Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau lên tính kháng khuẩn streptococcus spp của dịch chiết thảo dược và thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét do streptococcus spp trên cá trê lai

Tuy nhiên hiện nay có nhiều nguyên nhân dẫn đến việc điều trị không hiệu quả đối với các bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản như: các loại kháng sinh trước đây được sử dụng đặc trị b

TRẦN THỊ LAM GIANG

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG MÔI KHÁC NHAU

LÊN TÍNH KHÁNG KHUẨN Streptococcus spp

CỦA DỊCH CHIẾT THẢO DƯỢC VÀ THỬ NGHIỆM

KHẢ NĂNG TRỊ BỆNH LỞ LOÉT DO Streptococcus spp

TRÊN CÁ TRÊ LAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

NGHỆ AN - 2014

TRẦN THỊ LAM GIANG

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG MÔI KHÁC NHAU

LÊN TÍNH KHÁNG KHUẨN Streptococcus spp

CỦA DỊCH CHIẾT THẢO DƯỢC VÀ THỬ NGHIỆM

KHẢ NĂNG TRỊ BỆNH LỞ LOÉT DO Streptococcus spp

TRÊN CÁ TRÊ LAI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS TRẦN NGỌC HÙNG

NGHỆ AN - 2014

Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trương Thị Thành Vinh, cô giáo Nguyễn Thị Kim Chung và các giáo viên phòng thí nghiệm khoa Nông Lâm Ngư đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Phòng sau đại học, trường Đại học Vinh đã dạy dỗ, trang

bị cho tôi nền tảng kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt những năm học qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, tập thể lớp K20 - Sinh học thực nghiệm những người đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng với tất cả lòng biết ơn và kính trọng tôi xin gửi tới bố mẹ, các

em và toàn thể đại gia đình đã chăm sóc, nuôi dạy và giành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất!

Vinh, tháng 10 năm 2014

Học viên

Trần Thị Lam Giang

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC HÌNH VẼ iv

DANH MỤC BẢNG vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vài nét về đối tượng nghiên cứu 4

1.1.1 Cá trê lai 4

1.1.2 Vi khuẩn Streptococcus spp 6

1.1.3 Cây chó đẻ răng cưa Phyllanthus urinaria L 10

1.1.4 Tỏi Allium sativum L 13

1.2 Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho ĐVTS 15

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong phòng, trị bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản 17

1.3.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược trên thế giới 17

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong nước 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Vật liệu nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp thu dịch chiết thảo dược 27

2.3.2 Phương pháp định lượng mật độ vi khuẩn 28

2.3.3 Phương pháp thử kháng sinh đồ 29

2.3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

2.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 34

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 35

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi, lá cây chó đẻ răng cưa 35

3.2 Kết quả thử nghiệm khả năng trị bệnh của dịch chiết củ tỏi đối với vi khuẩn Streptococcus spp gây ra trên cá trê lai 45

KẾT LUẬN 53

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Cá trê lai 4

Hình 1.2 Vi khuẩn Streptococcus spp 7

Hình 1.3 Cây Chó đẻ răng cưa 10

Hình 1.4 Củ tỏi 13

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 27

Hình 2.2 Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn 28

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 30

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 31

Hình 2.5 Đường cấy vi khuẩn trên đĩa lồng 33

Hình 3.1 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi 38

Hình 3.2 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá chó đẻ răng cưa 41

Hình 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết củ tỏi 43

Hình 3.4 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết lá chó đẻ răng cưa 44

Hình 3.5 Tỷ lệ sống của cá của ở các công thức trong thí nghiệm trị bệnh 47

Hình 3.6 Cá bị gan phù nề 48

Hình 3.7 Phân lập vi khuẩn ở gan, thận 49

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết thảo dược 35Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết củ tỏi 38Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết lá cây chó đẻ răng cưa 40Bảng 3.4 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết củ tỏi 43Bảng 3.5 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết lá chó đẻ

răng cưa 44Bảng 3.6 Diễn biến bệnh lý của cá sau khi tiêm cảm nhiễm

Streptococcus spp 46

Bảng 3.7 Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh lở loét trên cá trê lai 49

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) là

loài cá có giá trị kinh tế cao có tốc độ sinh trưởng nhanh, chất lượng thịt thơm ngon và được thị trường trong và ngoài nước chấp nhận Do có những ưu điểm vượt trội, các trê lai dần trở thành đối tượng nuôi chủ yếu ở nước ta với sản lượng 80 - 100 tấn/ ha/ năm Nhiều mô hình nuôi cá trê lai ở các tỉnh như Vĩnh Long, Kiên Giang, Ninh Thuận, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình… đã đem lại lợi nhuận rất cao cho người nuôi, thu nhập hàng trăm triệu đồng mỗi năm Có thể nói nghề nuôi cá trê lai thực sự đã đem lại cuộc sống

ấm no cho người dân, đưa họ từng bước thoát nghèo và có cuộc sống ổn định [4] Nhu cầu về cá trê lai tiếp tục tăng trên toàn thế giới với sản lượng ước đạt

3 triệu tấn trên toàn cầu trong năm 2010 so với 2,6 triệu trong năm 2007 Với doanh thu ước tính lên tới 5 tỉ USD vào năm 2010, ngành nuôi cá trê lai tăng trưởng liên tục với sự đa dạng hóa về sản phẩm [21]

Tuy nhiên, loài cá này rất mẫn cảm với nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau trong ao nuôi như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng Trong đó, bệnh do

vi khuẩn Streptococcus spp là tác nhân gây thiệt hại lớn trên các đối tượng cá

nước ngọt đặc biệt là trên cá trê lai, ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành

nuôi trồng thuỷ sản thế giới Ước tính tổng thiệt hại bệnh do vi khuẩn gây ra

hàng năm là khoảng 150 triệu USD [30]

Một trong những giải pháp để phòng trị các bệnh do vi khuẩn hiện nay

là sử dụng các loại kháng sinh tổng hợp Tuy nhiên hiện nay có nhiều nguyên nhân dẫn đến việc điều trị không hiệu quả đối với các bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản như: các loại kháng sinh trước đây được sử dụng đặc trị bệnh nhiễm khuẩn trên các nước ngọt không còn hiệu quả do các dòng vi

khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng, danh mục kháng sinh bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy hải sản ngày càng nhiều…Mặt khác nếu sử dụng kháng sinh không đúng cách thì không những không chữa được bệnh cho đối tượng nuôi mà còn có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe, môi trường sinh thái và tạo

ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc Ngoài ra việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh động vật có thể để lại dư lượng trong sản phẩm sẽ gây hại cho người tiêu dùng và khả năng tiêu thụ sản phẩm

Trước tình hình đó việc nghiên cứu sử dụng các loại kháng sinh có nguồn gốc thảo dược trong phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn cho các đối tượng động vật thủy sản được coi là một hướng đi mới, vừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm vừa thân thiện với môi trường Hướng đi này đặc biệt phù hợp với nước ta vì Việt Nam là một trong những quốc gia có tiềm năng đa dạng sinh học cao, có nhiều loại thảo dược quí đã được ghi nhận là có tính kháng khuẩn

và đã được ứng dụng vào việc chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn trên người và một số loài động vật khác

