Khóa luận nghiên cứu tách dòng, giải trình tự và thiết kế vecto biểu hiện gene novw tham gia sinh tổng hợp kháng sinh novobiocin

và sử dụng “công nghệ ADN tái tổ hợp” những nhàkhoa học đang cố gắng tạo ra những cây trồng, vật nuôi có năng suất vàchất lượng cao, những loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việcchữa

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về kháng sinh 5

1.1.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh 5

1.1.2 Khái niệm kháng sinh 7

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 7

1.1.4 Phân loại kháng sinh 9

1.1.5 Đơn vị kháng sinh 10

1.1.6 Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu 10

1.1.7 Phổ kháng khuẩn của kháng sinh 11

1.2 Tổng quan về Novobiocin 11

1.2.1 Novobiocin 11

1.2.2 Cơ chế tác dụng của Novobiocin 11

1.2.3 Cấu tạo của Novobiocin 12

1.2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về Novobiocin 12

1.2.5 Ứng dụng Novobiocin 14

1.3 Đường khử 15

1.31 Gốc đuờng trong cấu trúc kháng sinh 15

1.3.2 Một số các nghiên cứu về gốc đường khử 16

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh vật 16

1.3.4 Con đường sinh tổng hợp đường Novioce 17

1.3.5 Giới thiệu về gen novW 18

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU 22

NGHIÊN CỨU 22

2.1 Hóa chất 22

2.2 Một số thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu 22

2.3 Vật liệu nghiên cứu 23

2.3.1 Chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy 23

2.3.2 Vector và plasmids tái tổ hợp 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Kỹ thuật tách plasmid 27

2.4.2 Kỹ thuật cắt gen bằng Enzyme giới hạn 28

2.4.3 Kỹ thuật ghép gen bằng enzyme 28

2.4.4 Kỹ thuật chuyển gen 29

2.4.5 Kỹ thuật thiết kế mồi và chạy PCR 32

2.4.6 Chạy điện di ADN plasmid trong Agarose 33

2.4.7 Giải trình tự gen 33

2.4.8 Đánh giá trình tự gen, so sánh cấu trúc protein 33

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết Quả 35

3.1.1 Sản phẩm PCR của gen novW 35

3.1.2 Chuyển gen novW vào vector pGEM 7+ 37

3.1.3 Giải trình tự gen novW 38

3.1.4 Chuyển gen novW vào vector pET -32a(+) 45

3.2 Thảo luận, đề xuất 49

Tài liệu tham khảo và Trích dẫn: 50

Bộ giáo dục và đào tạo Viện đại học mở hà nội Khoa công nghệ sinh học

-&&& -Khóa luận tốt nghiệp

đề tài:

NGHIÊN CứU TáCH DòNG, GIảI TRìNH Tự Và

THIếT Kế VECTOR BIểU HIệN GEN NOVW THAM GIA

SINH TổNG HợP KHáNG SINH NOVOBIOCIN

Giáo viên hớng dẫn: TS Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên thực hiện: Vũ Văn Hùng

Lớp KS.CNSH 06 - 04

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

LờI CảM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin bầy tỏ lòng biết ơn chân thành

đến cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy, Ngời đã trực tiếp hớng dẫn ân cần vàchỉ bảo giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin gủi lời cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ khoa Côngnghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ emtrong quá trình em thực nghiệm tại Phòng sinh học phân tử Viện ĐạiHọc Mở Hà Nội.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm và

động viên em trong suốt thời gian qua Qua đây em cũng xin cảm ơn sựgiúp đỡ nhiệt tình của tập thể nhóm G6 nhóm thực tập của em tại phòngsinh học phân tử

Do thời gian và khả năng bản thân có hạn, nên trong bài khóaluận này không tránh khỏi những thiếu sót Nên em rất mong nhận đợcthêm sự chỉ bảo của các thầy cô và sự góp ý của các bạn để bài khóa luận đợc

đầy đủ và hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm

2010Sinh viên

Vũ Văn Hùng

NHỮNG TỪ NGỮ Kí HIỆU VIẾT TẮT

Taq Polymerase Polymerase Thermus aquaticus

Information

MỞ ĐẦU

Ngày nay, công nghệ sinh học được coi là một trong năm ngành

công nghệ mũi nhọn của nhân loại gồm: công nghệ sinh học, công nghệ

thông tin, công nghệ điện - điện tử, công nghệ vật liệu mới và công

nghệ năng lượng

Công nghệ sinh học là một bộ môn tập hợp các ngành khoa học và

công nghệ gồm: sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh

hóa học và công nghệ học, nhằm tạo ra các quy trình công nghệ khai

thác ở quy mô công nghiệp các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào

động, thực vật để sản xuất các sản phẩm có giá trị phục vụ đời sống,

phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường

Công nghệ sinh học đã và đang được ứng dụng vào trong rất nhiềulĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằmphục vụ cho mọi như cầu của cuộc sống như dinh dưỡng, giải trí, chămsóc sức khỏe Bằng những kiến thức sinh học về thực vật, động vật,nấm, vi khuẩn, và sử dụng “công nghệ ADN tái tổ hợp” những nhàkhoa học đang cố gắng tạo ra những cây trồng, vật nuôi có năng suất vàchất lượng cao, những loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việcchữa bệnh cho con người

Xu hướng nghiên cứu về hoá dược hiện nay trên thế giới đó lànghiên cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốcđường mới vào gốc đường cũ của một số nhóm kháng sinh (7) Vì vậykháng sinh thế hệ mới này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránhđựơc hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đồng thời khả năng thải trừcủa thuốc nhanh hơn

Mục tiêu đề tài là tách dòng và giải trình tự gen novW tham gia sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin Từ việc giải trình tự gen novW

ta dự đoán chức năng của gen nghiên cứu novW, từ đó thiết kế vector

biểu hiện

Đề tài được thực hiện theo các bước cơ bản sau:

1 Thực hiện phản ứng PCR gen novW.

2 Chuyển gen novW vào vector pGEM 7+

3 Giải trình tự gen novW

4 Thiết kế vector biểu hiện ta sử dụng vector pET-32a(+),

là vector biểu hiện để chuyển gen novW vào vector pET-32a(+).

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về kháng sinh

1.1.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh

-Nấm Penicillium notatum

-Chất có tác dụng diệt khuẩn : penicillinÔng được coi là người mở ra kỉ nguyên sử dụng kháng sinh trong yhọc Ông đã được trao Giải thưởng Nobel về y học năm 1945 cùng vớiErnst Boris Chain và Howard Walter Florey về việc tìm ra và phân táchđược penicilin – được coi là loại kháng sinh đầu tiên trong việc điều trịnhững bệnh nhiễm trùng

Năm 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey (Đại HọcOxford) bắt đầu nghiên cứu tác dụng điều trị của penicillin(1)

Ngày 25/5/1940 thử nghiệm tác dụng của kháng sinh thành côngtrên chuột

Edward Abraham nghiên cứu điều chế penicillin tinh chất

Năm 1943 dự án sản xuất penicillin được chính phủ Mỹ đặc biệtchú ý nghiên cứu thử nghiệm và bước đầu sản xuất

Năm 1945, Chain và Florey nhận giải Nobel y học Năm 1939,Chain theo Howard Florey nghiên cứu các tác nhân tự nhiên chống vikhuẩn, do các vi sinh vật sản xuất Việc này đã dẫn ông và Florey xemxét lại công trình của Alexander Fleming, người đã mô tả penicillin 9năm trước đây Chain và Florey đi tới việc khám phá tác dụng chữabệnh của penecillin và thành phần hóa học của nó Ông cũng tạo ra lýthuyết về cấu trúc của penicillin, lý thuyết này đã được xác nhận bởiviệc xác định cấu trúc trong một tinh thể bằng phương pháp chiếu tia X

3 chiều (X-ray crystallography) do Dorothy Hodgkin làm Vì thếChain, Florey và Fleming đã đoạt giải Nobel năm 1945

Sulfonamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào năm 1932

Streptomycin được Selman Waksman và Albert Schatz tìm ra vàonăm 1934

Đến nay, có hơn 1600 chất kháng sinh được tìm ra nhưng chỉ cókhoảng 150 loại là sử dụng rộng rãi ( do phần lớn: độc, có tác dụngphụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành sản xuất cao…)

- Lịch sử phát triển kháng sinh ở Việt Nam

Ở nước ta loại thần dược này đã đánh dấu một bước ngoặt lớntrong công tác cấp cứu và điều trị chiến thương và bảo vệ sức khỏecộng đồng

