BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI KHCN: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT SẢN PHẨM DỊCH CHIẾT CÔ ĐẶC GIÀU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ YẾN SÀO KHÁNH HÒA

Khả năng chống oxy hóa của yến sào đã được công bố trong một số nghiên cứu trên thế giới như: dịch chiết từ yến sào có khả năng phòng chống ung thư đường ruột và ức chế

HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ YẾN SÀO KHÁNH HÒA

ĐT-2015-21101-ĐL/1

Chủ nhiệm đề tài: CN BÙI THỊ HẠNH

Cơ quan chủ trì thực hiện đề tài: CÔNG TY TNHH NHÀ NƯỚC MỘT THÀNH VIÊN YẾN SÀO KHÁNH HÒA

HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ YẾN SÀO KHÁNH HÒA

ĐT-2015-21101-ĐL/1

Chủ nhiệm đề tài: CN BÙI THỊ HẠNH

Cơ quan chủ trì thực hiện đề tài: CÔNG TY TNHH NHÀ NƯỚC MỘT THÀNH VIÊN YẾN SÀO KHÁNH HÒA

III

MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC BẢNG IX DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT XI

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Mục tiêu cụ thể 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

6 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 4

1.1 Khái quát chung về các vấn đề nghiên cứu 4

1.1.1 Tổng quan về yến sào 4

1.1.1.1 Thành phần hóa học của yến sào 4

1.1.1.2 Công dụng của yến sào 5

1.1.2 Tổng quan về gốc tự do và chất chống oxy hóa 5

1.1.2.1 Khái quát chung về gốc tự do và ảnh hưởng của gốc tự do đối với sức khỏe con người 5

1.1.2.2 Chất chống oxy hóa và vai trò đối với sức khỏe con người 6

1.1.3 Khái quát một số vấn đề cơ bản trong nghiên cứu quy trình sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 10

1.1.3.1 Giới thiệu về quá trình thủy phân 10

1.1.3.2 Giới thiệu về enzym sử dụng trong nghiên cứu tạo dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 13

1.1.3.3 Giới thiệu về phương pháp cô đặc sử dụng trong nghiên cứu quy trình sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 14

1.1.3.4 Giới thiệu về phương pháp tiệt trùng sử dụng trong nghiên cứu quy trình sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 16

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu yến sào trong nước 17

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu yến sào ngoài nước 18

1.3.1 Chiết tách thành phần hoạt tính từ yến sào 18

1.3.1.1 Chiết tách protein 18

1.3.1.2 Chiết tách axit sialic 19

1.3.1.3 Chiết khoáng chất 19

1.3.2 Các hoạt tính sinh học và dược lý của dịch chiết từ yến sào 19

1.3.2.1 Khả năng chống oxy hóa 19

1.3.2.2 Kháng viêm, bảo vệ tế bào 20

1.3.2.3 Là yếu tố làm tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor - EGF) 20

1.3.2.4 Ức chế hoạt động của virus cúm và ức chế sự ngưng kết 21

IV

1.3.2.5 Tăng trưởng tế bào 22

1.3.5.6 Tăng cường cấu trúc xương 22

1.3.6.7 Khả năng hình thành và bảo vệ mô sụn 22

1.3.3 Một số nghiên cứu về thủy phân yến sào 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng, hóa chất, thiết bị trong quá trình nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Hóa chất nghiên cứu 25

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu và phương pháp phân tích 26

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.2 Phương pháp phân tích 27

2.2.2.1 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân 27

2.2.2.2 Xác định hoạt tính chống oxy hóa 27

2.2.2.3 Xác định hàm lượng một số chất chống oxy hóa 28

2.2.2.4 Xác định hàm lượng kim loại nặng 28

2.2.2.5 Xác định các chỉ tiêu vi sinh 29

2.2.2.6 Đánh giá cảm quan sản phẩm 29

2.3 Thực nghiệm 29

2.3.1 Nghiên cứu quy trình thu dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 30

2.3.1.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30

2.3.1.2 Thuyết minh sơ đồ 31

2.3.2 Nghiên cứu quy trình cô đặc dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 36

2.3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

2.3.2.2 Thuyết minh sơ đồ 36

2.3.3 Nghiên cứu quy trình tiệt trùng dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 38

2.3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 38

2.3.3.2 Thuyết minh sơ đồ 38

2.3.4 Nghiên cứu quy trình bảo quản dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 39

2.3.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 39

2.3.4.2 Thuyết minh sơ đồ 40

2.2.5 Quy trình công nghệ sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 40

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41

3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình thu dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 41

V

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu hồi dịch chiết, hoạt tính và hàm lượng các chất chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 41 3.1.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu hồi dịch chiết 41 3.1.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hoạt tính chống oxy hóa 43 3.1.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hoạt chất chống oxy hóa 44 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại enzym đến hiệu suất thu hồi dịch chiết, hoạt tính và hoạt chất chống oxy hóa 45 3.1.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại enzym đến hiệu suất thu hồi dịch chiết 46 3.1.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại enzym đến hoạt tính và hoạt chất chống oxy hóa 46 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát (tỷ lệ enzym, nhiệt độ chiết, thời gian chiết) của enzym alcalase đến hiệu suất thu hồi dịch chiết và hoạt tính chống oxy hóa 50 3.1.3.1 Đánh giá mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến hiệu suất thu hồi dịch thủy phân 50 3.1.3.2 Đánh giá mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân bằng phương pháp DPPH 51 3.1.3.3 Đánh giá mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân bằng phương pháp ABTS 52 3.1.3.4 Đánh giá mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân bằng phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng 53 3.1.3.5 Tối ưu hóa quy trình thủy phân yến sào bằng enzym alcalase 54 3.1.3.6 Thử nghiệm quy trình 56 3.1.4 Quy trình công nghệ thu dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 56 3.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình cô đặc và quy trình tiệt trùng dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 57 3.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình cô đặc dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 57 3.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cô đặc chân không đến độ Brix của dịch chiết yến sào cô đặc 57 3.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cô đặc chân không đến giá trị cảm quan của dịch chiết yến sào cô đặc 58 3.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cô đặc chân không đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết yến sào cô đặc 59 3.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cô đặc chân không đến hàm lượng một số axit amin và hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết yến sào

cô đặc 61 3.2.1.5 Quy trình cô đặc dịch chiết giàu hoạt chất chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 63

VI

3.2.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình tiệt trùng dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính

chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 64

3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tiệt trùng đến giá trị cảm quan của dịch chiết yến sào cô đặc 64

3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tiệt trùng đến chỉ tiêu vi sinh của dịch chiết yến sào cô đặc 65

3.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tiệt trùng đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết yến sào cô đặc 69

3.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tiệt trùng đến hàm lượng một số hoạt chất chống oxy hóa của dịch chiết yến sào cô đặc 70

3.2.2.5 Quy trình tiệt trùng dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 72

3.3 Nghiên cứu quy trình bảo quản dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 73

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện bảo quản (nhiệt độ, thời gian) đến chất lượng cảm quan, chỉ tiêu vi sinh của dịch chiết cô đặc từ yến sào Khánh Hòa 73

3.3.1.1 Chất lượng cảm quan 73

3.3.1.2 Chỉ tiêu vi sinh 74

3.3.2 Nghiên cứu sự biến đổi hoạt tính của dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa ở các điều kiện bảo quản 75

3.3.3 Nghiên cứu sự biến đổi một số hợp chất chống oxy hóa chính của dịch chiết cô đặc từ yến sào Khánh Hòa ở các điều kiện bảo quản 77

3.3.4 Quy trình bảo quản dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 78

3.4 Sản xuất thử nghiệm dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa 80

3.4.1 Sơ đồ quy trình sản xuất 80

3.4.2 Thuyết minh sơ đồ quy trình 80

KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 86

KẾT LUẬN: 86

KIẾN NGHỊ: 86

PHỤ LỤC 96

VII

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết bằng phương pháp nhiệt độ

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu công đoạn thủy phân

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện cô đặc dịch chiết

Hình 2.5 Chủ nhiệm đề tài kiểm tra mẫu sản phẩm dịch chiết cô đặc

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện tiệt trùng dịch

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu quy trình bảo quản 39

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất dịch chiết cô đặc giàu

Hình 3.1 Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất thu hồi

Hình 3.2 Dịch chiết bằng nhiệt độ cao (100oC) và dịch chiết bằng

Hình 3.3 Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng bắt gốc tự

Hình 3.4 Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến giá trị tổng năng lực

Hình 3.5 Đánh giá ảnh hưởng của các loại enzym khác nhau đến hiệu

Hình 3.6

Đánh giá ảnh hưởng của các loại enzym khác nhau đến khả năng bắt gốc tự do DPPH, ABTS của dịch thủy phân yến sào

47

Hình 3.7 Đánh giá ảnh hưởng của các loại enzym khác nhau đến tổng

Hình 3.8 Quy trình thu dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến

Hình 3.9 Biến đổi độ Brix của dịch chiết yến sào cô đặc ở các điều

Hình 3.10 Biến đổi giá trị cảm quan của dịch chiết yến sào cô đặc ở

VIII

Hình 3.11 Biến đổi giá trị tổng năng lực khử của dịch chiết yến sào cô

Hình 3.12 Biến đổi khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch chiết yến

Hình 3.13 Biến đổi khả năng bắt gốc tự do ABTS của dịch chiết yến

Hình 3.14 Quy trình cô đặc dịch chiết giàu hoạt chất chống oxy hóa từ

Hình 3.15 Biến đổi cảm quan sản phẩm trong quá trình tiệt trùng 64

Hình 3.16 Biến thiên nhiệt độ tâm sản phẩm trong quá trình tiệt

75

Hình 3.21

Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến tỷ lệ tổn thất hoạt tính chống oxy hóa của của sản phẩm thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH

75

Hình 3.22

Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến tỷ lệ tổn thất hoạt tính chống oxy hóa của của sản phẩm thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS

76

Hình 3.23 Quy trình bảo quản dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống

Hình 3.30 Chủ nhiệm đề tài và nhóm nghiên cứu kiểm tra mẫu sản

phẩm mỹ phẩm ứng dụng dịch chiết từ yến sào Khánh Hòa 85

IX

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thí nghiệm xác định chế độ thủy phân bằng enzym alcalase 32

Bảng 2.2 Thí nghiệm chế độ thủy phân bằng enzym protamex 33

Bảng 2.3 Thí nghiệm chế độ thủy phân bằng enzym pepsin 34

Bảng 3.1 Hàm lượng các axit amin và một số hoạt chất trong dịch chiết

từ yến sào Khánh Hòa bằng nhiệt độ cao và enzym pepsin

44

Bảng 3.2 Hàm lượng các axit amin và một số hoạt chất trong dịch

thủy phân từ yến sào Khánh Hòa

49

Bảng 3.3 Kết quả tính bước chuyển động δj của các yếu tố 54

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của điều kiện cô đặc đến hàm lượng axit amin và

một số chất chống oxy hóa của dịch chiết yến sào cô đặc

62

Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra vi sinh ở các điều kiện nhiệt độ nghiên cứu 65

Bảng 3.7 Biến đổi giá trị F (thời gian hiệu quả tương đương) của quá

trình xử lý nhiệt

68

Bảng 3.8 Ảnh hưởng điều kiện tiệt trùng đến hoạt tính chống oxy hóa

dịch chiết yến sào cô đặc

Bảng 3.11 Ảnh hưởng điều kiện tiệt trùng đến hàm lượng polyphenol 72

Bảng 3.12 Bảng điểm cảm quan sản phẩm ở các điều kiện bảo quản 73

Bảng 3.13 Các chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm trong quá trình bảo quản 74

Bảng 3.14 Biến đổi hàm lượng cystein, glutathione của sản phẩm trong

quá trình bảo quản

X

Bảng 3.17

Hàm lượng các axit amin và một số hoạt chất của dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa trong sản xuất thử nghiệm

84

XI

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

trên các điểm đẳng điện khác nhau

ABTS 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic axit)

mg aa/ml dịch mg axit ascorbic/ml dịch

Thuở xưa, yến sào được coi là "vàng trắng" được dùng phục vụ yến tiệc cũng như xuất khẩu đổi lấy nhu yếu phẩm cần thiết cho quốc gia do những công dụng mà không có loại thực phẩm nào có thể thay thế được Ngày nay, nghiên cứu khoa học hiện đại đã chứng minh giá trị quý hiếm của yến sào là do một số thành phần như glycoprotein, chất chống oxy hóa, chất chống viêm, làm chắc xương, glucosamin, lacto ferin, axit sialic, axit amin, axit béo, triacyl glycerol, vitamin, khoáng chất, đây là những chất có công dụng rất tốt cho sức khỏe

Trải qua hơn 25 năm phát triển và trưởng thành, với thế mạnh là nhà khai thác trực tiếp nguồn tài nguyên yến sào đảo yến thiên nhiên, Công ty Yến sào Khánh Hòa được Đảng và Nhà nước trao tặng nhiều phần thưởng cao quý như: Huân chương lao động hạng nhất (2014), nhì (2009), ba (2004) và đặc biệt là danh hiệu Anh hùng lao động thời kỳ đổi mới vào tháng 11 năm 2015 Bên cạnh việc sản xuất kinh doanh, công ty luôn chú trọng tới công tác nghiên cứu khoa học và coi đó là chìa khóa để tăng năng suất, nâng cao chất lượng sản phẩm, phát triển thương hiệu Yến sào Khánh Hòa Thành công trong nghiên cứu khoa học đã đưa Công ty Yến sào Khánh Hòa đến với nhiều giải thưởng cao quý từ các Bộ, Sở ban ngành như: Đạt cúp vàng Top 50 sản phẩm hàng đầu 2007; Huy chương Bạc Hội thi sáng tạo kỹ thuật quốc tế tại Hàn Quốc năm 2009; Thương hiệu mạnh Việt Nam năm 2008 và 2011; Cúp vàng Top ten thương hiệu Việt - Ứng dụng khoa học công nghệ năm 2011; Thương hiệu uy tín Đông nam Á lần thứ nhất năm 2012; Thương hiệu vàng năm 2012; Cúp vàng sở hữu trí tuệ Việt Nam năm 2013; Giải thưởng Nhãn hiệu nổi tiếng ASEAN năm 2015; Giải nhất VIFOTEC năm 2015; Giải thưởng Quốc tế WIPO năm 2015; Giải vàng chất lượng quốc gia năm 2015; Giải thưởng doanh nghiệp thương mại dịch vụ tiêu biểu năm 2016; Giải thưởng khoa học và công nghệ tỉnh Khánh Hòa lần thứ nhất năm 2016; Top ten thương hiệu sản phẩm dịch vụ hàng đầu Việt Nam năm 2016; Top 50 doanh nghiệp xuất sắc nhất năm 2016; Top ten thương hiệu mạnh Đất Việt năm 2017, …

Để tiếp tục phát huy vai trò và thế mạnh của đơn vị kết hợp cùng nhu cầu thực tiễn của cuộc sống, Công ty Yến sào Khánh Hòa đã thực hiện các nghiên cứu về tình trạng stress trong cuộc sống hiện đại, nguyên nhân cũng như cách phòng ngừa Kết quả cho thấy áp lực của công việc và cuộc sống là nguy cơ phát sinh nhiều bệnh tật liên quan đến sự mất cân bằng oxy hóa Sự mất cân bằng này bắt nguồn từ những quá trình oxy hóa diễn ra trong cơ thể con người Để cân bằng các phản ứng diễn ra trong

cơ thể, con người thường sử dụng các chất chống oxy hóa tổng hợp như vitamin C,

vitamin E và các viên nén giàu chất chống oxy hóa Tuy nhiên những chất chống oxy

2

hóa này được chứng minh có nhiều tác dụng phụ cho người sử dụng và ngày càng bị hạn chế sử dụng bởi lo ngại ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng Trước tình hình đó, nhu cầu cấp thiết đặt ra là tìm nguồn thực phẩm từ thiên nhiên có khả năng chống oxy hóa, giúp cân bằng các quá trình oxy hóa cũng như lão hóa để ứng dụng vào thực tiễn cuộc sống

Khả năng chống oxy hóa của yến sào đã được công bố trong một số nghiên cứu trên thế giới như: dịch chiết từ yến sào có khả năng phòng chống ung thư đường ruột

và ức chế virut cúm, làm cân bằng các quá trình trao đổi chất trong cơ thể, tăng cường khả năng hoạt động thể lực và phản xạ thần kinh, Tuy nhiên, đối với yến sào của Việt Nam, đặc biệt là yến sào Khánh Hòa thì chưa có công trình khoa học nào công bố chính thức về hoạt tính chống oxy hóa Do đó, để có thể cung cấp những dữ liệu khoa học về hoạt tính chống oxy hóa, làm cơ sở để sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa cần có quy trình công nghệ hoàn chỉnh ở quy

mô phòng thí nghiệm Việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất sản

phẩm dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa” sẽ

đưa ra những cơ sở khoa học về hoạt tính chống oxy hóa của yến sào Khánh Hòa Đồng thời, mở ra hướng ứng dụng dịch chiết vào các dòng sản phẩm mới, mang tính chiến lược, có giá trị kinh tế cao chứa nhiều hoạt tính sinh học quý, góp phần nâng cao sức khỏe cho người sử dụng, đưa thương hiệu Yến sào Khánh Hòa đến gần hơn với người tiêu dùng trong và ngoài nước

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa;

- Xác định các dữ liệu khoa học về hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa;

- Đa dạng hóa sản phẩm góp phần khẳng định chất lượng sản phẩm và quảng bá thương hiệu Yến sào Khánh Hòa đối với khách hàng trong và ngoài nước; tăng cường khả năng xuất khẩu sản phẩm

3 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được các thông số kỹ thuật trích ly dịch chiết yến sào;

- Xác định được phương pháp cô đặc dịch chiết yến sào;

- Xác định được phương pháp tiệt trùng dịch chiết yến sào cô đặc;

- Đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết yến sào cô đặc một cách toàn diện;

- Đánh giá tính ổn định của dịch chiết yến sào cô đặc ở các điều kiện bảo quản khác nhau;

3

- Sản xuất thử nghiệm 100 chai dịch chiết yến sào cô đặc (30 ml/chai)

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Yến sào Khánh Hòa thu tại các đảo thuộc vùng biển Khánh Hòa do Công ty trực tiếp khai thác

5 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa một cách đầy đủ và hệ thống từ việc chọn nguồn nguyên liệu đến tạo ra sản phẩm dịch chiết yến sào cô đặc

Ngoài ra, đề tài còn cung cấp những dữ liệu khoa học mới về các vấn đề sau: Phương pháp thủy phân yến sào bằng enzym alcalase với mục đích nâng cao hiệu suất thủy phân;

Thông số kỹ thuật của quá trình cô đặc, tiệt trùng dịch thủy phân yến sào;

Phương pháp bảo quản dịch chiết yến sào cô đặc;

Cung cấp dữ liệu khoa học về hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết yến sào cô đặc

6 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Cung cấp được những dữ liệu khoa học mới về khả năng chống oxy hóa của dịch chiết cô đặc yến sào Khánh Hòa, giúp nâng cao giá trị của yến sào Khánh Hòa;

- Là tiền đề cho việc nghiên cứu những dòng sản phẩm cao cấp mới, đưa ra thị trường các dòng sản phẩm mang tính chiến lược, có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều hoạt tính sinh học quý góp phần nâng cao sức khỏe cho người sử dụng, đồng hành cùng với sự phát triển của xã hội;

- Mở rộng quy mô sản xuất kinh doanh của doanh nghiệp Đồng thời, góp phần tăng nhu cầu sử dụng lao động của doanh nghiệp, từ đó tạo nhiều cơ hội việc làm cho

người lao động, thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội, nâng cao đời sống người dân;

- Tạo điều kiện phát triển bền vững ngành nghề và nâng cao vị thế của yến sào Khánh Hòa ở thị trường trong nước và thế giới

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI

NƯỚC 1.1 Khái quát chung về các vấn đề nghiên cứu

1.1.1 Tổng quan về yến sào

1.1.1.1 Thành phần hóa học của yến sào

Yến sào là một loại thực phẩm cao cấp, được sử dụng chủ yếu ở khu vực Châu

Á Thành phần chính của tổ yến gồm: protein, glycoprotein [26] và một số thành phần khác như: chất chống oxy hóa, chất chống viêm, làm chắc xương, glucosamine, lacto ferrin, axit sialic, axit amin, axit béo, triacyl glycerol, vitamin, khoáng chất Đây là những hợp chất có công dụng rất tốt cho sức khỏe [36] Hàm lượng của protein và glycoprotein phụ thuộc vào loại tổ yến [26]

Glycoprotein có vai trò quan trọng đối với động vật bậc cao, động vật có xương sống và không xương sống Glycoprotein của tổ yến chứa khoảng 9% axit sialic; 4.19 – 7.2% galactosamin; khoảng 5.3% glucosamin; 5.03 – 16.9% galactos và khoảng 0.7% fucose [28] Chính cấu trúc glycoprotein trong tổ yến đã tạo nên sự khác biệt về mức độ hòa tan, tính chất đặc trưng và hợp chất có hoạt tính sinh học với các protein

có nguồn gốc khác [22]

Hàm lượng protein chiếm chủ yếu trong tổ yến với tỷ lệ từ 55.48% – 58.55%, tiếp đến là cacbohydrat chiếm từ 22.2% – 25.79% [28], nitơ khoảng 10.29%, lipit 0.14 – 1.28%, tro 2.1% [22] Protein có vai trò quan trọng đối với hoạt động sống Dưới tác dụng của enzym thủy phân, các protein trong thực phẩm bị thủy phân thành các protein có kích thước nhỏ hơn, peptit và các axit amin tự do [28] như: axit aspartic 40.44 mg/g; threonine 22.39 mg/g; serine 29.47 mg/g; axit glutamic 51.78 mg/g; proline 21.07 mg/g; glycine 18.34 mg/g; alanine 18.44 mg/g; cysteine 41.06 mg/g; valine 24.35 mg/g; methionine 5.77 mg/g; isoleucine 16.65 mg/g; leucine 26.06 mg/g; tyrosine 17.16 mg/g; phenylalanine 29.37 mg/g; histidine 16.54 mg/g; lysine 15.23

mg/g; arginine 18.36 mg/g [52] Những axit amin này góp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm [28]

Bên cạnh đó trong tổ yến còn chứa một số khoáng chất như: Ca khoảng 553.1 ± 19.5 mg/100g; Na khoảng 187.9 ± 10.4 mg/100g; Mg khoảng 92.9 ± 2.0 mg/100g và

K khoảng 6.3 ± 0.4 mg/100g Vị trí và thời điểm làm tổ của chim yến có ảnh hưởng đến hàm lượng các chất [47]

Ngoài ra, trong một số kết quả nghiên cứu cho thấy tổ yến còn chứa một lượng nhỏ taurin (micromol) Taurin (2 – amino ethane sulphonic axit) là một β – amino axit

tự do chứa lưu huỳnh có mặt trong các mô cơ, sữa, nước tiểu Nó có vai trò quan trọng đối với chức năng sinh lý như: làm chất chống oxy hóa, điều trị bệnh thần kinh, ung thư, kéo dài sự sống, nhiễm trùng huyết, viêm võng mạc sắc tố Sự khác biệt giữa nồng độ taurin trong thực vật, động vật và tổ yến giúp việc phát hiện tổ yến bị pha trộn trở nên đơn giản và hiệu quả hơn [46]

5

Hình 1.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chim yến

1.1.1.2 Công dụng của yến sào

Theo y học cổ truyền của Trung Quốc, yến sào được chứng minh có tác dụng chữa bệnh lao phổi, xuất huyết, tiêu chảy, sốt rét, nhiễm trùng phổi Yến sào dùng cho các trường hợp suy nhược cơ thể, viêm phế quản, ho khan đàm dính, hen suyễn, khái

huyết thổ huyết, viêm dạ dày thực quản gây nôn, lỵ và sốt rét kéo dài…[Error!

Reference source not found.] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu mới đây cho thấy yến

sào có tác dụng tăng cường khí lực, bổ huyết, bổ sung sinh lực cho phổi và thận, rất tốt cho da, tăng hấp thu các chất dinh dưỡng và kích thích sự phân chia tế bào bạch cầu ngoại biên, chứa nhiều nguyên tố vi lượng giúp tăng cường sức đề kháng cơ thể

1.1.2 Tổng quan về gốc tự do và chất chống oxy hóa

1.1.2.1 Khái quát chung về gốc tự do và ảnh hưởng của gốc tự do đối với sức khỏe con người

a Khái quát chung về gốc tự do

Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (Reactive oxygen species – ROS và Reactive nitrogen species – RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự

do và các dẫn xuất không phải gốc tự do

6

Bảng 1.1 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học

Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydro peroxit, nitro peroxit là tiền chất của các gốc tự do Các ROS và RNS phản ứng rất nhanh với các phân tử quanh

nó, do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như DNA, protein, lipit [3]

b Ảnh hưởng của gốc tự do đối với sức khỏe con người

Việc tạo thành các gốc tự do (ROS, RNS) là một phần chức năng bình thường của tế bào, tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác dụng xấu hoặc tốt đến cơ thể

Ở nồng độ thấp, các ROS và RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ: điều hòa phân ly tế bào (apoptosis), kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase, …) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm, điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa [3]

Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: đột biến DNA, biến tính protein, oxy hóa lipit [3] Quá trình này mở đầu cho quá trình oxy hóa các cặp phân tử dẫn đến tổn thương và làm chết tế bào, gây ra các bệnh lão hóa,

xơ vữa động mạch, xơ gan, đục thủy tinh thể [78]

1.1.2.2 Chất chống oxy hóa và vai trò đối với sức khỏe con người

a Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa [35]

Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất trong tế bào của cơ thể

Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại: các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với gốc tự do, do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc

7

bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc 2 kìm hãm sự hình thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím, tạo phức hợp với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe, vô hoạt oxy đơn)

b Các nhóm chất chống oxy hóa và vai trò của chúng đối với sức khỏe con người

Có 2 nhóm chống oxy hóa chính trong tế bào: chất chống oxy hóa enzym và chất

chống oxy hóa phi enzym

 Nhóm chất chống oxy hóa enzym (Enzymatic antioxidants) [78]

Enzym chống oxy hóa được chia thành 2 nhóm nhỏ là nhóm cơ bản và nhóm trung bình Nhóm cơ bản được bảo vệ bởi 3 enzym quan trọng, giúp ngăn chặn sự hình thành và trung hòa các gốc tự do Trong đó, glutathione peroxidase được xem là chất nền cho phản ứng Fenton; enzym catalase do có khả năng nhường 2 electron để giảm peroxide bằng cách hình thành selenols và loại trừ peroxides

Glutathione reductase và glucose-6-phosphate dehydrogenase có trách nhiệm bảo vệ enzym nhóm trung bình Glutathione reductase làm giảm chất chống oxy hóa glutathione từ dạng oxy hóa thành dạng khử sau đó tiếp tục trung hòa thành các gốc tự do

 Nhóm chất chống oxy hóa phi enzym (Non - enzym antioxidants)

Chất chống oxy hóa phi enzym bao gồm các nhóm hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh, vitamin, khoáng chất, các chất chống oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp, carotenoid, polyphenol Dưới đây là khả năng chống oxy hóa của một số nhóm

+ Nhóm axit amin chứa lưu huỳnh [39]

Gần đây, hoạt tính chống oxy hóa của các axit amin đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Có nhiều loại axit amin khác nhau tồn tại trong cơ thể người nhưng chỉ một số nhỏ chúng được nghiên cứu trong đó có axit amin chứa lưu huỳnh (S)

Lưu huỳnh là một nguyên tố vô cơ chính, cần thiết cho cơ thể, chúng tham gia vào cấu trúc của axit amin, protein, enzym, vitamin và các phân tử sinh học khác Lưu huỳnh (S) là một phần của nhóm sulhydryl, tồn tại ở dạng liên kết thioester, có vai trò quan trọng trong việc kích hoạt các phân tử như acetate, phản ứng với Fe trong flavoenzym như succinate dehydrogenase và NADH dehydrogenase

Dưới đây là một vài axit amin và hợp chất có khả năng chống oxy hóa chứa lưu huỳnh như: cystein, methionine, taurine, glutathione (GSH), axit lipoic (LA), N-acetylcysteine (NAC), α – mercaptopropionylglycine (MPG), hợp chất chống oxy hóa organosulfur của tinh dầu tỏi, diallysulfide (DAS), diallyldisulfide (DADS) và diallytrisulfide (DATS)

8

Cystein [69]: Là thành phần chiếm số lượng chủ yếu trong nhóm thiol plasma, tiếp theo

là homocystein và glutathione Cystein có một số vai trò như:

Tự oxy hóa trong quá trình chuyển hóa ion kim loại, tạo ra H2O2 Thêm vào đó, phần cystein còn lại trong phân tử superoxide dismutase sẽ hoạt động và tương tác với

disulfide trong tế bào và ức chế sản xuất của hoạt động enzym

Tạo liên kết cộng hóa trị trong cấu trúc protein, bằng cách hình thành các cầu nối disulfide giữa hai phân tử cystein, nó có vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc

protein, quyết định đến việc xác định cấu trúc của một số loại protein

Có vai trò quan trọng trong sản xuất glutathione, là tác nhân giảm ngoại bào Cystein cũng được xem là chất nền quan trọng trong tổng hợp protein, có công dụng

đặc biệt trong giảm các đốm đồi mồi [39]

Glutathione: là chất chống oxy hóa tripeptit được tạo thành từ 3 loại axit amin là

cysteine, glycine và glutamate Nó được xem là tác nhân bảo vệ và loại bỏ chất độc

cho cả hai phản ứng enzym và phi enzym Glutathione có vai trò sau:

Là một chất chống oxy hóa bên trong tế bào có chức năng bảo vệ màng tế bào Khi lượng glutathione giảm, các enzym và protein sẽ bị oxy hóa, dẫn đến mất cân bằng phản ứng oxy hóa khử, xảy ra liên kết chéo và tích tụ protein trong màng tế bào [39, 54]

Glutathione giúp giảm thiểu các bệnh nhiễm trùng, dị tật di truyền và rối loạn chuyển hóa bao gồm cả HIV Ngăn ngừa tổn thương tế bào do oxy hóa stress gây ra như lão hóa, xơ vữa động mạch [54]

Taurin: Là một axit amin sulfonic còn gọi là β-amino axit chứa lưu huỳnh,

chiếm hơn 50% amin tự do trong mô tim [66] Taurin có khả năng hòa tan trong nước cao (10.48g/100ml) [58], có cấu trúc là một nhóm amino axit gắn với một nhóm sulfonic bằng hai nhóm methylene trong cùng một chuỗi Taurin có vai trò quan trọng

đối với hoạt động của cơ thể, dưới đây là một số công dụng cơ bản:

+ Tác động đến tim mạch: nghiên cứu trên người tiểu đường tuýp 1, có hút thuốc

có tỷ lệ rối loạn chức năng nội mô cao bằng cách bổ sung taurin Sau khi bổ sung 1500

mg taurin trong 2 tuần, các thông số vượt kiểm soát trên đã trở về mức kiểm soát đồng

thời cũng cải thiện được lưu lượng máu [58]

+ Ảnh hưởng đến chuyển hóa glucose: taurin được xem là chất bảo vệ màng tế

bào bằng cách điều chỉnh sự lưu thông các chất qua màng, cũng như khả năng chống oxy hóa Nó có khả năng chống oxy hóa bằng cách tạo liên kết với các ion kim loại (Fe2+, Cu2+) và các protein kim loại oxy hóa mạch máu [80], sau đó chúng sẽ hoạt động như chất chống oxy hóa khi hàm lượng đường trong máu cao [82] Ở nồng độ 1mM, taurin có khả năng làm giảm quá trình oxy hóa stress lên mô cơ tim và ngăn chặn sự tổn thương lên mô tim do thiếu máu cục bộ [41, 49] Taurin có tiềm năng

9

trong điều trị kháng insulin cũng như tái tạo chất chống oxy hóa, giảm quá trình peroxit lipit, cải thiện sự kháng insulin do fructose gây ra Taurin có thể làm giảm đau

khớp do tiểu đường gây ra [85]

+ Phản ứng với hocmon: taurin có khả năng chống oxy hóa và ngăn chặn quá

trình oxy hóa stress, giúp giảm sự suy giảm testosterone do quá trình oxy hóa gây ra

bởi một số chất như nicotine, asen, cadmium [33]

+ Phản ứng với chất oxy hóa: taurin là chất chống oxy hóa không trực tiếp đào thải được gốc tự do [19], thiếu taurin sẽ dẫn đến rối loạn quá trình oxy hóa

+ Tương tác với các cơ quan khác trong cơ thể như mắt, thận, phổi: giúp bảo vệ

phổi, gan khỏi hiện tượng oxy hóa stress [74] Nghiên cứu trên chuột và khỉ (là đối tượng có taurin phụ thuộc và chế độ ăn do cơ thể không tự tổng hợp được) cho thấy khi chế độ ăn thiếu taurin sẽ làm giảm đáng kể nồng độ taurin trong võng mạc, điều

này có liên quan đến thoái hóa võng mạc

+ Ngoài ra, taurin kết hợp với vitamin A (retinol) trong mắt tạo phân tử

retinylidene taurin (tauret) Tauret được tổng hợp trong võng mạc [67] có liên quan đến tái sinh rhodopsin và khả năng cảm thụ ánh sáng [18] Ngoài ra, taurin cũng có khả năng thẩm thấu trong võng mạc, có thể bảo vệ bên ngoài võng mạc bằng cách điều chỉnh mức độ hydrat hóa và áp lực lên các cơ quan này Nó còn có khả năng bảo vệ

mắt tránh những tác động như nồng độ glucose tăng cao trong các mô ở võng mạc [75]

+ Tương tự như tim, việc bổ sung taurin giúp hạn chế hiện tượng thiếu máu, giúp

tái tạo máu ở thận [40] và hạn chế hiện tượng oxy hóa stress do chất độc gây ra [55,

77], giảm hiện tượng oxy hóa stress do ăn kiêng gây ra

Vitamin: điển hình cho khả năng chống oxy hóa của vitamin là vitamin E Chúng

tồn tại tám dạng trong tự nhiên: bốn dạng tocopherol và bốn dạng tocotrienol Cả tám dạng này đều chứa một vòng thơm và một chuỗi mạch thẳng 16 cacbon Nhóm hydroxyl gắn với vòng thơm quyết định tính chống oxy hóa của vitamin E trong khi mạch cacbon đảm bảo khả năng hòa tan trong chất béo của chúng [3]

Tính chất hòa tan trong chất béo của vitamin E giúp chúng có khả năng thâm nhập sâu vào các màng sinh học vốn chứa nhiều axit béo không no và ngăn cản chuỗi phản ứng oxy hóa lipit Các vitamin E sẽ chuyển hydro của nó cho gốc tự do peroxit Gốc tocopheryl tạo thành được khử về trạng thái ban đầu nhờ vitamin C

Tocopherol-OH + LOOo → Tocopherol-O + LOOH Với LOOo: gốc tự do peroxit

Khả năng chống oxy hóa của vitamin E phụ thuộc vào mức độ cản trở không gian của các nhóm methyl ở vị trí ortho đối với các nhóm hydroxyl ở vòng thơm

10

Nhóm hydroxyl càng bị cản trở ít (trường hợp δ-tocopherol và δ-tocotrienol), khả năng chống oxy hóa càng cao [3]

Các hợp chất phenol [3, 32]: Các hợp chất phenol là một trong các nhóm sản

phẩm trao đổi chất đa dạng về cấu trúc và chức năng Trong thực phẩm, đây là những

chất hoạt động chủ đạo giữ vai trò quyết định đến hương vị của nhiều loại sản phẩm

Về mặt y học, việc sử dụng thực phẩm giàu hợp chất phenol được chứng minh là

có lợi cho sức khỏe do chúng có khả năng chống oxy hóa Hợp chất phenol đa dạng về cấu trúc, tùy vào cấu tạo mạch cacbon mà chúng được phân thành phenol đơn giản (C6), axit phenolic, flavonoid (C6 - C3 - C6), stilbene (C6 - C2 - C6) và lignine (C6 -

C2)n Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol như sau:

- Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxy hóa khử thấp;

- Tạo phức với các ion Fe2+ và Cu+ Sắt và đồng là những kim loại đảm nhận các vai trò sinh lý trong cơ thể như tham gia vận chuyển oxy (hemoglobin), cofactor của nhiều enzym (Fe đối với catalase, Cu đối với superoxyde dismutase) Tuy nhiên, chúng lại có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber - Weiss để tạo ra các gốc tự do;

- Kìm hãm hoạt động của các enzym có khả năng tạo các gốc tự do như xanthine oxidase

1.1.3 Khái quát một số vấn đề cơ bản trong nghiên cứu quy trình sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa

1.1.3.1 Giới thiệu về quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân là quá trình phân giải một hợp chất hóa học có phân tử lượng cao, với sự tham gia của nước để tạo ra những hợp chất hóa học mới có phân tử lượng thấp hơn [9]

a Ưu nhược điểm cúa các phương pháp thủy phân [9]

Ưu nhược điểm của các phương pháp thủy phân được thể hiện ở bảng 1.2

11

Bảng 1.2 Ưu nhược điểm của các phương pháp thủy phân

và không bị ăn mòn;

+ Sản phẩm tạo thành có màu nâm sẫm do tryptophan bị phá hủy;

+ Phá hủy một số axit amin như: tryptophan, methionine, cysteine, histidine, lysine

bằng bazơ

+ Giữ được các axit amin có

cấu trúc vòng thơm

+ Hiệu suất thấp hơn thủy phân bằng axit;

+ Sản phẩm sau thủy phân cần

phải đưa về pH trung tính

bằng enzym

+ Dịch thu được sau thủy phân

có chứa tất cả các axit amin thiết yếu của nguyên liệu, bao gồm cả tryptophan;

+ Không tạo ra sản phẩm phụ

do enzym có tính đặc hiệu cao;

+ Sản phẩm thủy phân protein bằng enzym có tính chất hóa học và sinh học tương tự như sản phẩm tạo ra khi thủy phân protein trong hệ tiêu hóa

+ Thời gian thủy phân dài hơn

so với thủy phân bằng axit; + Muốn có hiệu quả cao phải có chế phẩm enzym tinh khiết; + Dễ bị ảnh hưởng của điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, …;

+ Chi phí cao hơn so với hai

phương pháp trên

12

b Giới thiệu về quá trình thủy phân bằng phương pháp sử dụng enzym

Cơ chế của quá trình thủy phân bằng enzym

Quá trình thủy phân bằng enzym gồm 3 giai đoạn [9]:

- Giai đoạn thứ nhất: Enzym sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu,

nhờ đó sẽ tạo ra được phức hệ enzym – cơ chất Phức hệ này thường không bền Phản ứng tạo ra phức hệ enzym cơ chất thường xảy ra rất nhanh và đòi hỏi ít năng lượng

- Giai đoạn thứ hai: khi cơ chất tạo phức với enzym sẽ bị thay đổi về cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả là các liên kết bị phá vỡ

và tạo ra sản phẩm

- Giai đoạn thứ ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng được tạo thành và tách ra khỏi enzym

- Cơ chế xúc tác tổng quát của enzym được trình bày như sau:

Trong đó: E – enzym; S – cơ chất; P – sản phẩm

c Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằng enzym

Ảnh hưởng của nồng độ enzym [12]

- Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym

- Cũng có trường hợp khi nồng độ enzym quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [12]

- Phức trung gian enzym - cơ chất (ES) được hình thành từ phản ứng trung gian enzym - cơ chất Sau đó phức ES chuyển hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng và enzym tự do, khi ES càng lớn thì tốc độ phản ứng càng lớn, do đó nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn đến vận tốc của quá trình phản ứng

Ảnh hưởng của nhiệt độ [9]

- Tốc độ phản ứng của enzym không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzym sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu

- Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzym cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu Các enzym khác nhau sẽ có tốc độ phản ứng khác nhau Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzym sẽ bị giảm Khi đó enzym không có khả

13

năng phục hồi lại hoạt tính

- Nhiệt độ tối ưu của một enzym phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ

Ảnh hưởng của pH [9]

- pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzym và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzym Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzym

- Nhiều enzym hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuy nhiên, cũng có nhiều

enzym hoạt động ở pH axit yếu Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả

Là loại enzym thủy phân protein được tách thủy phân từ Bacillus lichenifomis có

trọng lượng phân tử 27300 dalton Chúng có khả năng phân cắt các liên kết nội và ngoại phân tử (endopeptit ase) [65, 71] để chuyển protein thành các đoạn peptit Nhiệt độ tối ưu cho alcalase hoạt động từ 55oC đến 70oC, pH tối ưu là 6.5 đến 8.5 Alcalase

có tính chịu muối kém và hoạt động kém khi hàm lượng muối 5% so với khối lượng nguyên liệu, bị bất hoạt ở 90oC trong 5 phút [68]

Cơ chế xúc tác của phản ứng thủy phân bởi enzym alcalase thông qua hai bước:

- Acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm –OH của serine với

nguyên tử cacbon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng) Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl – enzym, vòng imidazol và một amin (phản ứng khử) [11]

- Khử acyl hóa: phức hệ acyl – enzym bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một Trong đó, nhóm imidazol chuyển proton của gốc –OH từ serine cho nhóm amin để tái sinh lại enzym [11]

có trong phân tử protein tạo thành các peptit chứa từ 5 – 8 axit amin Chúng không có

khả năng phân cắt triệt để protein thành các axit amin riêng lẻ mà chỉ cắt khoảng 15% liên kết peptit của protein tạo sản phẩm pepton có trọng lượng phân tử nhỏ

Ngoài ra, pepsin còn thủy phân liên kết giữa Ala-Ala, Ala-Ser, nó cũng cắt liên kết peptit giữa Leu-Val, Val-Cis, Glu-Asn, Leu-Glu nhưng ở mức độ thấp hơn Pepsin phân cắt dễ dàng các protein tan trong nước như albumin, hemoglobin, mystin, globulin, … Pepsin phân cắt rất khó hay không phân cắt được những protein không tan hay các nucleoprotein, protein hình sợi như keratin, neucin, glagen, gluten, các nucleo protein, …

c Enzym protamex [10, 24]

Là enzym thủy phân protein dùng trong thực phẩm được tách thủy phân từ các

chủng thuộc nhóm Bacillus Có pH hoạt động tối ưu từ 5.5 – 7.5, và nhiệt độ tối thích

từ 35 – 60oC Bất hoạt ở 85oC trong 10 phút

1.1.3.3 Giới thiệu về phương pháp cô đặc sử dụng trong nghiên cứu quy trình sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa

Có nhiều phương pháp cô đặc khác nhau như:

- Cô đặc dưới áp suất khí quyển;

- Cô đặc bằng lạnh đông;

- Cô đặc bằng phương pháp thẩm thấu ngược;

- Cô đặc chân không

Các phương pháp cô đặc trên đều dựa trên các nguyên tắc sau:

Đưa nhiệt độ của nguyên liệu cần cô đặc đến nhiệt độ sôi tương ứng với hàm lượng chất khô và áp suất môi trường cô đặc, tại đó nước sẽ bay hơi;

Làm đóng băng nước rồi tách ra khỏi sản phẩm;

Tách nước bằng màng thẩm thấu ngược

Trong các phương pháp trên, phương pháp cô đặc chân không được sử dụng rộng rãi cho các thực phẩm có chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ bị tác động của nhiệt độ

15

a Ưu điểm của phương pháp cô đặc chân không [14]

- Chất lượng sản phẩm ít bị biến đổi Hạn chế được những phản ứng hóa sinh không có lợi như: các phản ứng biến đổi màu, phản ứng thủy phân, phản ứng oxy hóa lipit, protein và các chất có hoạt tính sinh học khác

- Phương pháp đơn giản, tuần hoàn tốt, giảm khả năng tạo cặn, quá trình bay hơi nước xảy ra liên tục, có thể cô đặc đến các nồng độ khác nhau

b Nhược điểm phương pháp cô đặc chân không [14]

- Hơi thứ cấp không dùng được cho các mục đích khác

c Biến đổi của thực phẩm trong quá trình cô đặc [14]

Trong quá trình cô đặc, dưới tác động của nhiệt độ trong thời gian dài dẫn đến hiện tượng nước của dung dịch bị bốc hơi, do đó tính chất vật lý và thành phần hóa học của nguyên liệu bị biến đổi Dưới đây là một số biến đổi thường gặp trong quá trình cô đặc:

- Biến đổi vật lý;

- Biến đổi hóa học;

- Biến đổi về giá trị cảm quan sản phẩm

+ Biến đổi vật lý [1, 5, 6]

Dưới tác dụng của nhiệt độ, hàm lượng nước trong hỗn hợp bay hơi dẫn đến nồng độ chất tan tăng, làm thay đổi tính chất của dung dịch Bên cạnh ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc thì thời gian cô đặc cũng có vai trò quyết định đến biến đổi tính chất của hỗn hợp Trong cùng điều kiện nhiệt độ, khi thời gian cô đặc kéo dài sẽ gây biến đổi một số yếu tố như:

- Làm giảm: hệ số dẫn nhiệt λ, nhiệt dung C, hệ số cấp nhiệt α, hệ số truyền nhiệt K

- Làm tăng: khối lượng riêng ρ, độ nhớt η, tổn thất do nồng độ Δ, nhiệt độ sôi T

+ Biến đổi hóa học [1, 4]

Ở điều kiện nhiệt độ cao, một số phản ứng hóa học bất lợi có thể xảy ra Dưới đây là một số phản ứng hóa học thường gặp:

Phản ứng melanoidin: xảy ra do phản ứng giữa nhóm (–NH2) và đường khử (–CHO) làm sản phẩm bị sẫm màu

Quá trình đông đặc và biến tính protein: quá trình này phụ thuộc vào nguyên liệu, đối với nguyên liệu chứa hàm lượng protein cao thì quá trình biến đổi lớn, phản ứng xảy ra rõ

+ Biến đổi về giá trị cảm quan sản phẩm

Sản phẩm có thể bị sẫm màu hoặc có mùi ôi khét nếu cô đặc ở nhiệt độ cao và trong thời gian dài

1.1.3.4 Giới thiệu về phương pháp tiệt trùng sử dụng trong nghiên cứu quy trình sản xuất dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa

a Mục tiêu của quá trình tiệt trùng [31,79]

Ở sản phẩm đồ hộp, bào tử yếm khí Clostridium botulinum được chọn làm vi

sinh vật đích trong các quá trình xử lý nhiệt độ là do:

- Có khả năng sinh độc tố làm chết người ở liều lượng rất thấp;

- Có khả năng hình thành bào tử rất bền nhiệt;

- Clostridium botulinum tồn tại trong môi trường do đó dễ dẫn đến tình trạng

nhiễm bẩn vào thực phẩm, gây ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm

Để tránh ngộ độc thực phẩm, các nhà chế biến cần:

- Giảm mật độ bào tử Clostridium botulinum đến mức có thể chấp nhận được

ứng nhu cầu tiêu diệt Clostridium botulinum và bào tử của chúng

b Biến đổi thực phẩm trong quá trình tiệt trùng [1, 14]

+ Vật lý: trong quá trình tiệt trùng nhiệt, một số chỉ tiêu vật lý của thực phẩm sẽ

thay đổi như thể tích, trọng lượng, độ giòn, độ dai … Tùy theo từng trường hợp cụ thể

17

mà những biến đổi nói trên sẽ có những ý nghĩa tích cực hoặc tiêu cực (làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm, tăng giá trị sử dụng, giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm, …)

+ Hóa học: nhiệt độ là một tác nhân quan trọng thúc đẩy phản ứng hóa học xảy

ra Trong công nghiệp thực phẩm, phản ứng hóa học phi enzym (dưới tác dụng của nhiệt độ) phổ biến nhất là phản ứng melanoidin Đây là phản ứng giữa nhóm khử (–CHO, =CO) của đường và nhóm amino (–NH2) của các axit amin, peptit và protein Phản ứng melanoidin gồm một chuỗi nhiều phản ứng xảy ra nối tiếp nhau Phản ứng này xảy ra mạnh mẽ do nhiệt độ cao và thời gian tiệt trùng kéo dài làm giảm giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Bên cạnh phản ứng melanoidin còn có phản ứng thủy phân, phản ứng oxy hóa,

+ Hóa lý: sự gia tăng và giảm nhiệt độ trong quá trình tiệt trùng có thể gây ra

những biến đổi về pha như nước và một số chất dễ bay hơi sẽ chuyển sang pha khí, protein hòa tan trong thực phẩm lỏng có thể bị đông tụ và chuyển sang pha rắn … Tùy theo yêu cầu của sản phẩm mà chọn chế độ xử lý nhiệt phù hợp để hạn chế hoặc thúc đẩy các biến đổi nói trên

+ Hóa sinh học: nhiệt độ cao sẽ làm vô hoạt các enzym Đồng thời, dưới tác

động của nhiệt độ, quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật ngừng lại, các vi sinh vật trong thực phẩm sẽ bị ức chế hoặc tiêu diệt

+ Biến đổi cảm quan: sau quá trình tiệt trùng, màu sắc trở nên sậm hơn, sản phẩm thoảng mùi caramel

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu yến sào trong nước

Nghiên cứu của Ngô Thị Kim và cộng sự cho thấy, dịch chiết tổ yến thu được chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học, song hệ số thu hồi thấp Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, dịch chiết yến sào Khánh Hòa có tác dụng làm tăng thể trọng, cân bằng các quá trình trao đổi chất trong cơ thể, tăng cường khả năng hoạt động thể lực và phản xạ thần kinh, bổ đối với hệ huyết học, gây tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, giảm thời gian đông máu [8]

Cùng nhóm tác giả trên có làm một số thí nghiệm thăm dò tác dụng của tổ yến trên chuột nhắt trắng và đã thu được các kết quả sau đây: tổ yến làm tăng nhanh trọng lượng chuột lên khoảng 16.4% sau 30 ngày nuôi so với đối chứng không cho ăn dịch chiết tổ yến Có tác dụng giải độc: chuột ăn thức ăn có thuốc trừ sâu với liều 3 mg/kg kèm dịch chiết tổ yến thì sau 30 ngày nuôi vẫn tăng trọng lượng cơ thể so với đối chứng giảm trọng lượng 13% Tổ yến có tác dụng làm tăng rõ rệt lượng hồng cầu trong máu chuột thí nghiệm, giảm lượng bạch cầu Dịch chiết tổ yến có tác dụng tăng cường khả năng chống phóng xạ: chuột cho uống dịch chiết tổ yến sống được 65% so với 45% không uống dịch chiết tổ yến sau khi dùng coban 60 chiếu xạ trên cơ thể chuột với liều 8 Gy [8]

18

Theo nghiên cứu của PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, Viện trưởng Viện công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang, tổ yến chứa axit sialic là thành phần chính có tác dụng phục hồi nhanh khi cơ thể bị nhiễm xạ hay tổn thương hồng cầu, ngoài ra còn chứa galatosamine, glucosamine giúp phục hồi sụn, bao khớp trong những trường hợp thoái hóa khớp

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu yến sào ngoài nước

Trong khi tình hình nghiên cứu trong nước về yến sào và hoạt tính sinh học của yến sào còn khá hạn chế thì trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về vai trò, công dụng của yến sào đặc biệt ở lĩnh vực y học

Thành phần hóa học có vai trò quyết định đối với hoạt tính sinh học của yến sào Theo công bố của Marcone và cộng sự thì protein và cacbohydrat trong yến sào chiếm vai trò chủ đạo với tỷ lệ lần lượt là 60% và 30% Do đó, protein và cabohydrat được sử dụng để đánh giá chất lượng của yến sào Ngoài ra, yến sào còn chứa lipit (< 2%), khoáng chất như Na, Mg, Ca Các vi lượng có thể bị biến đổi theo mùa, vị trí làm tổ và giống loài [56]

Trong 18 loại axit amin được công bố trong yến sào thì serine chiếm chủ yếu với 15.4%, tiếp theo là valine (10.7%), tyrosine (10.1%) và isoleusine (10.1%), chúng có vai trò quan trọng trong việc cung cấp năng lượng, góp phần điều hòa chức năng tế bào, xây dựng hệ miễn dịch bằng cách tạo ra các kháng thể và globulin miễn dịch[56]

Cacbohydrat chiếm vị trí thứ hai trong thành phần hóa học của yến sào, dao động trong khoảng 27% – 58% [56, 57] Trong đó, có 9.0% axit sialic, 7.2% galactosamine, 5.3% glucosamine, 16.9% galactose và 0.7% fructose Axit sialic có liên quan đến tăng cường thần kinh não bộ, giúp trẻ sơ sinh phát triển trí tuệ vì nó có chức năng như một gangliosides não Ngoài ra, axit sialic còn có liên quan đến lớp nhầy tế bào, có vai trò kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Tuy nhiên, giá trị dinh dưỡng, công dụng và cơ chế sinh học của axit sialic đối với cơ thể con người vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu [52]

1.3.1 Chiết tách thành phần hoạt tính từ yến sào

1.3.1.1 Chiết tách protein

Yến sào chứa 40% – 60% protein Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng protein

có trong yến sào có nhiều hiệu ứng dược lý quan trọng Liu X và cộng sự đã sử dụng phương pháp điện di hai chiều (2-DE) để chiết xuất protein hòa tan trong nước từ yến sào Kết quả cho thấy rằng việc chiết xuất trong 6 giờ ở 60oC và trong 12 giờ qua đêm

ở 4oC cho hiệu suất chiết tương tự nhau [53] Hơn nữa, lượng thành phần protein có trọng lượng phân tử cao chiết xuất được ở 60oC tăng đáng kể Kết quả này chỉ ra rằng nhiệt độ cao 60oC không những không phá hủy cấu trúc protein của yến sào, mà còn

19

cải thiện đáng kể tỷ lệ chiết xuất protein và rút ngắn thời gian chiết xuất [43] Bên cạnh đó, phương pháp phân tách protein trong pha lỏng dựa trên các điểm đẳng điện khác nhau (LIEF) cũng đã được sử dụng để làm sạch các protein được chiết xuất từ yến sào Các mẫu protein được chuẩn bị bằng cách chiết trong nước hoặc axeton, trong

đó chiết bằng axeton cho thấy hiệu quả hơn [60] Các protein từ yến sào được tách riêng bằng cách sử dụng LIEF kết hợp với điện di 2 chiều Phương pháp LIEF đồng thời cũng loại bỏ hiệu quả axit mucopolysaccharide trong mẫu protein

1.3.1.2 Chiết tách axit sialic

Các công trình của Yagi H, Zhang S đã chiết axit sialic bằng dung môi nước, bằng enzym với sự hỗ trợ của vi sóng và bằng enzym papain với hiệu suất lần lượt như sau 9.08% ± 0.12%, 12.58% và 9.98% ± 0.05% Phương pháp sử dụng enzym với sự hỗ trợ của vi sóng cho hiệu suất cao nhất [83, 86]

1.3.1.3 Chiết khoáng chất

Phương pháp ICP-MS được thực hiện để phân tích số lượng 20 phần tử vô cơ trong 25 mẫu yến sào [88] Yến sào bao gồm Na, K, Ca, Mn, Fe, Co, Zn, Se và Rb Hàm lượng trung bình của các nguyên tố vô cơ trong yến sào từ cao xuống thấp là Na

> Ca > Mg > K > Al > Sr

1.3.2 Các hoạt tính sinh học và dược lý của dịch chiết từ yến sào

1.3.2.1 Khả năng chống oxy hóa

Ki Cheon Kim và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ yến sào đã chỉ ra rằng dịch chiết từ yến sào có khả năng làm giảm oxy hóa

stress gây ra [47]

Kết quả nghiên cứu của Noraini Deraman về khả năng chống oxy hóa của tổ yến đảo và đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng chống oxy hóa của tổ yến (môi trường axit, môi trường trung tính, môi trường kiềm) thu được đã chỉ ra rằng, dịch chiết tổ yến có khả năng chống oxy hóa và hoạt tính của chúng phụ thuộc vào pH Trong môi trường axit mạnh và kiềm mạnh, dịch chiết tổ yến có khả năng phản ứng mạnh với gốc tự do [61]

Yida Z và cộng sự đã đánh giá hoạt tính sinh học và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết yến sào bằng phương pháp đun sôi ở 100oC trong 30 phút Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết thu được có hoạt tính sinh học và hoạt tính chống oxy hóa cao [84]

Theo Hou Z và cộng sự đã nghiên cứu về hiệu quả chống oxy hóa của yến sào trên gan chuột bạch, thông qua thí nghiệm, có thể thấy yến sào có thể cải thiện mức SOD và CAT, cải thiện tỷ lệ SOD và CAT và giảm lượng MDA đáng kể Kết quả qRT-PCR cho thấy yến sào có thể làm tăng mRNA SOD1, mRNA SOD2, mRNA

Ngoài ra, Lee T và cộng sự đã chỉ ra rằng chiết xuất từ yến sào hoạt động như chất chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa này là do trong yến sào có chứa các axit amin như cysteine, histidine, tryptophan, lysine và methionine Nghiên cứu này cũng cho thấy, dịch chiết yến sào bằng nước có khả năng chống oxy hóa kém hơn dịch thủy phân yến sào bằng NaOH [51]

1.3.2.2 Kháng viêm, bảo vệ tế bào

Theo Mei Yeng Yew và cộng sự, tổ yến có chứa axit sialic và các yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF – Epidermal growth factor) Trên thực tế, axit sialic và EGF là

những yếu tố có khả năng thúc đẩy sự phát triển của tế bào thần kinh và não bộ [57]

Ngoài ra theo nghiên cứu của nhóm tác giả người Nhật cho thấy dịch thủy phân tổ yến có khả năng hình thành các tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ở người bằng cách làm tăng IL-6 và VEGF gen, bởi sự kích hoạt trung gian của NF-κB và AP-1 qua p44 /

42 MAPK và p38 MAPK Tế bào gốc từ mô mỡ là tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào thần kinh, vì vậy chúng có tiềm năng trong điều trị các bệnh lý về tổn thương tế bào thần kinh [42]

Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ yến đối với bệnh Parkinson ở quy mô thử nghiệm cho thấy tổ yến có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh bằng cách sử dụng neurotoxin 6-hydroxydopamine để giảm oxy hóa stress trên tế bào thần kinh SH - SY5Y người [43] Theo nghiên cứu của Hou Z và cộng sự về tác dụng của tổ yến lên vùng hippocampus và vỏ não của chuột bị cắt bỏ buồng trứng, cho thấy yến sào có khả năng bảo vệ thần kinh chống lại sự thiếu hụt estrogen liên quan đến quá trình lão hóa [43] Cùng nghiên cứu của Mei Yeng Yew và cộng sự cho thấy, dịch chiết từ yến sào

có khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh, chống lại sự thoái hóa 6-OHDA gây ra bởi các tế bào thần kinh dopaminergic, đặc biệt thông qua sự ức chế apoptosis Như vậy dịch chiết từ yến sào có thể là một lựa chọn dinh dưỡng hữu hiệu để bảo vệ chống các rối loạn thoái hóa thần kinh liên quan đến stress oxy hóa [57]

1.3.2.3 Là yếu tố làm tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor - EGF)

Một số nghiên cứu cho thấy tổ yến có khả năng kích thích quá trình tăng trưởng

biểu bì và quá trình tăng sinh tế bào

21

EGF là polypeptit có trọng lượng phân tử thấp với 53 axit amin, nó kích thích sự phát triển và tăng sinh tế bào, được phân lập đầu tiên từ tuyến thượng thận của chuột đực EGF cũng có mặt trong sữa, nước bọt, nước mắt, nước tiểu, tiểu cầu, đại thực bào, tinh dịch [29] Bổ sung EGF có lợi cho tái tạo và bình thường hóa chức năng tế bào bị giảm sút do tác động của quá trình lão hóa Ngoài ra, EGF còn có vai trò điều chỉnh liên kết trung gian giữa các tế bào, tăng trưởng tế bào, tạo nên sự khác biệt và thể hiện chức năng tế bào [63]

Theo nghiên cứu của Kong YC và cộng sự, protein thủy phân từ yến sào sau khi lọc bằng sắc kí siêu mịn Sephacryl-200 có thể tạo ra phản ứng mitogenic trong tế bào lymphocyte (có trong hệ bạch huyết) người và tăng cường phản ứng mitogenic trong concanavalin A-chuyển hóa tế bào lymphocyte [50]

Trong hơn hai thập kỉ qua, chưa có báo cáo về việc tinh chế EGF từ yến sào nhưng việc phát hiện ra yến sào có khả năng hoạt động như EGF là cơ sở cho những nghiên cứu khác về ảnh hưởng của yến sào đối với sự phát triển tế bào

1.3.2.4 Ức chế hoạt động của vi rút cúm và ức chế sự ngưng kết

Dịch chiết từ tổ yến có khả năng trung hòa vi rút cúm trong tế bào MDCK

(Madin - Darby canine kidney) và ức chế sự ngưng kết tế bào hồng cầu ở người do vi

rút cúm A gây ra [50] Theo một số nghiên cứu thì dịch thủy phân tổ yến bằng enzym pancreatin F với cấu trúc glycoproteins ( > 50 kD) đến glycopeptit (10 – 25 kD) có khả năng ức chế lây nhiễm vi rút cúm do liên kết 5-N-acetyl neuraminic axit (NANA) trong đường và axit sialic trong dịch chiết tổ yến Phân tích bằng phương pháp sắc kí lỏng cho thấy NANA là dẫn xuất axit sialic chính trong yến sào, là thành phần quan trọng có khả năng ức chế vi rút cúm [52]

Kết quả nghiên cứu cho thấy yến sào không làm tan huyết, không phá hủy tế bào hồng cầu và tế bào MDCK ngay khi sử dụng ở nồng độ cao Các hợp chất thu được từ dịch chiết tổ yến khi thủy phân bằng enzym pancreatin F có kích thước nhỏ hơn 25 kD

có thể được sử dụng làm thuốc kháng vi rút [52]

Theo nghiên cứu của Ran Zhao và cộng sự về ảnh hưởng của yến sào đối với quá

trình thúc đẩy và hoạt hóa Lymphocyte B và tác dụng kháng của nó lên quá trình ức

chế miễn dịch do cyclophosphate gây ra Kết quả nghiên cứu cho thấy yến sào có thể thúc đẩy quá trình hoạt động, phát triển của tế bào Lymphocyte B, làm tăng kháng thể IgE, IgA, IgM và IgG3 Nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết từ tổ yến có khả năng điều khiển sự bài tiết IgA trong ruột non giúp làm giảm tổn thương miễn dịch đường ruột gây ra bởi cyclophosphate bằng cách hoạt hóa và thúc đẩy quá trình phát triển

Lymphocyte B, tăng cường bài tiết kháng thể của tế bào Lymphocyte B [72]

22

1.3.2.5 Tăng trưởng tế bào

Có rất ít nghiên cứu ảnh hưởng của yến sào đến sự tăng sinh của các dòng tế bào khác nhau Aswir và cộng sự đã nghiên cứu tác động của yến sào đối với sự tăng sinh tế bào bằng cách sử dụng dòng tế bào Caco - 2 ở người và giải phóng TNF - α trong dòng tế bào RAW264.7 Kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào Caco - 2 tăng đáng kể, mức tăng này dao động từ 135% - 215% so với mẫu chuẩn tương ứng, đồng thời yến sào cũng ảnh hưởng đến sự giải phóng TNF-α trong tế bào RAW 264.7 Mức độ ảnh hưởng phụ thuộc vào nguồn yến sào và hàm lượng yến sào xử lý Sự ức chế sản sinh TNF - α cũng được quan sát thấy trong nghiên cứu của Vimala và cộng sự [20]

Một số nghiên cứu đã tìm thấy trong tổ yến giàu proteoglycans chứa nonsulfated chondroitin glycosaminoglycan (GAGs) giúp tăng cường hoạt động của

mô sụn Proteoglycans có chứa đến 83% cacbohydrat, trong đó GalNAc và GlcUA (D-glucuronic axit) chiếm 79% Nghiên cứu cho thấy tổ yến sau khi nấu chín có khả năng thúc đẩy quá trình tăng sinh của tế bào giác mạc và làm lành vết thương của giác mạc [34]

1.3.5.6 Tăng cường cấu trúc xương

Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng dịch chiết từ tổ yến thu được giàu proteoglycans

chứa chondroitin glycosid aminoglyca good (GAG) không sulphat, là một trong những

thành phần chính của xương Nghiên cứu trên chuột, quan sát độ chắc của xương và hàm lượng khoáng chất (calcium và phosphorous) cũng như đo nồng độ hydroxyl-proline Kết quả cho thấy, chuột uống dịch chiết từ tổ yến có hàm lượng calcium, phosphorus, hydroxyl-proline trong đùi và khối lượng đùi tăng, khả năng chịu lực của xương tăng Đồng thời, độ dày của da và độ dày của các lớp collagen trong da cũng tăng lên Do đó, có thể kết luận dịch chiết từ tổ yến làm tăng độ chắc khỏe của xương

cũng như cải thiện da, có thể ứng dụng đặc biệt cho phụ nữ sau mãn kinh [59]

1.3.6.7 Khả năng hình thành và bảo vệ mô sụn

Theo nghiên cứu của Kien-Hui Chua và cộng sự cho thấy dịch thủy phân từ tổ yến có khả năng ngăn chặn sự tiến triển của bệnh viêm xương khớp và giúp tái tạo mô sụn do đó chúng có khả năng kháng viêm, chống thoái hóa xương Đây được xem là nguyên nhân thúc đẩy quá trình hoạt động của mô sụn, do đó dịch thủy phân tổ yến được xem là chất có tiềm năng bảo vệ mô sụn [48]

Cùng nhóm tác giả trên đã nghiên cứu khả năng bảo vệ tế bào sụn ở người từ dịch chiết tổ yến Tổ yến được chiết bằng cách đun sôi với nước cất, kết quả thu được cho thấy khi bổ sung dịch chiết từ tổ yến ở nồng độ thấp từ 0.05% – 1% giúp thúc đẩy quá trình phát triển mô sụn phân lập được từ khớp người Tuy nhiên, khả năng phát triển mô sụn ở nhóm thí nghiệm này thấp hơn so với nhóm thí nghiệm sử dụng dịch chiết ở nồng độ cao hơn 1% Kết quả nghiên cứu còn cho thấy dịch chiết từ tổ yến là

23

nguyên nhân thúc đẩy quá trình hoạt động của mô sụn do đó có khả năng bảo vệ mô

sụn đồng thời nó còn có thể kháng viêm, chống thoái hóa xương [48]

Theo Yida và cộng sự, tổ yến giúp làm giảm các bệnh liên quan đến chế độ ăn giàu chất béo bao gồm oxy hóa stress và kháng viêm do dịch chiết yến sào có thể điều chỉnh chất chống oxy hóa ở gan và gen kháng viêm Nhóm nghiên cứu cũng báo cáo rằng tổ yến có thể làm giảm khả năng kháng insulin gây ra bởi chế độ ăn giàu chất béo

ở chuột [84] Tương tự, bổ sung dịch chiết yến sào ở liều lượng cơ bản cũng là nguyên nhân làm tăng phản ứng đồng hóa của mô sụn

1.3.3 Một số nghiên cứu về thủy phân yến sào

Theo nghiên cứu của tác giả Etty S.I và cộng sự, khi so sánh phương pháp chiết bằng nhiệt độ cao và thủy phân bằng enzym alcalase trên đối tượng yến sào của Malaysia thì thấy rằng thủy phân bằng enzym alcalase cho kết quả vượt trội so với chiết bằng nhiệt độ cao Cụ thể protein hòa tan tăng từ 25.5 mg/g yến lên 87.7 mg/g yến tương ứng với phương pháp chiết bằng nhiệt độ cao và phương pháp sử dụng enzym alcalase [36]

Ahmad A.I và cộng sự đã nghiên cứu để đưa ra các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân yến sào bằng enzym alcalase Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, các thông số phù hợp để thủy phân yến sào khi dùng enzym alcalase là: pH 8.5, nồng độ enzym 3% (v/w) và nhiệt độ là 50oC [17]

Một nhóm tác giả khác cũng của Malaysia không chỉ nghiên cứu giữa chiết và thủy phân mà còn so sánh khả năng thủy phân của các loại enzym khác nhau lên đối tượng là yến sào.Trong nghiên cứu này sử dụng hai enzym để thủy phân yến sào là alcalase và papain với thời gian thủy phân khác nhau (30, 60, 90 và 120 phút) Nghiên cứu chỉ ra rằng, thủy phân bằng enzym làm tăng hoạt tính sinh học của tổ yến đồng thời dịch thu được khi thủy phân bằng enzym alcalase cho hiệu suất thu hồi và hoạt tính chống oxy hóa (khả năng khử gốc tự do DPPH và ABTS) cao hơn so với dịch thu được khi thủy phân bằng enzym papain [65]

Các nghiên cứu về chiết thủy phân yến sào chủ yếu được nhóm tác giả người Malaysia thực hiện Họ đã nghiên cứu so sánh giữa phương pháp chiết bằng nhiệt độ cao, thủy phân bằng enzym và so sánh giữa các loại enzym với nhau trên đối tượng

là yến sào Malaysia Dựa trên những kết quả đã công bố, nhóm tác giả này đã công bố dưới dạng patent năm 2017 mà sản phẩm cuối cùng là nguyên liệu yến sào thủy phân được đưa vào sản xuất viên nang có hoạt tính chống oxy hóa (Patent WO2017034390) [21]

Đặc biệt là báo cáo của Etty S.I tại hội nghị lần thứ 4 về thực phẩm được tổ chức tại Ý năm 2014, cho thấy các loại peptit của tổ yến có hiệu quả ức chế sự phát triển của bào tử và các vi khuẩn hình thành bào tử Từ nghiên cứu này, có khả năng, dự kiến rằng peptit của tổ yến có thể sử dụng trong bảo quản thực phẩm và phát triển như chất

24

kháng khuẩn trong ngành dược, thực phẩm [37] Điều này mở ra một khả năng ứng dụng rất lớn trong việc sản xuất yến sào thủy phân cho mục đích thực phẩm không chất bảo quản

Như vậy, trên đối tượng yến sào Malaysia thì đã có những công bố khoa học về hoạt tính chống oxy hóa, tuy nhiên các đối tượng là yến sào Việt Nam, đặc biệt là yến sào Khánh Hòa thì chưa có công bố nào Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất sản phẩm dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa”

25

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, hóa chất, thiết bị trong quá trình nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Yến sào Khánh Hòa thu hoạch tại các đảo thuộc vùng biển Khánh Hòa do Công

ty TNHH Nhà nước MTV Yến sào Khánh Hòa trực tiếp khai thác;

- Dịch chiết từ yến sào Khánh Hòa

Hình 2.1 Nguyên liệu trong quá trình nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất nghiên cứu

Enzym protamex® sử dụng trong nghiên cứu được sản xuất từ vi khuẩn Baccillus

sp (EC: 3.4.21.62 và 3.4 24.28) do Novozymes A/S (Bagsvaerd, Đan Mạch) cung

cấp Có các đặc tính kỹ thuật như sau: có pH hoạt động trong khoảng 5 – 10, tối thích

ở 8, nhiệt độ tối thích ở 50 – 60oC, hoạt độ tối thiểu 1.5 AU/g, sản phẩm thương mại ở dạng dịch;

26

- DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Merck);

- Potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6 (Merck);

- ABTS [2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic axit)](Merck);

- Potassium persufate (K2S2O8) (Merck, Sigma);

- TCA 10% (Merck, Sigma);

- AlCl3 0,1% (Merck, Sigma);

- Axit gallic (250g/hộp – Sigma);

- L-Ascorbic axit (Sigma)

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

- Tủ sấy UNB500, chính xác ± 1oC (Đức);

- Thiết bị cô quay chân không Eyela N-1200BS (Nhật);

- Thiết bị tiệt trùng HV HIRAYAMA (HV 110) (Nhật);

- Máy quang phổ LABOMED Spectro UV-2505 (Mỹ);

- Máy ly tâm lạnh MIKRO 220R (Đức);

- Tủ lạnh ELEXTROLUX EME2600SA (Thái Lan);

- Cân phân tích điện tử KERN, chính xác ± 10-3 g (Nhật);

- Máy đo pH Hanna HI-98127 (Ý)

2.2 Phương pháp nghiên cứu và phương pháp phân tích

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

Trong phần này, chúng tôi thực hiện các phương pháp nghiên cứu như sau:

- Thủy phân bằng enzym;

- Cô đặc bằng phương pháp cô quay chân không;

- Tiệt trùng bằng phương pháp nhiệt;

- Bảo quản trong các điều kiện khác nhau

27

2.2.2 Phương pháp phân tích

2.2.2.1 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân

Hiệu suất quá trình thủy phân được đánh giá dựa trên tỷ lệ hàm lượng protein hòa tan và hàm lượng protein thô của nguyên liệu:

Xác định hàm lượng protein thô của nguyên liệu: bằng phương pháp

Kjeldahl [13];

Xác định hàm lượng protein hòa tan: bằng phương pháp dùng axit trichloacetic

(TCA) theo Green Wald [13];

Hiệu suất thủy phân được đánh giá theo công thức sau [24]:

Tổng protein hòa tan Hiệu suất thủy phân (DH) = - * 100%

b Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH [25]

Lấy V ml mẫu thêm 3 ml DPPH 0.16 mM pha trong metanol Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 517 nm Công thức tính :

100 ] ) (

1 [

c

mt m

A

A A SC

Trong đó: Ac: Độ hấp thụ của mẫu so sánh (Dung dịch DPPH không mẫu);

Am: Độ hấp thụ của mẫu (Dung dịch DPPH thêm vào mẫu thử);

Amt: Độ hấp thụ của mẫu không có DPPH

28

100)(

%  

mt

m mt A

A A SC

Trong đó: Am: Độ hấp thụ của phản ứng chứa mẫu phân tích;

Amt: Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng không chứa mẫu phân tích

2.2.2.3 Xác định hàm lượng một số chất chống oxy hóa

Mẫu kiểm định hàm lượng các axit amin, vitamin A, vitamin E, kẽm và polyphenol tổng được gửi tại các cơ quan kiểm định bên ngoài bao gồm: Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang, Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 (QUATEST 3), Trung tâm dịch vụ phân tích TP Hồ Chí Minh (CASE), Viện Pasteur Nha Trang Các phương pháp kiểm nghiệm bao gồm:

Hàm lượng các axit amin (không bao gồm glutathione) được xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: AOAC 994.12 (2012), AOAC 999.12 (2012) và AOAC 999.12 (2012);

Hàm lượng glutathion được xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: HPLC; Hàm lượng kẽm được xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: TCVN 10915:2015 (AOAC 969.32 - AAS);

Hàm lượng vitamin A được xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: TCVN 7081-2:2010;

Hàm lượng vitamin E được xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: CASE.SK.0108 (Ref HPLC-AOAC 2001.12; AOAC 981.17; Fat Soluble vitamin, p17);

Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: ISO 14502-1:2005

2.2.2.4 Xác định hàm lượng kim loại nặng

Mẫu kiểm tra hàm lượng kim loại nặng được gửi tại các cơ quan kiểm định bên ngoài bao gồm: Trung tâm dịch vụ phân tích TP Hồ Chí Minh (CASE), Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang Các phương pháp kiểm nghiệm bao gồm: Hàm lượng asen xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: AOAC 986.15;

Hàm lượng cadimi, chì xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: AOAC 999.1; Hàm lượng thủy ngân xác định theo phương pháp kiểm nghiệm: Ref AOAC 971.2

29

2.2.2.5 Xác định các chỉ tiêu vi sinh

Mẫu kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh được gửi tại các cơ quan kiểm định bên ngoài bao gồm: Viện Pasteur Nha Trang, Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang Các phương pháp kiểm nghiệm bao gồm:

Xác định Cl Perfringens theo phương pháp kiểm nghiệm: ISO 7937:2004; Xác định Coliforms theo phương pháp kiểm nghiệm: ISO 4832:2006;

Xác định E.coli theo phương pháp kiểm nghiệm: ISO 7251:2005;

Xác định Streptococci faecal theo phương pháp kiểm nghiệm: ISO 7899-2:2000;

Xác định tổng số bào tử nấm men, nấm mốc theo phương pháp kiểm nghiệm: ISO 21527-1:2008;

Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo phương pháp kiểm nghiệm: ISO 1:2013

4833-Xác định tổng số bào tử nấm men, nấm mốc, theo phương pháp kiểm nghiệm: TCVN 5166 - 90

2.2.2.6 Đánh giá cảm quan sản phẩm

Sản phẩm được đánh giá cảm quan theo TCVN 3215 - 79 và TCCS Kết quả

đánh giá cảm quan được thu thập và xử lý số liệu theo quy định của TCVN 3215 - 79

2.3 Thực nghiệm

Trong phần này chúng tôi thực hiện các nội dung thực nghiệm sau:

Nghiên cứu quy trình thu dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa;

Nghiên cứu quy trình cô đặc dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa;

Nghiên cứu quy trình tiệt trùng dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa;

Nghiên cứu quy trình bảo quản dịch chiết giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa;

Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch yến sào trong suốt quá trình nghiên cứu trên

Sản xuất thử nghiệm dịch chiết cô đặc giàu hoạt tính chống oxy hóa từ yến sào Khánh Hòa