Trong số các loại thảo dược nghiên cứu thì tỏi (Allium sativum L)và cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus amarus Schum.et Thonn) là hai loài thảo

dược có nhiều ưu điểm, đã được minh chứng có các hoạt chất kháng khuẩn và được sử dụng làm những bài thuốc chữa bệnh cho người Một số đề tài đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của củ tỏi ở dạng dịch ép và dạng bột còn cây chó đẻ răng cưa thì chưa được nghiên cứu nhiều Tuy nhiên, hầu như các nghiên cứu này chỉ mới dừng ở thử nghiệm tính kháng khuẩn của các loại thảo dược đó

Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của các loại

dung môi khác nhau lên tính kháng khuẩn streptococcus spp của dịch chiết thảo dược và thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét do streptococcus

spp trên cá trê lai”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá được ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau lên tính

kháng khuẩn streptococcus spp

- Đánh giá được khả năng trị bệnh lở loét do streptococcus spp trên cá

trê lai của dịch chiết thảo dược với loại dung môi tối ưu đã được lựa chọn

3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài triển khai các nội dụng sau:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến khả năng

kháng khuẩn của dịch chiết củ tỏi, lá cây chó đẻ răng cưa với vi khuẩn

Streptococcus spp

- Thử nghiệm khả năng phòng trị bệnh lở loét do vi khuẩn Streptococcus spp

gây ra trên cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus

male) của dịch chiết thảo dược

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét về đối tượng nghiên cứu

Cá trê lai được lai giữa cá trê phi và cá trê vàng, có ngoại hình tương tự

cá trê vàng, da trơn nhẵn, đầu dẹp, thân hình trụ, dẹp ở đuôi Thân có màu xám có những chấm nhỏ mờ, u lồi xương chẩm có hình gần giống chữ M với

các góc tròn, trong khi ở cá trê vàng là chữ U còn có trê phi là chữ M có các góc nhọn và rõ nét [2]

- Đặc điểm thích ứng môi trường:

Cá trê lai thích ứng rộng với môi trường nước, cá có thể sống trong giới hạn nhiệt độ từ 11-39,5o

C; pH: 3,5-10,5; độ mặn dưới 15‰ Do có cơ quan hô hấp phụ nên cá trê có thể thở bằng oxy không khí, sống được ở môi trường nước có hàm lượng oxy thấp thậm chí sống được ở trên cạn 1 giờ nếu giữ được độ ẩm cho cá [2]

- Đặc điểm dinh dưỡng:

Từ khi cá mới nở đến 48 giờ cá sử dụng noãn hoàng Sau đó bắt đầu ăn động vật phù du cỡ nhỏ như trứng nước, ấu trùng muỗi… Sau vài ngày có thể

ăn bọ gậy… Khi cá đạt cỡ 4-6cm bắt đầu ăn tạp thiên về động vật thối rữa, tôm cá nhỏ, ruốc, tép, côn trùng, các loại phế phẩm chế biến và thức ăn tinh khác như cám gạo, bã rượu, phân gia súc… [2]

- Đặc điểm sinh trưởng:

Cá trê lai lớn rất nhanh, trong điều kiện môi trường nuôi tốt, mật độ thích hợp và chăm sóc tốt có thể tăng trọng 100-150g/con/tháng Sau 6 tháng nuôi đạt trọng lượng bình quân 0,4-0,6kg/con [2]

- Tập tính sống:

Cá trê lai nuôi ít bị bệnh, chúng thường chui rúc đào hang dễ làm hỏng

bờ ao Khi mặt nước ao nuôi cao xấp xỉ bờ ao, cá thường phóng lên bờ Cá trê lai hoạt động bơi lội và ăn mạnh vào chiều tối và mờ sáng

- Cá trê lai có những đặc điểm nổi trội hơn so với cá trê vàng và cá trê phi

+ Cá trê phi: Có nguồn gốc từ Châu Phi Tên khoa học là Clarias

gariepinus Thân có màu xám có những mảng vân đen to, cá lớn nhanh

Cá trê phi trong vòng 6 tháng đạt bình quân 1kg/con Trọng lượng cá đạt tối đa là 12,8kg nhưng thịt mềm ít thơm

Vì vậy ít được sử dụng nuôi thương phẩm vì giá trị tiêu thụ của loài này thấp

+ Cá trê vàng: Tên khoa học Clarius macrocephalus có màu vàng nâu

điểm đốm nhỏ màu vàng thành hàng trên thân, thịt rất thơm ngon nhưng có kích thước nhỏ, nuôi chậm lớn, nuôi 1 năm chỉ đạt 300g/con

+ Cá trê lai: Cá trê lai dễ nuôi, mau lớn, nuôi tốt có thể tăng trọng

bình quân 100g/con/tháng Do được lai giữa 2 loài cá trê phi và cá trê vàng nên nó có nhiều đặc điểm nổi trội của cả 2 loài trên Tuy nhiên cá Trê lai sinh sản kém, không có hiệu quả trong sản xuất Chủ yếu chỉ sử dụng con lai F1 để làm cá thịt

Gần đây đã có một số nghiên cứu bệnh lở loét trên cá bống bớp, cá rô phi, cá trắm cỏ Trên đối tượng cá trê lai cũng có một vài nghiên cứu sử dụng dịch ép củ tỏi, củ gừng, lá húng để trị bệnh lở loét do vi khuẩn

Streptococcus spp gây ra [26] Thử nghiệm dịch ép lá ổi và củ tỏi trong

phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp trên cá Trê lai kết quả cho

thấy Dịch ép lá ổi và dịch ép củ tỏi có khả năng phòng bệnh tốt đối với cá trê

lai bị bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp Sử dụng dịch ép lá ổi với liều

lượng 300ml và 400 ml/kg thức ăn cho tỷ lệ sống đạt lần lượt là 83,33% và 86,67% Còn dịch ép củ tỏi với liều lượng 400ml/kg tỷ lệ sống đạt 73,3 % Sử dụng dịch ép lá ổi liều lượng 300ml/kg thức ăn có thể trị khỏi bệnh sau 7 ngày nuôi, tỷ lệ sống đạt 50%, Dịch ép từ củ tỏi liều lượng 300 ml/kg thức ăn có thể trị khỏi bệnh sau 6 ngày nuôi, tỷ lệ sống đạt 43,3% [27]

Hình 1.2 Vi khuẩn Streptococcus spp

Theo Bergey (1984), Streptocuccus spp có hình dạng cầu hoặc hình

ovan, có thể đứng riêng lẻ, thành cặp hay tạo thành chuỗi dài nên gọi là cầu khuẩn Vi khuẩn bắt màu tím của Gram dương không di động, hầu hết yếm khí tùy tiện, lên men trong môi trường Glucoze, nhu cầu phát triển phức tạp

Vi khuẩn có kích thước 0,5 x 1- 1,5 μm

Streptococcus spp là vi khuẩn thường gây bệnh lở loét trên cá hay còn

gọi là bệnh đốm đỏ [5] Nó thường tìm thấy trong các khu vực có khí hậu ấm, ngoài ra chúng ta còn tìm thấy trong muối tươi, biển và nơi cửa sông, được phân lập từ người và động vật Vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên cá,

người và động vật lưỡng cư như ếch, thằn lằn, cá sấu… [11] Streptocuccus

spp phát triển tốt trên các môi trường thạch Tryptic Soy, Brain Heart Infusion, Muller-Hinton, Nutrien agar và thạch máu cừu Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp

25 - 28oC Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo khuẩn lạc nhỏ (0,5 - 0,7mm) màu trắng đục, hình tròn, hơi lồi Một số chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc trong suốt

có tính nhầy sau 24 giờ nuôi cấy Vi khuẩn không phát triển ở điều kiện pH 9,6, NaCl 6.5%, nhiệt độ 10o