Năm 1950 trong kháng chiến chống Pháp, GS Đặng Văn Ngữ đãnuôi cấy Penicillium Chryroylum và dùng chiết môi trường nuôi cấy đểđiều trị vết thương cho thương binh

Năm 1968 Bộ môn công nghệ dược, đại học dược hà nội đượcthành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho sựphát triển của ngành công nghiệp kháng sinh, năm 1970 đơn vị nghiêncứu chuyên đề kháng sinh do giáo sư Trương Công Quyền làm chủnhiệm ra đời, hoạt động trong một thời gian nhưng không thành côngrồi giải thể Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nươc ngoài như Liên

Xô (cũ), Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp đỡ sảnxuất, điều chế kháng sinh, sau cũng không thành công do nhiều nguyênnhân(2)

Năm 1985 – 1990 một chương trình nghiên cứu nhà nước 64C bộ y

tế nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclinnhưng kết quả đạt không cao về cả công nghệ lẫn hiệu suất

Như vậy trong một thời gian nghiên cứu cộng tác điều chế sản xuấtkháng sinh gặp rất nhiều khó khăn và chưa thành công

Hiện nay trên thế giới có khoảng 8000 kháng sinh được tìm thấy cónguồn gốc từ vi sinh vật và việc sử dụng kháng sinh không chỉ giớihạn trong lĩnh vực y học mà có áp dụng rộng rãi trong chăn nuôi trồngtrọt và công nghiệp thực phẩm.

1.1.2 Khái niệm về kháng sinh

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hoá học xác định, không cóbản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ visinh vật), với đặc tính là ngay ở nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã có khảnăng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh màvẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị(3)

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay các đối tượng gâybệnh khác - gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mangđặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó, trong đó,những kiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào,rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tếbào chất, làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein, rốiloạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với những giaiđoạn nhất định trong các chuyển hóa trao đổi chất(4)

- Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn.Các nhóm kháng sinh gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Dotác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị cácđại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

- Ức chế chức năng của màng tế bào Các nhóm kháng sinh gồm

có : colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mấtchức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion

bị thoát ra ngoài

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S củaribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác

Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chếenzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vàochuỗi polypeptide

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S củaribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên củachuỗi polypeptide

- Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quátrình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme ADN gyrase làm chohai mạch đơn của ADN không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trìnhnhân đôi của ADN

Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzonic acid)

có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acidnucleotid

Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạonhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic

Mỗi ngày lại có rât nhiều loại kháng sinh được các dược sĩ bào chế

ra bởi vì quá trình kháng kháng sinh của vi khuẩn

1.1.4 Phân loại kháng sinh

Phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách có hệ thống danhmục các kháng sinh ngày càng nhiều thêm, có nhiều cơ sở để phân loạikháng sinh, có thể dựa vào phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, có thể dựa

vào nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay theo cấu trúc hóa học.Dưới đây là cách phân loại dựa theo cấu trúc hóa học Theo cách nàykháng sinh có 9 nhóm chính(3):

1 Các kháng sinh cacbonhydrat

Các saccacrid thuần nhất như nojirimycin

Các aminoglycosid như streptomycin

2 Các lacton macrocylic

Các kháng sinh macrolid như erythromycin

Các kháng sinh polyen như nystatin

3 Các kháng sinh quinon và dẫn xuất

Các tetracylin như tetracylin

Các antracylin như adriamycin

4 Các kháng sinh peptid và axit amin

Các dẫn xuất axit amin như cycloserin

Các kháng sinh β- lactam như penixilin

5 Các kháng sinh dị vòng chứa Nitơ

Các kháng sinh nucleotid như polyoxin

6 Các kháng sinh dị vòng chứa oxy

Kháng sinh polyete monenzin

7 Kháng sinh mạch vòng no

Các dẫn xuất alkan cycloheximid

Kháng sinh steroid như axit fuzidic

8 Các kháng sinh chứa nhân thơm

Các dẫn chất benzen như chloramphenicol

Các chất nhân thơm ngưng tụ như griseofulvin

Các ete thơm như novobiocin_kháng sinh nghiên được nghiên cứutrong đề tài này

Đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng kháng sinh tốithiểu pha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chếhoàn toàn sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn, thí dụ,với penicillin là số miligam penicillin pha vào trong 50 ml môi trườngcanh thang và sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểmđịnh; với Streptomicin là số miligam pha trong 1 ml môi trường canhthang và kiểm định bằng vi khuẩn Escherichia coli)

