Nghiên cứu, xác định hàm lượng vitamin d trong nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng d

VÕ QUỐC OAI

1.1 NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Mai Thị Thanh Huyền

Vinh, 2014

Lêi c¶m ¬n

Lu n v n ư c th c hi n t i ph ng th nghi m chuy n ề

H a ph n t ch - Khoa H a học - trường Đ i học Vinh

Tác giả xin y t l ng i t n ch n th nh v s u s c tới Trường Đ i học Vinh ph ng o t o sau i học Trung T m

Th c H nh th nghi m trường Đ i học Vinh trường THPT Mai Thúc Loan v các ồng nghi p nh m cộng tác nghi n cứu - phân tích vitamin D trong nấm

Đặc i t tác giả gửi lời cảm n ch n th nh s u s c tới

TS Mai Thị Thanh Huyền ã tr c ti p hướng dẫn giúp ỡ

với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triển khai nghi n cứu v ho n th nh ề t i

Tác giả rất mong nh n ư c s ng g p ph ình của quý thầy cô các nh khoa học ọc giả v các n ồng nghi p

MỤC LỤC

1.1 Vitamin D 8

1.1.1 Giới thi u cấu t o ph n lo i v t n gọi 8

1.1.2 Vai trò của vitamin D ối với c thể 9

1.1.3 Nguồn cung cấp vitamin D cho c thể 11

1.2 Các phư ng pháp xác ịnh vitamin D 13

1.2.1 Phư ng pháp thử nghi m sinh học [28] [34] 13

1.2.2 Phư ng pháp quang ph 14

1.2.3 ác phư ng pháp xét nghi m miễn dịch 15

1.2.4 Phư ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPL ) 18

1.3 T ng quan nghi n cứu xác ịnh vitamin D trong nấm 21

1.4 Đánh giá l a chọn phư ng pháp 26

1.5 S lư c về lý thuy t HPL 27

1.5.1 Giới thi u 27

1.5.2 C ch của quá trình tách trong HPL 29

1.5.3 Nguy n lý ho t ộng của h thống HPL 29

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 31 2.1 H a chất thi t ị v d ng c 31

2.1.1 H a chất 31

2.1.2 Thi t ị v d ng c 31

2.2 Thu th p v ảo quản mẫu 32

2.3 Xử lý mẫu 33

2.4 huẩn ị dung dịch vitamin D2 cho phép o HPL 34

2.5 L a chọn v c i ặt v n h nh thi t ị HPL 35

2.6 huẩn ị máy trước khi ti n h nh ph n t ch 35

2.7 Khảo sát ph hấp th tia UV của vitamin D2 trong dung dịch 36

2.7.1 Nghi n cứu ảnh hưởng của th nh phần pha ộng 36

2.7.2 Nghi n cứu ảnh hưởng của nhi t ộ 36

2.8 X y d ng ường chuẩn xác ịnh h m lư ng vitamin D trong dung dịch 36

2.9 Phư ng pháp khảo sát ánh giá 36

2.9.1 Khoảng tuy n t nh v ường chuẩn ịnh lư ng của phư ng pháp 36

2.9.2 Khảo sát ộ lặp l i 37

2.9.3 Khảo sát giới h n phát hi n (LOD) v giới h n ịnh lư ng (LOQ) của phư ng pháp 38

2.9.4 Xác ịnh hi u suất thu hồi 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Khảo sát phư ng pháp o 39

3.1.1 Khảo sát ph hấp th tia UV của vitamin D2 trong dung dịch 39

3.1.2 Nghi n cứu ảnh hưởng của th nh phần pha ộng 39

3.1.3 Nghi n cứu ảnh hưởng của tốc ộ d ng 41

3.1.4 Nghi n cứu ảnh hưởng của nhi t ộ 42

3.1.5 K t quả khảo sát phư ng pháp o 43

3.2 Xác ịnh khoảng tuy n t nh v ường chuẩn của vitamin D2 43

3.3 Khảo sát ộ lặp l i của máy 49

3.4 Xác ịnh giới h n phát hi n giới h n ịnh lư ng của phư ng pháp 51

3.4.1 Giới h n phát hi n (LOD) 51

3.4.2 Giới h n ịnh lư ng(LOQ) 52

3.5 Xác ịnh ộ l ch chuẩn (SD) v ộ l ch chuẩn tư ng ối RSD( ) của phép phân tích vitamin D2 tr n mẫu nấm 52

3.6 Xác ịnh hi u xuất thu hồi 53

3.7 K t quả ph n t ch một số mẫu nấm 54

Hệ thống các kí hiệu viết tắt

25(OH)D : 25-hydroxyl vitamin D

25(OH)D2 : 25-hydroxyl vitamin D2

25(OH)D3 : 25-hydroxyl vitamin D3

BHT : butylate hydroxytoluen

BSTFA :N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

DM : Chất khô (dry matter)

ECLIA : Ph n t ch miễn dịch quang h a

(electro chemiluminescence immunoassay )

EtOH : Etanol

FTIR : Phép phân tích Fourier hồng ngo i (Fourier transform infrared)

HPLC : S c ký l ng hi u n ng cao

IT : Bẫy ion ( Ion trap)

IS :Chất nội chuẩn (internal standard)

LC : S c k l ng (Liquid chromatography)

MeOH : Metanol

MS : Ph khối (Mass spectrometry)

MTBE : Methyl-tert-butyl ether

DAD : Đầu d mảng diot

RMSE : Độ l ch khởi ộng (root mean square error)

MỞ ĐẦU

1 L d chọn ề t i

Vitamin D hay c n gọi l vitamin mặt trời l một lo i vitamin khá ặc i t

so với những lo i khác Vitamin D c vai tr quan trọng với ời sống của con người như n ng vai tr quan trọng trong s phát triển ho n thi n duy trì s

n ịnh của xư ng r ng n tham gia v o iều h a chức n ng của một số gen ngo i ra c n tham gia một số chức n ng như: i ti t của insulin hormon c n giáp h miễn dịch phát triển h sinh sản v da ở nữ giới Một số nghi n cứu mới cho thấy thi u vitamin D thai ph c thể sinh con nhẹ c n cùng s t ng trưởng ch m của trẻ ch o ời ủ tháng [14],[22] Tình tr ng thi u vitamin D

tr n th giới cũng như các nước nhi t ới rất nghi m trọng [24] Theo một số nghi n cứu tình hình thi u vitamin D tr n th giới l 40-50 ở Thái lan v Malayxia 50 Nh t v H n Quốc 80-90 nước c Âu v c Mỹ khoảng 50-70% và 63% ở ph nữ châu Á Ở Vi t Nam theo một số nghi n cứu mới nhất về tình tr ng thi u dinh dưỡng của học sinh tiểu học thì h n 50 học sinh tiểu học thi u h t vitamin D

