1.2 Kết quả chuyển gen GerK vào vector pGEM 7+ 31

3.1.3 Kết quả giải trình tự gen gerK 31

3.1.4 Kết quả chuyển gen gerK vào vector pET32a+ 37

3.2 Kết luận và đề xuất: 40

3.3 Thảo Luận 41

Tài liệu tham khảo 42

EtBr Ethidium bromide

LB Luria-Bertani

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Axit ribonucleic

SDS Sodium dodecyl sulphate

TAE Tris – Acetate –EDTA

Taq Polymerase Polymerase Thermus aquaticus

TBE Tris – Base –EDTA

TE Trophectoderm

MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảngkhoa học về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo racác công nghệ khai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật

và động vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học cóchất lượng cao, phục vụ phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường

Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độphân tử Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần giống với các ngànhkhác trong Sinh học, đặc biệt là di truyền học và hóa sinh Sinh học phân tửchủ yếu nghiên cứu tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tếbào, gồm quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA vàprotein cũng như tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này

Ứng dụng những kỹ thuật của CNSH phân tử vào trong đề tài này để

nghiên cứu về vai trò của gen gerK trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc

đường khử của cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin Cụ thể như các kỹthuật như PCR nhằm tách dòng gen, cắt gen bằng enzyme giới hạn, táchplasmit, giải trình tự gen,…

CNSH nói chung và ngành CNSH Phân tử nói riêng đã và đang đượcứng dụng vào trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, yhọc, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ cho mọi nhu cầu của cuộc sống nhưdinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sức khỏe Bằng những kiến thức sinh học

về thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn, và sử dụng “công nghệ DNA tái tổhợp” những nhà khoa học đang cố gắng tạo ra những cây trồng, vật nuôi cónăng suất và chất lượng cao, những loại thực phẩm, dược phẩm phục vụcho việc chữa bệnh cho con người…

CHƯƠNG I:

TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Lịch sử ra đời và phát triển của kháng sinh

Trước khi Alexander Flemming phát hiện ra tác dụng của khángsinh, người ta đã biết sử dụng nấm để chữa trị các chứng viêm, chữa trị vếtthương bằng cách áp rêu lên vết thương cho chóng khỏi, thậm chí ngay cảnhững mẫu bánh mỳ mốc cũng được sử dụng để chữa vết thương

Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Flemming đãtình cờ phát hiện hiện tượng nấm xuất hiện trên đĩa và phát triển thànhnhững tảng nấm xung quanh những tảng nấm đó là những vi khuẩn bị pháhủy Ông chứng minh rằng loại nấm này tiết ra một chất có khả năng ứcchế sự phát triển của Staphylococcus, sau này được gọi là penixillin [1]

Năm 1929, ông công bố penicixillin trước dư luận công chúng Ôngkhẳng định rằng chất này có thể trở thành một thứ thuốc quan trọng nhưngbản thân ông không có khả năng và kỹ thuật để chiết xuất [1]

Năm 1938, hai nhà khoa học Howara Walter Florey và Ernst BorisChaen đã chiết được hoạt chất diệt khuẩn từ môi trường nuôi cấypenicillum notatum và hoạt chất được đặt tên là penicillin Tuy nhiên đếnkhi chiết được penicillin tinh khiết thì nó mới được thử nghiệm trên người[1]

Năm 1941, các nhà bác học Chain và Florey mới tinh chế đượcpenixillin dưới dạng ổn định và nghiên cứu được phương pháp lên men đểđiều chế đủ lượng cần thiết cho việc thử lâm sàng, điều trị hiệu nghiệm cácbệnh nhiễm khuẩn đã tạo điều kiện nhanh chóng việc đầu tư nghiên cứu sảnxuất penixillin ở quy mô công nghiệp

Năm 1944, penixillin đã được sản xuất ở quy mô lớn ở Mỹ để phục

vụ chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn cho thương bệnh binh trong chiến tranh

thế giới thứ II Sau đó Nga và một số nước khác cũng đã sản xuất đượcpenixillin G và penixillin V Việc phát minh ra penixillin đã tạo được mộtbước ngoặt quan trọng trong lĩnh vực y học thế giới.

Năm 1944, Waksman tìm ra streptomycin bởi nuôi cấy nấm

Streptomyces griseus và ông gọi đó là kháng sinh (antibiotics).

