Ứng dụng kỹ thuật real time PCR để phát hiện đa hình đơn nucleotid rs2856718 của gen HLA DQ trên bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

ĐẬT VẢN ĐÈUng thư là một nhõm cãc bênh liên quan dển việc tăng sinh tế bão một cách mẩt kiêm soát vả nhùng tể bào đó cỏ kha năng xâm lấn những mò khác bằng cách phảt trién trực tiềp vảo

LÙI CẢM ƠN

Khoa luận tốt nghiệp ỉả một trong nhùng cột mốc đáng nhớ nhất, đánh dau cho qua tnnli học tập va nghiên cửu cua sinh viên tại trường đại hục Đê hoán thảnh khoã luận nãy ngoài sự nò lực cua ban thán, em dà nhận được rất nhiều sự giúp đờ từ phía các thầy cô gia dính và bạn be

Với lòng lành trọng vả biết <m sâu sấc em xin bày to lời cam ơn chân thành tới:

Ban Giám Hỉịu Phong Quan fý Dào tụo Dụi học Khoa Kỹ thuật >* học, Trung tám lighten cừĩt Gene JỄ Protein - Trưởng Dại học Y Hà Nội Bệnh viện K trung ương (cư sư 3) đả tạo mụi diều kiện thuận lợi giup em

hoãn thành khoa luận

Em xin chân thảnh câm ơn GS TS Tạ Thành I 'ản Giảm dốc trung tàm nghiên cứu Gene & Protein, người Thầy dà lụo điều kiện cho em thực hiện khõa luận tai trung tám

Dặc biệt em xin gưi lòi cam ơn chân thành nhất tới TS Nguyễn Trọng

Tuệ người dã trực tiếp hướng dẫn tận tinh dạy bao va tụo mọi điều kiện giúp

đờ cho em trong suốt quá trinh thực hiện khóa luận náy

Em xin căm (TJ1 ES Nguyền Thu Thúy, là người đà hướng dàn chia sc cho em những kỳ thuật vá kinh nglũèm hừu ich trong quá trinh thực hiện khóa luận, cũng cãc thầy cô vả anh chi tại trung tâm nghiên cửu Gen & Protein, cảc thầy cô khoa Kỳ thuật Y học, Trường Đụi học Y Hà Nội đà tạo diêu kiện thuôn lợi cho em trong suờt quá trinh học tập và hoãn thành khóa luận nãy

Cuồi cùng, em xin gửi lởi cam ơn lới bổ mẹ ngưởi thán, bạn bê dà quan tàm dộng vén em trong suốt quã trinli hục tập và nghiên cứu

Hà NỘI ngày thủng nảm 202ỉ

Nguyễn Thị Thúy

: <€

LÒI CAM DOAN

Kinh girl: Phòng Quân ụ Dào tạo l)ạỉ học - Trường Dại học Y Hà NỘI

Hội dồng chấm khóa luận tốt nghiệp

Em tên là Nguyễn Thi Thúy, sinh viên tờ 31 lứp Y4K, chuyên ngànhXet nghiệm Y học niên khóa 2017 - 2021 Trường Đại học Y Hà Nội

Em xin cam đoan:

1 Đây lả khóa luận do bán thân em trục tiếp thực hiộn dưới sự hưởng dản cua rs Nguyễn Trọng Tttf

2 Nghiên cứu nãy không trúng lập với bát kỳ nghiên cứu nào khác dà

được cõng bổ iruởc đày

3 Các số liệu và thòng tin trong nghiên cứu la hoan toán chinh xác trung thực \-a khách quan

Em xin hoàn toàn clụu trách nhiộm về nhũng cam két náy

Hà Nội ngày thủng nám 202J

Sinh viên

Nguyen Thị Thủy

: <€

MỤC LỤC

LỜI CAM ƠN

LỜI CAM DOAN

DANH MỤC CHƯ VI ÉT TẢT

DANH MỤC BANG

DANH MỤC HĨNH

CHƯƠNG I TONG QVAN TÀI

LlẸV -1.1 Tỏng quan VC ung thư biểu mỏ tẻ bão gan

1.1.1 Sơ lược VC ung thư biêu mò tế bào gau

1.12 Các yểu tổ nguy cơ chính

1.2 Tớng quan vè gen HLA-DQ

1.3 Tông quan VC SNP rs2856718 cua gen HLA-DQ

1.3.1 Khái niệm và cách xác định SNPs

1.32 SNP «2856718 cua genHLA-DQ

1.4 Kỳ thuỹt Real-time PCR pliảt hiện SNP «2856718 cua gen HL A-DQ 10

CHƯƠNG 2.1)ÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứt 15 2.1 Thời gian địa diem nghiên cứu

2.1.1 Thời gian nghiên cửu:

2.12 Địa điềm nghiên cửu

2.2 Đối tượng nghiên cửu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.4 Quy tỉ inh nghiencưu •■