Để nh n ủ vitamin D thì ngo i vi c cho c thể ti p xúc với ánh n ng c

l i cho c thể thường xuy n thì cần thi t phải sung th m nguồn vitamin D từ nguồn th c phẩm n uống h ng ng y Nấm l l một trong những nguồn th c phẩm gi u vitamin D2 v dinh dưỡng c vai tr quan trọng trong x y d ng khẩu phần vitamin D2 h ng ng y Tuy nhi n nguồn nấm tr n thị trường rất a

d ng về chủng lo i v nguồn gốc, nhiều lo i nấm không rõ nguồn gốc không

ảm ảo chất lư ng tr n lan tr n thị trường H n nữa những ánh giá về giá trị dinh dưỡng chung cũng như h m lư ng vitamin D của các lo i nấm tr n ịa

n Ngh n H T nh ang c n h n ch

Vì v y vi c ph n t ch h m lư ng vitamin D2 trong nấm l cần thi t vừa ể

x y d ng một quy trình ịnh lư ng chúng trong nấm vừa ể g p phần ánh giá

h m lư ng vitamin D2 c trong nấm g p phần x y d ng ảng th nh phần dinh

dưỡng th c phẩm ịa phư ng

nhiều phư ng pháp k thu t ánh giá h m lư ng vitamin D trong th c

phẩm trong phư ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao cho phép ph n t ch với

ộ nh y v ộ chọn lọc cao

Từ những k t quả nghi n cứu về vitamin D n i chung v vitamin D2 trong

nấm n i ri ng cũng như tr n iều ki n s n c của ph ng th nghi m với mong

muốn x y d ng một phư ng pháp ph n t ch phù h p v quy trình xử lý mẫu

hi u quả tr n ối tư ng nấm ể ph n t ch vitamin D tôi ã chọn ề t i

“ NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HI U N NG C O(HPLC)”

2 Mục ích nghiên cứu

X y d ng quy trình ph n t ch vitamin D2 ng phư ng pháp s c ký l ng

hi u n ng cao HPL từ xác ịnh h m lư ng của chúng trong một số mẫu

nấm

3 Mục tiêu nghiên cứu

+ Thi t l p ư c phư ng pháp ph n t ch ảm ảo ộ ch nh xác ộ hội t

ộ nh y cao xác ịnh ư c LOD v LOQ của phư ng pháp

p d ng phư ng pháp ể khảo sát xác ịnh h m lư ng vitamin D2

trong một số lo i nấm trước v sau khi chi u x ng tia UV

4 Đối tƣ ng v h vi nghiên cứu

ác mẫu nấm ư c thu th p ở các ch tr n ịa n th nh phố Vinh H

T nh v một số lo i nấm t nhiên ở vườn quốc gia Pù Mát

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.2 Vitamin D

1.2.1 Gi i thiệu, cấu t , h n i v tên gọi

Vitamin l nh m chất cần thi t cho ho t ộng sống của ất kỳ c thể n o

v chúng c khả n ng ở nồng ộ thấp ho n th nh chức n ng xúc tác ở c thể sinh v t Vitamin D ư c x p trong nh m vitamin h a tan trong dầu éo cùng với vitamin A, vitamin E, vitamin K Vitamin D ư c phát hi n n m 1922

da ư c ti p xúc với tia UV (c trong ánh n ng mặt trời) vì th n c n ư c

m nh danh l "vitamin ánh n ng" [18]

Mặc dù vitamin D thường ư c gọi l một vitamin nhưng theo ngh a hẹp thì n không phải l một vitamin thi t y u trong ch ộ n ởi vì hầu h t ộng

v t c vú trong t nhi n ều c thể t t ng h p ủ cho c thể khi ti p xúc h p

lý với tia n ng mặt trời

Hình 1.1 Khái quát về cấu trúc v sự chuyển hóa các d ng vitamin D

1.2.2 Vai trò của vitamin D ối v i cơ thể

Vitamin D ng vai tr quan trọng trong s phát triển của xư ng Vitamin

D c vai tr quan trọng với s hấp th canxi ở ruột m canxi rất cần thi t cho

ho t ộng của tim c p v thần kinh l th nh phần chủ y u cấu t o n n

xư ng v r ng ồng thời cũng không thể thi u ể tham gia v o quá trình ông máu Trẻ em khi thi u canxi sẽ ch m lớn lùn c i xư ng xư ng i n d ng

r ng không ều r ng dị hình chất lư ng r ng kém v ị s u [15], [21] Người lớn thi u vitamin D c thể dẫn n nh loãng xư ng [21]

Một lư ng nh vitamin D mỗi ng y l m giảm nguy c m c nh cao huy t áp, vitamin D giúp l m t ng khả n ng miễn dịch, ngừa một số nh ung

thư ph i n l m ch m quá trình phát triển ung thư ặc i t l ung thư gan, ung thư i tr c tràng [10], [12], [19]

Thi u vitamin D trong thai kì c thể sinh con nhẹ c n ặc i t n u thi u vitamin D trong 3 tháng ầu thai kì, con sinh ra ị h n ch t ng trưởng gấp ôi

s thi u vitamin D trong thai kì g y ra những t n thư ng não không thể ph c hồi [30] Trẻ em n u không ư c cung cấp ủ vitamin D sẽ ảnh hưởng n s phát triển của xư ng do chất xư ng v s n không ư c vôi h a ầy ủ s n phát triển không ình thường l m xư ng i n d ng [30] ác tri u chứng cho

i t trẻ thi u vitamin D: Thần kinh ị k ch th ch (quấy kh c ngủ không y n giấc hay gi t mình nhất l trẻ dưới 3 tháng) hay mồ hôi trộm cả lúc trời

l nh co gi t khi sốt cao c thể c c n kh thở với ti ng thở r t Nặng h n nữa trẻ sẽ y u c v c s i n i ở xư ng ầu lồng ng c tay ch n c - dây

ch ng v cột sống N u thi u vitamin D trẻ em sẽ ị c i xư ng; trẻ ị c i

xư ng sẽ ảnh hưởng n phát triển chiều cao v tầm v c của trẻ sau n y [10], [12], [15], [21]

Vitamin D cũng c ảnh hưởng n nồng ộ serotonin trong não g y ảnh hưởng n t m tr ng con người Serotonin c n c t n gọi l ho c môn h nh phúc suy giảm serotonin khi n t m tr ng uồn chán hoặc dễ cáu gi n không thể kiểm soát ư c c n ốc ồng do thi u vitamin D kéo d i dễ dẫn tới trầm cảm[40] Do t ti p xúc với ánh n ng mặt trời chúng ta dễ ị thi u h t vitamin quan trọng n y dù c n ch ộ l nh m nh v t p thể d c ều ặn [11] , [12]

Thi u vitamin D l nh ặc hữu d nh cho người lớn Một số lư ng lớn các trẻ em v thanh thi u ni n kh e m nh cũng thi u h t vitamin D [20], [36] Một nghi n cứu d a tr n d n số của 2.972 ph nữ ộ tu i sinh ẻ Mỹ tìm thấy

42 ph nữ Mỹ gốc Phi ở Mỹ c mức 25(OH)D < 15 ng/ml v 12 c mức

<10ng/ml (1 ng/ml tư ng ư ng với 2 5 nmol/l) [30]

Theo các nghi n cứu cho thấy h m lư ng lý tưởng 25(OH)D trong máu cần thi t ể ng n ngừa nh c i xư ng v loãng xư ng l 15 ng/ml,mức cần thi t ể tối ưu h a s hấp thu canxi ở ruột l 34 ng/ml Gần y ã phát hi n ra

r ng h m lư ng trung bình 29-38 ng/ml có thể ảnh hưởng n vi c giảm áng

kể tỷ l m c nh ung thư nội t ng v tr n 33ng/ml sẽ giảm 50% nguy c ung thư i tr ng v ở mức ộ 52 ng/ml l m giảm 50 nguy c ung thư vú [11], [12]

