Khóa luận nghiên cứu sử dụng ba gene IS6110; IS1081 và 23s trong chẩn đoán lao bằng kỹ thuật multiplex PCR

Một số cơ sở trong nước đã áp dụng sinh học phân tử vào trongchẩn đoán lao nhưng các cơ sở này phần lớn sử dụng các bộ kít đã đượcthương mại hóa trên thị trường, các bộ kít đó chủ yếu dự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn : TS Nghiêm Ngọc Minh

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Vân

Hà Nội - 2010

LỜI CẢM ƠN!

Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới

TS Nghiêm Ngọc Minh Trưởng phòng Công nghệ sinh học môi trường

-Viện Công nghệ sinh học - -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tậntình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài luậnvăn này

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộPhòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học - Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đặc biệt là CN Nguyễn Văn Bắc và KS.

Cung Thị Ngọc Mai đã giúp đỡ chỉ bảo tận tình cho em trong quá trình học

tập và nghiên cứu tại phòng

Em cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy, cô Khoa Công nghệ Sinhhọc - Viện đại học Mở Hà Nội, Lãnh đạo Viện Công nghê sinh học đã tạođiều kiện và giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường vàViện

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè,những người thân yêu của em đã luôn động viên, ủng hộ và tạo điều kiện vềvật chất cũng như tinh thần cho em hoàn thành tốt bản luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2010.

Sinh viên

Nguyễn Thị Vân

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

E.coli Escherichia coli

DNA Deoxyribonucleic Acid

MOTT Mycobacterium other than tuberculosis

MTBC Mycobacterium tuberculosis complex

MỞ ĐẦU

Hàng ngàn năm nay, lao được coi là bệnh truyền nhiễm mãn tính đồnghành cùng lịch sử phát triển loài người Hiện nay, bệnh lao đang được khuyếncáo là một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất thế giới cùng với hộichứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét Theo thống kê của Tổchức Y tế thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới.Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc bệnh lao mới và 3 triệu ngườichết do lao Tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy, cònrất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộngđồng Việt Nam đứng thứ 13 trong số 22 nước có số bệnh nhân lao cao trênthế giới (WHO 2004), trong khu vực Tây – Thái Bình Dương, Việt Nam đứngthứ 3 sau Trung Quốc và Philipinne [2] Trước tình hình trên, WHO khẩnthiết kêu gọi tất cả các quốc gia trên thế giới phải đặt biệt quan tâm, tích cựcphòng chống và kiểm soát bệnh lao Bệnh lao hiện đang trở nên nghiêm trọngvới đặc trưng là lao kháng thuốc Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việcchuẩn đoán nhanh và chính xác Tuy vậy việc chuẩn đoán lao còn gặp nhiềukhó khăn

Ở Việt Nam hiện đang áp dụng phương pháp nhuộm Ziehl- Neslsen,nhưng với phương pháp này phải cần điều kiện số lượng vi khuẩn lao ≥ 104

AFB/1ml bệnh phẩm, nên nhiều trường hợp cho kết quả âm tính giả Nuôi cấy

vi khuẩn trên môi trường Lowenstein là tiêu chuẩn vàng để chuẩn đoán nhưngphương pháp này lại cần nhiều thời gian (4- 8 tuần) mới cho kết quả do vậykhó đáp ứng yêu cầu chẩn đoán nhanh, chính xác để giám sát và thanh toán vi

khuẩn lao Một số cơ sở trong nước đã áp dụng sinh học phân tử vào trongchẩn đoán lao nhưng các cơ sở này phần lớn sử dụng các bộ kít đã đượcthương mại hóa trên thị trường, các bộ kít đó chủ yếu dựa trên phản ứng nhânđoạn trình tự đặc

trưng IS6110 ở vi khuẩn lao Tuy nhiên, gần đây một số nghiên cứu đã công

bố có tỷ lệ nhất định các chủng lao không chứa trình tự IS6110, nhất là cácchủng được tìm thấy ở Đông Nam châu Á và Ấn Độ kể cả ở Việt Nam [20]

