Khóa luận nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn quang hợp tía có khả năng cố định nitơ phân tử

Trong số cácnhóm vi sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử, người ta đang chú trọngđến nhóm vi khuẩn quang hợp tía vì chúng có khả năng sử dụng nhiều hợpchất trong tự nhiên làm nguồn

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, chúng ta đều biết ô nhiễm môi trường đã trở thành vấn đềbức xúc đối với mỗi quốc gia Sự gia tăng dân số và phát triển sản xuất đã kéotheo sự tích tụ ngày càng nhiều các loại chất thải trong lòng đất, các thủy vực

tù đọng Hiện nay, toàn cầu đang phải đối mặt với sự biến đổi khí hậu, trong

đó các nước nhiệt đới phải chịu ảnh hưởng nặng nề nhất Liên hợp quốc đangkêu gọi mỗi Quốc gia cần phải có các biện pháp cấp bách để giảm thiểu đượctối đa những yếu tố gây ảnh hưởng đến môi trường, khí hậu

Trong sản xuất Nông nghiệp ngày nay, việc lạm dụng các hóa chấttrong phân bón hóa học, thuốc trừ sâu… đã gây ảnh hưởng xấu đến môitrường và làm nghèo đất, làm ành hưởng tới quần thể vi sinh vật đất làm mấtcân bằng sinh thái Do đó, người ta khuyến cáo nên dùng phân bón hữu cơ vàphân bón vi sinh trong sản xuất nông nghiệp nhằm mang lại sự bền vững sinhthái

Theo hướng nghiên cứu này, nhiều nhà khoa học đã sử dụng các nhóm

vi sinh vật có ích trong đất, đặc biệt nhóm có khả năng cố định nitơ phân tử

để sản xuất các chế phẩm sinh học sử dụng trong nông nghiệp Trong số cácnhóm vi sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử, người ta đang chú trọngđến nhóm vi khuẩn quang hợp tía vì chúng có khả năng sử dụng nhiều hợpchất trong tự nhiên làm nguồn Carbon cho sinh trưởng nên dễ dàng sản xuấtsinh khối của chúng Mặt khác, có thể tận dụng các nguồn nước thải nôngnghiệp làm môi trường nuôi để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, sinh khối saukhi xử lý có thể được sử dụng làm phân bón vi sinh cố định nitơ

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu này ít được chú ý, trước đây người tathường sử dụng vi khuẩn lam, vi khuẩn nốt sần để tạo các chế phẩm phân bón

vi sinh nhưng chưa đề cập đến nhóm vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) Do

đó, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng

Đề tài được nghiên cứu theo hai nội dung chính:

 Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng cố định nitơphân tử phân lập được ở Việt Nam

 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 Chu trình Nitơ trong tự nhiên:

Chu trình N là chu trình trong đó không khí là kho dự trữ đồng thời làvan bảo hiểm của hệ thống Giữa chu trình và không khí có sự trao đổi thườngxuyên: N phân tử chuyển thành N liên kết qua các quá trình cố định N sinhhọc, do tác dụng của điện và cố định quang học

Phản nitrate là quá trình ngược lại Nguồn nitơ để tổng hợp các aminoacid và protein được lấy từ đất và nước bởi cây ở dạng nitrate Cơ thể thực vậtđược động vật ăn và chúng dùng các amino acid từ các protein của thực vật đểtổng hợp nên amino acid, protein, nucleic acid và các hợp chất nitơ khác củariêng mình Những vi khuẩn hoại sinh sẽ biến đổi những hợp chất nitơ đóthành amoniac khi các động vật hoặc thực vật chết Các động vật cũng thải ranhiều loại chất thải chứa ure, acid uric, creatinin và amoniac Các vi khuẩnphân hủy biến đổi acid uric và ure thành amoniac Những amoniac này đượcbiến đổi bởi các vi khuẩn nitrite sang nitrite và tiếp tục biến đổi thành nitratenhờ các vi khuẩn nitrate Một số các amoniac được biến đổi sang nitơ khôngkhí bởi các thành phần vi khuẩn khử nitrate Nitơ không khí đến lượt mình cóthể được biến đổi sang amino acid và các hợp chất nitơ hữu cơ khác bởi một

số vi khuẩn lam, vi khuẩn quang hợp và vi khuẩn đất

Một số loài vi khuẩn khác thuộc giống Rhizobium mặc dù tự mình

không cố định được nitơ không khí, nhưng lại có khả năng làm được việc nàynhờ hợp tác với tế bào của rễ cây họ đậu hay một vài loại rau củ khác Vikhuẩn xâm nhập vào rễ cây và kích thích cây họ đậu hình thành các nốt sần ở

rễ Sự hợp tác của tế bào cây họ đậu và tế bào vi khuẩn để có khả năng cốđịnh đạm là một quá trình không thể thực hiện được một mình Vì vậy, cáccây họ đậu thường được trồng để phục hồi độ phì nhiêu của đất sau khi loàicây khác được trồng ở đó nhiều vụ Nitơ khí quyển cũng còn được cố địnhnhờ năng lượng điện hoặc sấm sét tự nhiên Mặc dù, nitơ chiếm 4/5 khí củakhí quyển, nhưng chỉ có một vài loại thực vật có khả năng dùng được nitơ

phân tử Khi các cơ thể của vi khuẩn cố định nitơ chết, các amino acid đượcđồng hóa thành amoniac và sau đó được biến đổi sang nitrite và nitrate nhờcác vi khuẩn nitrite và nitrate hóa.