C và 45oC

Streptococcus spp là tác nhân chính của các bệnh nguy hiểm gây nên

thiệt hại lớn ở cá Rô phi nói riêng và cá nước ngọt nói chung, làm ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản thế giới [30]

Những loài cá khác nhau khi bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp cho

một số dấu hiệu chung điển hình như:

* Các dấu hiệu bên ngoài

- Hành vi bất thường: Do vi khuẩn gây bệnh có hướng tấn công vào hệ thống thần kinh trung ương của cá nên cá bị bệnh sẽ có biểu hiện bị hôn mê

và mất phương hướng Những tổn thương mắt có thể gặp như viêm mắt hoặc lồi mắt, chảy máu mắt Tuy nhiên không phải con cá nào bị bệnh cũng bị những tổn thương về mắt

- Các vết áp-xe: Những con cá bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Streptococcus

thường thấy những vết áp-xe có đường kính từ 2-3mm và những vết loét này nhanh chóng vỡ ra tạo thành những vết lở loét xuất huyết không lành Những vết áp-xe lớn hơn có thể gặp thấy ở vây ngực và phần đuôi của cá và những vết áp-xe đó có chứa vật chất như mủ ở bên trong

- Xuất huyết ở da: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus là nguyên nhân gây

xuất huyết bên ngoài da Nhìn chung các điểm xuất huyết thường được nhìn thấy ở quanh miệng cá hoặc ở các gốc vây Đôi khi cũng có thể quan sát thấy những vùng da hơi đỏ xung quanh hậu môn hoặc lỗ sinh dục của cá

- Dịch cổ trướng: Sự có mặt của dịch chất lỏng trong bụng của cá là dấu hiệu của dịch bệnh ở thời kỳ cấp tính Dịch này có thể được nhìn thấy chảy ra từ hậu môn của cá

* Các dấu hiệu bên trong: Các dấu hiệu bên trong bệnh này có nhiều

điểm tương đồng với bệnh nhiễm trùng máu của cá

- Cá bỏ ăn: Nhìn chung không có sự hiện diện của thức ăn khô trong dạ dày hoặc ruột của những con cá bị bệnh Tuy nhiên trong các ao nuôi cá

thương phẩm khi cá bị bệnh ở giai đoạn đầu bệnh mới bùng phát cá vẫn có thể

ăn bằng cách lọc thức ăn Khi ruột và dạ dày của cá trống rỗng thức ăn thì sẽ quan sát thấy túi mật rất to, đó là đặc trưng của sự vắng mặt hoạt động tiêu hoá trong cơ thể

- Nhiễm trùng máu: Trong giai đoạn cấp tính của bệnh vi khuẩn nhanh chóng đi đến hệ thống máu và lan toả đến tất cả các cơ quan nội tạng Những dấu hiệu lâm sàng chính liên quan đến sự nhiễm trùng máu là sự xuất huyết, viêm gan, thận, lá lách, tim, mắt và ống ruột Lá lách thường mở rộng ra (trương và sưng nhẹ)

- Viêm màng bụng: Khi cá bị nhiễm bệnh nặng có sự dính nhau của các

cơ quan nội tạng với màng trong khoang bụng của cá Hơn nữa lúc này sự hiện diện của các tơ huyết (fibrinous) có thể được quan sát thấy trong màng ở khoang bụng của cá

Ngoài ra khi cá bị nhiễm bệnh nặng, bệnh còn kết hợp với những vi khuẩn cơ hội khác gây bệnh cho cá có sẵn trong môi trường như vi khuẩn

Aeromonas spp ở nước ngọt hay vi khuẩnVibrio spp ở trong nước lợ

Gần đây đã có một vài nghiên cứu về bệnh do vi khuẩn Steptococcus spp gây ra như: thử nghiệm cho thấy dịch ép nguyên chất của củ tỏi (Allium

sativum L) có tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococcus spp và giảm

dần ở các mức pha loãng Sử dụng dịch ép củ tỏi với liều lượng 400 ml/kg

thức ăn có khả năng phòng bệnh tốt đối với cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon

idellus) bị bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp, tỷ lệ sống đạt 70% Dùng liều

lượng 800ml/kg thức ăn có thể trị khỏi bệnh sau 6 ngày nuôi, tỷ lệ sống đạt 43,3% [14] Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch ép củ tỏi đối với vi

khuẩn Streptococcus spp gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi vằn cho thấy ở

nồng độ 100% dịch ép củ tỏi có tính kháng khuẩn cao với đường kính vòng kháng khuẩn đạt 20,75mm [7]

1.1.3 Cây chó đẻ răng cƣa Phyllanthus urinaria L

Hình 1.3 Cây Chó đẻ răng cưa

Thuộc họ Thầu dầu - Euphorbiaceae

- Đặc điểm:

Cây thảo sống hàng năm hoặc sống dai Thân cứng màu hồng, lá thuôn hay hình bầu dục ngược, cuống rất ngắn Lá kèm hình tam giác nhọn Cụm hoa đực mọc ở nách gần phía ngọn, hoa có cuống rất ngắn hoặc không có, đài

6 hình bầu dục ngược, đĩa mật có 6 tuyến, nhị 3 chỉ nhị rất ngắn, dính nhau ở gốc Hoa cái mọc đơn độc ở phía dưới các cành, dài 6 hình bầu dục mũi mác, đĩa mật hình vòng phân thùy, các vòi nhụy rất ngắn xẻ đôi thành 2 nhánh uốn cong, bầu hình trứng Quả nang không có cuống, hạt hình 3 cạnh Cây mọc hoang ở khắp nơi, trong nước cũng như ở các nơi trong các vùng nhiệt đới

- Bộ phận dùng: Phần trên mặt đất (Herba Phylanthi)

- Phân bố: Cây mọc hoang khắp nơi ở nước ta

- Thu hái: vào mùa hè, rửa sạch phơi nắng gần khô, đem phơi trong râm rồi cất dùng

- Tác dụng dược lý:

Kenneth Jones và các nhà nghiên cứu Brazil đã khám phá tác dụng

giảm đau mạnh và bền vững của một vài loại Phyllanthus, trong đó có cây

Chó đẻ răng cưa - Phyllanthus niruri Tác dụng giảm đau của Chó đẻ răng

cưa mạnh hơn indomethacin gấp 4 lần và mạnh hơn 3 lần so với morphin Tác dụng này được chứng minh là do sự hiện diện của acid gallic, ester ethyl và hỗn hợp steroid (beta sitosterol và stigmasterol) có trong Chó đẻ răng cưa Những nghiên cứu [38] vào năm 1999 cũng xác định những hoạt chất của Chó đẻ răng cưa có tác dụng gia tăng lượng nước tiểu, ngăn cản sự tạo thành những tinh thể calcium oxalate cũng như làm giảm kích thước những viên sỏi

đã hình thành Kết quả này cũng phù hợp với những nghiên cứu sau đó cho biết Chó đẻ răng cưa có tác dụng lợi tiểu, tăng tiết mật và giãn cơ, đặc biệt là các cơ ở vùng sinh dục tiết niệu và ống mật Những tác dụng này dẫn đến hiệu quả trục xuất sỏi Nghiên cứu cũng cho biết tác dụng làm bể nhưng tinh thể calcium oxalate và cả tác dụng giảm đau kéo dài của Chó đẻ răng cưa cũng hổ trợ tốt cho việc chữa sỏi thận [45] Một nghiên cứu của trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil-1984) đã phát hiện một alkaloid của Chó đẻ răng cưa (phyllan thoside) có tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích rõ hơn hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật của cây thuốc Những nghiên cứu này giải thích cho việc từ lâu Chó đẻ răng cưa đã được nhiều nước sử dụng trong việc phòng trị bệnh