1.1.6 Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu

Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìmhãm hay tiêu diệt một cách chọn lọc các chủng vi sinh gây bệnh, trongkhi không gây ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho phép trên ngườibệnh được điều trị(3) Đặc tính này được biểu thị qua hai giá trị là:

Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration Viết tắt là MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun BactericidalConcentration - Viết tắt là MBC), xác định trên các đối tượng vi sinhvật gây bệnh kiểm định lựa chọn tương ứng cho mỗi chất kháng sinh

-1.1.7 Phổ kháng khuẩn của kháng sinh

Phổ kháng khuẩn của chất kháng sinh biểu thị số lượng các chủnggây bệnh bị tiêu diệt bởi kháng sinh này Theo đó, chất kháng sinh cóthể tiêu diệt được nhiều loại mầm bệnh khác nhau được gọi là chấtkháng sinh phổ rộng, chất kháng sinh chỉ tiêu diệt được ít mầm bệnh làchất kháng sinh phổ hẹp(3).

1.2 Tổng quan về Novobiocin

1.2.1 Novobiocin

- Novobiocin là kháng sinh thuộc nhóm aminocaumarin được sinh

ra bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces Spherodes sp có tác dụng rất hiệu

quả trong điều trị các bệnh bị nhiễm bởi nhóm vi khuẩn Gram (+) như

Staphylococcus spp., Streptococcus spp, đồng thời có khả năng kháng

lại với các enzim thuộc nhóm beta – lactamase Hiện nay novobiocinđang được sử dụng để bào chế kháng sinh dùng điều trị bệnh cho người

và trong thú y dùng điều trị một số bệnh cho đại gia súc.(5)

1.2.2 Cơ chế tác dụng của Novobiocin

Về cơ chế tác dụng của thuốc, novobiocin có khả năng kìm hãmquá trình tổng hợp ADN của vi khuẩn bởi sự tương tác của thuốc vớitiểu phần B của enzim ADN gyrase (GyrB), enzim này có tác dụngtham gia quá trình cắt và nối ADN vòng để hình thành siêu xoắn(suppercoils) hoặc tham gia sửa chữa lỗi sao chép của quá trình tổnghợp ADN của nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào đơn giản(prokaryotes)(5)

1.2.3 Cấu tạo của Novobiocin

Về cấu tạo, novobiocin bao gồm 3 tiểu phần, gốc đường khửnoviose (ring C), gốc coumarin (ring B) và gốc acit prenylated 4-hydroxylbenzoic (ring A) (hình 1) Trong đó gốc đường noviose có tácdụng tăng tính tan của thuốc và tăng sự tương tác của thuốc với tác

nhân gây bệnh, ring B và ring A có vai trò chính trong quá trình gây bấthoạt chức năng của enzyme tại trung tâm hoạt động của enzim ADNgyrase.(6) (Hình 1)

1.2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về novobiocin

Năm 2000 nhóm gen tham gia vào con đường sinh hóa tổng hợpnovobiocin đã được tách dòng thành công bởi nhóm nghiên cứu MSteffensky và các cộng sự Toàn bộ đoạn ADN với tổng số 26,5 kb và

với 23 gen (ORFs) nằm trên hệ gen của xạ khuẩn Streptomyces

Spheroides sp NCIB 11891 đã được giải trình tự và công bố trên ngân

hàng gen (genbank – NCBI) Bằng cách so sánh trình tự với các gentương tự trên ngân hàng gen tất cả chức năng của từng ORF trongnhóm gen đó đã được dự đoán Tuy nhiên để chứng minh chức năngnày cần phải có các nghiên cứu tiếp theo bằng các nghiên cứu thựcnghiệm.(7)

Hình 1 Cấu trúc hóa học của kháng sinh novobiocin

Tên khoa học:

enyl)benzamido]-8-methylcoumarin-7-yl 3-O-carbamoyl-5,5-di-C-methyl-α-l-lyxofuranosideCông thức phân tử: C31H36N2O11

4-Hydroxy-3-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-Khối lượng phân tử: 612.624 đvc