Hình 1 Chu trình N trong tự nhiên

I.2 Quá trình cố định Nitơ.

I.2.1 Quá trình cố định nitơ trong tự nhiên:

Sự sống của vạn vật trên trái đất đều có nhu cầu đối với các hợp chất nitơ

để tạo ra các hợp chất cơ bản như protein và các axit nucleic Trong không khí,nitơ phân tử chiếm 79% nhưng chỉ một số loài vi sinh vật sử dụng được nitơ ởdạng này Nitơ phân tử có thể chuyển thành các hợp chất nitơ vô cơ khác dướicác hình thức: cố định trong không khí, tổng hợp thành các hợp chất nitơ nhờphương pháp hóa học dưới điều kiện nhiệt độ và áp suất không khí cao (nhiệt độkhoảng 500oC, áp suất không khí khoảng 200atm) và thông qua quá trình cốđịnh nitơ sinh học Quá trình cố định nitơ sinh học được thực hiện chủ yếu nhờmột số loài vi khuẩn Để tiến hành quá trình cố định nitơ sinh học đòi hỏi vi sinhvật phải có một phức hợp các enzyme tham gia và nhu cầu sử dụng ATP tươngđối lớn

I.2.2 Các nhóm vi sinh vật có khả năng cố định N 2

I.2.2.1 Vi khuẩn nốt sần:

- Vi khuẩn nốt sần: thuộc loại hiếu khí không tạo bào tử có thể đồng hóanhiều nguồn cacbon khác nhau, pH thích hợp: 6,5-9,5, nhiệt độ phát triểnthích hợp: 24-26oC Phân loại vi khuẩn nốt sần có nhiều ý kiến chưa thốngnhất:

+ Theo Todorovic chia vi khuẩn nốt sần ra 2 loài: Rhizibiomonas

leguminosarum và Rhizobacterum leguminosrum

+ Theo Bergli thì chi Rhizobium bao gồm 6 loài vi khuẩn nốt sần:

R.leguminosarum, R.phaseoli, R.Trifolii, R.lupini, R.sapnicum, R.meliloti.

Vi khuẩn sau khi tiếp xúc với lông hút của thực vật, tạo thành dãy xâmnhập đi dần vào bên trong của rễ và xâm nhập vào nhu mô kích thích tế bàothực vật bị phân chia nhanh chóng thành tế bào mới Vi khuẩn đi vào tế bàochất và phân chia chuyển thành thể giả khuẩn Giả khuẩn không phân chiađược nhưng phát triển mạnh tăng nhiều ribosom, nốt sần xuất hiện

Nốt sần thích hợp ở các điều kiện: Độ ẩm của đất: 60 - 70%; Độ thoángkhí: càng nhiều càng tốt, điều này cho thấy rễ càng sâu lượng nốt sần càngkém; pH thích hợp từ 4,6-8,0; Phân đạm thường ức chế tạo thành nốt sần;Phân lân, kali có tác dụng tích cực; Phân canxi, magiê và các muối khác cũng

có tác dụng tốt đến quá trình tạo thành nốt sần; Chất dinh dưỡng cacbon như

nước đường, rơm, rạ làm tăng khả năng xâm nhập và khả năng cố định nitơ,ngược lại những vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh sẽ gây ức chế vi

khuẩn Rhizobium

I.2.2.2 Vi khuẩn hiếu khí sống tự do thuộc chi Azotobacter và

Beiferinckia

- Azotobacter: chủ yếu có 4 loài:

+ Azotobacter chroocuccum: kích thước 3,1x2,0µ khi còn non có khả

năng di động, khi già có sắc tố màu nâu đến màu đỏ, không khuyếch tán vàomôi trường

+ Azotobacter beijerincki: kích thước 3,1x2,0µ không di động, khi già có

sắc tố màu vàng đến màu nâu sáng, không khuyếch tán vào môi trường

+ Azotobacter vinelandi: kích thước 3,4x1,5µ có khả năng di động, sắc tố

màu vàng lục đến huỳnh quang, khuyếch tán vào môi trường

+ Azotobacter agilis: kích thước 3,3x2,8µ có khả năng di động, sắc tố

màu lục, huỳnh quang, khuyếch tán vào môi trường

Azotobacter làm tăng cường nguồn thức ăn cung cấp cho cây trồng, kích

thích khả năng tăng trưởng, nâng cao tỷ lệ nảy mầm và độ phát triển của mầm

vì nó tiết ra môi trường thiamin, acid nicotinic, acid pantotenic, acidpiridoxin, biotin,… và có khả năng tiết ra một số chất chống nấm