Đến nay, có hơn 1600 chất kháng sinh được tìm ra nhưng chi cókhoảng 150 loài đã được sử dụng rộng rãi (do phần lớn: độc, có tác dụngphụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành sản xuất cao…)

1.1.2 Lịch sử kháng sinh ở Việt Nam.

Năm 1950, trong kháng chiến chống Pháp, GS Đặng Văn Ngữ đãnuôi cấy Penicillium chrysogenum và dung dịch chiết môi trường nuôi cấy

để điều trị vết thương cho thương binh

Năm 1968, bộ môn công nghệ Dược (trường Đại học Dược Hà Nội)được thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị chocông nghiệp kháng sinh và năm 1970 đơn vị nghiên cứu chuyên đề khángsinh được thành lập [14]

Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ);Trung Quốc; Tây Ban Nha; Triều Tiên hợp tác và giúp sản xuất điều chếkháng sinh, song cũng không thành công do nhiều nguyên nhân

Năm 1985-1990 một chương trình nghiên cứu Nhà Nước 64C của

Bộ Y Tế nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh oxytetracillin và tetracyclinenhưng kết quả đạt được không cao về công nghệ lẫn hiệu suất [4]

Như vậy trong thời gian nghiên cứu, hợp tác điều chế, sản xuấtkháng sinh gặp rất nhiều khó khăn nhưng vẫn chưa thành công

1.1.3 Định nghĩa kháng sinh.

Có rất nhiều cách định nghĩa về kháng sinh, nhưng theo Waksman(1942) có thể định nghĩa kháng sinh như sau:

“Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các visinh vật tạo ra có tác dụng ức chế phát triển hay tiêu diệt chọn lọc đối vớicác vi sinh vật khác” [1].

Tuy nhiên định nghĩa này có phần hạn chế và chưa đề cập đến cáckháng sinh thực vật, kháng sinh bán tổng hợp và các hợp chất hóa học cótác dụng tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật Ngày nay, có thể định nghĩathuật ngữ kháng sinh theo nghĩa rộng là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tựnhiên, tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chon lọc đối với các visinh vật gây bệnh mà không có hoặc hầu như không có tác dụng lên conngười, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung

Ngoài ra, tính mẫn cảm của vi sinh vật đối với chất kháng sinh cũngthay đổi tùy trường hợp, thông thường thì các vi khuẩn Gram (+) mẫn cảmvới chất kháng sinh hơn vi khuẩn Gram (-)

1.1.4 Đơn vị kháng sinh.

Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinhthường được biểu thị bằng một trong các đơn vị là : mg/ml, mg/ml, hay đơn

vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit ).

Đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng kháng sinh tốithiểu pha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế hoàntoàn sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn, thí dụ, vớipenicillin là số miligam penicillin pha vào trong 50 ml môi trường canh

thang và sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định; với

Streptomicin là số miligam pha trong 1 ml môi trường canh thang và kiểm

định bằng vi khuẩn Escherichia coli) [2].

1.1.5 Cơ chế tác dụng của kháng sinh.

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay các đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó; trong đó, những kiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn hay ức chế quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hóa trao đổi chất (hình 1.1) [15]

Hình 1.1 Sự tương tác đặc hiệu với những giai đoạn trao đổi chất

- Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn.Cácnhóm kháng sinh gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác độnglên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bàophá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

- Ức chế chức năng của màng tế bào Các nhóm kháng sinh gồm có :colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năngcủa mqàng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát rangoài.

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S củaribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác

Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chếenzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗipolypeptide

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S củaribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗipolypeptide

- Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quátrình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm chohai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhânđôi của DNA

Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzonic acid) cótác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp axit nucleotit

Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạonhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic

Mỗi ngày lại có rât nhiều loại kháng sinh được các dược sĩ bào chế

ra bởi vì quá trình kháng kháng sinh của vi khuẩn

1.1.6 Phân loại kháng sinh.

Phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách hệ thống danh mụccác kháng sinh ngày càng nhiều thêm, có thể phân loại dựa vào phổ tácdụng, theo nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay theo cấu trúc hóa học

Tuy nhiên phân loại theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất Sau đây xingiới thiệu một số loài kháng sinh theo cấu trúc hóa học, gồm có 9 nhómkháng sinh chính: [1]

1- Các kháng sinh cacbon hydrat gồm:

Các saccarit thuần nhất (nojirimycin)

Các kháng sinh macrolid ( erythromycin)

Các kháng sinh polyen ( nystatin)

4- Các kháng sinh peptid và axit amin

Các dẫn xuất axit amin (cycloserin)

Các kháng sinh beta-lactam (penixilin)

Các kháng sinh peptid (bacitracin)

Các cromopeptid (actinomycin)

Các peptid tạo kelat (bleomycin)

5- Các kháng sinh dị vòng chứa Nito

Các kháng sinh nucleozid polyoxin

6- Các kháng sinh di vòng chứa oxy

Kháng sinh polyete (monenzim)

7- Các kháng sinh mạch vòng no

Các dẫn chất alkan (ctcloheximid)

Kháng sinh steroid (axit fuzidic)

8- Các kháng sinh chứa nhân thơm

Các dẫn chất benzene (chloramphenicol)Các chất nhân thơm ngưng tụ (griseofulvin)