Tác dụng giải độc: Người Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc dùng Diệp hạ

châu để trị các chứng mụn nhọt, lở loét, đinh râu, rắn cắn, giun Nhân dân Java, Ấn Độ dùng để chữa bệnh lậu Theo kinh nghiệm dân gian Malaysia, Chó đẻ răng cưa có thể dùng để trị các chứng viêm da, viêm đường tiết niệu, giang mai, viêm âm đạo, Công trình nghiên cứu tại Viện Dược liệu - Việt Nam (1987 - 2000) cho thấy khi dùng liều 10 - 50g/kg, Chó đẻ răng cưa có tác dụng chống viêm cấp trên chuột thí nghiệm

Điều trị các bệnh đường tiêu hóa: Cây thuốc có khả năng kích thích ăn

ngon, kích thích trung tiện Người Ấn Độ dùng để chữa các bệnh viêm gan,

vàng da, kiết lỵ, táo bón, thương hàn, viêm đại tràng Nhân dân vùng Haiti, Java dùng cây thuốc này trị chứng đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa,

Bệnh đường hô hấp: Người Ấn Độ sử dụng Chó đẻ răng cưa để trị ho,

viêm phế quản, hen phế quản, lao,

Tác dụng lợi tiểu: Y học cổ truyền một số nước đã sử dụng Chó đẻ răng

cưa làm thuốc lợi tiểu, trị phù thũng

Điều trị tiểu đường: Tác dụng giảm đường huyết của Chó đẻ răng cưa

(Phyllanthus niruri) đã được kết luận vào năm 1995, đường huyết đã giảm một cách đáng kể trên những bệnh nhân tiểu đường khi cho uống thuốc này trong 10 ngày Thành phần hoá học: flavonoid, alcaloid phyllanthin và các hợp chất hypophyllanthin, niranthin, phylteralin

Gần đây có một số thông tin cho rằng uống Chó đẻ răng cưa có thể gây

vô sinh Điều này có lẽ bắt nguồn từ 1 nghiên cứu về tác dụng ngừa thai của Diệp hạ châu trên trên loài chuột của các nhà khoa học trường Đại học Gujaret ở Ấn độ Kết quả nghiên cứu cho thấy khi cho chuột uống cao toàn thân cây Chó đẻ răng cưa liều 100mg/kg thể trọng đối với chuột cái [39] hoặc 500mg/kg thể trọng đối với chuột đực [40] có thể tạm thời ức chế khả năng sinh sản trong thời gian thí nghiệm 30 ngày (chuột cái) hoặc 45 ngày (chuột đực) Sau khi ngưng uống Chó đẻ răng cưa, khả năng này phục hồi bình thường Điều này khác với vô sinh Hơn nữa chỉ mới là thử nghiệm ban đầu trên loài vật Do việc sử dụng cây chó đẻ răng cưa được quan tâm nhiều nên đã có nhiều tác giả nghiên cứu về mặt thực vật học của hai loài cây này trong thời gian qua[15] [28] Đặc biệt trong Đông y Diệp hạ châu sử dụng như 1 loại thuốc thanh Can lương huyết, giải độc sát trùng từ lâu đời Tuy nhiên, tác dụng giải độc gan và chữa viêm gan siêu vi B chỉ mới được các nhà khoa học lưu ý từ những năm 1980 về sau Nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật bản và Ấn độ đã cho biết họ đã phân lập được những hợp chất trong Chó

đẻ răng cưa có khả năng chữa bệnh viêm gan như phyllantin, hypophyllantin

và triacontanal Tác động chống virus siêu vi B được báo cáo lần đầu tiên tại

Ấn độ vào năm 1982 Sau đó, một báo cáo trên tạp chí Lancet vào năm 1988 cũng xác định tác dụng này Theo báo cáo này 2 nhà khoa học Blumberg và Thiogarajan đã điều trị 37 trường hợp viêm gan siêu vi B với kết quả 22 trong

số 37 người đã đạt được kết quả âm tính sau 30 ngày dùng Chó đẻ răng cưa Ðối với viêm gan siêu vi, Chó đẻ răng cưa có khả năng làm hạ men gan, tăng cường chức năng gan và ức chế sự phát triển của virus Theo các nhà khoa học, những tác nhân gây viêm gan hoặc hoại tử tế bào gan thường bắt đầu từ

sự gia tăng quá trình peroxide hoá lipid ở màng tế bào Do đó, bảo vệ gan phải bắt đầu từ những chất chống oxy hoá có tính năng ức chế qúa trình này Chó đẻ răng cưa có hàm lượng những chất chống oxy hoá hướng gan[41] có khả năng ức chế rất mạnh quá trình peroxide hoá ở gan Ngoài ra, những chất này còn làm gia tăng hàm lượng Glutathione ở gan làm giảm hoạt động các enzym SGOT và SGPT trong những trường hợp viêm gan siêu vi đang tiến triển Điều này mở ra hướng sử dụng cây Chó đẻ răng cưađiều trị bệnh ảnh hưởng tới gan của các loài thủy sản Song trong lĩnh vực thủy sản chưa có nhiều nghiên cứu

1.1.4 Tỏi Allium sativum L

Thuộc họ Hành - Alliaceae

Hình 1.4 Củ tỏi

- Đặc điểm: Thuộc dạng cây thảo sống nhiều năm Thân thực hình trụ, phía dưới mang nhiều rễ phụ, phía trên mang nhiều lá Lá cứng, hình dải, thẳng dài 15-50cm, rộng 1-2,5cm có rãnh khía, mép lá hơi ráp Ở mỗi nách lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển thành một tép Tỏi; các tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ Tỏi tức

là thân hành (giò) của Tỏi Hoa xếp thành tán ở ngọn thân trên một cán hoa dài 55cm hay hơn Bao hoa màu trắng hay hồng được bao bởi một cái mo dễ rụng, tận cùng thành mũi nhọn dài Hoa tháng 5-7, quả tháng 9-10

- Bộ phận dùng: Thân hành (giò) - Bulbus Allii, thường có tên là Ðại toán

- Nơi sống và thu hái: Cây của miền Trung châu Á, được gây trồng ở nhiều nước ôn đới Ở nước ta, cũng trồng nhiều, có những vùng trồng Tỏi có tiếng ở Quảng Ngãi, Hà Bắc, Hải Hưng Tỏi là gia vị rất quen thuộc trong đời sống của nhân dân ta Thường ta thu hoạch vào cuối đông, đầu xuân; có thể dùng tươi hay phơi khô dùng dần

- Tác dụng dược lý:

Trong các nghiên cứu và thử nghiệm các loại thuốc chiết xuất từ dịch

ép củ Tỏi trên người bệnh đã cho thấy Tỏi có tác dụng chữa trị nhiều căn bệnh khác nhau Trong tỏi tươi có chất allicin, nhờ tác dụng của men allinaza chuyển hóa aliin có sẵn trong tỏi thành allicin, là chất chủ yếu gây tác dụng đối với vi khuẩn Allicin là chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng mạnh hơn cả penicillin Nước tỏi pha loãng 125.000 lần vẫn có dấu hiệu ức chế nhiều loại

vi khuẩn gram âm và gram dương như: Staphylococcus, Streptococcus,

samonella, V cholerae, B dysenteriae, Mycobacterium tuberculosis Tỏi

cũng ức chế sự phát triển của nhiều loại siêu vi như bại liệt, cúm và một số loại nấm gây bệnh ở da hoặc bộ phận sinh dục nữ như candida Trong Tỏi còn

có liallyl sulfide, chất này tuy không mạnh bằng allicin nhưng có thể tồn tại lâu hơn và giữ nguyên được dược tính khi nấu [13] đã chiết xuất từ Tỏi một

chất gọi là allistalin, có tính chất giống như allicin; Machado (1948) cũng chiết xuất từ Tỏi chất garcin, nó là một chất kháng khuẩn màu vàng, không có mùi lưu huỳnh, không độc, có tác dụng đến cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Garcin có thể dễ dàng hấp thu qua thành ruột và có thể đi tới dịch não

tủy, đã ứng dụng có kết quả trong nhiễm khuẩn Shigella hoặc d o các bệnh ký

sinh trùng như giun kim, giun đũa và giun tóc Các nhà khoa học Mỹ đã tìm thấy chất prostagladin A trong nước Tỏi có khả năng hạn chế bệnh nhồi máu

cơ tim, hạ huyết áp, phòng bệnh xơ vữa động mạch Các bác sĩ Nhật Bản lại nhận xét rằng do Tỏi chứa chất allixotine nên Tỏi có tác dụng chữa đau lưng, viêm khớp Ngoài ra các nghiên cứu lâm sàng cũng cho thấy Tỏi có tác dụng chữa trị được nhiều căn bệnh như: các bệnh về tai, mũi, họng; bỏng nhiễm khuẩn và vết thương có mủ; dùng Tỏi để trị các loại giun; dùng nước ép Tỏi

để trị viêm âm đạo trùng roi; chữa các bệnh về tim mạch [1] Theo kinh nghiệm của người dân, có thể dùng tỏi trộn vào thức ăn cho cá để trị bệnh viêm ruột ở cá Trắm cỏ

1.2 Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho ĐVTS

Kháng sinh tổng hợp là chất hữu cơ do sinh vật tiết ra hoặc do con người tổng hợp nên, có khả năng ức chế, kìm hãm và tiêu diệt vi khuẩn ở một nồng độ nhất định Trong y học, thú y và nuôi trồng thủy sản, người ta dùng kháng sinh tổng hợp để trị các bệnh nhiễm khuẩn và đem lại hiệu quả rất cao, nếu dùng đúng thuốc, đúng liều và đúng thời gian Tuy vậy, kháng sinh tổng hợp cũng là con dao hai lưỡi, có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe động vật sử dụng nó và cũng có tác động không nhỏ tới môi trường sinh thái, nếu dùng kháng sinh tổng hợp tùy tiện và thiếu hiểu biết có khả năng làm giảm sức đề kháng của vật nuôi với các loại mầm bệnh [11]

Việc sử dụng kháng sinh tổng hợp trong phòng trị bệnh vi khuẩn đã mang lại những thành công nhất định, nhưng nó cũng làm gia tăng những

dòng vi khuẩn kháng thuốc (Weston, 1996) Sự kháng thuốc này còn được truyền sang dòng vi khuẩn khác thông qua các thể plasmid trong đó có các vi khuẩn gây bệnh trên người và động vật nuôi khác, làm hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh cho người và trong thú y (Towner, 1995)

Dư lượng kháng sinh tổng hợp tồn tại trong cơ thể động vật thủy sản nuôi làm giảm giá trị thương phẩm và tăng rủi ro cho người tiêu thụ Sự kháng thuốc cũng được tìm trên những vi khuẩn gây bệnh cho người (Towner, 1995) Ở Anh và Ai Len, ADN của những vi khuẩn kháng thuốc

kháng sinh đã chuyển sang các loại vi khuẩn E coli và Aeromonas phân

lập từ các bệnh viện (Rhodes và ctv, 2000) Ở Việt Nam Kim ngạch xuất khẩu trong lĩnh vực thủy sản năm 2013 đạt hơn 6,7 tỷ USD, hơn 32 lần so năm 1990, trở thành một trong những nước xuất khẩu thủy sản lớn trên thế giới Tuy nhiên, tình hình nhiễm dư lượng kháng sinh vẫn chưa được xử lý triệt để Theo kết quả báo cáo của Tổ chức Phát triển Công nghiệp của Liên Hợp Quốc (UNIDO) ở 4 thị trường lớn là EU, Hoa Kỳ, Nhật Bản, c thì Việt Nam là một trong ba nước đứng đầu về số vụ bị từ chối nhập khẩu sản phẩm thủy sản giai đoạn 2006-2010 Tính trung bình trong giai đoạn này, mỗi năm Việt Nam thiệt hại hơn 14 triệu USD do hàng xuất khẩu thủy sản bị trả lại [21]

Một trong những lý do quan trọng nhất để kiểm soát việc sử dụng kháng sinh tổng hợp trong NTTS là sự nguy hiểm của việc các vi khuẩn kháng thuốc phát triển Khi vi khuẩn đã mang gen kháng thuốc thì chúng ta sẽ rất khó khăn trong việc loại trừ chúng bằng thuốc kháng sinh thông thường Hơn nữa, nhiều loại thuốc kháng sinh tổng hợp được sử dụng có tính bền khá cao trong môi trường và có thể lan ra các vùng xung quanh, làm thay đổi hệ sinh thái bằng cách biến đổi cấu trúc thông thường của vi khuẩn và cũng có những ảnh hưởng rất lớn đối với động thực vật thủy sinh [16]

Với những hạn chế như trên, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang có xu hướng nghiên cứu các loại thuốc điều trị bệnh cho ĐVTS có nguồn gốc từ thiên nhiên để thay thế dần các thuốc kháng sinh tổng hợp

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dƣợc trong phòng, trị bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản

Ưu thế của những loại thuốc có nguồn gốc thảo dược là không có hiện tượng kháng thuốc, không có tồn dư trong thực phẩm an toàn với vật nuôi, môi trường và con người [24, 25] Nó khắc phục được những hạn chế mà việc dùng hó chất và thuốc khangs sinh tổng hợp mắc phải như: dư lượng hóa chất, kháng sinh trong thịt tôm cá nuôi, độc hại đối với sức khỏe con người và tác động xấu tới môi trường Do đó, xu hướng nghiên cứu những loại thuốc có nguồn gốc thảo dược phòng và trị bệnh cho động vật thủy sản đang được thế giới quan tâm

Tính kháng khuẩn, diệt khuẩn của chúng được nghiên cứu trên khá

nhiều loài vi khuẩn như Aeromonas hydrophyla, Streptococus sp, Vibrio sp

Các nghiên cứu đã đề xuất được một số phương thức sử dụng thảo dược bằng cách sử dụng các bộ phận khác nhau trong cây như lá, ngọn, thân và rễ; sử dụng dạng bột, dịch ép, dịch chiết hay hoạt chất của thảo dược với các nồng

độ khác nhau Qua các kết quả nghiên cứu cho thấy một số thảo dược bước đầu có tác dụng trong việc phòng trị bệnh cho vật nuôi hoặc giúp sinh ra kháng thể Bên cạnh đó, có nghiên cứu còn chứng minh được tính vô hại của thảo dược đối với môi trường Mặc dù còn hạn chế nhiều so với nghiên cứu

trên người và gia súc nhưng cũng có một số nghiên cứu điển hình như:

1.3.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược trên thế giới

* Sử dụng thảo dược ở dạng dịch ép

- Ở Thái Lan, Sataporn Direbusarakom, Ungkana Hiransali và Sompron Runngkammerdwong (1997) đã thử nghiệm tác dụng của một số loại cây

Ocimum sanctum (Hương nhu tía), Eclipta alba (Cỏ mực), Cassia alata (Muồng trâu), đối với YHV trên Penaeus monodon (Tôm sú) Kết quả cho

thấy O.sanctum, E alba, C alata, P acidus có tác dụng kháng khuẩn đối

với vi khuẩn này và nồng độ ức chế tối thiểu là 1mg/ml, liều gây chết 50% đối với poslava 15 sau 24h là 1,987 - 3,548 ppm [42]

- Ở Trung Quốc, Khuê Lập Trung (1985) trong “Kỹ thuật phòng trị

bệnh tôm, cá và nhuyễn thể” đã đưa ra 22 loại thảo dược chủ yếu phòng trị

bệnh nhiễm khuẩn, ngoại ký sinh trùng và bệnh đường ruột Các loài thảo dược có thể kể như: Xuyên Tâm liên, Địa Niên thảo, Lưu Xô thử, Tiền thảo, Quản trọng…[31]

Cũng ở Trung quốc Huonjun Yin và ctv đã nghiên cứu hiệu quả của 2

loại thảo dược (Astralagus radix và Scutellavia radiis) lên tính miễn dịch đặc hiệu của cá rô phi Kết quả cho thấy Astralagus radix cho ăn với nồng

độ 0,1 và 0,5% trong thời gian 3 tuần là có hiệu quả tối ưu nhất; với

Scutellavia radiis cần có thêm thí nghiệm để tìm ra nồng độ và thời gian cho

ăn thích hợp [35]

* Sử dụng thảo dược ở dạng bột

Thảo dược ở dạng bột, thức ăn trực tiếp có ưu điểm là dẽ bảo quản, vận chuyển và sử dụng hơn dạng dịch ép và dịch chiết nên nó được sử dụng rộng rãi trên thế giới

- Ở Trung Quốc sản phẩm được sử dụng phổ biến và nhiều người biết

đến có nguồn gốc từ tỏi (Allium sativum), đóng gói dạng bột mịn trắng với

trọng lượng 1kg/gói (trong gói 1kg có 10 gói nhỏ mỗi gói có trọng lượng 100gram) đã được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trong việc phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá trắm cỏ nói riêng và cá nuôi nước ngọt nói chung [12] Một nghiên cứu khác trên cá chép ở Trung Quốc là người ta trộn lẫn một

số thảo dược với nhau (Astragalus mempranaceus phần rễ và thân, Poligonum

multiflorum phần rễ, Isatis tinctoria phần rễ, Glycyrhida grabra phần thân)

cho cá ăn 0,5 và 1% trong thời gian 30 ngày, kết quả cho thấy tính miễn dịch của cá tăng lên đáng kể [34]

- Ở Ấn Độ, người ta đã tiến hành nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

với 3 loài thảo dược: Ocimum sanctum (os), withania somniera (ws) và

myristik fragrans (mf) có ảnh hưởng kháng lại vi khuẩn Vibrio harveyi gây

bệnh trên cá song [43] Một nghiên cứu khác đề cập đến hiệu quả của thảo dược đối với tính miễn dịch của cá chép Ấn Độ khi cho ăn thức ăn chứa 0,5%

rễ cây Achyranthes astera sau 4 tuần thấy cá có khả năng sinh kháng thể [46] Năm 2004, Hasnabana đã nghiên cứu sử dụng Azadirachta indik, Allium

sativum và Poligonum hidropiper là 3 loại thảo dược dùng để kháng khuẩn

Kết quả cho thấy chúng có tác dụng phòng bệnh nhưng không gây ô nhiễm môi trường [36]

* Sử dụng thảo dược dạng dịch chiết

Các nhà khoa học người Trung Quốc và Ấn Độ đã hợp tác nghiên cứu

về hiệu quả của 1 số thảo mộc đối với khả năng kháng lại virus đốm trắng trên

tôm Sú (Penaeus monodon) Thí nghiệm được tiến hành như sau: Năm loại thảo dược lần lượt có tên Cyanodon dactylon (cỏ gà), Aegle marmelos,

Tinospora cordifolia, Picrorhiza kurooa và Eclipta alba (cỏ mực) được tách

chiết bằng phương pháp methanol, tiến hành dùng thảo dược đã được tách chiết trộn vào thức ăn lần lượt với các nồng độ sau 100mg/kg thức ăn; 200mg/kg thức ăn; 400mg/kg thức ăn; 800mg/kg thức ăn Sau 7 ngày thí nghiệm lô đối chứng (lô không có tác động của thảo dược), tôm đã chết Sau

25 ngày lô thí nghiệm có ăn thảo dược ở nồng đô 800mg/kg thức ăn có tỷ lệ

sống đạt trên 74% (P<0,0001) [44]

Các loại thảo mộc Ocimum sanctum (OS), Withania somnifera (WS)

và Myristica fragrans (MF) ở Ấn Độ, đã tiến hành nghiên cứu trong quy mô

phòng thí nghiệm đều có ảnh hưởng kháng lại vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh trên cá song (Epinephelus tauvina) bước đầu đã có kết quả tốt trong việc trị bệnh do vi khuẩn Vibrio harveyi Một nghiên cứu khác tại Ấn Độ cho thấy

chất chiết từ lá ổi và quả ổi có tác dụng chống lại các loài vi khuẩn

Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Bacillus, E coli, Clostridium và Pseudomonas [43]

Harikrishnan et al., (2009) ngâm cá chép (Cyprinus carpio) đã gây cảm nhiễm với vi khuẩn A hydrophila (nồng độ 108

cfu/ml) với thảo dược Ấn Độ

(Azadirachta indica) (nồng độ 1g/lít trong 10 phút suốt 30 ngày cho thấy số

lượng bạch cầu, hồng cầu và hàm lượng protein huyết thanh tăng có ý nghĩa

thống kê so với cá đối chứng Kết quả của Ardó et al., (2008) cho thấy trộn chiết chất từ cây Hoàng kỳ (Astragalus radix) và Kim ngân (Lonicera

japonica) vào thức ăn có thể tăng cường hệ miễn dịch cá chép và cá rô phi

(Oreochromis niloticus) chống lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila Theo Yin et al., (2006) khi bổ sung 0,1-0,5% Hoàng kỳ (Astragalus radix) vào thức

ăn làm tăng hàm lượng lysozyme của cá rô phi sau 1 tuần và hoạt động thực

bào của tế bào thực bào tăng sau 3 tuần Cũng trên cá Rô phi, Pachanawan et

al., (2008) chứng minh có thể sử dụng lá ổi (Psidium guajava) để kiểm soát

bệnh do Aeromonas hydrophila gây ra Chiết chất từ cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) có thể kiểm soát được bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá Trê trắng (Clarias batrachus) (Balasundaram và Harikrishnan, 2009).Zheng et al., (2009) chứng minh khi thêm tinh dầu cây lá thơm (Origanum heracleoticum) vào khẩu phần thức ăn

cá nheo (Ictalurus punctatus) bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh xuất huyết (Aeromonas hydrophila) thì cá vẫn tăng trưởng khác biệt có ý nghĩa

(P<0,005) so với đối chứng Chức năng gan và các cơ quan nội tạng được cải thiện và hoạt động chống oxy hóa của cá cũng tăng lên

Nhìn chung, trên thế giới đã quan tâm tới vấn đề hiệu quả sử dụng thảo dược về khía cạnh kháng khuẩn trên các đối tượng thủy sản nhằm phòng và trị bệnh Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu còn hạn chế ở quy mô phòng thí nghiệm, các sản phẩm ra đời trên thị trường từ các kết quả nghiên cứu hiện nay còn hạn chế

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong nước

Cũng như nhiều nước trên thế giới có nghề NTTS, Việt Nam cũng đang đối mặt với những ảnh hưởng lớn của dư lượng hóa chất, kháng sinh sử dụng tồn đọng trong sản phẩm thủy sản gây độc cho sức khỏe con người, vật nuôi đồng thời tác động xấu đến môi trường sinh thái

Để khắc phục tình trạng lệ thuộc vào hóa chất, kháng sinh trong phòng trị bệnh cho động vật thủy sản nuôi, đảm bảo nguồn thực phẩm an toàn cho người tiêu dùng, thời gian qua đã có không ít những nghiên cứu sử dụng thảo dược trong phòng trị bệnh thủy sản Một số loài thảo dược đã được đưa vào nghiên cứu: tỏi, lá xoan, lá ổi, lá hẹ,… Đối tượng nuôi được nghiên cứu bao gồm cả các loài nước mặn và nước ngọt như cá chép, cá trắm cỏ, cá rô phi, cá song [32]

Việc sử dụng các loài cây quen thuộc trong vườn để trị các bệnh thông thường như đường ruột, bệnh đường hô hấp, mụn nhọt, vết thương… cho người đã có từ xa xưa Nó đã khẳng định các loại cây có thể sử dụng trong phòng và trị bệnh nuôi trồng thủy sản

Theo y học cổ truyền, phần lớn những cây thuốc có tác dụng chữa bệnh nhiễm khuẩn đã được xếp trong nhóm thuốc thanh nhiệt giải độc, táo thấp, thuốc khử hàn, như alicin trong tỏi, odorin trong hẹ, Từ thế kỷ XIV, Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mộc như tỏi, hẹ, tô mộc, hạt cải, trầu không để trị một số bệnh viêm nhiễm [24]

Từ giữa thế kỉ XX, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Ngữ (1956) trên 500 loài cây thuốc, đã khẳng định rằng nhiều cây có tác dụng kháng

khuẩn rất lớn Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Hưởng và cộng sự (1959), trên 1000 cây thuốc, chỉ ra rằng kháng sinh thực vật sử dụng rất an toàn, có tác dụng mạnh, nhóm nghiên cứu đã đưa ra chế phẩm cây tô mộc trị bệnh tiêu chảy

* Sử dụng thảo dược dạng dịch ép

Ở miền Nam, các cây cỏ được dùng trong phòng trị bệnh cho vật nuôi thủy sản chủ yếu từ kinh nghiệm dân gian: Khu vực nuôi cá bè ở Tân Châu - Châu Đốc - An Giang; Hồng Ngự - Đồng Tháp; Vĩnh Hưng, Tân Hưng -

Đồng Tháp Mười - Long An,… người dân đã biết dùng cây cỏ mực (Prostista

alba), dây trầu không (Piper better L.) để phòng trị bệnh ký sinh trùng cho cá;

lá ổi (Psidium guajava) chữa bệnh nhiễm khuẩn cho cá [18]

Nghiên cứu khác của Phan Xuân Thanh và ctv (2002) đã xác định được chất: 2-hydroxy-6-pentandecatrienilbenzoat có nguồn gốc từ thảo dược, có tác dụng phòng trừ các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra Nhằm mục đích sử dụng các hoạt chất sinh học thay thế các hoá chất độc và kháng sinh trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản [24]

Trong báo cáo “Sử dụng kháng sinh thảo mộc phòng và chữa trị một

số bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi động vật thuỷ sản”, Nguyễn Thị Vân Thái và ctv đã trình bày về khả năng sử dụng y dược y học cổ truyền trong phòng và chữa trị một số bệnh nhiễm khuẩn cho tôm cá, động vật thân mềm… thay thế các thuốc kháng sinh hiện đang phổ biến trên thị trường Các tác giả đã đưa ra phương pháp phòng bệnh bằng thức ăn bổ trợ có tác dụng tăng cường sức đề kháng của động vật thuỷ sản

Năm 2008, Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch ép từ lá hẹ, trầu không và đinh lăng Kết quả cho thấy Hẹ có

tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Streptococcus sp gây bệnh

trướng bụng, xuất huyết trên cá rô phi nuôi với đường kính vòng vô khuẩn đạt

>25mm với lượng sử dụng 100µl/khoanh Hiệu quả tính kháng khuẩn của hẹ giảm mạnh khi có tác động của nhiệt độ ở 1500C, đường kính vòng vô khuẩn

chỉ đạt 5mm Kết quả phòng và trị bệnh cá rô phi nhiễm khuẩn Aeromonas

hydrophila và Streptococcus sp trong quy mô phòng thí nghiệm khi sử dụng

nước ép lá hẹ trộn vào thức ăn viên đạt được tỷ lệ sống 50% so với lô thí nghiệm đối chứng Ngoài ra, hẹ còn có tính diệt nấm ở nồng độ 15.000ppm trong 6h và ở 13.000ppm ở 24h Riêng đối với đinh lăng, chè xanh kết quả

cho thấy chúng không có tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila và

Streptococcus sp gây bệnh trướng bụng, xuất huyết trên cá rô phi nuôi với

lượng sử dụng 250µl/khoanh, trầu không có tính kháng vi khuẩn Aeromonas

hydrophila và Streptococcus sp nhưng ở mức độ kém với đường kính vòng vô

khuẩn đạt 10mm ở lượng sử dụng 250µl/khoanh [12]

Năm 2011 là nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu, Đại học Cần Thơ về khả năng kháng khuẩn của cỏ mực thu tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long cho thấy chúng có khả năng kháng khuẩn tương đối tốt đối với một số chủng

vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản, trong đó điển hình nhất là

Edwardsiella tarda, riêng đối với loài Streptococcus faecalis mức độ kháng

khuẩn chỉ ở mức trung bình [6]

* Sử dụng thảo dược dạng dịch chiết

Trong công trình nghiên cứu của Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám có đề cập đến ý kiến của Nguyễn Ngọc Hạnh và cộng sự về nghiên cứu thử nghiệm thành công các hợp chất chiết xuất từ thảo dược, như Hepato và Alixin có tác dụng hỗ trợ tiêu hoá tốt, giúp tôm khoẻ mạnh, sinh trưởng bình thường, có khả năng chống nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về gan Trong đó Hepato có công dụng hỗ trợ và bảo vệ gan phòng và trị bệnh về gan như MBV và teo gan [19]

Trong một nghiên cứu vào năm 2006, Nguyễn Viết Khuê và ctv cho thấy trong số những người được phỏng vấn có 41,33% người nuôi sử dụng

thảo dược, phổ biến là tỏi và lá xoan, 15% dùng không hiệu quả, 85% đạt hiệu quả từ ít đến nhiều Việc nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong thảo mộc là cơ sở nghiên cứu cho ra các sản phẩm thuốc ứng dụng phòng trị bệnh động vật thuỷ sản nói riêng