2.5 Chuẩnbị dụng cụ trang thi Ct bị vã hoa chất sư dụng 2.5.1 Chuânbi dung cu, trang thiết bị

2.52 Chuân bi hóa chát

17

18

• ••••• 18 ?? 2.6 Quy trinh kỳ thuật • •••••••••••••••••••••••••••••••••••■•••••••••••••••••••••■•••••■•••••••■•••••a 2.6.1 Thu thập và bão quân màu bệnh phàm

2.62 Quy trinh tách chiết DNA từ mau mò

2.63 Kỳ thuật Real-time PCR

2.7.1).H> đức trong nghiên cứu y hục

CHƯƠNG 3 KÉT QUA NGHIÊN cút 3.1 Dậc diêm chung cùa đổi tuợng nghiên cửu

3.2 Kèt qua tách chiêt DNA • •••••••••••••• •••••••••••••••••••••• •••••••••••••••••••• 3.3 Kct qua xác dinh kicu gen SNP FS2856718 bang kỳ thuât Real-time PCR 29

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 4.1 Đặc diêm cua nhóm nghiên cứu

4.2 Kèt qua tách chiêt DNA

4.3 Kèt qua Real-time PCR • •••••»••■ ••••••••• 4.4 So sánh với cảc nghiên cúu trẽn thè giói

KẼT LUẠN • M •••••• M •••••••••••••••••••••••«•• •••••••• • ••••• •••••••••• •••••••«•• ••••••• ••••••••••• TÀI LIỆU THAM KHAO 25 25 • ••• Ma/ 34 34 34 37 40

43

PHỤ Lực

DANH MỤC BÂNG

Bang 2.1 Thành phàn cua phan img Real-time PCR 23Bang 3.1 Dặc diêm chưng cua các đổi lượng nghiên cíai 25Bang 32 Kẻt qua và độ tinh sực 11 cua các màu DNA được tách chi Ct 26Bang 3.3 Ket qua ldêu gen cua SNP rs2856718 gen HLA-DQ ttong cãc mầuDNA nghiên cứu

Bang 3.4 Tỷ lệ kiêu gen vả alen SNP ĨS2856718 gen HLA-DQ 33

: <€

DANH MỤC HÌNH

I linh I I Ung thư biêu mõ tề bao gan ~ 3

I lính 1.2 Sơ lược tố chức genome cùa phirc hè HLA 6

Hình 13 Sự khác biệt SNPs Hình 1.4 Biêu dồ khuếch đại cua một quy ninh Real-time PCR 11

I lính 1.5 Đường chuẩn Real-time PCR (phai) được dựng tứ giá trị Ct vã nông độ cưa cac mảu chuân (Std) 12 I lỉnh 1.6 Sơ đồ nguyên lý hoai động cua mầu dò Taqman 13

Hỉnh 2.1 Sơ dồ nghiên cứu 16 Hình 3.1 Ret qua đo mật độ quang học cùa mầu DNA RG - 01 sau khi tách chict DNA trẽn máy Nano Drop 2000c 26

Hình 3.2 Ret qua điện di DNA tông số trên gel agarose 0.8% 28

I lỉnh 3.4 Đờ thị tin hiệu huỳnh quang cua kiêu gen AG 30

Hình 3.5 Dồ tiu tin hiệu huỳnh quang cua kiêu gen GG 30

.?T C : <€

ĐẬT VẢN ĐÈ

Ung thư là một nhõm cãc bênh liên quan dển việc tăng sinh tế bão một

cách mẩt kiêm soát vả nhùng tể bào đó cỏ kha năng xâm lấn những mò khác bằng cách phảt trién trực tiềp vảo mô làn cận hoặc di chuyên đển những bộ phận khác trong cơ thê (di cản) Không phai tàt ca các khối u đều là ung thư,

có một sô khói u thuộc vào nhỏm lành tính, tức la khôi u không xàm lẩn các

bộ phận khác cua cơ thê Hiện nay có khoáng hơn 100 loại ung thư anh hương dền cuộc sồng con người *

Trong cac loạt ung thư hiện nay mig /Air gan nguyên phứt lã một trong sâu bệnh ung thư phổ biền nhất va lã nguyên nhãn gãy tư vong lớn thử ba trãi the giới (khoang 830.000 trường hợp tương đương 83% tống sỗ ca tư vong

do ung thư), dặc biệt ớ cãc nước chưa phát triển 2 Khoang 80% ung thư gan

nguyẻn phát lá ung thư biêu ntỏ tể bào gan (HCC)5 Sự hĩnh thảnh khối u cũa

HCC là một quá trinh phửc tạp liên quan đến nhiIV yếu tồ nguy co Sự phô biến cua các yếu tố nguy cơ thay đối theo sự phàn bồ cua HCC trên toản thê giới Nhicm virus viêm gan B mân tính (HBV) và Aflatoxin Bl (AFB1) là những yếu tố nguy cơ chính ớ các khu vực đang phát tnên như Trung Quốc

va Án Độ í ơ cac khu vực dã phát Iriếạ HCC chu yếu plỉát triển từ xơ gan do virus viêm gan c (HCV) ’ và bệnh gan nhiễm mờ không do rưựu (NAFLD) * Ngoài ra nhiều nghiên cứu cùng dà chi ta rằng da hình gen liên quan den các quâ trinh gây ung thư khác nhau Do dô SNPs có thê đóng một vai trò quan trọng đe xác định tinh nhạy cám cũa một người đối với HCC, từ đó giúp ích cho việc phòng ngừa vả điều trị HCC s