- Beiferinckia: là loài hiếu khí, cố định nitơ giống Azotobacter nhưng có

khả năng chịu chua cao hơn Gồm có 3 nhóm:

+ B.indica: kích thước tế bào 0,5-1,5 x 1,7-3,0µ có khả năng di động

hoặc không di động, khi già có sắc tố màu đỏ đến màu nâu, có tốc độ cố địnhnitơ nhanh

+ B.fluminensis: kích thước tế bào 1,1-1,5 x 3,0-3,5µ có khả năng di

động, sắc tố màu nâu tối, tốc độ cố định nitơ chậm

+ B.derxii: kích thước tế bào 1,5-2,0 x 3,5-4,5µ không di động, sắc tố

màu lục huỳnh quang

I.2.2.3 Vi khuẩn kỵ khí sống tự do thuộc Clostridium:

Loài được nghiên cứu nhiều nhất là Clostridium pasteriaum, ngoài ra còn có các loài Clostridium khác như C.butylicum, C Bacterinkin, C.

ceticum,

Kích thước tế bào 2,5-7,5 x 0,7-1,3µ có thể riêng rẽ hoặc xếp đôi hoặcthành chuỗi ngắn Có khả năng di động khi còn non, có khả năng tạo bào tử,bào tử có kích thước lớn hơn tế bào và có thể nằm ở đầu hoặc ở giữa tế bào

I.2.2.4 Vi khuẩn lam sống tự do và vi khuẩn lam cộng sinh trong bèo hoa dâu:

Hiện nay đã phát hiện nhiều loài vi khuẩn lam sống tự do trong đất vàtrong nước có khả năng cố định nitơ Có một số loài sống cộng sinh với thựcvật, trong đó đáng chú ý nhất là vi khuẩn cộng sinh trong bèo hoa dâu (vi

khuẩn này có tên là Anabaena azollae) Đa số các loài vi khuẩn lam phát triển

tốt trong môi trường trung tính hoặc kiềm, hiếu khí, thích hợp ở nhiệt độ

28-30oC, cần khí CO2

I.2.3 Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử:

Quá trình cố định nitơ phân tử theo 2 hướng cơ bản: con đường khử vàcon đường oxy hoá

Con đường khử theo chuỗi biến hoá:

N2 → HN=NH → H2N-NH2 → NH3 → NH4OH

Con đường oxy hoá:

N2 → N2O → (HNO)2 → NH4OH

Quá trình cố định nitơ phân tử bị ức chế khi có mặt oxy nên hiệu suất cốđịnh nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn những vi sinhvật hiếu khí

I.3 Khả năng cố định nitơ phân tử ở vi khuẩn tía quang hợp.

I.3.1 Giới thiệu vi khuẩn tía quang hợp:

Vi khuẩn quang hợp tía (VKTQH) là sinh vật chưa có nhân thật(prokaryote) và thuộc nhóm proteobacteria Trong quá trình quang hợp, chúngkhông sử dụng nước làm nguồn cho điện tử như các đối tượng quang dưỡngkhác mà sử dụng các hợp chất khác nhau từ bên ngoài như lưu huỳnh và cáchợp chất của lưu huỳnh, phân tử hydro (H2) hoặc các hợp chất hữu cơ đơngiản, do đó không thải oxy

Nhóm VKTQH có khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí theo kiểuquang dị dưỡng với các nguồn cơ chất hữu cơ khác nhau hoặc sinh trưởngtheo kiểu quang tự dưỡng CO2 với phân tử hydro làm chất cho điện tử Ở điềukiện hiếu khí và vi hiếu khí, tối, nhiều loài có thể sinh trưởng hóa dị dưỡng vàmột vài loài sinh trưởng hóa tự dưỡng Một số loài rất nhạy cảm với oxy, một

số khác sinh trưởng tốt ở điều kiện hiếu khí, tối với áp suất oxy khí quyển.VKTQH có các kiểu trao đổi chất rất linh hoạt, phụ thuộc vào điều kiệncủa môi trường sống nên chúng phân bố trong tự nhiên rất rộng rãi Có thểtìm thấy chúng trong các điều kiện môi trường sống khắc nghiệt như ở NamCực hay suối nước nóng, suối lưu huỳnh Sự điều hòa giữa các quá trình traođổi chất để tạo năng lượng ở VKTQH được điều khiển bởi ánh sáng, oxy vàcác chất cho điện tử

I.3.1.1 Đặc điểm hình thái tế bào của VKTQH.