Theo như công bố của nhóm nghiên cứu C T Walsh năm 2008 vàcác cộng sự, gốc coumarin là gốc chính tương tác với enzim gyrase của

vi khuẩn và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chính Gốc này được bắtđầu tổng hợp từ tyrosin dưới sự xúc tác của các enzyme được tạo ra từ

novH, novJ, novK và cuối cùng được kết thúc bằng hoạt tính của enzim novH (hình 3) Các gen này được tách dòng chứng minh hoạt tính bằng

phương pháp gây đột biến ngoài ra gen tách dòng được biểu hiện trên

vật chủ E.coli các enzim được được tinh sạch và chứng minh hoạt tính

đã chuyển vào hệ gen Streptomyce coelicolor từ đó đã tạo được chủng

tái tổ hợp mới, cùng với phương pháp gây đột biến điểm hoặc đột biếnthay thế một số gen trong nhóm gen vật chủ tái tổ hợp mới đã tạo rahàng loạt các chất dẫn xuất mới của aminocoumatin hay chính là cácthế hệ aminocoumarin mới

1.2.5 Ứng dụng novobiocin

Novobiocin là một kháng sinh chống lại sự hoạt động củaStaphylococcus epidermidis và có thể đã được dùng để nhận biết vi

khuẩn coagulase-negative Staphylococcus saprophyticus – Một vi

khuẩn kháng lại được với novobiocin Trong nuôi cấy novibiocin đượcđặt và dùng với cái tên Albamycin (Pharmacia And Upjohn) năm 1960.Hiệu quả của nó đã được chứng minh thử nghiệm trong các thuốc điềutrị bệnh Novobiocin có hiệu lực trong điều trị MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus )

1.3 Đường khử

1.31 Gốc đuờng trong cấu trúc kháng sinh

Đường khử là gốc đường đặc biệt được tìm thấy rất nhiều trong cấutrúc tế bào vi khuẩn, trong tế bào nấm, trong cấu trúc của rất nhiều cácchất có hoạt tính sinh học và trong thành phần cấu trúc của rất nhiềuthuốc kháng sinh hay các chất chống ung thư (1) Về cấu tạo các chấtđường khử là chất mà trong phân tử của chúng có một hay nhiều hơnmột nhóm hydroxyl (-OH) được thay thế bởi nguyên tử H hay cácnhóm chức khác như amino, methyl, alkyl….Các loại đường khử này

có thể tồn tại ở dạng đường đơn hay đường đa hoặc phân nhánh và làdẫn xuất của các sản phẩm trao đổi chất bậc 2 trong các hợp chất tựnhiên (5)

Trong các chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai trò quantrọng đối với xác định hoạt tính của các chất này, có rất nhiều cácnghiên cứu đã chứng minh rằng các chất hoạt tính sinh học sẽ bị mấthoàn toàn hoạt tinh nếu như gốc đường trong cấu trúc bị loại bỏ(6)

Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật đường khử tham gia tạo thành cấutrúc peptidoglycon là thành phần của lớp thành tế bào của rất nhiều loài

vi sinh vật đặc biệt là một số vi khuẩn gram dương hoặc hình thành lớpLipopolyscharide trong cấu trúc màng tế bào của nhóm gram âm

1.3.2 Một số các nghiên cứu về gốc đường khử

- Theo như nghiên cứu (7) gốc đường khử trong nhóm kháng sinhenedine có vai trò quyết định hoạt tính kháng khuẩn của chất khángkhuẩn, nghiên cứu cho thấy gốc đường rhamnose trong kháng sinhcalicheamicin đóng vai trò làm cầu nối liên kết phân tử kháng sinh vớienzyme tham gia vào quá trình sao mã hay sinh tổng hợp mRNA

- Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gốc đường khử trong nhóm khángsinh macrolide như erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai tròtrong gắn kháng sinh này với các enzyme tham gia tổng hợp proteincủa vi khuẩn

- Việc nghiên cứu vai trò của gốc đường đã chỉ ra rằng nếu mất đigốc đường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật sẽ gây ứcchế sự sinh truởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật (6)

- Xu hướng nghiên cứu về hoá dược hiện nay trên thế giới đó lànghiên cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốcđường mới vào gốc đường cũ của một số nhóm kháng sinh (7) Vì vậykháng sinh thế hệ mới này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránhđựơc hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đồng thời khả năng thải trừcủa thuốc nhanh hơn