1.2.3 Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể

thể người c thể nh n ư c vitamin D trong 3 cách: qua da ch ộ n uống v sung ng thuốc

lẽ vì vitamin D mang ngh a của từ 'vitamin' hầu h t mọi người hiểu sai về n cũng giống như các vitamin khác c ngh a l họ c thể c ư c

lư ng ầy ủ ng cách n một ch ộ n uống tốt Tuy nhi n hầu h t ch ộ

n uống t nhi n con người c chứa t vitamin D trừ khi những ch ộ n gi u nguồn gốc hoang dã cá éo Một lư ng nh vitamin D có trong th c phẩm

t ng cường sung như sữa nước cam v các lo i ngũ cốc t i Mỹ v th c

v t ở ch u Âu nhưng các nguồn cung như v y thường l những nguồn ng

g p nh cho nguồn vitamin D c thể Theo truyền thống nguồn vitamin D con người t ầu từ da không phải t nguồn từ mi ng [23], [30]

S t ng h p vitamin D của da xảy rất nhanh ch ng v m nh mẽ quá trình

t ng h p diễn ra dễ d ng chỉ sau một v i phút ư c ti p xúc với ánh n ng mặt trời Ti p xúc với ánh n ng mặt trời chứ không phải ch ộ n uống l nguồn cung cấp ch nh vitamin D cho c thể cho d trữ v tuần ho n c thể xem y

l một chức n ng của phần ề mặt da hở [24] Nguồn cung cấp vitamin D qua

da giúp cung cấp 80-85 nhu cầu vitamin D của c thể Dưới tác d ng của tia

c c t m các tiền chất vitamin D c ở tuy n ã v lớp Malpighi của iểu ì sẽ

ư c chuyển th nh vitamin D N u ư c ph i n ng ầy ủ sau 3 giờ 1cm2

da

c thể sản xuất ra 18UI vitamin D3 [11], [16], [18], [23], [24]

V d khi người c l n da ư c t m n ng v o mùa hè ( to n th n, liều tối thiểu UVB) mỗi c thể sản xuất ~ 20.000 IU vitamin D trong <30 phút [25]

Để t ư c iều n y tư ng ư ng với con người sẽ phải uống 200 ly sữa (100 IU/8 oz thủy tinh) hoặc dùng 50 vi n vitamin t ng h p ti u chuẩn (400 IU/vi n) trong một lần

Nguồn cung cấp t nhi n vitamin D khác l qua thức n vitamin D có trong nguồn th c phẩm từ ộng v t (D3 )v th c v t (D2) c nhiều trong các

th c phẩm như dầu gan cá thu dầu dừa l ng trứng sữa ộng v t [24]

Dữ li u về th nh phần th c phẩm hi n nay cho thấy nấm l một nguồn cung cấp vitamin D tốt ngo i các nguồn từ ộng v t như trứng sữa thịt cá Vitanmin D ư c ảo to n tốt trong quá trình nấu n [29]

ác áo cáo về nấm của một số nước tr n th giới cho thấy h m lư ng vitamin D trong nấm t nhi n ở trong khoảng 2 – 40 µg/100g c thể áp ứng

ủ nhu cầu vitamin D trong một ng y của c thể người v thay th nguồn vitamin D từ các sản phẩm từ ộng v t ặc i t ối với người n chay [39] Khi sung vitamin D cho c thể cũng n n phối h p sung canxi cho

c thể ể t ng hi u quả sử d ng với c thể [10], [12], [31]

Lư ng vitamin D c thể cần mỗi ng y ph thuộc v o tu i của mỗi người Trung ình lư ng khuy n cáo h ng ng y từ t chức Food and Nutrition Board cho các lứa tu i khác nhau ư c li t k dưới y n vị quốc t (IU) ảng 1.1

Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D i ng y của các ứa tuổi [17]

Stt Lứa tu i Liều lư ng (IU)

Khuy n cáo-tối a

Liều lư ng ( g) Khuy n cáo-tối a

1.3.1 Phương há thử nghiệ sinh học [28], [34]

Phư ng pháp ch nh thức ầu ti n ể xác ịnh vitamin D là phư ng pháp thử nghi m sinh học trong ho t t nh sinh học của vitamin D ư c xác ịnh

ng khả n ng của n ng n ngừa hoặc cải thi n các tri u chứng thi u h t vitamin D trong c thể

B ng cách o khả n ng ho t ộng chống c i xư ng v d như thử nghi m

tr n lo i chuột (kiểm tra iểm vôi h a hoặc kiểm tra chữa nh c i xư ng) ã

từ l u ư c sử d ng ể xác ịnh vitamin D trong th c phẩm hoặc các dư c phẩm

huột c i xư ng ư c cho n ng thức n c chứa một lư ng khác nhau của vitamin D ã ư c thi t l p theo các ịnh mức ti u chuẩn Sau ảy ng y

xư ng của những con chuột ư c xử lý ng dung dịch nitrat c Lư ng canxi

mới ư c chuyển v o xư ng ư c iểu hi n th nh v t tối tr n ảnh ch p Thang

ti u chuẩn ư c thi t l p ng cách x y d ng mối li n h giữa các vùng tối tr n

xư ng với lư ng vitamin D trong ch ộ n uống (cho g con mới sinh thức n sung c chứa h m lư ng khác nhau của vitamin D) H m lư ng vitamin D trong mẫu sau ư c xác ịnh ng cách so sánh với khu v c mờ tối của chất chuẩn từ xác ịnh tỷ l tro xư ng sau a tuần với mỗi ch ộ n uống

ác thử nghi m sinh học hấp thu canxi ở ruột khác ao gồm tr n c thể v trong ống nghi m cũng ã ư c nghi n cứu ng cách iều tra khả n ng của các h p chất thử nghi m ể k ch th ch s hấp thu canxi ở ruột non Trong các

thử nghi m 45

Ca2 + ư c sử d ng ể gián ti p ịnh lư ng h m lư ng vitamin D

ác sinh tr c nghi m c thể phát hi n vitamin D ở nồng ộ rất thấp V

d kiểm tra tr n d ng chuột c thể phát hi n h m lư ng thấp tới 12 ng vitamin

D Tuy nhiên như c iểm của phư ng pháp l không ph n i t giữa các d ng khác nhau của vitamin D i h i thời gian chuẩn ị l u d i ộ tin c y thấp so với các phư ng pháp khác

1.3.2 Phương há quang hổ

Ph hồng ngo i ã ư c sử d ng ể ph n t ch ịnh lư ng của vitamin D Trong các pha r n vitamin D2 c thể ư c ph n i t với vitamin D3 d a v o ỉnh ph vitamin D2 t i 907 cm-1 [34]

Ph FTIR ặc trưng của tinh thể vitamin D2 và D3 cũng ã ư c mô tả Không c phư ng pháp lu n ư c ưa ra trong quá trình ịnh lư ng vitamin D

ng cách sử d ng ph dao ộng Lý do c thể l do giới h n phát hi n của phư ng pháp n y li n quan n nồng ộ vitamin D thường thấp trong th c phẩm Vitamin D c thể ư c ịnh lư ng ng cách o s hấp th tia c c t m tối a ở 264 nm H n ch của phư ng pháp n y l các h p chất hấp th tia c c

t m khác trong mẫu o sẽ can thi p v o k t quả ịnh lư ng vitamin D [34]

