Khóa luận nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katg

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: "Nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG” Với m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CễNG NGHỆ SINH HỌC

xác định đột biến trên gen KatG

HÀ NỘI – 2010

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS

Nghiêm Ngọc Minh - Trưởng phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện

Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để giúp tôi hoàn thành quyển khóa luận này

Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ

Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đặc biệt là CN Nguyễn

Văn Bắc và KS Cung Thị Ngọc Mai đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình cho tôi

trong quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học Viện đại học Mở Hà Nội, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường và viện

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt quyển khóa luận này

Hà Nội, ngày tháng năm 2010

Sinh viên

Đỗ Thị Phương

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

: Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc): Exetensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng): Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol

: Deoxyribonucleic acid: Ribonucleic acid: Polymerase Chain Reaction: Isopropyl-thio-β-D-galactoside: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside: Tris-Acetate-EDTA

: Luria - Bertani: Deoxyribonucleotide Triphosphate

: Escherichia coli : Thermus aquaticus DNA polymerase

: Base pairs: Kilo base: Công nghệ sinh học: Tổ chức y tế thế giới: Chương trình chống lao quốc gia

MỞ ĐẦU

Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những

nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người Hiện nay, bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với đặc trưng là kháng đa thuốc Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là điều trị thất bại cao, dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao kháng đa thuốc mà còn chưa tìm ra được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý, trong khi các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung vào một số ít loại

Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rất khó điều trị Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao

Để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, hiện nay các cơ sở trong nước chủ yếu vẫn phải dựa vào nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ Thời gian chuẩn đoán lao kháng thuốc cần ít nhất 4 – 6 tuần Với thời gian dài như vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị, khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao

Khắc phục những nhược điểm đó, việc ứng dụng sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày, với độ nhậy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn

Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do các gen tương ứng chịu trách nhiệm Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid thường là do sự biến đổi

ở codon thứ 315 trên gen katG (biến đổi acid amin serin thành threonin) từ đó

dẫn đến chủng lao đó kháng isoniazid

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: "Nghiên

cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG”

Với mục tiêu nghiên cứu là:

Phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid ở

các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu bằng phương pháp nhân đoạn và phân tích

trình tự nucleotide của gen katG

Và nội dung nghiên cứu gồm:

- Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu.

- Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi

khuẩn E coli.

- Tách dòng gen katG.

- Giải trình tự gen katG.

- Phân tích, phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng

thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện

Công nghệ sinh học với sự tài trợ kinh phí của đề tài nhánh “Nghiên cứu tối

ưu hóa quy trình xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”, Mã số: KC.10.15/06-10-04.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH LAO

Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những

nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người Hiện nay tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao được xác định là chiếm 1/3 dân số thế giới Có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị và đang tiếp tục làm lây lan bệnh cho cộng đồng

Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay Trên thế giới chưa bao giờ và cũng không có một quốc gia nào, khu vực hay dân tộc nào là không có người mắc lao và chết do lao Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa trị bệnh lao đơn giản và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại

và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển

1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới

Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm họa của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [27]

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới) Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết do lao Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ đều

ở độ tuổi lao động, trong đó có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có tỷ lệ mắc bệnh lao cao [1]

Năm 2005, TCYTTG ước tính khu vực Đông Nam Á có 4,8 triệu bệnh nhân lao Trong số đó số ca bệnh nhân lao mắc mới là gần 3 triệu, chiếm

34% toàn cầu Số người chết vì bệnh lao ở Đông Nam Á là 512000 người, chiếm 1/3 toàn thế giới Châu Phi có số bệnh nhân lao là 3,8 triệu ; số ca mới mắc là 2,5 triệu; số chết do bệnh lao là 544 000 Hai khu vực này có tình hình mắc lao nặng nề nhất thế giới.