Kháng nguyên bạch cầu ngưòi HLA (Human Leukocyte antigen system) là một chu đề nghiên cửu quan trọng đổi với di truyèn cùa cơn nguủỉ Giìra các chúng tộc có sự khác biệt lớn về hệ thong HI.A Dó có thê là lí do

: <€

dản tới sự khác biệt về tiền trièn bệnh ớ các chủng tộc khác nhau 5 I0 Các HLA-DQ có tính đa hình cao đặc biệt trong exon 2 mà hóa cho cảc VỊ tri gẳn kháng nguyên và đóng vai trò quan trọng ưong việc dưa kháng nguyên virus váo các tế bào miễn dịch từ dó giúp thanh thai các tể báo bị nhi cm virus hay

tề bao u :I SNP rs285671S nằm trong khu vực giữa các gen HLA-DQA2 và HLA-DQB1 Nghiên cửu cua Hu vã cộng sự đà chi ra ràng HLA-DQ

»285671 s làm giam dáng kê nguy cơ HCC cua vật chu Nghiên cúu cùa người Liu vá cộng sự chi rỏ hơn rang kiêu gen GG cua HLA-DQ »2856718

có thê lả yếu tố bào vệ đỗi với nhỉ cm HBV và sự tiến triên cua HCC liên quan den HBV »

Chân đoán ung thư biểu mò tế bào gan sớm là một thách thức, vì triệu chứng làm sàng thường xuất hiộn muộn trong quá trinh phát trièn ung thư cho nèn việc nghiên cứu nhùng yếu tó nguy cư như HLA-DQ »2856',1S là điều cằn thirl de xác định tinh nhụy cam cua một người dối với HCC tữ dô giúp ích cho việc phòng ngứa và dicu ti| HCC Đà có những nghiên cưu dãnh giã mói liên quan giữa SNP »285671 s cua gen HLA-DQ va tinh nhạy cam với HCC liên quan den HBV tuy nhiên kết qua còn nhiều Ưanh cài ■,1:,1J, u Ilơn nừa chưa có nghiên cứu nào đánh giá mối liên quan náy ỡ người Việt Nam Do vậy đe tải nghiên cứu: ”ứng đụng kỳ thuật Real-time PCR dê phát

hiện da liínli dam rs28Sò”i8 cùa gen HL.4-DỌ trẽn bịnh nhàn ung thư biến mô tể bào gan” dưực thực lúộti vin mục tiêu: Xảc định dược lỹ lộ kiêu

gen cua da hình thái dint »2856718 cua gen HLA-DQ trên bệnh nhàn ung thư biêu mô tề bào gan

: <€

CHƯƠNG 1 TÔNG QƯAN TÀI LIỆU

1.1 Tông quan về ung thư biếu mô tế bào gan

1.1 J Sơ tược về ling tliư hiên inỏ tế bào gan

Ưng thư gan gồm ung thư gan nguyên phát vã thử phát Ưng thư gan thử phát do các tế bão ung thư ờ các bộ phân khác cua cơ thê di vào gan gây

ra các khối u di căn Ưng thu gan nguyên phát lá bệnh lý ảc tinh cua gan xảy

ra khi tẻ báo bính thưởng cua gan trớ nên bắt thường về lùnh thái vá chức nâng Các tế bao ung thư phát triên gây anh hương đen mô bính I hường liên

kè va có thè lây lan sang cac vung khac cua gan cũng như các cư quan bên ngoài gan Ưng thư gan nguyên phát gốm 3 ioựi chính: ung thu biêu mõ tẻ bão gan (phát triẽn từ tể bào gan), ung thư biêu mõ đường mát (phát triên tử đường mật trong gan) vả u nguyên báo gan (Hepatoblastoma) Trong đó ung thư bicu mỏ tể báo gan (Hepatocellular cancer - HCC) (Hình 1.1) lã hay gặp nhất *5