Do đó cần có một giải pháp mới cho sinh học phân tử chẩn đoán lao nhằmnâng cao hiệu quả chẩn đoán tại Việt Nam

Để khắc phục những vấn đề trên, tại phòng Công nghệ sinh học môi

trường-Viện Công nghệ sinh học đã tiến hành: “Nghiên cứu chế tạo bộ kít sử dụng ba gene IS6110; IS1081 và 23S trong chuẩn đoán lao bằng kỹ thuật Multiplex PCR” và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ Tuy nhiên, việc

thử nghiệm và đánh giá tính chính xác của bộ kít qua việc xác định ba geneđích là một phần quan trọng trước khi bộ kít được đưa vào sử dụng tại các cơ

sở y tế

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu sử dụng ba gene

IS6110; IS1081 và 23S trong chẩn đoán lao bằng kỹ thuật Multiplex PCR”

đã được tiến hành với nội dung nghiên cứu bao gồm:

1- Thử nghiệm hệ thống multiplex PCR phát hiện vi khuẩn lao đối với cácmẫu bệnh phẩm lâm sàng

2- Đánh giá hiệu quả của hệ thống multiplex PCR bằng phương pháp xácđịnh trình tự 3 đoạn gene đích

Nội dung nghiên cứu trên được thực hiện tại Phòng Công nghệ sinh học môitrường - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nhánh cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tối ưu hóa

quy trình xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”, Mã số: KC.10.15/06-10-04

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO

Lao là một bệnh truyền nhiễm mãn tính, là tình trạng nhiễm vi khuẩnđến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (laokê), xương và khớp Lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và thường gặp nhất

Theo thống kê của WHO năm 2007, khoảng 1/3 dân số thế giới

(khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M tuberculosis và 10% trong

số đó sẽ phát triển thành bệnh tại một thời điểm nào đó trong đời Riêng năm

2005 toàn thế giới có gần 8,8 triệu người mắc bệnh lao và đã dẫn tới 1,6 triệungười bị chết Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ởcác nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độtuổi lao động

Việt Nam đứng thứ 13 trong số 22 nước có số bệnh nhân lao cao trongtoàn cầu Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sauTrung Quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao cũng như số bệnh nhânlao xuất hiện hằng năm [2]

Hiện nay nguy cơ nhiễm lao ở nước ta hàng năm ước tính là 1,5% (ởcác tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%) Trên thực tế, chỉ sốnguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5%, như vậy các con số nêutrên còn có thể lớn hơn Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tácchống lao không những trong năm tới mà có thể trong thời gian khá dài

Tuy nhiên, bệnh lao vẫn còn gặp nhiều khó khăn trong việc chẩn đoán

và điều trị, những năm gần đây việc áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện vi

khuẩn lao M tuberculosis là một bước đột phá và mang lại kết quả khả quan.

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN LAO

Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobateria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium

Tên khoa học của vi khẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis

Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm 2 nhóm

Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm :

M tuberculosis, M bovis, M africanum, M microti, M canetti…

Trong đó M tuberculosis và M bovis gây bệnh lao điển hình.

Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm:

M avium, M ortuitum, M govdovac, M kansasii…

Nhóm này không gây bệnh lao [4, 20]

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc

 Cấu trúc hình thể

Vi khuẩn lao được Robert Koch phát hiện khoảng 100 năm trước đây,trực khuẩn có hình que, kích thước 2-3 µm, dầy 0.3 µm, kháng cồn, khángacid (hình 1.1) Nhuộm Ziehl – Neelse trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm,không bị cồn và acid làm mất màu carbonfuchsin, vì vậy chúng được gọi làtrực khuẩn kháng cồn kháng toan (acid fast bacilli – AFB), đây là đặc điểmnổi bật của mycobacteria Đặc điểm này rất quan trọng trong việc phát hiện vikhuẩn lao đặc biệt là trong các mẫu bệnh phẩm Một số giả thiết cho rằngmức kháng với acid là độ dài của các chuỗi acid mycolic Trực khuẩn trongdịch huyền phù duy trì tính kháng acid trong khoảng thời gian rất dài thậm chí

chịu tác dụng của nhiệt M.tuberculosis

có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, acidamin và các enzyme co- factor thiết yếu của tế bào [3, 4, 5, 8].