Vi khuẩn tía quang hợp là các tế bào gram âm, đơn bào và có các dạngcầu, xoắn, gậy và phẩy Có thể gặp chúng ở trạng thái chuỗi trong những điềukiện môi trường đặc biệt Kích thước của tế bào thường từ 0,3 – 6µm Đa sốcác loài đều sinh sản bằng nhân đôi, một số loài có tế bào dinh dưỡng dạngphân cực thường sinh sản bằng cách nảy chồi ( là đặc trưng của chi

Rhodopseudomonas ) Khi sinh trưởng trong điều kiện quang hợp, dịch huyền

phù tế bào thường có màu tía, đỏ, nâu vàng, nâu Sự khác nhau về màu sắcnày do khả năng hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng khác nhau Phổ hấp thụdịch tế bào nguyên của một số đại diện được thể hiện ở hình 2 [20]

Hình 2: Phổ hấp thụ dịch huyền phù tế bào của một số đại diện vi khuẩn

quang hợp [20]

I.3.1.2 Đặc điểm sắc tố quang hợp của VKTQH.

Đặc trưng của nhóm vi khuẩn quang hợp này là chứa sắc tố quang hợploại bacteriochlorophyll (Bchl) và các dạng carotenoid khác nhau:

Đa số các loài sinh trưởng và tổng hợp Bchl trong điều kiện kỵ khí khiđược chiếu sáng, một số loài khác có thể tổng hợp một lượng rất nhỏ khi sinhtrưởng ở điều kiện tối, vi hiếu khí hoặc hiếu khí

 Bacteriocholorophyll (Bchl) :

Sắc tố quang hợp chính ở vi khuẩn quang hợp là bacteriochlorophyll(Bchl) Hiện nay, bacteriochlorophyll của nhóm VKTQH được chia thành 2nhóm a và b Vùng cực đại của phổ hấp thụ dịch chiết trong ete hoặc dịch tếbào nguyên của hai loại này được phân biệt ở bảng 1

tử và cực đại hấp thụ của dịch huyền phù tế bào Đặc điểm này được các nhàkhoa học sử dụng làm một trong các yếu tố để phân loại vi khuẩn quang hợptrong khóa phân loại vi khuẩn của Bergey [20]

Bảng 2: Các nhóm carotenoid có mặt trong tế bào vi khuẩn quang hợp.

Nhóm Họ carotenoid Các carotenoid chính

1 Spirilloxanthin thường Lycopen, rhodopin, spirilloxanthin

2 Spirilloxanthin thay thế Chloroxanthin, sphaeroiden, sphaeroidenon,

(spiriloxanthin)

4 Rhodopinal Lycopen, lycopenal, lycopenol, rhodopin,

rhodopinal, rhodopinol, (spirilloxanthin)

I.3.1.3 Phân loại VKTQH

Năm 1907, Molisch là người đầu tiên phát hiện ra một số vi khuẩn cósắc tố màu đỏ và có khả năng quang hợp nên ông gọi nhóm vi khuẩn này là

Rhodobacteria (hay chính là vi khuẩn tía quang hợp ) VKTQH bao gồm hai

họ Thiorhodanceae ( là những vi khuẩn tía có khả năng hình thành giọt lưu huỳnh “S” bên trong tế bào) và Athiorhodaeae (là những vi khuẩn tía không

có khả năng hình thành giọt lưu huỳnh “S” trong tế bào) [1] Đây là đặc điểmquan trọng về hình thái để phân biệt hai nhóm này

Vi khuẩn tía quang hợp lưu huỳnh :

Nhóm vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các thủy vực nước

ngọt hoặc mặn có chứa sulfua với hàm lượng cao (40-100mg/l) Ngoài ra, có

thể tìm thấy đại diện của nhóm này ở các suối nước nóng và các thủy vực

kiềm hóa[49].

Hình ảnh tế bào một số loài đại diện của nhóm này mô tả ở hình 3

Hình 3 Dạng tế bào của một số đại diện vi khuẩn tía quang hợp lưu

huỳnh A Chromatium okeni; B Thiospirillum ; C Thiopedia rosea

Vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh:

Các vi khuẩn nhóm này được phân bố rộng rãi trong tự nhiên Có thể gặpchúng trong các ao hồ tù đọng, các thủy vực chứa nước thải, các vùng đầmnước lợ hay mặn, cũng có thể tìm thấy chúng trong đất bùn hay đất ruộng.Tuy nhiên, chúng ưa thích các thủy vực chứa nước ngọt, lợ hay mặn với hàmlượng chất hữu cơ khá cao và hàm lượng oxy hòa tan thấp

Hình ảnh tế bào của một số chủng đại diện

Hình 4 Dạng tế bào của một số đại diện chủng VKTQH không lưu

huỳnh A Rhodospirillum rubrum; B Rhodospirillum tenue; C.

Rhodobacter sphaeroides;D Rhodocyclus perpureus; E Rhodoacidophila; F.

 Cố định CO 2 :

Giống như các đối tượng quang dưỡng khác, VKTQH lưu huỳnh vàkhông lưu huỳnh cũng có khả năng cố định CO2 theo chu trình Calvin [4, 61]

Một số loài VKTQH không lưu huỳnh như ở loài R rubrum và R.

genlationsus còn có khả năng sử dụng CO làm nguồn cơ chất cho sinh trưởng.