Hình / / L IIỊỊ thư biên mờ tế bao gan

Ung thư biẻu mỏ lể báo gan một trong nhìmg khối u ảc tinh phồ biến nhất, lã nguyên nhân háng đầu gây tử vong liên quan đền ung thu trên toàn the giới Theo thống kè cùa Tô chúc Y tê Thè giói nảm 2020 IIC< duợc xếp hạng thư sáu về tý lệ mẩc va thú ba vẻ ty lệ tư vong, gãy ra khoang 906.000

ca mắc mời và hon 830.000 ca tư vong mồi nảm Tý lệ mắc HCC khác nhau theo vùng địa lý và hâu het các trường hợp HCC xay ra ơ các khu x ực kẽm phát triển hơn chàng hạn như Dông Á (chiếm 54.8% tnrimg hợp) và Dòng Nam A (chiếm 10.8% trường hợp)2,16 r Nam cô tý lệ mẩc I ICC cao hơn nừ (2 3 lần) 2 Tuồi thưởng từ 40 50 16 o Việt Nam dây là loại ung thư dứng hàng thữ 3 Ước tinh mồi năm có 10.000 trường hợp mẳc mới, tý lệ nam gấp khoang 4 lần nừ ở các tinh phía Nam cao h<m phía Bắc Viột Nam nđm trong

số các quốc gia có ty lộ mắc ung thư gan cao nhất thể giới:8

1.12 Các yểu tồ nguy car chinh

(WHO) nãm 2016 dụa trên một sỗ nghiên cưu từ 2003 đen 2014 ty lè nhiễm

tích gộp (meta - analysis) đà chứng to nguy cơ HCC ơ những người nhiêm IIBV cao hơn 15 - 20 lằn so với nhùng người không nhi em Nguy cơ bị HCC trong cuộc dời cua người nhiem HBV mạn lã khoảng 10 25% Có nhiều yếu

tồ làm tảng nguy cơ HCC ở người nhicm HBV man bao gồm cảc yểu tổ VC hình thải (nam giớL tuồi lởn tiền sư gia dính cỏ nguởi bl HCC) vẻ virus (mức độ nhân ban HBV cao kiêu hình HBV thin gian nhiem HBV dồng nhiêm vời HCV HTV) về lãm sảng (có xơ gan) và về mỏi trường và lồi sóng (phoi nhiêm với Aflatoxin, nghiện rưụu nặng, hút thuồc lá)l9

- Viius viêm gan c (HCV): theo số liệu cua Tô chức Y tê Tile giỏi (WHO) nảni 2016 dựa trên một số nghiên cuu từ 2003 đèn 2014 ty lè nhiễm HCV ư người lờn tai Viẻt Nam khoang 1 - 3.3% Một phân tích gộp trẽn một

sổ nghiên cíni bệnh - chủng cho thay người có kháng thê kháng HCV có nguy

cơ bị HCC gấp 17 lằn so với người không cõ kháng thê khăng HCV 19

nghiên cưu 24091 trưởng hợp HCC tại miền Trung và mien Nam Việt Natn trong thời gian 2010 đen 2016 ty lệ đống nhiễm HBV va HCV la 2,7% :5

cứu ghi nhận nguy cơ HCC táng 16% ơ những người sư dụng từ 3 đơn vị đồ uống có cồn ttỡ lẽn môi ngày và tăng 22% ờ những người sư dụng từ 6 đơn vị

đồ uống có cồn trơ lên mồi ngày, và nguy cơ này cùng tàng ngay cá khi chi sữ dụng lượng cồn thẳp nhất mỏi ngây (25g mỏi ngày, tương ửng vói 2 đơn vị đồ uồng cỏ cồn mỗi ngày), ó Việt Nam chưa có sổ liệu chính thức về mồi liên quan giừa HCC va việc sư dụng đỗ uổng cỏ cồn Theo một nghiên cứu trẽn

1617 bộnh nhãn HCC tụi miền Trung và miền Nam Việt Nam có 68.6% bệnh nhân đã và đang sư dụng đố uống có cồn với nhiêu mức độ khac nhau 1?

Ngoải ra ung thư biêu mó tế bão gan con có một sổ yếu tố nguy cơ hiếm gặp như Aflatoxin Dioxin Do dứ nên sang lọc pliat hiện sớm ung thư biêu mõ tế báo gan báng cảch làm siêu âm ỏ bựng xét nghiêm định lượng Alpha feto protein (AFP) vã thứ AFP mòi 06 tháng một lần cho nhùng người

cô cãc yếu tố nguy cơ trẽn !9

: <€

1.2 Tong quan về gen HLA-DQ

Hmli 1.2 Sơ lược tô chức genome cua pltức hệ HLA •*

Hệ tilling khảng nguyên bạch cầu người (HLA) chỉnh la phức hợp hòa họp mỏ (MHC) chu yểu ở người, tứ lâu dưực coi lã khu vực quan trụng nhất trong con người hớn quan đen nhi Ồn hung, viêm, tự miền vá cay ghép Phức hợp HLA la một vung gen nằm trài nhánh ngân cua nhiêm sàc thế số 6 (6p21), bao gồm hơn 200 gcn năm gần nhau Các gen trong phức hợp nảy được phân loại thánh ba lớp cơ bân: lớp ] (HLA-A HLA-B HLA-C) vã lớp II (HLA-DR, HLA-DQ HLA-DP) vả l<Vp w (Hình 1.2)2l