Các nghiên cứu về kinh tế cho thấy mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình khoảng 3 – 4 tháng lao động, làm giảm 20 – 30% thu nhập bình quân của gia đình Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập Bệnh lao đã tác động mạnh tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, năng suất lao động giảm Ngoài ra việc đầu tư cho công việc chẩn đoán và điều trị cho người bệnh cũng làm tiêu tốn một lượng tiền không nhỏ của gia đình và của

xã hội [11]

1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

Ở nước ta, bệnh lao còn rất phổ biến Việt Nam đứng thứ 13 trong số

22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG, 2004) Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philipines về số lượng bệnh nhân lao cao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm

Công cuộc chống lao ở Việt Nam bắt đầu từ năm 1957 khi Viện chống lao được thành lập ở Hà Nội [11] Trong những năm chiến tranh và thời kì hoà bình lập lại, mặc dù có những cố gắng trong công tác phòng chống lao nhưng do còn nhiều khó khăn về kinh tế và nguồn lực nên chúng

ta chưa thực sự kiểm soát được bệnh lao

Đến tháng 11 năm 1994, Chương trình chống lao Quốc gia (CTCLQG) được thành lập Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch

tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và lao/HIV Nhà nước và Bộ Y

tế Việt Nam đã quyết định đưa chương trình chống lao thành một trong những chương trình y tế quốc gia trọng điểm Cùng với sự đầu tư phát triển các

Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lực lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình chống lao Ban chỉ đạo chống lao và chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế.

Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ về kỹ thuật và tài chính của Chính Phủ Hà Lan, hiệp hội chống lao hoàng gia Hà Lan, ủy ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996 – 2000 Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện trong cả nước [2]

Trong giai đoạn 1997 – 2000, CTCLQG đã phát hiện 532703 bệnh nhân lao các thể, đạt 82% số bệnh nhân ước tính và đã điều trị 260698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92 [4]

Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện cà điều trị bệnh nhân, năm1996, Việt Nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của TCYTTG [11]

Vì là số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống lao do TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10 năm

2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hội chống lao hoàng gia Hà Lan nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành lập tổ chức này

Nhân ngày thế giới chống lao 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một trong 6 nước và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [11]

Hiện nay, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1.5% Ước tính với dân số 70 – 80 triệu, hàng năm ở nước ta có một số lượng lớn

người bị mắc lao mới Số lượng người mắc lao mới được thể hiện qua bảng sau:

Số lao phổi BK dương tính mới 60 000

Tổng số lao phổi BK dương tính 120 000

Đất nước ta có trình độ dân trí chưa cao, ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng, điều kiện kinh tế còn khó khăn và phát triển không đều, nhất là hiện nay đại dịch HIV/AIDS đang lan tràn khắp nơi làm cho công tác phòng chống kiểm soát bệnh lao càng gặp nhiều khó khăn Tỷ lệ bệnh lao trong nhân dân còn cao không những trong những năm tới mà còn có thể còn trong một thời gian khá dài nữa

1.3 Tình hình lao kháng thuốc

Sau khi thuốc kháng sinh đầu tiên điều trị lao streptomycin ra đời vào

1944, vài năm sau người ta đã sớm nhận thấy hiện tượng kháng thuốc này ở

vi khuẩn lao [11] Cùng với sự ra đời của thuốc điều trị lao khác người ta cũng lần lượt nhận thấy vi khuẩn lao kháng với các thuốc đó sau một thời gian

Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tình hình vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực trên thế giới, theo công bố này tỷ lệ kháng thuốc tiên phát trung bình với riêng từng loại thuốc có khác nhau, cụ thể là: kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, ethambutol 0,3%, streptomycin 2,5% Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát trung bình là 9,9% trong

đó kháng 1 thuốc chiếm 6,6%, kháng 2 thuốc chiếm 2,5%, kháng 3 thuốc chiếm 0,6%, 4 thuốc là 0,2%, kháng đa thuốc trung bình là 1,4% [11,28].Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau: kháng isoniazid trung bình là 6,3%, rifampicin 0,7%, Ethambutol 0,4%, streptomycin 2,6% Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình trên thế giới là 36% , trong đó kháng 1 loại thuốc là 12,2%, 2loại thuốc là 9,7%, 3 loại thuốc

là 5,4% , 4 loại thuốc là 4,4% Lao kháng đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bình là 13%.