1.3.3 Các phương há xét nghiệm miễn dịch

Phư ng pháp miễn dịch phóng x RI (Radioimunoassay) do Yalow và Berson (giải No el) ề xuất 1960 Phư ng pháp n y c thể phát hi n v t chất

hi n ở nồng ộ < 0,001 μg/ml [44]

N m 2013 Wendy L rneson v công s ã ề c p n các phư ng pháp

hi n t i ư c dùng rộng rãi ể ánh giá h m lư ng vitamin D trong lâm sàng

ng cách o lư ng 25(OH)D v các d ng chuyển h a hydroxyl vitamin D khác trong huy t thanh người [44] Trong i áo n y tác giả c ánh giá về các phư ng pháp thường dùng ph i n nhất ể ịnh lư ng vitamin D l phư ng pháp RI phư ng pháp L -MS/MS v phư ng pháp HPLC Tác giả

ã mô tả khá ầy ủ về quy trình th c hi n phư ng pháp xét nghi m miễn dịch

v n u ra một số phư ng pháp xét nghi m miễn dịch ể ịnh lư ng vitamin D

ư c FD chấp thu n hi n c gồm phư ng pháp xét nghi m miễn dịch quang

h a học (E LI ) phư ng pháp RI Quy trình th c hi n như sau: Bước thứ nhất 25(OH)D ư c tách ra từ d ng li n k t với protein v g n v o kháng thể pha r n ặc i t sau th m vitamin D-isoluminol ánh dấu th nh phần không li n k t ư c lấy ra ng cách rửa sau th m thuốc thử ể xảy ra phản ứng quang h a T n hi u ánh sáng ư c phát hi n c s tỉ l nghịch với nồng

ộ 25(OH)D

Ph ng th nghi m ott cung cấp một cách ho n thi n phư ng pháp trên nền tảng ph n t ch miễn dịch t ộng xác ịnh h m lư ng 25(OH)D – phư ng pháp miễn dịch quang hoá học vi ph n tử ( MI ) Phư ng pháp n y ư c

FD chấp thu n n m 2011

Công ty Immuno Diagnostics cung cấp một phư ng pháp t ộng ph n

t ch miễn dịch CMIA, IDS-ISYS ể ịnh lư ng h m lư ng t ng 25(OH)D v

d ng hydroxyl chuyển h a khác của vitamin D trong huy t thanh hoặc huy t

tư ng người Báo cáo cho thấy c mối quan h ặc i t giữa 25(OH)D3 và D2

v ộ nh y của phư ng pháp l 5,5 ng/ml

Phư ng pháp quang h a (E L) ư c cấp ng sáng ch ởi F

Hoffman-La Roche AG (Basel, Switzerland) ư c ch o h ng thư ng m i phân tích vitamin D Test c s n ể sử d ng cho tất cả các nền tảng ph n t ch mô un Roche cobas, n ã ư c hi u nh ởi FD trong tháng 7/2012

Phư ng pháp miễn dịch enzyme cũng ư c sử d ng ể ph n t ch vitamin

D Vitamin D cho li n k t với protein ồng nhất từ o lường h m lư ng

th c t ng cộng 25(OH)D ác t h p li n k t protein - vitamin D c thể nh n

di n vitamin D2 và D3 v cũng xác nh n h m lư ng t ng cộng 25-hydroxy D một cách ch nh xác

Một phư ng pháp xét nghi m miễn dịch c s n tr n nền tảng DVI entaur phát triển ởi nh khoa học người Đức Siemens A.G Trong phư ng pháp n y t ng số Vitamin D ư c ph n t ch ng một ph n t ch miễn dịch

c nh tranh ồng nhất trong các n vị ức x ư c phát hi n ng một thi t

ị ầu cuối

Một công trình nghi n cứu của Lena Jafri v nh m cộng s [45] ã ánh giá hi u suất của các phư ng pháp miễn dịch ph ng x (RI ) với HPLC và phư ng pháp miễn dịch quang h a học (E LI ) cho vi c ịnh lư ng 25(OH)D

tr n ối tư ng huy t thanh người Trong nghi n cứu n y ối với phư ng pháp RIA: sử d ng một ống p ph ng x gama a n ng Genesys ư c sử d ng ể ghi l i s phát x của các ph n tử ph n t ch 25(OH)D ư c th c hi n ng cách sử d ng kit thư ng m i 25(OH)D 125

I RIA Giới h n phát hi n dưới của thử nghi m l 1 5 ng/ml, giới h n phát hi n tr n l 100 ng/mL và CV của phư ng pháp l 11 Đối với phư ng pháp HPL sử d ng h thống HPL Perkin Elmer series 200 ể ph n t ch các 25(OH)D huy t thanh với cột 5 μm C-18 (4,6 ×150 mm Supelco) v một ầu d mảng diode 0 5 ml mẫu huy t

thanh ư c th m v o 25 μl etanol sau khi votex v ủ trong v ng mười phút ở nhi t ộ ph ng thì th m ti p 500 μL metanol, isopropanol (90:10, v/v) v ti p

t c votex mười l m gi y Dịch thu ư c sau sung 1 5 mL n-hexane và

ti p t c votex trong sáu mư i gi y v ly t m trong a phút Lớp hexane ư c cho bay h i n khô dưới d ng kh nit ác mẫu ư c pha trong 100 ml metanol và em ph n t ch sử d ng cột -18 (4,6 ×150 mm supelco) t i tốc ộ

d ng chảy 1 75 ml/phút với pha ộng Metanol-nước (85:15, v/v) ng ầu d

UV ở 265 nm Giới h n phát hi n l 3 ng/ml trong khi khoảng tuy n tính tiêu chuẩn l 25-100 ng/ml Thời gian lưu cho 25(OH)D l 4 1 phút Với phư ng pháp E LI sử d ng máy ph n t ch xét nghi m miễn dịch Roche (Roche Modular E170) ộ kit thư ng m i d a tr n phư ng pháp E LI từ Roche Giới h n phát hi n dưới của thử nghi m l 4 0 ng/ml, giới h n phát hi n tr n l

100 ng/mL v ộ ch nh xác của thử nghi m l V = 9 9 H m lư ng trung ình 25(OH)D với HPL so với RI l 50 1 nmol/L ( khoảng tuy n t nh l 17,7-199,4 nmol/L) và 51,1nmol/L (12,5-187,2nmol/L), trong khi nồng ộ 25(OH)D trung ình với RI so với E LI l 32 4 nmol/L (9,98-199,7 nmol/L) và 29,9 nmol/L (4,9-214,6 nmol/L) Dữ li u so sánh cho HPL so với

RI cho thấy RI = -1,13 +1,01 (HPLC) (RMSE = 11,2 nmol/L) và cho RIA

so với E LI ti t lộ E LI = 3,21 +0,9 (RIA) (RMSE = 9.6 nmol/L) K t quả cho thấy c mối tư ng quan c thể chấp nh n ư c giữa HPL v RI cũng như RI v E LI trong ịnh lư ng 25(OH)D [45]