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh vật

- Hầu hết đường khử trong cấu trúc kháng sinh đựợc sinh ra từ visinh vật là đường 6- deoxyhexose Tiền chất đầu tiên tham gia quá trìnhsinh tổng hợp các gốc đường này đều bắt đầu từ glucose -1- phosphatequa một chuỗi các phản ứng sinh hoá trong tế bào được xúc tác bởinhóm enzyme và kết quả là tạo ra được gốc đường khử có thể 1 haynhiều hơn 1 nhóm OH bằng các nguyên tử H, nhóm -CH3, nhóm =O,hay nhóm CHO- (hình 3)

1.3.4 Con đường sinh tổng hợp đường Novioce

- Giới thiệu về đường novioce

Trong các kháng sinh đại phân tử gốc đường khử có vai trò vôcùng quan trọng trong việc tăng tính tan của chúng trong dung môi,tăng khả năng tương tác của thuốc với tác nhân gây bệnh Trong đó gốc

đường noviose (ring C) (hình 2) có vai trò rất lớn trong việc xác địnhphổ kháng khuẩn của gốc Coumarin bởi các 3 nhóm methyl tromg phân

tử đường và chính phân tử noviose giúp cho gốc Coumarin của khángsinh này tương tác tốt hơn với enzim gyrase (GyrB) (Hình 2)

- Con đường sinh tổng hợp đường novioce.

Quá trình sinh tổng hợp đường noviose được bắt đầu từ đườngGlucose- 1- phosphate dưới sự hoạt động của enzyme dTDP-D-glucose

synthase novV, sự xúc tác của emzyme dTDP – dehydratase novT để hình thành của dTDP-4-keto-6 deoxyglucose như

D-glucose-4,6-một chất trung gian trong con đường sinh tổng hợp phần lớn đườngdeoxy từ dTDP-D-glucose Quá trình đồng phân hóa dTDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose được thực hiện dưới sự xúc tác của enzyme dTDP-4-

keto-6-deoxy-D-glucose 3,5-epimerase được mã hóa bởi novW Bước

tiếp theo trong sinh tổng hợp noviose Quá trình methyl hóa tại C5 bởi

enzyme 5-methyltransferase được mã hóa bởi novU, sự khử C4

carbonyl carbon được thực hiện bởi enzyme 4-ketoreductase được mã

hóa bởi novS và enzyme O-methyltransferase được mã hóa bởi novP.

Sự gắn đường deoxy vào phân tử coumarin trong kháng sinh coumarin

và vào aglycons trong những kháng sinh khác bởi enzymeglycosyltransferases trước khi quá trình methyl hóa vào nhóm 4-hydroxyl của vòng pyranose Những giả thuyết về chức năng của

proteins được mã hóa bởi novW, novS, novU được đưa ra bởi sự so

sánh về độ tương đồng của trình tự axit amin đã biết và đã được đăng

ký trên ngân hàng gen thế giới 8) Tuy nhiên để chứng minh chức năngcủa các gen này bằng các nghiên cứu thực nghiệm và các phuơng phápnghiên cứu khác thì chưa được thực hiện

Để khám phá chức năng của các sản phẩm của gen novWSU trong

quá trình sinh tổng hợp đường noviose Chúng tôi đã clined và biểuhiện những gen này trong E coli và tiến hành các thí nghiệm kiểm tranhững đặc tính đã biểu hiện

1.3.5 Giới thiệu về gen novW

Gen novW trong nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp

gốc đường khử noviose trong cấu trúc kháng sinh novobiocin đuợc dựđoán là gen có tên 3,5 epimerase hay gen này có chức nănng là thamgia xúc tác cho phản ứng chuyển đồng phân 2 nhóm methyl (-CH3) ở vịtrí C6 và chuyển vị trí nhóm OH ở vị trí C3 từ vị trí mằt phẳng phíatrên xuống mặt phẳng phía duới vuông góc với mặt phảng không giancủa gốc đường dTDP – noviose (hình 8, hình 9)

Hiện nay, có rất ít các nghiên cứu về các nhóm gen tham gia tạokháng sinh và đặc biệt chưa có nghiên cứu nào công bố về các gentham gia sinh tổng hợp đuờng khử Vì vậy việc nghiên cứu về các genđường này vô cùng quan trọng nó giúp cho các nhà nghiên cứu tìm ra

cơ chế tổng hợp kháng sinh và từ đó có thể tác động đến con đuờngsinh tổng hợp kháng sinh ở mức độ phân tử theo ý muốn Từ những ýnghĩa trên nhóm nghiên cứu đã thực hiện nghiên cứu với tên là