Ban đầu, CO bị oxy hóa thành CO2 nhờ CO – dehydrogenase, sau đó CO2

được tế bào đồng hóa trở lại theo chu trình Calvin Ngoài khả năng cố định

CO2, VKTQH không lưu huỳnh còn có khả năng đồng hóa nhiều loại hợpchất hữu cơ có sẵn trong môi trường

 Khả năng sử dụng các nguồn C hữu cơ :

Nhóm VKTQH lưu huỳnh sinh trưởng chủ yếu bằng quang hợp tựdưỡng, sử dụng CO2 làm nguồn cacbon và các hợp chất khử của lưu huỳnhhoặc H2 làm chất cho điện tử Khả năng đồng hóa các chất hữu cơ của chủngkém hơn so với loài VKTQH không lưu huỳnh Acetate và một số hợp chấthữu cơ được các loài vi khuẩn nhóm này sử dụng như nguồn cacbon bổ sung

và được đồng hóa theo chu trình TCA ( Tricacboxylic Acid) nhưng khôngkhép kín hoặc chu trình glyoxylate hoặc qua con đường đồng phân [12]

Nhóm VKTQH không lưu huỳnh có khả năng sử dụng nhiều hợp chấthữu cơ làm nguồn cacbon cho sinh trưởng Chúng có sự điều chỉnh các cơ chếtrao đổi chất hữu cơ rất linh hoạt tùy thuộc các điều kiện sinh trưởng khácnhau Hầu hết, các loài thuộc VKTQH không lưu huỳnh đều có khả năng sinhtrưởng ở ngoài sáng trên môi trường chứa hợp chất 2C như acetate [40],pyruvate [53]… và hợp chất 3C như glycerol, acetone VKTQH không lưuhuỳnh sinh trưởng nhanh hơn và mật độ cao hơn khi sinh trưởng trong môitrường chứa các cơ chất 4C với hai nhóm carboxyl so với khi sinh trưởng trêncác nguồn cơ chất khác

Các con đường trao đổi chất trung tâm ở nhóm VKTQH không lưuhuỳnh được mô tả ở hình 5.

Hình 5 Các con đường trao đổi chất trung tâm ở vi khuẩn tía quang hợp

không lưu huỳnh [Tabita , 1995]

Ngoài ra, một số loài VKTQH không lưu huỳnh có khả năng sinh

trưởng trên môi trường có chứa hợp chất hữu cơ 1C như loài R palustris có

khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa formate khi được chiếu sáng, loài

Rhodospirillum gelatinosa và R acidophila có khả năng sử dụng methanol

làm nguồn carbon khi sinh trưởng ngoài ánh sáng nhưng cần có CO2 làm chấtnhận điện tử.

I.3.2 Khả năng cố định nitơ phân tử của VKTHQ

I.3.2.1 Khả năng sử dụng các nguồn nitơ liên kết.

Nguồn nitơ ưa thích nhất đối với hầu hết các VKTQH là amôn Rấtnhiều loài có khả năng sử dụng các amino acid làm nguồn nitơ cho sinhtrưởng Khả năng đồng hóa nitrate của VKTQH rất hạn chế, một số loài như

R.sphaeroides, R.capsulatus có thể sinh trưởng được trong điều kiện môi

trường có chứa nitrate nhưng nguồn nitơ mà chúng sử dụng trực tiếp để xâydựng tế bào là nitơ phân tử được sinh ra trong quá trình khử nitrate dị hóa[9,41] Hệ thống enzyme tham gia quá trình nitrate dị hóa ở các vi khuẩn này

là các protein nằm ở màng ngoài tế bào và hoạt tính của chúng bị ức chế bởiánh sáng và oxy

II.3.2.2 Khả năng cố định nitơ phân tử ở Vi khuẩn tía quang hợp

Gest và Kamen là những người đầu tiên phát hiện khả năng cố địnhnitơ phân tử ở vi khuẩn quang hợp khi tiến hành nghiên cứu quá trình quangthải H2 của Rhodospirillum rubrum [10] Những nghiên cứu sau đó đã khẳng định rằng khả năng cố định nitơ phân tử không chỉ có ở R rubrum mà còn có

ở những loài vi khuẩn quang hợp khác với mức độ hoạt tính nitrogenase khácnhau (Bảng 3) Hoạt tính cố định nitơ phân tử được xác định thông qua hoạttính khử acetylen thành etylen [34]

Bảng 3 Ho t tính kh acetylen m t s lo i vi khu n tía không l u hu nh ạt tính khử acetylen ở một số loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh ử acetylen ở một số loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh ở một số loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh ột số loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh ố loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh ài vi khuẩn tía không lưu huỳnh ẩn tía không lưu huỳnh ưu huỳnh ỳnh

Loài

Hoạt tính nitrogenaza (nmol C 2 H 4 / mg trọng lượng khô/h)

Chú thích: Rb : Rhodobacter ; Rps : Rhodopseudomonas ; R : Rhodospirillum ;

Rd : Rhodopila ; Rc : Rhodocyclus ;Rm : Rhodomicrobium.