1.3.4 Phương pháp sắc k ỏng hiệu năng ca (HPLC)

Phư ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) ã ư c sử d ng rộng rãi

ể xác ịnh các vitamin tan trong chất éo từ giữa những n m 1970 v ã ư c thông qua như l phư ng pháp ch nh thức nhờ khả n ng phát hi n t nh chọn lọc cao [16].Thi t ị sử d ng ể ph n t ch vitamin D trong th c phẩm l máy

s c ký l ng cao áp sử dung h thống tách s c ký ghép nối các ầu d UV ầu

ác phư ng pháp tr n về nguy n t c ều tư ng t nhau mỗi phư ng pháp

ều thông qua 4 giai o n ch nh:

+ X ph ng h a mẫu

+ hi t mẫu ể tách các vitamin D ra kh i các nền mẫu th c phẩm

+ L m s ch tách các vitamin D kh i các th nh phần khác trong th c phẩm

+ Định lư ng ng HPL với ầu d UV

ác phư ng pháp tr n khác nhau ởi vi c l a chọn chất nội chuẩn dung môi chi t ( heptan hexane pentane hoặc ether dầu h a ) các phư ng pháp

l m s ch (các cột nhôm cyano cột pha ảo hoặc silica pha r n ) s l a chọn của cột ph n t ch (Partisil pha ảo hoặc silic) v ước s ng UV ể phát hi n (254 hoặc 265 nm.)

Phư ng pháp HPL ầu ti n ư c giới thi u ể xác ịnh vitamin D l phư ng pháp ngo i chuẩn [42] sau ư c giới thi u phư ng pháp nội chuẩn [26] Tuy nhi n những nghi n cứu n y chỉ xác ịnh ư c vitamin D3 và vitamin D2 m không ao gồm d ng chuyển h a 25(OH)D Một phư ng pháp HPL ể xác ịnh 25(OH)D trong thịt ư c mô tả ởi Koshy and VanDerSlik (1977) tuy nhi n không ồng thời xác ịnh D3 [33] Một phư ng pháp HPL hai chiều ã ư c sử d ng ể xác ịnh ồng thời vitamin D3 và 25(OH)D3 [27] Tuy nhi n phư ng pháp cho thấy giới h n phát hi n khá cao khoảng 0 2-1,0 mg/100g

Tác giả nders Staffas v cộng s ã nghi n cứu xác ịnh vitamin D3trong sữa ột sữa công thức dầu n margarine v dầu cá ng phư ng pháp HPLC [13] Phư ng pháp ph n t ch d a tr n phư ng pháp ề xuất của O 2002.05 Mẫu ph n t ch ư c th m chất nội chuẩn l vitamin D2 sau x

ph ng h a ng KOH etanol c sung th m chất chống oxi h a utylated hydroxytoluene (BHT) chi t mẫu thu ư c ng cyclohexan v n-heptan (1:1)

v l m s ch ng cột silica Dịch chi t ư c em o mẫu ở máy HPL ầu d

UV ở ước s ng 265 nm, cột cho ph n t ch ịnh lư ng L -C18, 250x 4,6 mm,

dp = 5μm (Vydac 201 TP 54 hoặc tư ng ư ng) với cột ảo v 18 4.0x 4 0

mm, dp = 5 μm (Li hro RT 4-4 hoặc tư ng ư ng) Pha ộng 1: 0.5 isopropanol và 2% methyl-tert-butyl ether (MTBE) trong cyclohexane:n-heptan; trộn 5ml isopropanol v 20 mL MTBE với 1L cyclohexane:n-heptan (1

+1); pha ộng 2 : isopropanol+n-heptan (20+80) Pha loãng 200 ml isopropanol

th nh 1 l t với n-heptan; Pha ộng 3: Metanol axetonitril (20 + 80) Pha loãng 200ml metanol th nh 1 l t với acetonitrile H m lư ng vitamin D3 trong các mẫu nghi n cứu từ 0 4 – 12 µg/100g Độ thu hồi từ các mẫu th m chuẩn vitamin D3 thay i 93-102 Giá trị ộ lặp l i ộ l ch chuẩn tư ng ối (RSD) cho k t quả chấp nh n thay i từ 2 2 (dầu cá) v 7 4 (dầu n) trong khi tái lặp ộ l ch chuẩn tư ng ối (RSD) giá trị thay i từ 6 8 ( th c v t) v

24 (dầu n)[13]

Jette Jako sen v cộng s ã xác ịnh h m lư ng t ng vitamin D trong thịt ao gồm vitamin D3 và 25-hydroxyvitamin D3 ư c ịnh lư ng ng phư ng pháp HPL sau khi thủy ph n ng kiềm chi t pha r n v án chuẩn

ị HPL [28] Một h thống án chuẩn ị HPL gồm ộ iều khiển 600 v

m một máy l m l nh 717PLUS t ộng v một detector hấp th 2487

Detector DAD ư c sử d ng ở khoảng 220-320 nm v vi c ịnh lư ng ư c

hi n ở ước s ng 265 nm Vitamin D2 ư c sử d ng giống như chất nội chuẩn

ối với vitamin D3 cũng như l ối với 25(OH)D3 Nghi n cứu n y l một phư ng pháp ph n t ch c thể ư c sử d ng cho vi c ánh giá các lo i vitamin

D khác nhau ng g p thông tin mới v o ảng th nh phần th c phẩm

Markus Herrmann v cộng s ã phát triển một phư ng pháp ph n t ch

s c ký l ng khối ph song song (L -MS) [37] Thi t ị gồm h thống khối ph

PI 5000 k t h p với một nguồn ức x ion h a tách s c ký sử d ng cột s c

ký pha ảo Supelco 8 (Supelcosil L -8 3.3cm x 3mm k ch thước h t 3 μ m) cột ảo v C8 (4 ×2,0 mm) ể ịnh lư ng 25(OH)D2 và 25(OH) D3 trong huy t thanh [37] Phư ng pháp mới n y ư c ánh giá k t quả cùng với hai phư ng pháp sử d ng rộng rãi ể xét nghi m miễn dịch RI v E LI K t quả cho thấy phư ng pháp L -MS ịnh lư ng ch nh xác 25(OH)D phù h p với phép

ph n t ch ng RIA c n ối với phư ng pháp ECLIA thì cho thấy c s sai

l ch

Một phư ng pháp ịnh lư ng n giản vitamin D ư c Lone Hymoller và cộng s công ố n m 2011 [35] Mẫu huy t tư ng hoặc huy t sau khi xà phòng

h a v chi t xuất ư c tách ng cột s c ký l ng pha ảo 30 (250mm × 4.6

mm ID) với cỡ h t 5 0 μm v cột ảo v 30 (10 mm × 4.0 mm ID) với cỡ h t 5,0 μm Nhi t ộ cho cả hai cột l 500 thể t ch ti m mẫu l 50 μL.Chư ng trình gradient rửa giải ư c th c hi n t i tốc ộ d ng chảy 1 0 ml/phút với MeOH (85%) v EtOH trong 55 phút Trong 12 phút ầu ti n 5 EtOH ư c

m qua cột v sau l tỉ l EtOH ư c t ng l n n 40 trong a phút Mười ảy phút sau số lư ng EtOH ư c t ng l n n 90 trong thời gian 3 phút v ư c duy trì li n t c trong 10 phút ể l m s ch các cột Gradient ư c