9- Các kháng sinh mạch thẳng

Các chất chứa photpho (photphomycin)

1.2 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh

1.2.1 Gốc đường trong cấu trúc kháng sinh.

Đường khử là gốc đường đặc biệt được tìm thấy rất nhiều cấu trúccủa tế bào vi khuẩn, trong tế bào nấm, trong cấu trúc của rất nhiều các chất

có hoạt tính sinh học và trong thành phần cấu trúc của rất nhiều thuốckháng sinh hay các chất chống ung thư [5] Về cấu tạo các chất đường khử

là các chất mà trong phân tử chúng có một hay nhiều hơn một nhómhydroxyl (OH) được thay thế bởi nguyên tử H hay các nhóm chức khácnhư amino, methyl, alkyl… Các loại đường khử này có thể tồn tại ở dạngđường đơn hay đường đa hoặc phân nhánh và là dẫn xuất của các sản phẩmtrao đổi chất bậc 2 trong các hợp chất tự nhiên [6]

Trong các hợp chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai tròquan trọng đối với xác định hoạt tính của các chất này, có rất nhiều cácnghiên cứu đã chứng minh rằng các chất hoạt tính sinh học sẽ bị mất hoàntoàn hoạt tính nếu như gốc đường trong cấu trúc bị bỏ [7]

Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật đường khử tham gia tạo thành cấutrúc peptidoglycon là thành phần của lớp thành tế bào của rất nhiều loại visinh vật đặc biệt là một số vi khuẩn gram dương hoặc hình thành lớpLipopolyscharide trong cấu trúc màng tế bào của nhóm gram âm

1.2.2 Một số nghiên cứu về gốc đường khử.

Theo như nghiên cứu gốc đường khử trong nhóm kháng sinh enedine cóvai trò quyết định hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng khuẩn, nghiên cứunày cho thấy gốc đường rhamnose trong kháng sinh calicheamicin đóng vaitrò làm cầu nối liên kết phần tử kháng sinh với enzyme tham gia vào quátrình sao mã hay sinh tổng hợp mRNA [8]

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gốc đường khử trong nhóm kháng sinhmacrolide như erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai trò trong gắnkháng sinh này với các enzyme tham gia tổng hợp Protein của vi khuẩn [9]

Việc nghiên cứu vai trò của các gốc đường đã chỉ ra rằng nếu mất đigốc đường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật sẽ gây ức chế sựsinh trưởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật [10]

Xu hướng nghiên cứu về hóa dược hiện nay trên thế giới đó lànghiên cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốcđường mới vào gốc đường cũ của một số nhóm kháng sinh [11] Vì vậy màkháng sinh thế hệ mới này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh đượchiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đồng thời khả năng thải trừ của thuốcnhanh hơn

1.2.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh vật

Hầu hết đường khử trong cấu trúc kháng sinh được sinh ra từ vi sinh vật làđường 6-deoxyhexose Tiền chất đầu tiên tham gia quá trình sinh tổng hợpcác đường này đều bắt đầu từ glucose-1-phosphate qua một chuỗi các phảnứng sinh hóa trong tế bào được xúc tác bởi nhóm enzyme và kết quả là tạo

ra được gốc đường khử có thể 1 hay nhiều hơn 1 nhóm OH bằng cácnguyên tử H, nhóm –CH3, nhóm =O, hay nhóm CHO-… (hình 1.2)

Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp và cơ chế sinh tổng hợp của một số

đường khử

Trong đó: Các vị trí đánh dấu chỉ ra vị trí có thể có các nhóm chức hay các

nguyên tử khác thay thế cho gốc OH của phân tử đường để hình thành nêncác cấu trúc đường khác nhau

1.3 Giới thiệu về Enzyme giới hạn.

Enzyme giới hạn (Restriction enzyme, RE) là một enzyme

Endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu Những enzymenày phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi màkhông gây tổn hại đến bases Các liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt cóthể được nối trở lại bằng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các phânđoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắcthể hoặc gene khác nhau có thể được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầudính bổ sung với nhau (xem chi tiết phía dưới) Nhiều kỹ thuật sinh họcphân tử và kỹ thuật di truyền đều dựa vào các enzyme giới hạn.Thuật ngữ

giới hạn xuất phát từ việc các enzyme này được khám phá từ các chủng E coli mà đang hạn chế sự phát triển của các thực khuẩn thể" Vì thế enzyme

giới hạn được cho là cơ chế của vi khuẩn nhằm ngăn chặn sự tấn công củavirus và giúp loại bỏ các trình tự của virus [17]