Cấu trúc thành tế bào ( hình 1.2)

M.tuberculosis có thành tế bào không bình thường, cấu trúc thành 4 lớp,

bề mặt giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu, kiểm soát con đường hòa tan giữa

tế bào chất và môi trường

Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là cácphospholipid Các phân tử phospholipid bao gồm hai nhóm, nhóm ưa nướchướng về bên trong và nhóm kị nước hướng về bên ngoài, quay ra phía vỏ [1].Màng sinh chất của mycobacteria điều hòa sự thẩm thấu giữa nguyên sinh

chất và môi trường, màng chứa các protein có chức năng khác nhau như phân

tử nhạy (sensor) với nồng độ của các phân tử trong môi trường, các proteintruyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất,các enzyme liên quan đến quá trình trao đổ chất và sinh năng lượng, các chấtmang làm trung gian cho vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion Cácenzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia

tế bào, tập hợp và tiết một số protein ngoại bào, sao chép DNA [3, 5, 8]

Lớp tiếp theo là peptidoglycan liên kết với đường arabinose và cácphân tử mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảocho vỏ vi khuẩn có độ cứng nhất định [1] Thành tế bào của Mycobacteria làcấu trúc phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có một số thành phần hóa học

và nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành

tế bào M.tuberculosis là 70 - 80% trong khi E.coli là 20 – 30%.

Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid vàcác chất lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấutrúc làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn giúp trực khuẩntồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thựcbào và các tế bào miễn dịch [1] Bám với peptidoglycan là mộtpolysaccharide phân nhánh, arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử nàyđược ester hóa với acid béo có khối lượng phân tử cao là acid mycolic Sự sắpxếp của các acid mycolic có tính đặc hiệu loài cho phép xác định loàimycobacteria bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí -

lỏng Các acid mycolic đặc hiệu M.tuberculosis là alpha – keto và

mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 cacbon Lớp ngoàicủa thành tế bào có các phân tử lipid tự do như phthiocerol dimycoserosates(PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalose - containing glycolipids vàsulfolipids (SL) Nằm ngang qua toàn bộ lớp màng là một số glycolipid nhưphosphatidyl - myoinoinositol mannosides, lipomanan (LM) và

lipoarabinomanan (LAM), được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bênngoài thành tế bào trong đó LAM có tính đặc hiệu loài Thành tế bàomycobacteria chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này có tác dụngcấu trúc thành tế bào, một số protein porin hình thành các kênh ưa nước chophép vận chuyển tích cực các chất tan trong nước thông qua lớp acid mycolic.Porin ở mycobacteria khác so với vi khuẩn Gram âm

Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vikhuẩn lao phát triển bên trong tế bào, nó có tác dụng tăng cường như một lớp

áo giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống được các enzyme phân giải

từ các lysozyme của tế bào [1] Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng

hoặc trong đại thực bào, M tuberculosis tích lũy một capsule giả không bám.

Thành phần của capsule có thể bung ra trong in vitro bên trong các đại thựcbào Màng tế bào của vi khuẩn lao gây bệnh đa phần giống với màng của cácmycobacteria trong cùng một giống bao gồm cả mycobacteria không gâybệnh

Hình 1.2 Cấu tạo thành tế bào của M Tuberculosis

[http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biolo

gy_cell.htm]