ưa trở l i thi t l p an ầu trong 5 phút v 5 phút sau các mẫu ti p theo c thể ư c ti m Peak thu ư c n m trong khoảng 25 phút ầu ti n Giới h n phát hi n gấp a lần so với t n hi u nhiễu nền ã ư c xác ịnh n 0 14 ng/mL huy t tư ng v giới h n ịnh lư ng gấp mười lần t n hi u nhiễu nền n 0,45 ng/mL huy t tư ng Phư ng pháp n y ư c sử d ng ể xác ịnh thành phần vitamin D v chất chuyển h a của n trong huy t tư ng của sáu loài khác nhau với: l n gia cầm chồn ng a v con người Ở gia súc hi u suất thu hôi t 86,6 và 101,0%, sai khác trong ng y từ 0 9 n 5 9 v sai khác giữa các ng y l 0 2 n 1 7 Tuy nhi n tùy thuộc v o lo i v số lư ng mẫu m phần tỉ l sai số l khác nhau

1.4 Tổng quan nghiên cứu xác ịnh vitamin D tr ng nấ

Phần lớn các nghi n cứu tr n th giới trong thời gian về ph n t ch xác ịnh h m lư ng vitamin D trong nấm sử d ng phư ng pháp s c ký l ng hi u

n ng cao ác nghi n cứu cũng chỉ ra r ng h m lư ng vitamin D cao c trong

nấm ư c hình th nh nhờ ức x mặt trời h nh vì v y các h m lư ng trong nấm nuôi trồng thường thấp ởi ặc iểm của phư ng pháp nuôi cấy thường trong môi trường thi u ánh sáng

Viraj J Jasinghe v cộng s ã ưa ra k t lu n từ vi c ph i n ng cho nấm

ể t ng h m lư ng vitamin D [46] Nấm ông cô (Lentinula edodes) nấm S (Pleurotus ostreatus) nấm Mỡ (nấm nút) (Agaricus bisporus) v nấm B o ngư (Pleurotus cystidus) ư c chi u x 1 giờ với tia c c t m (UV ; ước s ng

315-400 nm) tia c c t m B (UVB; ước s ng 290-315 nm) v tia c c t m-C (UV ; ước s ng 190-290 nm) Mẫu ột nấm khô ông l nh (0 5g) ư c c n

ch nh xác v o ình áy tr n 250 ml v trộn với 4ml dung dịch natri ascor ate (17,5 g natri ascorbate trong 100 ml dung dịch NaOH 1M), 50 ml etanol (95%),

và 10 ml dung dịch kali hydroxit 50 Mẫu ư c x ph ng h a trong iều ki n

un hồi lưu ở 80 ° trong 1 giờ sau n ã nhanh ch ng l m l nh n nhi t

ộ ph ng v chuyển v o phễu tách Hỗn h p n y lần ầu ti n ư c chi t xuất với 15ml nước de-ion sau l 15 ml etanol v sau chi t a lần với n-pentan c thể t ch lần lư t l 50 50 v 20 ml To n ộ phần hữu c ư c rửa

a lần với 50 ml dung dịch KOH 3 trong etanol 5 v sau rửa lần cuối với nước de-ion cho n khi trung h a ác phần dịch chi t hữu c ư c chuyển v o ình áy tr n cô quay ở 40° v ngay l p tức tái h a tan trong 5

ml etanol Sau mẫu ư c i qua một ộ lọc 0 45 μm 20 μl của mẫu lọc

ư c ti m v o h thống HPL ầu d UV v tách rửa nhờ cột 18 pha ảo với pha ộng l ACN:MeOH (5:25) v tốc ộ d ng chảy 2 3 ml/phút Quá trình chuyển i của ergosterol th nh vitamin D2 dưới UV UVB v UV ã có

s khác i t áng kể H m lư ng vitamin D2 cao nhất (184 ± 5.71 μg/g DM)

ư c quan sát thấy trong nấm S chi u tia UVB ở nhi t ộ 35 0 v ộ ẩm khoảng 80 Mặt khác theo cùng iều ki n chi u x nồng ộ vitamin D2 thấp nhất (22 9 ± 2 68 μg/g DM) ã ư c quan sát thấy trong nấm Mỡ Ngo i ra

cường ộ của ức x tia c c t m v liều chi u x ư c áp d ng cũng g p phần

v o s chuyển i của ergosterol trong nấm th nh vitamin D2 Ngay cả trong iều ki n ình thường 5 g nấm ông cô tư i ư c chi u trong 15 phút với tia

UV hoặc UVB l thừa ủ ể c ư c các liều cung cấp ư c ề nghị của vitamin D cho người lớn (10 μg/ngày) [46]

N m 2010 Sundar Rao Koyyalamudi v cộng s ã công ố một công trình khoa học về nồng ộ vitamin D2 trong nấm mỡ (Agaricus bisporus) sau

khi ti p xúc với tia c c t m ng h thống HPL -MS sử d ng cột Gemini 5μm C18 với pha ộng methanol:acetonitrile (25:75 v/v) tốc ộ d ng 0.2 mL/min [41] H m lư ng vitamin D2 trong nấm t ng tư ng ứng với số lư ng các xung ánh sáng tia c c t m Không c s khác i t th nh phần vitamin D2 trong nấm

từ các gi 200 g và 500 g theo các xung ánh sáng Nấm lớp tr n cùng có hàm

lư ng vitamin D2 cao h n so với lớp dưới cùng của một gi , c n nấm thái lát (d y khoảng 5 mm) sau khi chi u x c h m lư ng vitamin D2 cao h n nấm thái lát thông thường Như v y sử d ng các xung c c t m cung cấp một phư ng pháp c hi u quả cao ể t ng nồng ộ vitamin D2 trong nấm mỡ A

Bisporus [41]

Katherine M Phillips v cộng s ã xác ịnh ư c vitamin D4 trong quá trình phân tích vitamin D2 trong s c ký ồ HPL -UV của nấm n [32] ác sterol ư c xác ịnh ng s c ký kh phát hi n ng phư ng pháp ion h a ngọn lửa sau khi x ph ng h a ể th c hi n chi t lipid t ng dùng s c ký kh khối ph (G -MS) ể kiểm tra ịnh t nh l i th nh phần vitamin D4 ã ư c ịnh lư ng ng HPL với ầu d UV sử d ng vitamin D3 l m chất nội chuẩn Nấm porta ella nấm nút m u tr ng nấm crimini nấm kim ch m (Enoki) nấm Đông cô nấm maitake nấm h u nấm morel nấm m o g ( hanterelle) ư c chi u x UV v ph n t ch Ph n t ch 4 th nh phần vitamin D của mỗi mẫu trong

t ng số 71 mẫu từ các nh cung cấp án lẻ v nh sản xuất của Mỹ cho thấy

vitamin D4 c mặt (>0.1 μg/100 g) trong t ng số 18 mẫu t ng h p v trong t nhất một mẫu của từng lo i nấm trừ nấm nút m u tr ng Mức cao nhất trong các mẫu sau khi ti p xúc với tia UV l nấm porta ella nấm maitake (0,2-7,0

và 22,5-35,4 mg/100 g) Trong một mẫu nấm s h m lư ng vitamin D4 t

h n gấp ôi so với D2 (6 29 so với 2 59 mg/100 g) vitamin D4 vư t quá 2 mg/100 g trong nấm morel v nấm m o g mẫu c chứa D4 nhưng không phát

hi n ư c trong hai mẫu nấm morel Tiền vitamin D4 là 22,23- dihydroergosterol ã ư c tìm thấy trong tất cả các mẫu (4,49-16,5 mg/100 g) [32]