Cũng giống như các vi sinh vật cố định nitơ khác, về cấu trúc thànhphần các amino acid và vật liệu gen mã hóa cho protein, enzyme nitrogenase

ở vi khuẩn quang hợp bao gồm hai tiểu phần : Protein- Mo ( dinitrogenase )

và Protein-Fe (dinitrogenase – Rc2 ) Để nitrogenase hoạt động đòi hỏi phải

có đầy đủ các thành phần bao gồm hai protein của nitrogenase, năng lượngkhử (ATP), chất khử có thế năng thấp và nguồn điện tử [60, 72].

Phức hợp enzyme nitrogenase xúc tác phản ứng khử một phân tử nitơtạo thành amôn theo phương trình phản ứng sau [5, 6]:

N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP 2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

Các vi khuẩn tía không lưu huỳnh được coi là các cá thể có khả năng cốđịnh nitơ với tốc độ cao nhất, trong số đó đáng kể đến là các chủng thuộc các

loài Rhodobacter capsulatus, Rb Sphaeroides, Rhodopseudomonas viridis,

Rhodocyclus gelatinosus và Rb Blastica Các loài thuộc chi Rhodospirillum

có hoạt tính cố định nitơ phân tử ở mức thấp hơn [45, 46] Đa số các VKTQHkhông lưu huỳnh có thể sinh trưởng với nitơ phân tử làm nguồn N duy nhất(diazotrophic ) và tốc độ sinh trưởng mạnh nhất được ghi nhận ở điều kiệnquang dị dưỡng ( photoheterotrophic ) [46] Tuy nhiên, một số ít loài còn cókhả năng cố định nitơ phân tử khi sinh trưởng quang tự dưỡng(photoautotrophic) với các chất cho điện tử quang hợp là H2, các hợp chất khửcủa lưu huỳnh hoặc một số nguồn vô cơ khác [42] Khi nghiên cứu về khảnăng sinh trưởng của vi khuẩn quang hợp ở điều kiện tối (kỵ khí cũng nhưhiếu khí ), một số nhà khoa học đã giả thiết rằng có mối liên quan chặt chẽgiữa quang hợp và cố định nitơ ở các nhóm này [43,47,82] Năm 1979,

Madigan và cs [44] đã ghi nhận được hoạt tính nitrogenase của Rhodobacter

capsulatus, khi sinh trưởng ở điều kiện kỵ khí trong tối với mức độ thấp

Cũng như các đối tượng cố định nitơ khác, oxy không chỉ gây bất hoạtnitorgenase ở VKQH mà còn là tác nhân gây ức chế sự tổng hợp enzyme này[18, 4] Trong quá trình trao đổi chất theo kiểu hô hấp hiếu khí, VKQH cầnoxy để sản xuất ATP nhưng oxy lại có tác dụng phá hủy cả hai tiểu phầnprotein và gây bất hoạt nitrogenase [55] Mức độ ảnh hưởng của oxy đối vớienzyme này lại tùy thuộc vào khả năng hô hấp hiếu khí của từng loài [57], do

chủng trong điều kiện vi hiếu khí hay hiếu khí [48, 7, 58] Nitrogenase trong

dịch chiết tế bào loài Rb capsulatus bị ức chế hoàn toàn khi nồng độ của oxy

vượt quá 40% trong pha khí [48]

Hoạt tính nitrogenase của vi khuẩn quang hợp được tăng cường khi cómặt carbonate [54], alcohol, bicarbonate hoặc bất kỳ một nguồn CO2 nào khác

mà chúng có thể sử dụng được [23] Hydro phân tử có thể được sử dụng làmnguồn cho điện tử bổ sung trong quá trình cố định nitơ nhưng khi nồng độquá cao lại trở thành tác nhân gây ức chế quá trình này [7, 81, 99]

Khi các tế bào của VKQH sinh trưởng trong điều kiện có amôn,nitrogenase bị bất hoạt rất nhanh nhưng có thể được phục hồi khi môi trườngnuôi chỉ còn nitơ phân tử là nguồn N duy nhất Hiện tượng này được gọi hiệuứng “ NH4 switch - off ” và quan sát được ở rất nhiều loài thuộc nhóm vi

khuẩn tía không lưu huỳnh và hai loài vi khuẩn xanh Chlorobium limicola và

thiosulfatophilum [69, 16, 21, 71, 19, 24] Hiệu ứng này xảy ra tùy thuộc vào

tuổi của giống cấy [2, 67, 72], các điều kiện cho sinh trưởng quang hợp nhưcường độ chiếu sáng [73], nguồn C [70] và đặc biệt là nguồn N [2, 67]