Theo báo cáo dựa trên thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng thuốc hiện nay ở mức cao chưa từng có Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% trong số 9 triệu ca nhiễm lao hàng năm Cũng trong báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc cực mạnh được đề cập, đây là một dạng gần như không chữa lành được [10]

Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu đặc biệt nghiêm trọng, nhất là lao kháng đa thuốc Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao Nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị được quy định của chương trình chống lao Một nguyên nhân khác hay gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng hoặc do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian…

Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc Chi phí điều trị bệnh nhân kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bình thường và thậm chí không điều trị được ở một số trường hợp

Vi khuẩn lao kháng đa thuốc là một thách thức lớn đe dọa công cuộc phòng chống lao trên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc Trong khi các thuốc chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì thuốc chống lao loại hai thường có độc tính cao mà giá thành lại đắt

Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tình hình kháng thuốc của

vi khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5% đứng thứ tư trên thế giới trong khảo sát của TCYTTG Tình hình kháng thuốc trong số 640 bệnh nhân được nghiên cứu bởi TCYTTG cụ

thể là: kháng streptomycin là 24%, isoniazid là 20%, rifampicin là 3,6%, ethambutol là 1,1% Kháng đơn độc với một loại thuốc chiếm tỷ lệ 19,1%, kháng đa thuốc tiên phát 2,3% Vi khuẩn kháng thuốc phối hợp gặp nhiều nhất là kháng isoniazid kết hợp với thuốc khác (20%), có 0,9% trường hợp

vi khuẩn đã kháng với cả 4 loại thuốc (HRSE) Các số liệu nghiên cứu này cũng cơ bản phù hợp với những nghiên cứu trước đó ở trong nước cho thấy rằng Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao kháng thuốc cao trên thế giới [8]

Nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc là những nguyên nhân dẫn tới thất bại trong điều trị Những bệnh nhân lao mới có thể chữa khỏi 95 – 100% Nhưng bệnh nhân lao kháng thuốc mắc phải, tỷ lệ chữa khỏi chỉ 20 – 30%, thậm chí còn thấp hơn nữa ở những trường hợp kháng đa thuốc mắc phải hoặc không chữa được Nguy hiểm hơn là các bệnh nhân này có thể tiếp tục truyền bệnh cho người khác, vì vậy phát hiện và ngăn chặn sự lan tràn của các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong chiến lược điều trị lao hiện nay [27]

1.2 VI KHUẨN LAO

1.2.1 Cấu tạo của vi khuẩn lao và cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium

Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis.

Các chủng vi khuẩn lao được chia làm hai nhóm:

Mycobacterium tuberculosis complex gồm 4 loài có khả năng gây bệnh lao

điển hình: M tuberculosis, M bovis, M africanucleotidm, M microti

Mycobacteria other than tuberculosis (MOTT) gồm nhiều loài không

gây bệnh lao ở người: M avium, M ortuitum, M govdovac…[7].

Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn, kích thước dài 2 µm – 4 µm, rộng 0,3 – 1,5 µm Trực khuẩn thanh mảnh, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N,

Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây (hình 1.1), không di động, không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường do có lớp sáp

ở thành tế bào [7]

Hình 1.1 Hình dạng của M tuberculosis [20]

Vi khuẩn lao ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí Nhiệt độ thích hợp để mọc là 370 C Hầu như không mọc ở dưới 370C hoặc trên 420C Vi khuẩn lao mọc chậm, phải từ 4-6 tuần mới hình thành khuẩn lạc điển hình dạng R (hình 1.2) [5] và phải nuôi ở môi trường đặc biệt, giàu chất dinh dưỡng chứa trứng, khoai tây, citrat, glyxerol, asparagin, xanh malachite

Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn lao phát triển trong môi trường nuôi cấy [19]Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những

bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện Hơn nữa tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh Những cơ chế này tạo nên độc lực của vi khuẩn Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé nhỏ này [7].

Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose - 6,6 - dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của thành tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt mãn tính Miễn dịch trong bệnh lao ngày nay được xác định là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Đáp ứng miễn dịch làm chậm sự nhân lên của vi khuẩn lao, gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn lao, dẫn tới phá hủy thành tế bào vi khuẩn Một số trường hợp vi khuẩn lao

có khả năng ức chế tiêu diệt trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ trong các u hạt nên cơ thể không tiêu diệt được Đặc biệt trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ thể không tiêu diệt được vi khuẩn và các thuốc cũng mất tác dụng Đó là một vấn đề nan giải trong điều trị lao [21]

Vi khuẩn lao có thể vào cơ thể qua nhiều con đường, thường là qua đường hô hấp, bên cạnh đó là các đường tiêu hóa, da, kết mạc….Sau khi gây tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới cơ quan gây tổn thương thứ phát

Nhiều cơ quan: phổi, thận, màng não, xương, hạch, da… đều có thể bị xâm nhập nhưng thường xuyên hơn cả là ở phổi và vị trí gặp nhiều nhất là đỉnh phổi, nơi có phân áp oxy 10 mmHg [8]

1.2.2 Đặc điểm hệ gen của vi khuẩn lao

Hệ gen của vi khuẩn lao đã được đọc trình tự, có chiều dài 4411522

bp trong đó có 3924 trình tự được dự đoán là có mã hoá protein, tỷ lệ G +C chiếm 65,6% Genome của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8% trình tự mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả [26]

Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên hệ gen

(genome) của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme peroxidase Thông qua enzyme này tác dụng lên quá trình tổng hợp axit mycolic rất cần cho thành tế bào vi khuẩn lao Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc isoniazid có đột biến trên gen này [26]

catalase-1.3 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO

1.3.1 Các loại thuốc kháng sinh được dùng trong điều trị lao

Thuốc chữa lao hiện nay có rất nhiều loại, tác dụng của mỗi thuốc trên trực khuẩn lao cũng không giống nhau như có thuốc tác dụng ức chế vi khuẩn, có thuốc tiệt khuẩn, có thuốc tác dụng lên trực khuẩn lao khi chúng ở trong tế bào, có thuốc lại tác dụng ở cả trong và ngoài tế bào

Hiện nay thuốc chữa lao được chia ra làm 2 loại là thuốc thiết yếu và thuốc thứ yếu Có 6 loại thuốc thiết yếu là: isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol, pyrazinamid, thiacetazon Và 7 loại thuốc thứ yếu là: ethionamid, prothionamid, PAS, cycloerin, kanamycin, capreomycin Trong đó:

Isoniazid được biết đến như một hợp chất phân giải isonicotinylhydrazine (INH), nó được phát hiện vào năm 1912 nhưng phải tới

40 năm sau người ta mới sử dụng nó cho điều trị lao INH là thuốc được biết đến đầu tiên trong việc phòng chống và điều trị lao Tuy nhiên, nếu sử dụng 1 mình isoniazid sẽ cho kết quả không được cao vì nó dễ bị vi khuẩn lao kháng lại một cách nhanh chóng

1.3.2 Các nguyên nhân gây kháng thuốc của vi khuẩn lao

Có rất nhiều nguyên nhân gây nên tính kháng thuốc của vi khuẩn lao nhưng có 3 nguyên nhân chính là:

- Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc

do đó các thuốc không còn tác dụng nữa trong việc tiêu diệt vi khuẩn

- Sản phẩm gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc được vi khuẩn sản xuất thừa ra

- Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt tới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh

Ngày nay những nghiên cứu về sinh học phân tử người ta đã xác định được cơ chế kháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan đến các gen tương ứng Ví dụ: Kháng RMP được xác định là liên quan đến đột biến ở vùng gần

lõi của gen RpoB, gen mã hóa cho tiểu phần β-subunit của RNA polymerase

Kháng SM có thể là do đột biến ở gen rpsL Kháng PZA có thể liên quan đến

gen pncA Kháng quinolon có thể liên quan tới gen gyrA Kháng INH được cho là chủ yếu liên quan đến gen katG [11,23] Ở đây chúng ta chỉ tập trung nghiên cứu kháng thuốc do đột biến ở gen katG

1.3.3 Cơ chế kháng thuốc isoniazid của vi khuẩn lao

Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm

sắc thể của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa cho enzym peroxidase Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến trên gen này

catalase-Gen katG của vi khuẩn lao mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase

Enzyme này hoạt hóa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ axyl isonicotinic-NADH Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất enoyl-AcpM Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao Cơ chế phân tử của tính kháng

isoniazid chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 (S315T) của gen

katG mã hóa catalase-peroxidase Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base

thứ 2 trên codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn

đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase-peroxidase

do đó M tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [17] Do đó phát hiện sự thay đổi di truyền trong gen katG có thể cung cấp cho một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M

tuberculosis kháng isoniazid.

Hình 1.3 Cơ chế kháng thuốc isoniazid của vi khuẩn lao [22]

1.3.4 Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc

Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay gồm có 2 loại phương pháp đó là phương pháp xác định

kiểu hình và phương pháp xác định kiểu gen [24].

1.3.1.1 Các phương pháp xác định kiểu hình

Các phương pháp xác định kiểu hình thông thường có thể là: Phương pháp xác định tương quan, Phương pháp xác định tỷ lệ kháng, Phương pháp nồng độ tuyệt đối

Các phương pháp mới trong xác định kiểu hình gồm có: Sử dụng phage (phase-base methods), phương pháp đo màu (colorimetric methods), phương pháp khử nitrat (the nitrate reductase assay), phương pháp lớp thạch mỏng (the thin-layer agar method).

Các phương pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh Từ đó có thể kết luận về sự kháng thuốc của chủng vi khuẩn nghiên cứu Nhược điểm của phương pháp này là thời gian nuôi cấy để chẩn đoán quá dài, ít nhất mất 2 – 4 tuần Điều này làm cho công tác điều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao cũng như bệnh lao kháng thuốc còn gặp nhiều khó khăn

1.3.1.2 Các phương pháp xác định kiểu gen

Hiện nay có nhiều phương pháp xác định kiểu gen được ứng dụng để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc[3,11,24, 25], các phương pháp đó bao gồm:

- Giải trình tự gen (Sequencing)

- Lai trên pha rắn (Solid-phase hybridization techniques) gồm: test LiPa, kỹ thuật PLH (PCR- reverse lineblot hybridization) hay kỹ thuật Spoligotyping

- Real-time PCR

- Microarrays

Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan đến kháng thuốc tương ứng Phương pháp sử dụng các kỹ thuật cao đòi hỏi trang thiết bị máy móc hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chuyên sâu Nhưng thời gian để chẩn đoán bằng các phương pháp này nhanh hơn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao [24] Các phương pháp xác định kiểu gen vì vậy có ý nghĩa rất lớn, đã tạo bước đột phá cho công tác điều trị và kiểm soát bệnh lao

1.3.2 Phương pháp chẩn đoán vi lao kháng isoniazid

Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác định theo phương pháp chẩn đoán kiểu gen Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng

Để xác định đột biến trên gen katG hiện có nhiều phương pháp, song

giải trình tự gen vẫn là phương pháp cơ bản, chính xác, rõ ràng nhất

Giải trình tự (DNA squencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotit trong phân tử DNA Nguyên lý của phương pháp này là : Tổng hợp các mạch đơn DNA mới có độ dài ngắn hơn mạch khuôn, nhờ kĩ thuật đánh dấu và ngắt đoạn trong quá trình tổng hợp mạch DNA, thu được các mạch đơn hơn kém nhau một base từ đó có được sơ đồ trật tự mạch DNA khuôn mẫu So sánh trật tự của mẫu thí nghiệm với trật tự DNA chuẩn ta biết được vị trí các sai lệch (đột biến) [14]

Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định được các chủng vi

khuẩn lao kháng isoniazid là do có đột biến ở gen katG Codon xảy ra đột

biến là codon 315 [13]

Sự đột biến xảy ra là do thay thế nucleotit ở codon 315 (AGC thành ACC hoặc AGC thành ACA) [14]

Để giải trình tự gen katG, hiện nay người ta có thể thực hiện trực tiếp từ

sản phẩm PCR Khi sản phẩm PCR có độ dài thích hợp cho việc phân tích kết quả thì có thể thực hiện giải trình tự trực tiếp Cũng có thể giải trình tự thông

qua tách dòng bằng cách gắn đoạn gen katG cần nghiên cứu vào vector Đoạn gen cùng với vector tái tổ hợp được nhân lên trong tế bào E.coli Khi giải trình tự gen, cả đoạn gen katG và một phần vector đều được xác định trình tự

Giải trình tự thông qua tách dòng được ứng dụng trong khi sản phẩm PCR không được tốt, đặc biệt là trong các trường hợp gây đột biến nhân tạo kiểm chứng kháng thuốc và trong nghiên cứu biểu hiện gen [8]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các chủng vi khuẩn lao được phân lập từ các bệnh nhân tại bệnh viện Phạm Ngọc Thạch-Thành phố Hồ Chí Minh do Học viện Quân Y cung cấp

Bảng 2.1: Danh sách các mã DNA và mã chủng vi khuẩn lao phân lập từ các bệnh nhân

2.2 VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các sinh phẩm hóa chất chính

Các sinh phẩm hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu này được liệt kê

ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất chính

Ethanol tuyệt đối

Applied BioSciences (Mỹ)Fermentas (Mỹ)

Sigma (Mỹ)Sigma (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Fermentas (Mỹ)Applied BioSciences (Mỹ)Applied BioSciences (Mỹ)Fermentas (Mỹ)

2.2.2 Các máy và thiết bị chính (Bảng 2.3)

Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính

Tủ ấm ổn nhiệt

Máy PCR (GenAmp PCR System 9700)

Máy PCR (Thermo cycle)

Máy ly tâm lạnh (Biofuge Primo R)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Máy chụp ảnh Gel-Doc

Tủ lạnh -200C, -800C

Lò vi sóng

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire

Bể ổn nhiệt

Máy lắc Gyromax 737R

Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop

Máy phân tích trình tự DNA ABI

3100-Avant

Sanyo (Nhật Bản)Applied BioSciences (Mỹ)Bio-rad (Pháp)

Heraeus (Mỹ)Thommas Scientific (Mỹ)Dolphin (Mỹ)

Nuaire (Mỹ)Sanyo (Nhật Bản)Nuaire (Mỹ)Memmert (Đức)Amerex Instrument (Đức)Analitika (Đức)

Applied BioSciences (Mỹ)

2.2.3 Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

(oC)

KT(bp)KatG-F 5’ GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG 3’

KatG-R 5’ GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT 3’

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.3.2 Các kỹ thuật chính dùng trong nghiên cứu

- Tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol [6,15]

- Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

DNA vi khuẩn lao

PCR

gen katG

Gắn gen katG

vào plasmid pBT

Sơ đồ qui trình nhân bản đoạn gen katG

Cụ thể:

1 Sau khi đo nồng độ DNA khuôn, tính toán và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nhau trong cùng một thể tích của phản ứng PCR, và đạt khoảng 100 ng/thể tích 25 µl phản ứng

2 Tính các giá trị của các thành phần khác (Bảng 2.4)

Tách chiết DNA tổng số, đo nồng độ DNA của mẫu nghiên cứu

Tối ưu các thành phần phản ứng

PCR

Nhân gen theo chu trình nhiệt đã

được tối ưu hóa

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR