Xác định đột biến gen HBB gây bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger

Nguyên Hoàng Việt, nhùng người thầy tộn tinh chia se kỳ thuật và kinh nghiệm hừu ích trong quá trinh thực hiện thí nghiệm, cúng các anh chị tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein Trưởng

Với tằl ca tâm lõng trân trọng, em xin bây to lòng biểl ơn sàu sắc tới GS.TS 'l ạ Thành Vản Giám đốc Trung tâm Nghiên cúu Gen- Protein Trường Đại học Y Hà Nội; PGS.TS.BS Trần vân Khánh Phó Giám dốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Dại học Y Hồ Nội Trương Bộ món B^nh học phân tử Trường Dai llọc Y llà Nội dà tạo diều kiện cho cm được thực hiện khóa luận tại trung làm dồng thời cùng lả người hướng dần tận tính chi bao và giúp dừ em luôn dưa ra nhùmg lời khuyên hửu ích cùng như những lời góp ý lâm huyết dê em hoàn thành lổt bải khóa luân nãy Em xin bày to lòng biot ơn sâu sác tời TS Phạm Lê Anh Tuấn, TS Nguyên Hoàng Việt, nhùng người thầy tộn tinh chia se kỳ thuật và kinh nghiệm hừu ích trong quá trinh thực hiện thí nghiệm, cúng các anh chị tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein Trưởng Đại học Y Hà NỘI vả ThS Lê Thị Phương Trường Dại học Y Hà NỘI dã tận lính giúp dờ cm dê em hoan chinh khóa luận.

Em xin chân thành cam ơn Ban Giám Hiệu Phòng Quân lý Dào tạo Dại Học Khoa Kỳ thuật Y học Trường Dại Học Y Hà Nội dà tạo diều kiện cho

em làm khóa luân tốt nghiệp

Lài cuối cũng em xin gưi lởi cam cm tới gia dính, bạn bé luôn quan tâm dộng viên và giúp dỡ em trong quá trinh học tạp vả nghiên cứu

Hả NỘI 14 tháng 5 nôm 2021

Sinh viên

Vương Thị Hái Yen

CAM ĐOANKinh gửi: Phòng Quân lý (lào tạo Dại hục Triràmg Dại hục Y Hà Nội Hội (lồng chấm khóa luận tốt nghiệp

Tói xin cam đoan đây lã công trinh nghiên cứu cua tôi với sự giúp đò cua thầy cô tại Bộ môn Bệnh học phàn tu và các anh chị tại Trung tàm nghiên cứu Gcn - Protein Trưởng Đại học Y llà Nội Tất ca các sỗ liêu nghiên cứu trong khóa luận náy lá trung thực vả chưa từng dược công bố ớ bát cứ công trinh nào khác

Hà NỘI 14 tháng 5 nảm 2021 Người viết khóa luận

Vuông Thị Hãi Yen

: <€

••••<

••••••••••a

ĐẶT VÁN ĐỀ _

CH L ƯNG lỉTỔNG QUAN

1.1 Bệnh p- Thalassemia

1.1.1 Dinh nghía • •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ••••••••••••' 1.1.2 Dịch tẻ học bệnh p -Thalassemia

1.1.3Dặc diêm lâm sàng và phân loại bệnh P- Thalassemia 1.1.4Cơ chế bệnh sinh bệnh P-Thalassemia

1.1.5ĐÍCU trị bệnh P-Thalassemia

1.2 Sơ lược VC hemoglobin (HB)

1.2.1 Vị trí cấu trúc gen p globin ( HBB)

1.2.2Tương quan giữa dột biên gen HBB va bệnh |ỉ Tlialassemia 10

1.3 Các phương pháp phát hiện dột biến gen 1IBB gây bệnh pthaỉassemia trcn người lánh mang gcn bênh 11

13.1.Các phương pháp chân đoán sàng lọc 11

1.3.2.Chân đoản xác dịnh bệnh bảng câc kỳ thuật sinh học phàn từ 11

CIIUONG 2: DÓI TUỢNG VÀ PHUONG PHẤP NGHIÊN cửu 15

2.1 Đồi tượng nghiên cứu 2.1.1.Tiêu chuàn chọn mẫu 2.1.2.Tiêu chuân loại trừ

2.2 Thời gian vá địa diêm nghiên cửu 2.3 Phương pháp nghiên cưu

23.1 Thiết kê nghiên cữu 23.2 Cừ mẫu 23.3Sơ đỗ nghicn cứu

15 15 15 15 15 15 16

: <€

2.4.2Quy trinh nghiên cứu

2.5 Xu lý sổ liệu

17

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ NGHIÊN cíflu 24

3.1 Ket qua trung bính cua một sỗ chi số xét nghiệm cận lâm sang 243.2 Kẽt qua hoàn thiện quy trinh phát hiện đột biến trẽn gen HBB bângphương pháp giai trinh lự Sanger

32.1.Kết qua tâch chiết DNA

Bang 1.1 Phân loại đột hiến p Thalassemia 4

Bang 1.2 cấu trúc globin và thời kỳ xuất hiện llb ư người bính thường 8

Bang 1.3 Ti lộ các loạt Hb ờ các giai đoạn phát triển 8

Bang 2.1 Bang thanh phần phan ứng cua một phán ứng PCR 20

Bang 2.2 Thành phân phan ửng uua PCR giai trinh tự gcn 22

Bang 3.1 Kết qua trung binh cua một so chi số xét nghiệm cận lâm sang 24

Bang 3.2 Kct qua đo mật độ quang các màu DNA được tách chiết 25

Bang 33 Cãc dột biến trên gen IIBB cùa 15 máu nghiên cứu 28

: <€

Hình 1.1 Cơ che bệnh sinh của fT Thalassemia 6

I lỉnh 1.2 Vị trí cũa gen « và |ỉ globin trên NST 16 vả II 9

Hình I 3.Cau trúc và quá trình tông hợp chuải 1$ globin 9

llính 1.4.Nguyên lý cùa kỳ thuật Multiplex ARMS- PCR 12

Hình I.5.CŨU trúc ddNTP và dNTP 13

Hình 1.6 Phương pháp giai trinh tự gen Sanger báng máy tự động 14

Hình 3.1 Minh hợa kết qua đo mặt độ quang học trên máy Nanodrop 2000c cua mau DNA sau khi tach chict .«.5

I lỉnh 3.2.1 lính ảnh kct quả điện di DNA tông số với thang marker 26

lỉinh 3.3 Kct quả điện di san phẩm PCR exon I và 2 (cộp mồi HBB AB) 27

Hình 3.4 Két quả điện di san phim PCR exon 3 ( cập mồi HBB CD) 27

Hình 3.5 Bicu do tì lộ xuất hiện dột biến trong 15 màu nghiên cứu 29

Hình 3.6 Kct quà giái trinh tự mẫu THAI 1 29

Hình 3.7 Kct quã giai trinh lự màu THAI.10 30

Hỉnh 3.8 Kết qua giai trinh tự mẫu đột biến THALI2 30

llinh 3.9 Kết qua giai trinh lự mẫu THALI3 31

1 linh 4.1 Mô ta dột biến tạo vị trí cắt nối 36

: <€

luRXA Messenger Rbonucleic add

: <€

DẠT VÁN ĐÈ•

Bệnh Thalassemia thuộc nhóm bệnh rối loan tồng hợp huyết sẩc tố là một trong nhùng bệnh di truyền lặn theo quy luậi Mendel phô biến nhất trên thế giới [I] Bộnh gây ra bởi dột biến gen quy định lóng hợp chuỗi globin dẫn dến giâm hoặc mất hoàn loàn sụ tòng hợp chuỗi náy tạo nên hất (hường về huyết sấc lố vá thanh phần các loại huyết sắc tổ dàn tời hiện tượng vò hồng cầu và gây ra tính trạng thiêu mau ờ bệnh nhàn [2 J Bệnh |ỉ- Thalassemia gảy

ra bơi dộl biến gen p globin nam trên nhiễm sác thè (NST) 11 Đột biển trên gen HBB phan lớn la đột biến điểm [3 j Cho đen nay đà có hơn 900 đột biến phát hiện trên gcn p-globin dược công bỗ trẽn toàn thề giới, trong đó có khoảng hơn 200 dột biền đà dược xãc dịnh lã gây bệnh 0- Thalassemia Theo Liên Doãn Thalassemia Ọuốc Tố số người mang gcn bệnh trên thể giới rất lởn, ước tính khoang 7% (4) Ớ Việt Nam bệnh p- Thalassemia là nguyên nhân hãng đầu gây thiều máu tan máu nộng ờ tre em [5] Thè bệnh làm sáng nặng nhất cua bệnh ị5-Thalassemia với kiểu gen bệnh đồng hợp tử, có biếu hiện bệnh thiêu máu tan máu nặng nê với nhiêu biến chứng trên nhiêu cơ quan cua cơ thê Những người bệnh nay cân diều trị truyền mau vã thai sắt suốt đới và cliàt lượng cuộc sống thấp do các bién chưng cua bệnh Ngoai ra bệnh co thê kết hợp với một bat thường câu trúc hemoglobin VỚI các hình thai lâm sàng da dạng, phô biến nhát là 0- Thalassemia kết hợp với bênh hemoglobin E (llbE) [6] Việc những người mang gcn bênh kểt hôn và sinh con chinh là nguồn phát tân gen bệnh chu yếu trong cộng dồng Hiện nay chưa có phương phảp diều tri bệnh P-Thalassemia triội de, một số hưởng nghiên cứu mới như liộu phàp gen vả ghép tề bào gốc dà cố nhùng bước dầu (hành công, tuy nhiên cổc phương pháp nay khá tổn kém vả khỏng phai lúc nao cùng thực hiện được Chinh vì vậy phảt hiện

nhửng người lãnh mang gcn bệnh đê tư vần liền hòn nhãn, chán đoán tniỏc sinh nhẩm hạn che những thai nhi bị bệnh là mội biện pháp hữu hiệu nhằm giam ty lỹ mắc bệnh trong cộng đồng.

Bệnh 0-Thalasscmia được chân đoán dựa vảo phân lích pha hệ các đặc diem lâm sàng vả các xót nghiệm huyết học Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tứ xác định các đột biến tròn gcn P-globin là diều kiện thiết VCU kháng định the bệnh, thực hiện chẩn đoản trước sinh và lư vấn tiền hôn nhân

VC bộnh Trong những nâm gần dây, một trong sổ các kỳ ihưật sinh học phân

tư như Multiplex ARMS- PCR đâ góp phẩn tích cực trong việc chân đoán cảc kiểu dột biền gen giúp cho còng tác tư vẩn quan lý nguồn người mang gen vả phòng bệnh ngày càng tót hơn Tuy nhiên, phương pháp giai trinh tự Sanger không chi dược sử dụng dê phát lnộn hầu het các đột biền gcn phô biến gây bệnh halassemia mà còn được COI la tiêu chuãn vàng trong việc phát hiện

nhiều dột biên nun trẽn gcn HBB dà và dang trờ thanh công cụ trong chân

đoản thường quy (7) Xuãl phát từ thực IC trôn, chúng tôi thực hiện dẻ lài ”

tựgen Sanger "với mục ticu:

Phát hiện dột biển trên gen p globin ỡ người mang gen gây hộnh |ỉ Thalassemia bang phương pháp giãi trinh lự gen Sanger

ĩ 1.2 Dịc h tễ hục bệnh Ịỉ - Th aỉassemỉa

Theo Liên đoản Thalassemia quốc tế (2005) thê giới có từ 80-90 triệu người mang gcn bệnh, và cứ mồi nãm có tới 60.000 trường hợp mới sinh mang gen bệnh Toàn Châu Á có trẽn 60 triệu người mang gcn [{- Thalassemia Riêng khu vực Dõng Nam Á trong đó cỏ Việt Nam ước tính so người mang gen p-Thalasscmia chiêm tói 50% người mang gen toàn cầu, khoang 40 triệu người [9| Theo thống kè cua Bộ Y tể nãm 2019 ó nước ta ưóc tính có khoáng 12 triệu người đang mang gen bệnh (chiêm khoang 12% dãn sổ Việt Nam), mỏi nãm có trẽn 8000 tré sinh ra bị bệnh, trong đõ có lum

2000 tre mắc bệnh ỡ inưc độ nặng cân đưực diều tri ca đời và hon 20.000 bệnh nhan dang cằn được diêu tri theo loa* gcn nào bi anh h lí ưng ma phân biột thành bệnh u- Thalassemia vả fl- nialasseinia[5] [10]

1.13 Dục (tiêm làm sàng vù phún ỉơựi bịnh ịi- Thalassemia

Cán cứ vào đác dicm lâm sàng, cận lâm sảng và sỗ lượng alcn bị dột biển, kiêu hình bệnh ({-Thalassemia dược chia thành 3 thể: thê nâng, thé trung gian vã thê nhẹ

Bệnh ({- Thalassemia xáy ra do dột biến gcn (ỉ-globin dản dẻn xuất hiện nhùng kiều gen sau:

• p° -Thalassemia lá các đột biẻn lảm mầl chức nâng gcn |ỉ-globin nên không tông họp được chuồi p-globin, ví dụ nlnr: đột biển lam tạo thành bộ ba két thúc sớm.

• p+ -Thalassemia là các đột biến lãm giam chức nàng gen p-globin nên giám tống hợp chuồi p-globin ư nhiêu mức độ khác nhau VI dụ như dột biến ỡ vùng khơi động [I I] [12]

Bâng I ỉ Phân toại iíộf biền Ịf Thalassemia

Triệu chửng làm sàng không rộ rang

Hổng càu nho nhược sac

Trung gian

Ị°/ p +, 3 +/ p +p°/p+, p+/p p +/ p p°/ p° p +/ p+ p°/p + pỡ/p°.p+/0+.p&/p+p+/ |ỉ hoặc p +/ p

Biểu Inện lâm sàng muộnThiều máu nhẹ, trung bỉnhKhông phụ thuộc truyền máu

Độ nặng lâm sang thay đôi lư nhe đến Iiãng

vã chất lượng [ 13]

: <€

1.1.4 Cư chế hfiih sinh hfnh /Ỉ-Thalassettỉia

Cơ chế thiểu máu trong |l-Thalassemia gốm 3 nguyên nhân chính: sinh hòng cầu không hiệu lục tan mau va klìông tòng hợp được đu huyết sác tồ Tôn thương gen p-globin làm giâm hoặc mất tồng hợp chuồi p-globin bên cạnh đỏ sự làng hoạt động trơ lại cũa gen y-globin vả làng hoạt dộng gen ồ- globin (ớ tre sau khi ra đời) Các chuồi náy khi kết hợp với chuôi (ỉ-globin tạo

kẽm dần đến thiếu oxy tại tô chức [3Ị [S| [13Ị Bẽn cạnh đó, giâm tổng hợp chuồi «-globin sỗ làm thừa chuỗi p-globin vã ngược lại Các chuỗi globin thừa lổng đọng trên màng hồng cầu làm lòn thưumg và gày vờ hồng cầu.Viộc giam (ông hợp chuồi [i-globin khiến cho chuồi u-globin tự nó không thê tạo thành một phân tư huyết sắc tố hoãn chinh, do đó nó bị kết tua tụo thánh thê VÙI trong các tể bao tiên thân dõng hống cầu trong giai đoạn lòng hợp huyết sắc tổ Những thè vùi lơn lãm phá huy nguyên hổng cầu gây ra sinh hống càu không hiệu lực trong lất ca các the p-Thalassemia (14] Trong p-Thalassemia the nạng, phan lớn các tể bào dâu dòng hồng câu bị phá huy ngay khi còn ơ trong tuy xương Chuồi globin tự do kết hợp với protein màng hồng cầu lảm thay dối cấu trúc và chửc nàng mảng hồng cầu làm hồng cẳu de bị dại thưc bão bất giử ờ hẻ liên vòng, gây lính trạng tan máu [15]

C : <€

Hình Ị I Cư the bịnh sinh cha Ịỉ-Thaỉassemia

Triệu chửng chính cúa bệnh P-Thalassemia là hội chứng thiều máu và tan máu mọn tính, do vậy ncu không dược truyền máu sớm và định kỹ bệnh nhân sè bị biền chửng biến dạng xương do tính trụng tăng sinh tạo máu quá mức Bôn cạnh đỏ, do cơ thè tâng hẩp thu sát và việc đưa một lượng lớn s<ii vào cư thề qua truyền máu đã gày nên tính trạng quá tai sốt ơ bệnh nhàn [ỉ- Thalassemia [16]

Cơ che bệnh sinh bệnh [Ỉ-Thalasscmia dàn den thay đối một sỗ chi số xét nghiệm công thúc máu cận làm sàng, ngoai nóng độ huyèt sẳc tố llb con

co sự thay dõi vé lượng huyết sác tố trung binh hồng càu (MCII) va thè lích trung bỉnh hóng cáu (MCV) MCV lá thè tích cua một hóng cầu được lính trung bính, giúp xác định kích thước hổng cầu bính thường hay bất thường (to hay nhô), giâ trị MCV cua người trương thánh khoe mạnh từ 80-100 ỂL MCH

la lượng huyết sac tố tmng bính chứa đựng trong một hồng cẩu, giá tri MCH cua người trường thành khoe mạnh lu 28-32 pg Dựa vào đặc điểm huyết học các chi so thè lích trung bỉnh hống càu (MCV) huyêt sắc tồ trung bính hồng cầu (MCH) sức ben thâm thấu hồng cầu và tàng HbA; được sư dụng đẽ sang lọc 0-Thalassemia [17].

1.1.5 Diều trị bịnh ịi- Tha Iasi einia

lliẻn nay chưa có phương pháp điều trị triệt đè bệnh [ỉ-Thalassemia Tùy thuộc vảo the bệnh vả mức độ bệnh, bác si’ sê có nhìmg hưởng diều tri triệu chửng chính như tiến hành truyền máu cho các thè bệnh Thalassemia phụ thuộc truyền máu Ngoài ra có thê tiến hành điều tq thai sắt và cẳt lách cho bênh nhàn Phương pháp ghép tê báo gốc tạo máu dong loài cùng dà dược

áp dụng đoi với Thalassemia mức độ nậng Phương pháp (ìen trị liệu vẫn dang được tiếp tục nghiên cữu [18J

ó u mỗi globin này gồm có 146 acid amin Ngoai ra còn co phan lư 2.3- DPG được tạo ra trong quá ưinh thoái hòa glucose, lãm giam ái lực cua Hb với Ọj (3) [17] [19) Trong quà trinh phát triẽn cả thê các loại llb thuộc hộ «

vã không u cô mật ơ người bính thường túy theo timg giai doạn

, t Ậ X f • * fit

Bang 1.2 Cân trúc globin vi thin kỳ xuat Ilifii lib ở người hình thưởng

Như vậy sau khi sinh CƯ thè người bính thường chi còn 3 loại hemoglobin là HbAI HbA2 va HbF Dưới đây lu ti lệ các loại Hb (%) Ư một

Số giai đoạn cua cá thê người binh thường

globin

Thời kỳ xuãt hiện

thường

Bang 1.3 Ti lị các loại Hb ớ các giai đoạn phút trièn

NST); hự gen globin không a, một trong sổ đó bao gồm gen p-globin năm trên nhiễm sắc thê (NST) 11.

mill Z///Z

Hình 1.2 17 trícúu gen a và Ịi Ịịlnbin trên \ST 16 và 11

Hb (hemoglobin) la thánh phân hoạt động chúc năng cua hông câu khi huyết sấc tố ( llb) không đạt nống đô cần thict trong máu thí bị coi là thiếu máu Nồng độ lỉb ớ nam là I30-160g'l ơ nữ là I25-I45g'l [3] [8] [171 Tàng HbA; trong nhừng trường hợp mang gen dột biền gây bệnh p-Thalassemia lả

do tàng mạnh ổ-globin sán sinh lừ gen ổ bên canh gen p bị đột biền p Thalassemia, và từ gcn ổ cúa nhiêm sắc thê đoi diện còn bình thưởng Tâng HbA? còn do sự phối hợp cua mạch globin s với mạch globin a thay thế cho mạch globin [I thiêu

1.2.1 Vị trí, cán trúc gen Ịi RỈnbin (HBB1

Gen HBB là gen mã hóa cho chuỗi 0 globin nằm trên nhánh ngắn cua

NST sò 11.0 vị trí I Ipl5.5 mói NST chứa một gen p globin Gcn dài 1600 cập base, mà hóa cho 146 acid amm gồm 3 cxon và 2 intron xen kè (20)

Hình 1.3 cắn trúc vù lỊttu trình tthiịỊ hợp chuơi Ịỉ Ịỉlobin Ị ij

1.2.2 Tương quan giữa dột biển gen IIRR và bệnh Ịỉ Thalassemia

Hiện nay đà phát hiện trên 200 đột biến |t-Thalassemia, phân bố các loại đột biển khác nhau tùy từng khu vực quốc gia vả dàn tộc Trong đõ có khoang 150 lã đột biền diêm, còn lại là mất đoạn ngắn va một sô loại hiềm gap khác Phẩn lớn các đột biền đà dược mò ta nhưng trong đó có chi khoang

20 dột biến hay gặp chiếm 80% câc dột biến trên gcn p Thalassemia trẽn the giới [21] Dưới đây lả một số dột biển có thê gặp trên gcn |}-globin:

- Dột biền diêm tại vùng khơi dộng (promoter): dột biến thay the nucleotitde tại vị tríTATA hoặc CACCC dẫn đen giâm lổng hợp chuỗi [T globin so với bính thưởng

nucleotit trong exon cố thê dàn đến sự tạo thành một trong ba mâ kết thúc (UAA ƯAG hoặc UGA) lam cho việc dịch mà kết thúc sớm him so với bình thường và tạo san phẩm p-globin không vừng ben b| phá huy ngay trong le báo

phần cua diem nổi cỏn nguyên vẹn hoặc bị biên dõi hoán toàn mà dàn đên - Thalassemia hay 0 Thalassemia

mất đi một hoặc vài nucleotit hoặc một đoạn có diìn đến thay đổi khung đọc

mà di truyền làm thay dôi san phâm |Uglobin

mức độ khác nhau cũng tao ra kiêu hình cua bệnh p- Thalassemia Quá trinh cắt nhùng đoan intron và nối nhùng đoạn cxon cua gcn |l- globin dôi hoi các

vi trí cho nôi GT tai dau 5' và vi trí nhàn dầu nồi AG tai dâu 3’ cua intron Những dột biển lai các diêm nỗi cỏ thê sè giam hoặc loai bo hoàn toàn quả trinh hình thảnh mRNA thông thường [13] [22]

1.3 ('ác phirtmg pháp phát hiện (lột biến gen IIBB gây bệnh ịỉ

Thalassemia trẽn người lành mang gen bệnh

1.3.1 Các phưung pháp chán đoản sàng lọc

Có thê sàng lọc những người lanh có nguy cơ cao mang dột biển gen

- Tiền sư: gia đính cỡ người bi bệnh Thalassemia

- Triệu chứng làm sảng: vàng da, mệt moi,

- Xét nghiệm cận lâm sàpg:

4- Tổng phàn tích tề bảo máu ngoại vi: thiéu máu (Hb giâm) hồng cẩu nhô (MCV < xo ÍL) hồng cẩu nhược sắc (MCH < 27pg) [5] [17]

4°ó Trường họp nghi ngớ cỏ đột biển gãy bệnh HbE có I Ibiỉ > 25% [3Ị

J.3.2 Chân lỉttủn xúc (lịnh bệnh bung các kỹ thuật sình học phàn tư

CỈLQ xét nghiệm di truyền học phàn tư như Multiplex ARMS PCR giai trinh tự gen, là những chân đoán xác định nhằm phản tích cảc dột biến gcn trên cãc gen p globin

1.3.2.1 Kỳ thuật Multiplex ARMS PCR ( Multiplex Amplification Mutation System!

Multiplex ARMS- PCR được dùng đê sàng lọc sự hiộn diện của nhiều alen dột biền, dược sứ dụng hiệu qua (rong quá trinh phát hiện dột biến diêm Nhùng mồi sư dụng cho phán ứng Multiplex ARMS PCR bao gồm mồi bính thưởng và mồi dột biến Moi bính thường dặc hiệu cho trinh tự DNA bính thường, không khucch đụi được trinh tự DNA đột biến và ngược lại (hình 1.4) Neu mâu có kiêu gcn đông hợp lư thí chi xuàt hiện vạch diện di Ư giếng có moi đõt biền, nêu mẫu có kiêu gen di hợp tư thí ca hai giêng đều xuất hiện sach diên dj chứng 10 có ca san phàm ờ mồi thường va mồi dột

&.IỊK <€

biên Trong phan ứng Multiplex ARMS PCR còn có cặp mồi nội chuân nhâm khuếch đại vùng gen đích không có đột biền đe tranh trường hựp âm tính gia do các nguyên nhãn như: qua It hoặc qua nhiều khuôn DNA chat lượng DNA không tòi, không có một trong các thanh phần cua phan ứng PCR hoặc có mặt chất ức chể phân ứng PCR Kỳ thuật này được sứ dụng đè phát hiện các đột biến đà bicl Các nghiên cứu cùa Nguyền Khẩc Hân Hoan (2011)

và Trằn Vân Khánh (2014) dà làm rõ kỳ thuật Multiplex ARMS - PCR phú hợp dè phát hiện các dột bicn diem, cho phcp phát hiện the bát thường vả kiểu gen dột biển Tuy nhiên, các doạn mồi có thê bị thoái hóa và tụo ra những sảnphẩm không đặc hiệu [ 18] [23]

Hỉnh l.4.Nguyên lý cua kỷ thuật Multiplex ARMS- PCR

1.3.2.ĩ Kỳ thuật giãi trình tự gen Sanger

Giai trinh tự gcn là phương pháp xác đinh vi trí cua 4 loậi nucleotide A (Adenine), c (Cytosine), G (Guanine), T (Thymine) trong phân tư DNA Nám

1977, Frederick Sanger củng cộng sự dà phát minh ra phương pháp giai trinh

tự gen bang enzyme với nguyên lý: sừ dung didcoxynuclcotidc tddXTP) là một phân tư nhân tạo, có cẩu trúc tương lư nhtr phàn tủ deoxynuclcotidc (dNTP) tuy nhiên ỡ carbon số 3 cùa đường deoxyribose không phái lả nhóm hydroxyl (-OH) má la (-11) đê dừng việc tòng hợp mạch bô sung do không hình thành dược liên kết photphodieste 124Ị

: <€

Dựa trên nền tang cua kỳ thuật Sanger cố điên, ngày nay các phông xét nghiệm thướng su dung phương pháp giai trinh tụ gcn băng máy tự động Kỹ thuật Sanger cải lien sử dụng cãc ddNTP có đánh dầu huỳnh quang thay cho việc đánh dấu phóng xạ như trước đây đà giúp cho việc sẩp xếp trinh tự DNA trơ nên nhanh chóng vã hiệu quá him Mỏi loại ddNTP được gủn một mâu cô bước sóng phát xụ huỳnh quang khác nhau cho phép thực hiện giãi trinh tư trong một phan ứng duy nhất Hệ thống diện di mao quan dược sứ dụng dè dọc trinh tự DNA một cách tụ động Nguyên tác hoạt động cua máy là trong suốt quá trinh diộn di khi cỏ một vạch diện di di qua chùm tia laser thi’ vạch điện di sè phát sáng và dược camera ghi nhận va lưu lại thành một cưởng dộ dinh sáng (peak) trong biêu đồ Từ biểu dồ cùa các đinh cưởng độ sáng này, máy sè so dóng cua các dinh tương ứng với nhau và phân lích thành trinh tự cua các đoạn DNA (25) Ưu diêm cua phương pháp này lã phan ưng giai trinh

lự gen cỏ thê thực hiện trong một ống nghiệm vả chi cần điện di trên một hang, từ dó tiết kiệm thòi gian và công sức cua người thực hiộn kỳ thuật, ỉlon nừa, vởi nguyên lý trên, hầu hết các dột biên trên gcn sè được phát hiện, diều náy dàn den ứng dụng vượt trội cua phương pháp Sanger so với Multiplex ARMS- PCR lá phat hiện ra những đột biền mới Tuy nhiên chi phí cao him