Cảc phản tư láp I được phát hiện trẽn tất cã các té bão cỏ nhãn (không

có trên hổng cấu) Trong khi đó các phàn tư híp n chi có trên một số loụi tế báo cua hộ mien dịch, như cãc tô bâo trinh diện khang nguyên chuyên nghiệp (đại thục bão, te bão tua) hoặc cảclympbo B dã hoạt hóa Cac tê bão nay thực bao cãc kháng nguyên, xư lý chúng thanh các đoạn peptide truck khi gẩn vói MHC lóp II roi vàn chuyền ra bê mật ngoai mang te bào

Các gene HLA-D mà hóa cho các chuồi a vá K cua NÍHC lớp n Tô chúc cùa HI.A-D đa dạng lum cua cảc gene thuộc MHC lóp I bao gồm các

locus HL A-DR (D-reỉaĩeđ) HLA-DQ và HLA-DP Tại mỗi locus có hai gene

Al và BI mã hóa ttrimg ứng cho các chuỗi tt vả 0 cùng một số các pseudogene HLA-DQ thuộc về các phàn tu HLA lớp II các protein MHC híp

II này gân vào các đoạn protein (peptide) trên be mật tẽ bào khác vã trinh diện cảc peptìd này cho hộ thống miền dịch Ncu hê thống miễn dịch nhận ra các peptid là ngoại lai (như peptide cua virus hoặc vi khuân), nõ sò kích hoạt phán ứng dê tân công virus hoặc vi khuân xâm nhập *2 HLA-DQ chửa 5 gen gồm 3 gen p và 2 gen « Trong đó cỏ 2 gcn chức nâng mà hóa cho chuồi u (DQA1)

và chuỗi |ỉ (DQB1) Ngoài ra còn một số gen gia là DQA2 DQB2 ;s HLA- DQs cõ tinh đa hình cao độc biệt là 1» exon 2 nià hóa các vị trí liên kểt kháng nguyên ;4 Do dó một sô alcn dả được được cho rủng lá có liên quan đến nhiem HBV dai dâng:4

1.3.Tông quan VC SNP rs285671S cua gen HLA-DQ

1.3.1 Khái niệm vứ cách xúc định SNPs

Hinli 1.3 Sự khác bi(1 S.XPs 25

Cảc đa hình nucleotide đon thường dược gọi là SNPs lá sự thay thế cua nucleotide đơn tại một vị tri cụ thê trong bộ gen có mặt trong một phần đù lớn cua dãn só (ít nhất l% dán $ồ) -’6 SNPs lả loại biến thê di truyền phô biền nhất ớ người XIỖÍ SNP dụi diện cho một sự khác biệt nucleotide nong DNA (Hình l 3) Nhưng biến the SNPs CO the la duy nhất hoặc xay ra ớ nhiều cả nhân; các nha khoa học đă tỉm thấy him I (X) triộu SNPs trong dãn sổ trẽn toàn thể giới SNPs có thê xay ra ỡ bẩt kỳ vị trí nao tiên hộ gen, ca ờ vùng mà hóa

va không mà hoa tuy nhiên thòng thường những biến thè nay đưọc tim thấy với tần suẩt cao ớ các doan DNA năm giữa các gen 2S Mãc dũ hơn 99% trình

tự DNA của cong người là giồng nhau, nhưng chi một sự thay dôi nhỏ trong

hệ gen cùng có thể tác dộng lớn dền đến tinh nhạy cam cua những người khác nhau với bệnh tật sự đáp ứng cảc liệu pháp điều trị cùng như kha nàng thích ứng với các yếu tố từ môi trường như: chắt độc, vi khuân, virus Điều nảy làm cho SNPs cỏ vai trò quan ưọng trong nhiêu linh vực y sinh học • ■ Chúng

có thè hoạt động như các dẩu hiệu sinh học giúp các nhà khoa học xác đinh

VỊ trí các gcn có liên quan đèn bệnh tật Khi SNPs xây ra trong gen hoặc trong

: <€

khu vực gẩn gen chúng có thể đỏng vai trỏ trvc tiép hơn trong bệnh bang cách anh hướng đến chức nâng cua gen25

Việc xác định vá mỏ ta lượng lớn SNPs lá cằn thiêt trước khi chúng ta

có thè sư dụng chúng rộng rãi như một cõng cụ di truyền Bốn phương pháp thường đưọc su dụng cho phát hiện SNPs (hay đột biến) la: (i) phân tích da hĩnh sựi đơn (identification of single strand conformation polymorphisms - SSCPs), (ii) phân tích dị sợi kép {heteroduplex analysis), (iii) giai trinh tự trực tiếp DNA vá (iv) cãc mang pliat hiện biên thê (the developed variant

tốn nhiêu cõng sức và có hiệu suắt lương đồi thấp, mậc dủ các phượng pháp cho công suầt cao hơn cùng đang dược phát triển Phàn tích dị sợi kép lả phương pháp phó biến cho phát hiên SNPs do sụ đom giàn, gia thành thâp vã

tự trục tiếp cùng khã dược yêu thích Một khi phan img giai trinh tự đưực hoàn thảnh, một hè thống, mao mạch Applied Biosy stems cỏ thê tao ra trinh tự

tư > 1500 manh DNA 500bp trong 48h với sự can thiểp cua con người Dye giãi trinh tư sê phát hiộn 95% cảc dị hợp tư các dye dắt tiền hơn vả cân nhiều công sức hơn cô thế phát hiên 100?-'® Còng nghệ VDAs cùng cõ nhiêu ưu diem và tý lệ phát hiên cao cho phép phát hiộn các SNPs bang quá trinh lai san phàm PCR vởi mang array sứ dụng đằu dỏ oligonucleotide trẽn một chip thuy tinh vả do sự khác biột trong liên kết lai giừa oligonucleotides phu hợp

va không phũ hợp Ngoài vice chụn lựa phương phổp cho phái hiện SNPs, quẩn thê sư dụng dê phai hiộn SNPs cùng cẩn dirợc chọn lựa Tần số alien SNPs khác nhau dang kê giữa cac dân tộc khac nhau và cãc quân thê khác nhau Cãc công ly phân lích SNPs đã lựa chọn sư dụng các nhõm người đa sac tộc dè tối da hoa cơ hội phat hiện SNPs Một số nghiên cúu klíác lai sư dụng

.?T C : <€

Trẽn thế giới dà cỏ những nghiên cửu VC SNP rs2856718 Một nghiên cứu dà chi ra rằng kiêu gen HLA-DQ rs2856718 AG/AA vã alen o làm táng nguy cơ HCC lien quan đền HBV ớ người khoe mạnh u Một sổ nghiên cứu khác cho thấy rủng SNP rs2 856718 tại gen HLA-DQ vả SNP rs3077 tại gen HLA-DPA1 cỏ tác dụng bão vệ chổng lại sự tiến niên cùa ung thư biêu mỏ tế bao gan trong đó SNP rs285671X chiếm ưu thế ư dàn tộc Han Tuy nhiên, không có mối liên quan dáng kè nao giữa phãt hiộn ung thư biêu mò tẽ bão gan do nhiễm HBV vói alm HLA ơ Hãn Quốc hay quần thê Nhật Ban :ỷ Do

dó vẫn chưa rò locus 11L/\ cụ thê dong vai trò quan trọng nhu thế nao trong ung thư biêu mõ tế bào gan ờ bênh nhãn HBV

Tại Việt Nam cho đến nay chưa có nghiên cứu nâo vè đa hình đơn nucleotide rs2856718 cùa gen HLA-DQ trẽn bênh nhân ung thư biêu mõ tế bão gan Và dày cũng lã lý do chủng tôi thực hiện dề tài này

1.4 Kỳ thuật Real-time PCR

Real-time PCR là kỳ thuật nhãn ban DNA dựa váo cac chu kỳ nhiệt Tín hiệu khuếch dại đưực hiên thị ngay sau mói chu kỹ nhiệt

Biêu dồ khuếch đụi cua Real time PCR (Hĩnh 1.4):

- Giai đoạn u; Tin hiêu huỳnh quang phai ra chưa du manh dê máy cõ thê đo dưục dường tin liiêu nám ngang (gọi la tín hiéu nền)

- Giai đoạn lũy thừa: số ban sao DNA đủ lớn máy bải đầu ghi nhận dưực tin hiệu huỳnh quart; và tin hiệu (ủng lèn sau môi chu kỳ nhiệt

Taq polymerase khong cỏn hoạt động hiệu qua dẫn dền tin hiệu không tiếp tục gia tâng

Hình ỉ.4 Biêu dầkhtưdí dụi cua fnột quy trinh Real-time PCR

Chu kỳ ngưỡng (Ct): tin hiệu huỳnh quang trong ống Real-time PCR bai đầu vượt qua dưỏng tin hiệu ncn Ct SC xuất hiện Slim hay muộn tùy thuộc vào lượng màu han dầu Mầu ban dầu nhiêu thi Ct sè xuắ! hiện sớm vã ngược lại mẫu ban đầu it till Ct sỏ xuắt hiện muộn

Diròngchuân cua Real-time PCR:

Khi dem một màu chuãn Cỏ hàm lưụng DNA dà xác định di pha loăng bậc 10 liên tiếp, sau đó đem tât ca cãc nồng độ pha loăng đi chạy Real-time