1.4 Giới thiệu về gerK.

Gen gerK là một trong những gen tham gia vào sinh tổng hợp đường của kháng sinh dihydrochalcomycin thuộc nhóm macolide từ Streptomyces

sp.KCTC 0041 BP (hình 2.2) Trong nhóm gen này có 6 gen là gerE, gerD, gerF, gerK, gerM2 và gerM3 đã được dự đoán là nhóm gen tham gia sinh

tổng hợp đường, trong đó gen GerK đã được dự đoán có độ dài là 0.9 kb và

mã hóa cho dTDP-4-keto-6- deoxyhexose reductase được tham gia vàosinh tổng hợp của dTDP-6-deoxy-D-allose.dTDP-4-keto-6-deoxyhexosereductase là enzyme rất quan trọng và được tìm thấy trong các nhóm gendeoxysugar Các enzyme đã được chứng minh là xúc tác cộng nhóm H+ vàonhóm keto (C=O) tại vị trí cacbon số 4 của đường kết hợp với các bước

khác nhau từ đó tạo ra một số loại đường khác nhau Gen gerK mã hóa cho

NDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase được thực hiện tại vị trí cacbon số 4của nhóm keto

Với chức năng quan trọng như vậy nhưng vẫn chưa có nghiên cứu

chính thức về loại gen này của Streptomyces KCTC 0041 BP Tuy nhiên, trước đây đã từng có một số nghiên cứu ở các chủng streptomyces khác và

cùng với các gen có chức năng tương tự

Vì vậy, Mục tiêu của nghiên cứu này đó là: Tách dòng được gen

gerK, giải trình tự gen gerK, đối chiếu, so sánh với các chủng gen khác

trong ngân hàng gen Nhằm nghiên cứu về vai trò của gen gerK trong nhóm

gen sinh tổng hợp gốc đường khử của cấu trúc kháng sinhdihydrochalcomycin Rồi thiết kế vector biểu hiện để phục vụ cho cácnghiên cứu tiếp theo

Hình 2.2 A: Nhóm gen deoxysugar trong sinh tổng hợp

Dihydrochalcomycin, nhóm gen được phân lập từ cosmidpGERI-5

B: Con đường sinh tổng hợp kháng sinhDihydrochalcomycin

1.5 Vector

Vector là một hay nhiều đoạn ADN có kích thước nhỏ cho phép gắn cácđoạn ADN cần thiết, có khả năng tái bản, không phụ thuộc vào sự phânchia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và khônggây biến đổi bộ gene của tế bào chủ

1.5.1 Vector tách dòng

Vector tách dòng (vector cloning) là một phân tử ADN có kích thước

nhỏ cho phép cài gắn một đoạn ADN ngoại lai vào nhằm mục đích nhânđoạn ADN ngoại lai lên với số lượng lớn

Việc chèn đoạn ADN vào vector được thực hiện bằng cách cắt vector vàđoạn ADN bằng cùng một loại enzyme giới hạn, sau đó nối chúng lại vớinhau

Có rất nhiều loại vector tách dòng, hầu hết là sản phẩm của việc biến đổi ditruyền của plasmit và vi khuẩn Một số loại vector tách dòng khác bao gồmnhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo ( BACs) và nhiễm sắc thể nấm men nhântạo ( YACs)

Vector pEGM 7+ dùng trong việc chuyển gene gerK – là sản phẩm

của phản ứng nhân gene PCR vào vector

1.5.2 Vector biều hiện pET 32a+

pET-32a+ là một plasmit có 5899bp Vector pET32a+ được thiết kế chonhân dòng vô tính và biểu hiện ở cấp độ cao chuỗi trình tự peptide nối vớiprotein thioredoxin 109aa Trx•Tag™.Vị trí tách dòng được dùng gắn genbiểu hiện là fusionproteins, bao gồm chuỗi 6His•Tag dùng để phát hiện vàtinh sạch protein của gen cần biểu hiện.Vị trí duy nhất để chuyển gen đượcbiểu hiện trên vector (hình 1.3) Vùng biểu hiện hay vùng cloning của gencần biểu hiện được gắn với T7 promotor, đây là promotor mạnh giúp chođiều tiết tăng cường quá trình tổng hợp protein

Bố trí thiết kế vector pET 32a+ gồm có:

- Promoter T7: 764-780 (Nu)

- T7 transcription start: 763 (Nu)

- Trình tự coding 6His•Tag: 327-344 (Nu) (6His.Tag có chứa 6 axit

amin histidin được sử dụng để tinh sạch Protein)

Vị trí chuyển gen

- (Nco I - Xho I): 158-217 (Nu)

- Trình tự coding His•Tag: 140-157 (Nu)

- T7 terminator: 26-72 (Nu)

- Trình tự coding L acI:1171-2250 (Nu)

- Điểm khởi đầu pBR322: 3684 (Nu)

- Trình tự coding bla: 4445-5302 (Nu)

- Điểm khởi đầu f1: 5434-5889 (Nu)

Hình 1.3: Bản đồ các điểm enzyme cắt giới hạn và chuỗi gene trên vector

pET 32a (+) [19]