“ Nghiên cứu tách dòng, giải trình tự và thiết kế vector biểu hiện

gen novW tham gia sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin”

Hình 2 Con đường sinh tổng hợp đường noviose (ring C)

O HO

HO

OH

OH OPO - 3

O HO

HO

OH

OH OdTDP

O O

HO

OH OdTDP

phân tử đường để hình thành nên các cấu trúc đườngkhác nhau

Hình 4: Chuỗi gen tham gia sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin

Gen novW khoanh tròn, nằm ở cuối chuỗi

Hình 5: Mô tả vai trò đồng phân hóa của gen novW

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU

NGHIÊN CỨU2.1 Hóa chất

Enzyme cắt giới hạn, Emzyme Arnase được cung cấp bởi Công tyTakara ( nhật bản) được dùng trong cloning và các phản ứng cắt ADN

bằng enzyme giới hạn, enzym EcoRI, Hind III dùng để cắt gen novW

Kháng sinh ampicillin được cung cấp bởi công ty hóa chất xich-ma(U.S.A), dùng trong nuôi cấy vi khuẩn, tạo môi trường có kháng sinhtrong nuôi cấy chủng vi sinh vật có khả năng kháng sinh, thử khángsinh

TE buffer, Isopropanol, cồn 70 và 90 độ (Sigma U.S.A), Sử dụngtrong tách plasmid

Cao nấm men, trypton, NaCl, agar, (Sigma U.S.A), dùng để phamôi trường nuôi cấy vi sinh vật

Tris.Cl, EDTA, NaOH, SDS, potassium, acetate, nước cất (Takara-nhật bản) dùng pha dung dich solution I, II, III dùng trong táchplasmid.

TBE 5X dùng pha dung dịch chạy điện di

Ethybromine (Takara - nhật bản), dùng trong chạy điện di ADN.Buffer loading, được cung cấp bởi công ty hóa chất dùng trongchạy điện di ADN

2.2 Một số thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu

Máy nhân gen PCR dùng nhân gen

Máy chạy điện di ADN dùng chạy điện di ADN

Máy soi ADN UV-high performance ultraviolet transilluminatordùng soi ADN

Máy lắc vortex, Dùng lắc, trộn, hòa tan dung dich

Máy ly tâm dùng ly tâm

Nồi hấp vô trùng dùng hấp vô trùng thiết bị và môi trường nuôicấy

Tủ cấy UV dùng trong cấy vi sinh vật

Tủ ấm dùng nuôi vi sinh vật trong môi trường LB đặc

Tủ lắc dùng nuôi vi sinh vật trong môi trường LB lỏng

Tủ lạnh, tủ đông dùng trong bảo quản môi trường, hóa chất và giữgiống vi sinh vật

Thiết bị khác như bình ổn nhiệt, cân điện tử, pipet, ống nghiệm,bông, đĩa pettri,

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy

1 Chủng vi sinh vật

Trong đề tài chủ yếu sử dụng hai chủng vi khuẩn là chủng E coli XL1 Blue và chủng E.coli BL21 DE3

2 Điều kiện nuôi cấy:

Chủng E coli XL1 Blue và chủng E.coli BL21 DE3 được nuôi cấy

trong môi trường LB lỏng ở chế độ lắc, với điều kiện nhiệt độ là 370C,trong khoảng thời gian từ 14h – 16h Hoặc chúng được nuôi cấy trongmôi trường LB đặc, trong tử ấm 370C, với thời gian khoảng 14h- 16h

Với chủng vi khuẩn đã chuyển gen novW thì có thể sống trong môi

trường LB có bổ sung thêm kháng sinh( 1mg/1l)

2.3.2 Vector và plasmids tái tổ hợp

Những vector và plasmids tái tổ hợp được sử dụng trong nghiêncứu là:

Vector pGEM7+, dùng làm vector cloning sản phẩm PCR, xuất xứ

Giới hạn trình tự pET-32a(+)

Điểm khởi đầu f1 5434-5889

- Vector pGEM7 + : là một plasmid có 3033 bp, dùng làm công cụ

trong tách dòng và giải trình tự gen.( hình 7)