Khả năng đặc biệt để sống sót trong tế bào động vật có vú, khả nănggây bệnh và các đặc tính sinh miễn dịch dường như bắt nguồn từ tự nhiên củamột số phân tử thành tế bào vi khuẩn Màng tế bào của vi khuẩn lao dườngnhư là một cấu trúc linh động có thể thay đổi khi phát triển hoặc tồn tại trongcác môi trường khác nhau Sự dầy lên của thành tế bào có thể quan sát trongcác điều kiện thiếu oxy, sự biểu hiện của các geneme mã hóa cho các porindường như được điều hòa ngược trong các điều kiện môi trường nhất địnhnhư trong môi trường nuôi cấy acid nhẹ cũng như trong khoang đại thực bào.Ngoài ra sự hình thành cấu trúc cord liên quan đến Trehalose 6,6’ - dimycolate

là một glycolipid chứa hai phân tử acid mycolic bám lỏng lẻo ở lớp bên ngoàithành tế bào Rất nhiều các hoạt tính sinh học liên quan đến khả năng gâybệnh, tính sinh độc tố và bảo vệ chống lại đáp ứng của tế bào chủ [3, 5, 7, 8]

Trong điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại 3 đến 4 tháng,trong điều kiện phòng thí nghiệm người ta có thể giữ và bảo quản chúng trongnhiều năm Tuy nhiên dưới ánh sáng mặt trời thì sau 1,5 giờ vi khuẩn lao sẽ bịtiêu diệt Dưới ánh sáng của tia cực tím, vi khuẩn lao chỉ tồn tại được 2-3phút Ở nhiệt độ 420C vi khuẩn lao ngừng phát triển, ở nhiệt độ 800C vi khuẩnlao chết sau 10 phút [1, 6]

1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điềukiện kị khí Nhiệt độ thích hợp để mọc là 370C Hầu như không mọc ở nhiệt

độ dưới 370C hoặc trên 420C Không nuôi được vi khuẩn lao trong môi trườngthông thường, phải nuôi trong môi trường đặc biệt, giàu chất dinh dưỡng Môitrườg thường dùng là môi trường đặc Loewenstein đươc cải tiến bởi Jensen(hoặc môi trường lỏng Sauton) Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, phảimất 4 - 6 tuần sau mới hình thành khuẩn lạc điển hình, dạng R Trong môi

trương nuôi cấy M tuberculosis gây bệnh phát triển thành các khuẩn lạc xù xì

trong môi trường đặc, bề mặt ngoài dính và uốn khúc (hình 1.3) Trong khi đócác mycobacteria không gây bệnh và các trực khuẩn lao bị làm suy yếu đitrong nuôi cấy kéo dài thường phát triển các khuẩn lạc nhẵn, tạo thành đámtrong môi trường nuôi [3, 5, 8]

Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn lao phát triển trong môi trường nuôi cấy[http://images.google.com.vn/images?hl=vi&gbv=2&tbs=isch:1&q=m.

+tuberculosisi&sa=N&start=80&ndsp=20]

Thời gian phân chia: Dưới điều kiện phòng thí nghiệm, M.

tuberculosis cứ 12 đến 24 giờ phân chia một lần Tốc độ phát triển chậm có

thể do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ các chấtdinh dưỡng và liên quan tới tốc độ tổng hợp ribosome Harshey vàRamakrishnan đã xác định rằng tổng hợp RNA là một tác nhân chính liênquan tới thời gian sống dài của trực khuẩn Tỷ lệ RNA trên DNA, tốc độ kéo

dài chuỗi RNA chậm hơn 10 lần so với E.coli Một đặc điểm khác là chỉ tồn

tại một operon duy nhất cần thiết trong tổng hợp RNA Hơn nữa, khi trựckhuẩn chuyển từ trạng thái ổn định sang phân chia thì RNA tổng số chỉ tănglên hai lần Kết quả là tổng hợp protein bị chậm lại

1.2.3 Hệ gene vi khuẩn lao

1.2.3.1 Đặc điểm hệ gene M tuberculosis

M tuberculosis H37Rv (Taxonomy ID: 83332, ACCESSION

NC_000962) chứa một trình tự gồm 4.411.529 bp, có đặc tính chứa nhiềuGuanine và Cytosine (G +C 65,5%) không thay đổi ở các vị trí khác nhautrong toàn bộ hệ gene, kiểm chứng cho giả thuyết là không có các nhân tố

chuyển gene theo phương ngang trong hệ gene M tuberculosis.