so với các kỳ thuật giai trinh tự gcn bâng các phương pháp khác

: <€

li inh 1.6 Phương pháp giãi trinh tựgen Sanger hàng /nãy tự dộng

(Nguồn https://gentis.com ì

Chương 2: ĐỎI TUỌNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu

Tiến hành nghiên cửu trên mầu mảu ngoại vi cua người được chấn đoán có nguy cơ mang đột biến gen gây bệnh P- Thalassemia sau khi dà có kct quá xét nghiệm cận làm sàng (tông phân tích tế bào mâu ngoại vi, xét nghiệm sinh hóa điộn di huyết sảc tố) ơ Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein trường Đại hục V Hà NỘI

2.2 J Tiêu chuân chọn mâu

Mầu máu ngoại vi cua người tham gia nghiên cứu dụa trẽn nhùng sàng lục VC tiền sử gia đinh ( cô họ hàng mắc bệnh Thalassemia), yếu lổ dịch te (dân tộc Kinh vả các dân tộc thiểu số miền Bắc Việt Nam có nguy cơ mang dột biến gcn cao) cỏ thê có triệu chửng thiếu máu làm sàng, dược chân doán

lã thiểu máu nhirực sắc hong cầu nhỏ ( llb giam MCH < 27pg MCV<80 fL)

và có nống dộ IỉbAj > 4%)

2.2.2 Tiêu choán loụi trừ

- Mau bt hu hong trong quá trính luu trử bao quan

* Thời gian nghiên cưu: Tháng 11 năm 2020 dến tháng 5 nãm2021

- Dịa diêm nghiên cứu: Trung tám nghiên cửu Gcn - Protein Trường Dai Học Y Hà Nội

2.3.1 Thiết kể nghiên cửu

Phương pháp mô ta cắt ngang

2.3.2 Cữ mầu

2 AS Sư (hl nghiên cửu

• Bước I: Thu thập mầu máu ngoại VI cua đối tượng nghicn cưu

+ Tách DNA bang kit The Wizards Genomic DNA Purification cua hàng Promega

4- Đo nồng độ và kiêm tra độ tinh sạch cua DNA băng phương pháp do mật độ quang

4- Khuếch dai các vùng gen với mồi đặc hiệu

+ Kiềm tra san phẩm being kỳ thuật điện di trên gel agarose

Workbench

2.4 Đụng cụ trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị và húa chắt nghiên cừu Dụng cụ

• Pipct bán tự động và dầu còn các loại 1000 gL 200gL lOOpL 20pL, lOpL, 2,5pL

• Óng F.ppcndorf loại 1,5 mL vả 0,2 mL

- Cổc dong, bính thúy rinli

- Găng tay giấy thắm vó trùng, giá đựng

Sinh phẩm, hóa chổi

r ỉ ỉ òa chát tách chief DNA

Nucleic Lysis Solution, dung dịch Protein Prcpcipitation Isopropanol, ethanol 70% DNA Rehydration Solution Proteinase K

> tỉóư chát khuếch cỉựi PCX

- Nước PCR (nước cal được khu ion, không chứa bất cứ thành phần nào khác như: DNAase RNAase enzyme cát giới hạn )

Taq Polymerase MgCL buffer, loading dye

** Hóa dial (ỉiên dt

• Dung dịch đệm TBE I0X (Tris Borate EDTA I hàng (Promcga) gồm: Tris base Boric acid EĐTA Khi sư dụng dung dịch dệm TBE được pha thảnh đệm TBE IX

- DNA Gen Ruler 100 bpDNA Ladder

Thief hị

• Máy vortex (Eppendorf Mixyó Mate)

• Mảy Spindown E-centrifuge (Eppendorf)

- Máy lầc nhiệt (Eppcndort' Thcrmonữxer 5437)

• Máy diện di EC 300X1- Power Supply (Thermo)

2.4.2 Quy trin ft n gh iên l int

2.4.2.1 Quy Irinh ihu ihập vù báo quan mẫu

Mầu máu loàn phan cứ thè lích khoang 2 ml dược bao quan trong ông chứa chắt chống dông EDTA bao quan Ờ4-8;C tồi da hai tháng

: <€