N m 2013 Maximilian Wittig v cộng s ã công ố một i áo về

phư ng pháp phân tích vitamin D trong nấm s (Pleurotus ostreatus) sau khi

xử lý ng tia UVB [38] Thi t ị chủ y u của phư ng pháp l một máy s c ký (HPLC Agilent 1200 G1315) với ầu d mảng diode (D D) Sau 60 phút chi u x 10 chất tham gia v o phản ứng quang h a ã ư c tách ra ư c xác ịnh ởi ph D D ặc trưng v ph n i t ởi trọng lư ng ph n tử của n các chất vitamin D2, previtamin D2, tachysterol2, lumisterol2 v ergosterol cùng với một số lư ng nh một lo t các chất c cấu trúc tư ng t 22 23-dihydroergocalciferol (vitamin D4) ã ư c tìm thấy [38]

Cũng theo Maximilian Wittig quy trình xử lý mẫu cũng ảnh hưởng n

t ng sản lư ng vitamin D cũng như tỷ l của tiền vitamin, vitamin D2 v vitamin D4 Thủy ph n ng kiềm n ng c tác d ng ph n hủy tốt nhất cấu trúc của nấm v cho hi u suất thu ư c vitamin D cao nhất (D2: 141,32 μg/g DM,

D4: 22,72 μg/g DM) Quy trình chuẩn ị mẫu như sau ột mẫu nấm khô (5 g),

4 ml dung dịch natri ascor ate (17,5 g natri ascorbate trong 100 ml dung dịch natri hydroxyd 1M), cho và bình ình áy tr n m u h phách 250ml trộn với

50 ml ethanol (95%), 10ml KOH 50%, và 100 μg vitamin D3 ( hòa tan trong 1

ml methanol) Hỗn h p ư c x ph ng h a ng cách un hồi lưu 80 0

C trong

1 giờ v ình ư c l c ể ảm ảo hỗn h p ư c xáo trộn tốt Trước khi ư c chuyển v o một phễu chi t hỗn h p ư c l m l nh xuống nhi t ộ ph ng v pha loãng với 50 ml nước cất Sau chi t li n t c trong phễu chi t ầu ti n với 50 ml dietyl ete sau với 10 ml etanol hoặc 50 ml n-pentane với 50 ml n-pentane v cuối cùng với 20 ml n-pentane Phần dung môi ư c gộp chung chi t a lần với 50 ml 3 kali hydroxit trong 5 ethanol v cuối cùng rửa

s ch ng nước khử ion cho n khi chất chi t ã ư c trung h a Phần chi t

ư c sấy khô qua m (natri sulfat khan) v các dung môi ư c lo i ng cách sử d ng một thi t ị cô quay ch n không Phần dư ư c tái h a tan trong 1,5 ml methanol ng si u m v ư c em i ph n t ch tr n h thống HPL với ầu d UV hoặc h thống L -MS Ngo i ra i áo n y cũng nh c n phư ng pháp x ph ng h a ở nhi t ộ l nh (18-20 0 ) v qúa trình tri t ư c

l c li n t c trong v ng 18giờ ở 200 Một phư ng pháp chi t khác cũng ư c giới thi u với s hỗ tr của thi t ị si u m hỗn h p một mịn mẫu nấm với chất nội chuẩn ư c th m v o v chi t 3 lần với n-pentan k t h p si u m trong

10 phút Sau to n ộ phần chi t ư c li t m ở 40 trong 15phút Phần dịch

l ng thu ư c cho cô quay n khô v sau quy trình ư c lặp l i như ở tr n

ể ph n t ch HPL K t quả thu ư c giới h n phát hi n cho vitamin D2/4 là 0,02 μg/g DM v ước t nh cho previtamin D2/4 (0,06 μg/g DM) tachysterol2/4

(0 02 μg/g DM) và lumisterol2/4 (0,06 μg/g DM) Độ thu hồi của vitamin D2 là 97± 0 7 Nghi n cứu n y cung cấp một phư ng pháp công c ph n t ch ánh giá quá trình giải ph ng vitamin D sau khi xử lý UVB ể sản xuất nấm s c

th nh phần dinh dưỡng c n ng của các h p chất vitamin D [38]

N m 2014 Ulrich Krings v cộng s cũng ã công ố về ồ thị h m

lư ng sterol v các axit éo sau khi xử lý UVB của nấm s [43] Quả thể của

nấm sò (Pleurotus ostreatus) ư c chi u UVB với t i 310-320 nm cường ộ

11,5W/m2 cho 60 phút ở 20° Vitamin D2 ư c hình th nh ngay trong quả

thể trong cuống v trong phi n nấm H m lư ng ão h a tr n 100 μg/g chất khô ã t ư c sau 1 giờ H m lư ng của các ồng ph n lumisterol2, tachysterol2 và previtamin D2 cũng ư c t ng theo vitamin D4 t nồng ộ tối

a khoảng 20 μg/g chất khô Xử lý UVB nấm s trước khi thái lát l nguồn sung ư c nhu cầu h ng tuần của vitamin D của người lớn Quá trình phân tích

ư c th c hi n tr n h thống L -MS gồm 320-Triple Quad LC–MS2 (Palo Alto, CA, USA) và Varian Pro Star UV/vis detector (Palo Alto, CA, USA) [43]

chiếu sáng từ hía dư i; FBs-quả thể thái át; ST-cuống; FBt-quả thể chiếu sáng

từ hía trên) [43]

1.5 Đánh giá, ựa chọn phương pháp

Với s phát triển trong suốt những th p ni n qua về thi t ị v s nhồi cột

s c ký l ng hi u n ng cao (HPL ) n i l n như một phư ng pháp ư c ưa th ch cho kỹ thu t tách v ph n t ch ịnh lư ng của rất nhiều lo i mẫu

Ph n t ch HPL nhanh hi u quả v c thể d tìm lư ng mẫu nh n 200

pg Những c hội áp d ng HPL hầu như không giới h n do HPL ã trở

th nh một công c không thể thi u trong khoa học v công nghi p

Khi ư c sử d ng như một công c ph n t ch L c thể xác ịnh các cấu

tử trong một hỗn h p v lư ng của chúng trong mẫu Khi k t h p với những kỹ thu t ph n t ch khác thì c thể nh n di n ịnh t nh các cấu tử trong mẫu

Phư ng pháp HPL sử d ng cột pha ảo v detector UV cho phép ph n

t ch ồng thời các chất với ộ nh y cao ở ước s ng tối ưu Phư ng pháp n y

Nghi n cứu kỹ thu t tách ng L l cần thi t vì n sẽ ti p t c ng một vai trò quan trọng trong tất cả những l nh v c của ph n t ch h a học mặc dù c những ti n ộ h n nữa trong các thuốc thử chọn lọc v những cải ti n trong các

kỹ thu t v t l o lường

Với s phát triển trong suốt những th p ni n qua về thi t ị v s nhồi cột

s c ký l ng hi u n ng cao (HPL ) n i l n như một phư ng pháp ư c ưa th ch cho kỹ thu t tách v ph n t ch ịnh lư ng của rất nhiều lo i mẫu