PCR ta sè được cảc giá trị chu kỳ ngưởng (ì khác nhau Dường biểu diễn mối liên hệ giừa Cl vã hãm lượng DNA được gọi là đường chuân Real-time PCR (Hình 1.5)

càng gần I thí thao các cáng chính xác Thòng thường R-' > 0.99

- Hiệu quá khuếch dại E: điêu kiện lý tưởng E = 100% nhưng thực tế

Hìnli Ỉ.S Dường chuẩn Real-time PCX (phãi) dược đựng từ giá trị ct và

nồng dụ cùa các mầu chuẩn (Stứ)

Dựa vào đường chu ân và giá trị Ct cua mầu đầu váo ta cỏ thê định lượng chính xâc ham lượng DNA bẽn trong màu

Rral lime PCR sư (lụng mẫu dòTaqMan:

3

5’

fCutlt 1.6 Str đồ nguyên lý hoạt động cua mẫn dò Taqntan

Mầu dó TaqMan (probe) được sử dụng kha phô biền trong kỹ thuật Real-time PCR dê tụo tin hiộu huỳnh quang Mầu dô TaqMan la một đoạn oligo nucleotide dai khoang 24 30bp vói đầu 5' gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) va đau 3* côn lại gán chat hap thu (quencher) Khi máu

: <€

reporter phát ra Khi phân ứng Real-time PCR diẻn ra mảu dò sẽ bị Taq

giai phóng tín hiệu huỳnh quang không còn bị quencher hâp thụ

Phát hiện khác biệt SNP và xác định kiêu (li truyền

San phâni khuếch đại cua trinh tự đích có thê khác biệt chi một nucleotide, gọi lá SNP hay khác biệt một so nucleotide cua một trinh tự

với Real-time PCR dùng probe lảm chất phat huỳnh quang, để phát hiện sự khác biệt SNP và đinh genotype cần thiết kế cãc TaqNỉan probe (mang các chẩt phát huỳnh quang R khác nhau) bất cộp trên cùng vi tri cua sàn phàm khuếch dai nhưng các probe náy có sự khác biệt về trinh tự tương img vởi sự khac biệt SNP hay khác biệt ưinh lự giúp phản biệt genotype Trong giai đoạn bát cập thi probe cỏ tri nil tụ tuơng thích nhất vói trinh tự đích trên san phàm khuếch đại sè bất cập lén sợi đích vá sè bj Taq polymerase phân giai, do vậy đường biêu diên khuếch dại tương ứng với mau huỳnh quang cua probe sẽ đi lèn vá đen cực đai trong khi tin hiệu cua cac mau huỳnh quang khac sè vẫn nám dưới huynh quang nền VI các probe tương ứng vần còn nguyên vẹn và không bi phân giai

: <€

CHƯƠNG 2.

ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cút;

2.1 Thòi gian - địa diêm nghiên cứu

Từ thảng 09/2020 đen toang 05/2021

2.12 Dị a diêm nghiên cứu

2.2 Dổi tưựng nghiên cứu

Gom 30 màu mò ung thư dà đủc paratìỉn cùa 30 bệnh nhãn dược chắn doán ung thư biêu mỏ rề bào gan bâng giai phau bệnh tại Bệnh viện K3 cơ sở Tân Triều

Tiêu chuẩn chọn mảu:

hỗ sơ bqih an tại viện

đay du những yêu câu lợi ích cua việc nghiên cửu

Tiêu chuần lợụt trừtnầu:

• Bệnh nhãn mac ung thư gan thứ phát

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp dirợc sư dụng trong lighten cứu nãy lã phương pháp mõ ta căt ngang

: <€

2.4 Quy trinh nghiên cứu

Hình 2.1 Sư dồ lighten cừn Còng việc 1: Thu thập mau mõ ung thư đà đúc paraflin cua nhom bệnh

nhân ung thư biêu mò tế báo gan tham gia nghiên cứu

Cõng việc 2: Tadi clúcl DMA từ mẫu mò.

inật độ quang

• Kiểm tra chất luring DNA sau tách chi Ct bang phương pháp điện di DNA tổng số

Còng việc 3: Thực hiện kỷ thuật Real-time PCR su dụng mẫu dò

TaqMan

Còng việc 4: Đọc và phán tích kết qua.

2.5 Chuân bị (lụng cụ trang thiết bị và hóa chắt sư (lụng

2.3.1, Chuẩn bị dụng cụ, trang thiêt bị

- Pipct định mức lOOOpl 200pl lOOpl 20pl IOpl 2.5(d và dầu côn các loại

hộp đựng ổng

- Gang tay giầy thấm vô trũng

- Cân điện tư AB204 (Mettler Toledo)

- Lò vi sõng (Sharp)

• Bộ diện di ngang

2.3.2 Ch nân bị hóa chui

Hỏa chia rách chìiỉĩ DNA ĩ ừ mỏ:

- Hóa chất theo QIAamp FFPE Tissue Kít cua hầng Qiagen bao gồm: Buffer ATL Proteinase K Buffer AL Buffer ATE Buffer AWl Buffer AW2

Hóa chát điện di DNA tông sổ:

Tris base Acetic acid EDTA Khi sứ dụng pha thành IX

- Bột agarose (Promega)

Hòa chut Real-time PCR:

- HLA-DQBl (rs2856718) - primer probe (ABI) có trinh tự như sau: CCTCTGGCAGGTTAAGAAGAGCTGT[CT]TAATCCCATGGCCTG TCCTCCCACA

2.6 Quy trình kỹ thuật

Mầu mò ung thư biểu mỏ tế bao gan dược chấn đoản xác định tại Khoa Giãi Phàu Bệnh Bênh viện K3 cơ sơ Tán Tricu Cãc màu mõ trong khồi dúc

paraffin được cắt thánh tửng lát mong cỏ kích thước khoáng 2 4 um lấy 2

4 manh cắt bao quan trong ống eppcndorí đế tiến hãnh tách chiết DMA có thê bao quan ờ nhiệt độ phông ncu chưa tiến hành tách DMA

- Hưúc 2: Ly lãm vói tốc độ tối đa ớ nhi ột độ phots’ (15 25°C) noiẸ 2 phúĩ

- Bước 3: Loụi bo phần chất long nồi phía trẽn, giử lid kết tủa.

- Bước 4: Thêm I ml Con 100* vortex 10 giày.

- Bưức 5: Ly tâm va tốc độ tối đa ư nlũột độ phong (15 25°C) trong 2 phút.

hơi hết

- Bưởc 8 Thèm 180 pl Buffer ATL và 20 pl Proteinase K vortex trong

10 giãy

- Bước 9’ ử ỡ 56*c qua dèm (hoỹc cho tói khi kết tua tan hoàn toàn).

- Bườc 10: ù ở 90°C trong 1 giờ Sau u spindown ưong 5 giày

200 pl cẩn 100* vortex ưong 10 giày

d|ch trong ông x ao cột QIAamp MinElute (nằm trên 1 õng thu 2ml) dóng nắp

va ly tâm 8000 vong/ 1 phút ơ nhiệt độ phông Chuyển cột QIAamp MinElute sang một ống sạch 2 mi khac bo óng 2 ml chứa chát long chay qua

Buffer AW1 Đóng nắp vả ly tâm 8000 võng/ 1 phút ở nhiệt độ phòng Chuyền cột QlAamp MinElute sang một ống sạch 2 ml khác, bõ ống 2 ml chira chẩt long cháy qua

Buffer AW2 Đóng nẩp và ly tàm sooo vòng/ 1 phút ờ nhiệt độ phóng Chuyên cột QIAamp MinElute sang một ồng sụch 2 ml khác, bo ổng 2 ml chúa chắt long chay qua

dè lâm khò hoán toàn mang

- Rước 16: Chuyên cột QIAamp MinElute sarẹ ổng sạch 1.5 ml và bó

ông chim chất lõng chay qua Càn thận mớ nÁp cột QIAamp Mi nE lute vã them vào 100 pl Buffer ATE

tốc độ tối đa (14000 vòng' 1 phút ớ nhiệt độ phòng), bo cột QIAamp MinElutc ta thu được dung DNA hoa tan trong óng 1.5 ml bèn dưới

2.6.2.2 Kiêm ưa nồng dụ và (tụ tinh sạch cùa DNA bằng phương pliãp dơ mật (tộ quang

a Nguyên lý

Nguyên lý cua phương pháp này là dựa trên sự hầp thụ ãnh sáng cực đai cua một chất ờ một bước sóng nhẩt định Nucleic Acid hẩp thụ cực đụi ánh sảng tứ ngoại ờ bưóc sóng 260nm do sự cỏ mặt cua hai đơn phàn cấu tạo nên DNA là base purin và base pyrimidin Do đó ngưòi ta su dựng giá tri mật

độ quang ờ buck sõng 26ỡnm (OD^Cw) đê xác dịnh nòng độ acid nucleic trong mẫu

Don vi OD:ý;sB tương ứng với nồng độ 50 ng/ml cho một dung dich DNA sợi đôi nông độ DNA trong mẫu đưọc tính theo cõng thức:

Ngoải ra ngươi ta còn do mật độ quang tại bước sõng 280nm (OD.'soum)

đè xác dinh nồng dỏ các protein (một số acid amin cỡ nhân thơm di võng gồm: tyrosin tryptophan, histidin phenylalatân co mật độ quang lớn nhất tại bước sóng 28ỡnm) va do một độ quang tụi bước sóng 23ỡnm (OD;;^) đề xác định nồng độ caibonhydrate (do catbonhydrate hấp thụ ánh sang cực đụi tại bước sõng 230nm)

Tuy nhiên protein vẫn hấp thụ anh sang ở bước sóng 260nm, vi vậy người ta dưa váo tý lệ Aiíộ/A^ũ, Aiac/A^ộ dê kiêm tra chat lượng và mức độ tinh sạch cua DNA tách chid