Người ta thấy rằng, sự ức chế hoạt tính nitrogenase (switch - off) là hậuquả của quá trình biến đổi dẫn đến sự bất hoạt của tiểu phần dinitrogenasereductase (Rc2) - protein Fe của nitrogenase [22, 23, 14, 37, 38, 11, 54]

Những nghiên cứu về nitrogenase ở Rb capsulatus cho thấy sự bất hoạt này

là do một phân tử ADP – ribose đã liên kết với protein Rc2 tại vị trí đặc hiệuarginine 101 nhờ hoạt động của enzyme Dinitrogenase Reductase ADP –Riboryl Transferaza (DRAT ) [ 54, 36] Phản ứng này phụ thuộc vào NAD vàMgADP, thường xảy ra khi vi khuẩn không được chiếu sáng hay có mặt mộtnguồn nitơ liên kết nào đó [35] Khi giống cấy được chiếu sáng trở lại hay cácnguồn nitơ liên kết bị cạn kiệt, ditrogenase reductase có thể được hoạt hóabằng cách loại bỏ nhóm ADP- ribose nhờ một phản ứng thủy phân với sựtham gia của enzyme Ditrogenase Reductase ADP – ribose – N -

glycohydrolase ( DRAG) [56,54] Phản ứng này phụ thuộc vào MgADP và

Mn++ [24,39] Mô hình kiểu điều hòa riboryl hóa Rc2 thuận nghịch của

nitrogenase ở Rhodospirillum rubrum đã được Ludden và Robert [39] mô tả

như sau:

Hình 6 Kiểu điều hoà hoạt tính thuận nghịch ADP-riboryl hoá của

dinitrogenase reductase ở R rubrum[39].

Ngoài kiểu điều hoà riboryl hoá Rc2 thuận nghịch như trên, người tacòn cho rằng có một số cơ chế ức chế nitrogenase khác như ức chế sự vậnchuyển điện tử đến nitrogenase [13] hay sự thay đổi tỷ lệ ATP/ADP trong tếbào, hoặc thay đổi tỷ lệ C/N trong môi trường nuôi cấy [72]

I.3.3 Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn tía quang hợp trong thực tiễn I.3.3.1 Ứng dụng của VKTQH trong xử lý nước thải

Việc lựa chọn các chủng VKTQH để xử lý những nguồn nước thải cóthành phần khác nhau đã được tiến hành VKTQH có khả năng chuyển hóacác hợp chất vô cơ cũng như hữu cơ trong tự nhiên [29,30], do đó chúng cóthể tham gia vào chu trình chuyển hóa chất thải và đặc biệt ở quá trình xử lý

kỵ khí [28] Đối với nguồn nước thải chứa các hợp chất lưu huỳnh, các chủng

các cơ chất hữu cơ làm nguồn C cho sinh trưởng giống như nhóm VKTQHkhông lưu huỳnh, chúng còn có khả năng loại bỏ các hợp chất của lưu huỳnhvới hiệu suất cao [50,51,3] Do đó, khi làm sạch nguồn nước thải chứa hàmlượng sulfur cao, người ta thường sử dụng hỗn hợp các chủng VKTQH lưuhuỳnh với các chủng VKTQH không lưu huỳnh để nâng cao hiệu suất xử lý[27].

Các loài VKTQH không lưu huỳnh thuộc các chi Rhodopseudomonas,

Rhodobacter và loài Rhodocyclus gelatinosusđược sử dụng rộng rãi trong xử

lý nước thải Tuy nhiên, xu hướng được lựa chọn là sử dụng một số chủng để

có thể phân hủy hầu hết các thành phần ô nhiễm có mặt trong nước thải[68,3,52] Việc sử dụng hỗn hợp của một số chủng giống trong quá trình xử lýnước thải đã được đề cập đến rất nhiều trong những năm gần đây [64, 59]

Trong thực tế, người ta thường sử dụng các chủng thuộc hai loài Rhodobacter

sphaeroides và Rhodopseudomonas palustris để xử lý nhiều nguồn nước thải

có thành phần khác nhau Ngoài mục đích loại bỏ các chất hữu cơ dễ phânhủy sinh học, chúng còn có thể sử dụng để loại bỏ các chất khó phân hủy sinhhọc như : phenol, cresol, các hợp chất hữu cơ có chứa nhóm halogen hay cáchydrocacbon mạch dài [52,8,17] Khi sử dụng các chủng vừa nêu với các

chủng thuộc loài VKTQH lưu huỳnh Chromatium vinosum còn có thể loại bỏmột số hợp chất vô cơ có mặt trong nước thải như : H2S, NO3-,… và do đó,nâng cao hiệu suất xử lý [25,62]

I.3.3.2 Ứng dụng của VKTQH trong sản xuất phân bón sinh học

Việc sử dụng sinh khối của VKTQH để sản xuất phân bón sinh học córất nhiều ưu điểm như khả năng sinh trưởng với tốc độ rất nhanh, tốc độ cốđịnh nitơ cao, có khả năng sinh trưởng và cố định nitơ ngay cả trong tối …