HPLC l một phư ng pháp chia tách trong pha ộng l chất l ng v pha t nh chứa trong cột l chất r n ã ư c ph n chia dưới d ng tiểu ph n hoặc một chất l ng phủ l n một chất mang r n hay một chất mang ã ư c i n i

ng li n k t h a học với các nh m chức hữu c Ph n t ch HPL nhanh hi u quả v c thể d tìm lư ng mẫu nh n 200 pg Những c hội áp d ng HPL hầu như không giới h n do HPL ã trở th nh một công c không thể thi u trong khoa học v công nghi p

S c k l ng d a tr n hi n tư ng: dưới cùng một iều ki n mỗi cấu tử trong một hỗn h p tư ng tác với môi trường xung quanh khác với tất cả các cấu tử khác

Khi ư c sử d ng như một công c ph n t ch L c thể xác ịnh các cấu

tử trong một hỗn h p v lư ng của chúng trong mẫu Khi k t h p với những kỹ thu t ph n t ch khác thì c thể nh n di n ịnh t nh các cấu tử trong mẫu

Phép tách ư c i h i khi:

 Một hỗn h p quá phức t p cho vi c ph n t ch tr c ti p v d o

ph

 ác chất ph n t ch rất giống nhau v d các ồng ph n

 S cần thi t phải iều ch một chất c ộ tinh khi t cao

 Xác ịnh lư ng của của một chất n o

S c k cột mở s c k ản m ng ư c sử d ng trong những trường h p tách tư ng ối n giản c n HPL l kỹ thu t tách những hỗn h p phức t p v

c khả n ng tách với ộ ph n giải cao ể giải quy t những vấn ề nhanh h n v tốt h n

Trong HPL nhiều thông số phải ư c xác ịnh v thi t l p trước khi mẫu

ư c cho v o trong máy Vì th ể th nh công với HPL cần thời gian ể thi t

l p ch ộ v iều ki n ho t ộng th ch h p cho máy trong mỗi phép ph n t ch

1.6.2 Cơ chế của quá trình tách trong HPLC

Pha t nh l một y u tố quan trọng quy t ịnh ản chất của quá trình s c ký

v lo is c ký

N u pha t nh l chất hấp ph thì ta c s c ký hấp ph pha thu n hoặc pha

ảo

N u pha t nh l chất trao i ion thì ta có s c ký trao i ion

N u pha t nh l chất l ng thì ta c s c ký ph n ố hay s c ký chi t

N u pha t nh l gel thì ta có s c ký gel hay r y ph n tử

Trong chủ y u hi n nay sử d ng s c k hấp ph Quá trình s c ký d a

tr n s hấp ph m nh y u khác nhau của pha t nh ối với các chất tan v s rửa giải (phản hấp ph ) của pha ộng ể kéo chất tan ra kh i cột S tách một hỗn h p ph thuộc v o t nh chất ộng học của chất hấp ph Trong trường

hủ y u hi n nay chúng ta sử d ng lọai s c ký cột hấp ph pha ảo ( RP )

S tách diễn ra trong cột c chứa những h t xốp c di n t ch ề mặt lớn (pha t nh) ác cấu tử trong mẫu li n t c tư ng tác với pha t nh Pha ộng (c n gọi l chất rửa giải) ư c m qua cột ư c nhồi chặt các h t s c k

Với vi c chọn pha ộng v v t li u nhồi cột th ch h p các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc tr n cột với những tốc ộ khác nhau d các cấu tử

ư c ph n tách th nh các ph n o n khác nhau dọc theo d ng chảy của cột Khi những cấu tử lần lư t thoát ra kh i cột v i v o detector th ch h p ở

y t n hi u ư c ghi l i xử l v chuyển ra ngo i một s c k ồ cho i t s

hi n di n của mỗi cấu tử dưới d ng một Peak Khi lư ng cấu tử c trong mẫu ư c t nh toán d a v o chiều cao hoặc di n t ch của Peak của n

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất, thiết bị v dụng cụ

2.1.1 Hóa chất

+ Metanol ( lo i dùng cho HPL của Merk)

+ n-hexan (lo i dùng cho HPL )

+ Dietyl ete(P của Trung Quốc )

+ hất chuẩn vitamin D2, D3 100mg của Supelco

+ xetonitril (Lo i dùng cho HPL )

+ Etanol 960( Trung Quốc)

+ Axit ascobic (Merk)

+ Máy quang ph UV – Vis: Agilent 8453

+ Máy cất quay ch n không: IK ® RV10 digital

+ Máy siêu âm: Ultrasonic LC 60H

+ Máy nghiền th c phẩm h thống un hồi lưu

+ Máy Vortex IK - made in USA

+ Đèn UVB Exo –Terra

+ n ph n t ch ộ ch nh xác 10-5g

D ng c : ình chi t 250ml ình ịnh mức (ml) 5; 10; 100 Pipet (ml) 1; 2; 5; 10 Pipet t ộng ịnh mức(μl) 100 1000 Bình áy tr n (ml) 250, 500 Bình tam giác v các d ng c thủy tinh khác

2.2 Thu thậ v bả quản ẫu

ác mẫu nấm khô ư c thu th p từ rừng quốc gia Pù Mát Nấm s ư c mua t i ch Vườn Ư m-tp H T nh c nguồn gốc sản xuất t i xã Th ch Đ i huy n Th ch H - tỉnh H T nh Nấm Đông ô ư c mua t i ch tỉnh H T nh

c nguồn gốc sản xuất từ huy n Đông nh ngo i th nh H Nội Nấm thủy ti n

n u nấm kim ch m ư c mua t i si u thị Ocean mart H T nh c xuất xứ Nh t Bản v Trung Quốc Nấm sau khi thu ho ch ư c ảo quản trong tủ l nh ở 40 Một số mẫu ư c chi u x ng èn UVB

Hình 2.1.Hình ảnh ột số ẫu nấ tươi

Hình 2.2 Nấ khô ư c thu h ch từ vườn quốc gia Pù Mát

2.3 Xử ẫu

ác mẫu nấm tư i ư c em chi u x ng èn UV t ng h p Extra (225 µw/cm2) trong v ng 2 giờ sau em ảo quản trong ng n á tủ l nh

ác mẫu ph n t ch ư c nghiền nh ng máy xay chuy n d ng sau x

ph ng h a mẫu theo phư ng pháp kiềm n ng ng phư ng pháp [46] ã ư c chỉnh sửa phù h p với iều ki n ph ng th nghi m

Hỗn h p gồm 5 – 10 g mẫu nấm ông l nh ( ã ư c nghiền) 4ml natri asco at (17,5 g ascobic+100 ml NaOH), 50 ml etanol, 3 g KOH cho v o ình cầu áy tr n v votex trong 30 phút Ti n h nh un hồi lưu ở 70-800 trong v ng 1 giờ sau ư c

l m l nh ở nhi t ộ ph ng th m v o 50 ml nước v ư c chi t 3 lần với 50 ml hỗn