Nguyễn Ngọc Phước và ctv (2007) đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu không để trị bệnh do nấm gây ra trên đối tượng nuôi động vật thuỷ sản Bước đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm Nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết lá trầu với cả hai loại dung môi là nước cất và ethanol đối

với họ nấm Saproleginaceae và nấm Achlya sp là 2.500ppm; 1.250ppm đối với chủng Aphanomyces piscicida Ở nồng độ cao nhất 10.000ppm, dịch chiết

lá trầu có thể tiêu diệt được 5 chủng nấm thí nghiệm Saprolegnia dicilina;

Saprolegnia diclina; Saprolenia parasitica; Achlya sp; và Aphanomyces piscicida [20] Cũng tại đại học Huế mọt nhóm tác giả khác có nghiên cứu và

cho kết luận rằng tỏi và lá trầu không là hai loại thảo dược có khả năng diệt

khuẩn rất tốt đối với A.hydrophyla gây bệnh lở loét cho cá trắm cỏ [17]

Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013 Nghiên cứu tác dụng diệt

khuẩn in vitro của dịch chiết tỏi (Allium sativumL.) đối với E coli gây bệnh

và E coli kháng ampicillin, kanamycin kết quả thử nghiệm dung môi Ethanol, Methanol chiết xuất dịch tỏi và xác định khả năng kháng khuẩn với E.coli O44

kết quả cho thấy đường kính vòng vô khuẩn đạt lần lượt 19,1 mm và 19,7mm, sai khác không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 [10]

* Sử dụng thảo dược đã được chế biến thành thuốc

Sản phẩm với tên VTS1 - C và VTS1 - T được Bùi Quang Tề và cộng

sự phối chế thành công vào năm 2005, từ các hoạt chất tách chiết từ tỏi

(Allium sativum), sài đất (Weledia calendulacea), nhọ nồi (Elista alba Hassk)

để phòng trị bệnh cho tôm Sú và cá tra nuôi ao và nuôi lồng để phòng trị một

số bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda, Hafnia

alvei, Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus Với VTS1 - C gồm 30% cao dầu

tỏi và 70% cao dầu sài đất dùng cho cá Tra và cá Basa[23]

Ở miền Bắc, thuốc KN 04 - 12 là sản phẩm phối chế của đề tài cấp nhà nước mã số KN 04 -12 năm 1990 - 1995 do Hà Ký làm chủ nhiệm Thành phần thuốc bao gồm các cây thuốc có kháng sinh thực vật, gồm: rau nghể

(Polygonum hydropiper L.); rau sam (Portulaca cleracae L.); cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L.); cỏ sữa lá nhỏ (Euphobia thymifolis); sài đất (Wedelia

calendulacae); nhọ nồi (Eclipta alba Hassk); bồ công anh (Lactuca indica

L.); cây vòi voi (Heliotrpium indicum L.); chó đẻ răng cưa (Phyllantus

urinaria L.) và vitamin cùng một số vi lượng khác Thuốc có tác dụng phòng

và trị bệnh nhiễm khuẩn như đốm đỏ, thối mang, viêm ruột của cá nuôi lồng hay nuôi ao [12]

Từ những nghiên cứu thử nghiệm thảo dược ở các dạng khác nhau, đã

có một số loại thảo dược ứng dụng vào sản xuất và tiêu thụ trên thị trường, phục vụ nhu cầu phòng trị bệnh cho các đối tượng thủy sản điển hình như: Thuốc KN-04-12 là sản phẩm phối chế của đề tài cấp nhà nước mã số KN-04-

12 năm 1990-1995[16]

Năm 2006, Thuốc BecaNor 1 và BecaNor 2 là 2 sản phẩm với thành phần chính là tỏi và gừng bước đầu đã có hiệu quả rất tốt trong việc phòng và trị bệnh đốm đỏ ở qui mô phòng thí nghiệm và thử nghiệm ngoài thực địa tại

3 tỉnh Quảng Ninh, Nam Định, Hà Giang phòng bệnh cho cá trắm cỏ bước đầu cho kết quả tốt

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh lở loét trên cá trê lai được thu và

giữ tại phòng thí nghiệm vi sinh bệnh học thủy sản khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Củ tỏi (Allium sativum L)

- Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus amarus Schum.et Thonn)

- Cá trê lai với kích thước trung bình của chiều dài thân 8 - 13 cm, nặng

9 - 12 g/cá thể

- Dụng cụ phân tích vi khuẩn: Ống nghiệm vô trùng các loại, đĩa peptri, que cấy vô trùng, đèn cồn, lamen, lam, pipet, kẹp gắp, dầu soi kính, tủ lạnh, kính hiển vi, nước muối sinh lý, nước cất, kim tiêm,…

- Hoá chất: Cồn, thuốc thử, thuốc nhuộm Gram

- Môi trường nuôi cấy cơ bản NA (Nutrient Agar)

- Dụng cụ lấy dịch chiết thảo dược: Máy xay, chai lọ, giấy lọc

- Đĩa giấy tẩm nước ép thảo dược đường kính 6mm

- Dao, kéo, panh, găng tay…

- Thùng xốp, máy sục khí, dây sục khí, đá bọt

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu dịch chiết thảo dược

+ Đối với củ tỏi: Bóc vỏ lụa, lấy các ánh tỏi và nghiền trong các dung môi hữu cơ theo tỷ lệ 1:1 (1g tỏi: 1ml dung môi), dịch này được bảo quản 2 giờ

ở nhiệt độ phòng, lọc qua gạc Dung dịch chiết được siêu âm trong 30 phút ở điều kiện lạnh Tiếp tục li tâm với tốc độ 3500 vòng/phút trong 20 phút Hút lấy dịch trong, mang đi cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi Dịch chiết đã được loại bỏ dung môi được bảo quản trong tủ mát 4o

C

+ Đối với lá cây chó đẻ răng cưa cần rửa sạch, để khô tự nhiên sau đó cũng nghiền nát riêng các loại lá này trong các dung môi hữu cơ theo tỷ lệ 1:1 sau đó làm tương tự như đối với thu dịch chiết củ tỏi

Đánh giá ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược với vi khuẩn Streptococus spp

Dịch chiết thảo dược với loại dung môi có khả năng kháng khuẩn cao nhất

Thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét do vi khuẩn Streptococus spp gây ra trên cá trê lai

Kết luận

2.3.2 Phương pháp định lượng mật độ vi khuẩn

Chuẩn bị một số ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý

Lấy 1ml mẫu nước cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiêm thứ nhất làm đồng đều ta được độ pha loãng 10 lần (10-1

)

Lấy 1ml nước ở ống nghiệm 10-1

cho vào ống nghiệm thứ 2, ta được độ pha loãng 100 lần (10-2

)

Cứ làm như vậy ta được độ pha loãng tiếp theo: 10-3

, 10-4, …,10-n

Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2 - 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt Mỗi độ pha loãng nuôi cấy từ 2 - 3 đĩa lồng

Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng

Hình 2.2 Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn

Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: X =

K V

A

.

Nước muối sinh lý

Vi khuẩn gốc 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Đọc kết quả, đo đường kính vòng kháng khuẩn sau 24h

+ Đường kính vòng kháng khuẩn >20 mm là vi khuẩn có tính mẫn cảm cao

+ Đường kính vòng kháng khuẩn từ 11 - 20 mm là vi khuẩn có tính mẫn cảm trung bình

+ Đường kính vòng kháng khuẩn <11 mm là vi khuẩn có tính mẫn cảm kém

+ Đường kính vòng kháng khuẩn = 0 là vi khuẩn không có tính mẫn cảm