Vì vậy, việc triển khai áp dụng dạng phân bón này trên đồng ruộng lúa

ở các nước trong khu vực Châu Á gặp nhiều thuận lợi vì đảm bảo các nhu cầu

về ánh sáng, nguồn cơ chất (hữu cơ hoặc vô cơ) và môi trường ngập nước,

không có oxy, thuận lợi cho sự phát triển của VKTQH Nhiều thực nghiệmđược triển khai có hiệu quả trên đồng ruộng tại các nước Ai Cập, Nhật Bản vàcác nước Đông Nam Á như : Thái lan, Philippin [33] Sử dụng dạng phân bónnày còn có thể hạn chế bệnh thối rễ lúa do đất nhiễm sulfua vì các VKTQH cókhả năng oxy hóa hợp chất này tới sulffat.

Ngoài ra, người ta đã thử nghiệm thành công trên rất nhiều đối tượngcây hoa màu, khoai tây [32] và các loại cây ăn quả [28] Kết quả sử dụngVKTQH làm phân bón cho các cây ăn quả như cam, chanh…cho thấy chúngkhông chỉ làm tăng số lượng quả trên một cây mà còn làm gia tăng trọnglượng quả, cũng như hàm lượng đường trong quả Màu sắc của quả cũng trởnên hấp dẫn hơn do sự gia tăng của hàm lượng sắc tố carotenoid [28]… Mặtkhác, so với các loại phân bón hóa học thì phân bón sinh học chứa VKTQHcòn có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các loại nấm gây bệnh cho các loạicây ăn quả hoặc củ Các amino acid như proline và uracil được tạo ra bởiVKTQH lại có tác động đến năng suất và chất lượng khoai tây[15] Hàmlượng các vitamin B và C trong củ khoai tây được tưới dịch huyền phù cóchứa VKTQH cao hơn so với các cây đối chứng[26]

Quá trình sản xuất sinh khối vi khuẩn quang hợp với mục đích làmphân bón vi sinh bằng cách tái sử dụng nước thải làm môi trường nuôi, vừagiảm thiểu ô nhiễm môi trường vừa đem lại lợi ích về kinh tế và giảm chi phísản xuất [31]

Tóm lại : VKTQH có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: xử

lý nước thải, sinh khối sau khi xử lý còn có thể tái sử dụng để sản xuất phânbón sinh học và làm thức ăn trong chăn nuôi, làm nguyên liệu trong sản xuấtdược liệu quý để phục vụ đời sống con người

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

II.1 Đối tượng nghiên cứu:

Nguồn giống lấy từ tập đoàn giống vi sinh vật quang dưỡng tại phòngQuang sinh học - Viện công nghệ sinh học - Viện khoa học và Công nghệquốc gia Việt Nam

- Đĩa petri, túi nilon kín

- Đèn cồn, que cấy bằng kimloại

II.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

* Môi trường AT giữ giồng và nuôi cấy VKTQH (van de Graaf et al.,1996)

Hòa tan trong 100ml nước cất, khử trùng sạch bằng màng lọc vô trùng,cất giữ trong tủ lạnh ở 4oC (chú ý dùng bình tối màu đã vô trùng) Dung dịchvitamin tổng hợp được bổ sung sau khi môi trường đã khử trùng

- Thành phần dung dịch vi lượng SLA :

HCl (25%): 6,5ml , FeCl2.4H2O: 1,5g , H3BO3: 62mg , MnCl2.4H2O:100mg, CoCl2.6H2O: 190mg, ZnCl2: 70mg, NiCl2.6H2O: 24mg;

II.4 Phương pháp tuyển chọn VKTQH có khả năng cố định nitơ phân tử

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên đĩa petri trong môi trường

AT không chứa NH4+ Các đĩa petri được bọc kín và được đặt trong túi nilon

có bơm khí nitơ (không khí trong túi được thay thế bằng khí nitơ) Sau đó, túinilon được đặt dưới ánh sáng đèn sợi đốt 40W với khoảng cách là 20cm giữnhiệt độ là 30-35oC

Chủng vi khuẩn có thể sinh trưởng được trên môi trường không chứanitơ liên kết được ghi nhận có khả năng cố định nitơ phân tử

II.4.1 Cách xác định khả năng cố định nitơ ở vi khuẩn tía quang hợp

Sử dụng môi trường AT nhưng không chứa amôn Để tuyển chọnnhững chủng có khả năng sinh trưởng trên môi trường không chứa nitơ liênkết, tiến hành theo các bước sau:

1 Theo dõi khả năng sinh trưởng của các chủng trên môi trườngthạch AT không chứa nitơ liên kết

2 So sánh khả năng sinh trưởng của chúng trên 2 môi trường chứa

II.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào

Hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học OlympusModel CH-S (Nhật Bản) và chụp ảnh tế bào dưới kính hiển vi điện tử JEOL-